Search

Restrikcijos endonukleazės (REazės) – tai fermentai, kurie dėl savo ypatingo specifiškumo DNR taikiniui sulaukė plataus pritaikymo kaip DNR manipuliacijų in vitro ir genų inžinerijos įrankis. Kristalografiniais metodais nustatomos trimatės REazių atomų koordinačių struktūros (toliau – struktūros) padeda atskleisti, kaip skirtingos struktūrinės sanklodos yra pritaikytos restrikcijos endonukleazių funkcijai atlikti. Disertacijoje pristatomo darbo tikslas – kristalografiniais bei biocheminiais metodais ištirti specifiškumo-struktūros sąryšį PD-(D/E)XK ir fosfolipazių D (PLD) superšeimoms priklausantiems restrikcijos fermentams. Savo darbo objektais pasirinkome PD-(D/E)XK superšeimos Cfr10I/NgoMIV/Bse634I pogrupiui priklausančias REazes Bse634I ir EcoRII, bei PLD superšeimos fermentą BfiI. Disertacijoje pristatomos REazės Bse634I mutanto R226A komplekso su alternatyviais taikiniais 5'-ACCGGT ir 5'-GCCGGC struktūros atskleidė, kad Bse634I specifiškumą RCCGGY taikiniui lemia tiesioginio bei netiesioginio atpažinimo mechanizmai. REazės EcoRII N- ir C-galinių domenų kompleksų su specifine DNR struktūros iliustruoja du skirtingus taikinio 5'-CCWGG atpažinimo mechanizmus. EcoRII C-galinis domenas (EcoRII-C) išsuka centrinius A/T nukleotidus iš DNR duplekso. Ši deformacija leidžia fermentui panaudoti Cfr10I/NgoMIV/Bse634I REazių pogrupiui būdingus simetrinius konservatyvius struktūrinius elementus 5'-CCGG sekos atpažinimui. EcoRII N-galinio domeno (EcoRII-N) struktūra yra pirmas B3... [toliau žr. visą tekstą], Due to their unique specificity, restriction endonucleases (REases) have gained widespread application as indispensable tools for in vitro manipulation and cloning of DNA. Delineation of the repertoire of the protein folds, providing three-dimensional portraits of the REases by crystallographic methods, should reveal how different folds are tailored to function as restriction enzymes. The major goal of this work was to explore the specificity‑structure relationships within PD‑(D/E)XK and phospholipase D superfamily enzymes using a combination of the crystallographic and biochemical methods. More specifically, we have focused on the Bse634I and EcoRII restriction enzymes belonging to the Cfr10I/NgoMIV/Bse634I branch of PD‑(D/E)XK superfamily, and BfiI REase of PLD superfamily. Dissertation presents the crystal structure of the Bse634I REase mutant (R226A) complexed with two alternative target sites 5'‑ACCGGT and 5'‑GCCGGC, respectively. The analysis of the crystal structures revealed for the first time that the degenerate base pairs recognition by Bse634I is achieved through the combination of direct and indirect readout mechanisms. The crystal structures of the N‑ and C‑terminal domains of EcoRII solved in the DNA bound form revealed different structural mechanisms used for the recognition of the same target sequence 5'‑CCWGG. The first structural evidence has been provided that the C‑terminal domain of EcoRII (EcoRII-C) flips out the central nucleotides A/T while interacting... [to full text]

Due to their unique specificity, restriction endonucleases (REases) have gained widespread application as indispensable tools for in vitro manipulation and cloning of DNA. Delineation of the repertoire of the protein folds, providing three-dimensional portraits of the REases by crystallographic methods, should reveal how different folds are tailored to function as restriction enzymes. The major goal of this work was to explore the specificity-structure relationships within PD-(D/E)XK and phospholipase D superfamily enzymes using a combination of the crystallographic and biochemical methods. More specifically, we have focused on the Bse634I and EcoRII restriction enzymes belonging to the Cfr10I/NgoMIV/Bse634I branch of PD-(D/E)XK superfamily, and BfiI REase of PLD superfamily. Dissertation presents the crystal structure of the Bse634I REase mutant (R226A) complexed with two alternative target sites 5'-ACCGGT and 5'-GCCGGC, respectively. The analysis of the crystal structures revealed for the first time that the degenerate base pairs recognition by Bse634I is achieved through the combination of direct and indirect readout mechanisms. The crystal structures of the N- and C-terminal domains of EcoRII solved in the DNA bound form revealed different structural mechanisms used for the recognition of the same target sequence 5'-CCWGG. The first structural evidence has been provided that the C-terminal domain of EcoRII (EcoRII-C) flips out the central nucleotides A/T while interacting... [to full text], Restrikcijos endonukleazės (REazės) – tai fermentai, kurie dėl savo ypatingo specifiškumo DNR taikiniui sulaukė plataus pritaikymo kaip DNR manipuliacijų in vitro ir genų inžinerijos įrankis. Kristalografiniais metodais nustatomos trimatės REazių atomų koordinačių struktūros (toliau – struktūros) padeda atskleisti, kaip skirtingos struktūrinės sanklodos yra pritaikytos restrikcijos endonukleazių funkcijai atlikti. Disertacijoje pristatomo darbo tikslas – kristalografiniais bei biocheminiais metodais ištirti specifiškumo-struktūros sąryšį PD-(D/E)XK ir fosfolipazių D (PLD) superšeimoms priklausantiems restrikcijos fermentams. Savo darbo objektais pasirinkome PD-(D/E)XK superšeimos Cfr10I/NgoMIV/Bse634I pogrupiui priklausančias REazes Bse634I ir EcoRII, bei PLD superšeimos fermentą BfiI. Disertacijoje pristatomos REazės Bse634I mutanto R226A komplekso su alternatyviais taikiniais 5'-ACCGGT ir 5'-GCCGGC struktūros atskleidė, kad Bse634I specifiškumą RCCGGY taikiniui lemia tiesioginio bei netiesioginio atpažinimo mechanizmai. REazės EcoRII N- ir C-galinių domenų kompleksų su specifine DNR struktūros iliustruoja du skirtingus taikinio 5'-CCWGG atpažinimo mechanizmus. EcoRII C-galinis domenas (EcoRII-C) išsuka centrinius A/T nukleotidus iš DNR duplekso. Ši deformacija leidžia fermentui panaudoti Cfr10I/NgoMIV/Bse634I REazių pogrupiui būdingus simetrinius konservatyvius struktūrinius elementus 5'-CCGG sekos atpažinimui. EcoRII N-galinio domeno (EcoRII-N) struktūra yra pirmas B3... [toliau žr. visą tekstą]