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Orientadora : Profª Drª Maria Eliane Merlin Rocha Co-orientadora : Profª Drª Glaucia Regina Martinez Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2008 Inclui bibliografia

Orientador : Prof. Dr. Geraldo Picheth Coorientador : Prof. Dr. Glaucio Valdameri Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 28/02/2018 Inclui referências : p.87-104 Resumo : O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune com uma incidência crescente em todo o mundo. Os polimorfismos do gene da insulina têm uma forte associação com DM1. A interleucina 18 (IL-18) é uma potente citocina pró-inflamatória, que está envolvida nas respostas imunes inatas e adaptativas e na patogênese de várias doenças, incluindo DM1. O transportador de glicose 4 (GLUT4) é conhecido por ser um transportador de glicose responsivo a insulina e tem sido associado a várias doenças, incluindo diabetes mellitus. O objetivo deste estudo foi estudar variações genéticas e biomarcadores laboratoriais associados ao DM1 e suas complicações. Nós investigamos a associação dos polimorfismos, rs689 (INS), rs187238 (IL-18) e rs5435 (GLUT4) em um estudo caso-controle em euro-brasileiros com DM1 (N = 136) e indivíduos saudáveis (N = 144). A genotipagem foi realizada utilizando sondas fluorescentes (TaqMan, Applied Biosystems). Os indivíduos do grupo controle apresentaram maior IMC quando comparado ao grupo DM1. As concentrações séricas dos marcadores de controle glicêmico foram significativamente maiores no grupo DM1(P

Orientadora: Profa. Dra. Maria Eliane Merlin Rocha Coorientadores: Profa. Dra. Sheila Maria Brochado Winnischofer, Prof. Dr. Glaucio Valdameri Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Ciências – Bioquímica. Defesa : Curitiba, 30/10/2018 Inclui referências Resumo: Chalconas são compostos intermediários na via de síntese dos flavonoides. As chalconas possuem uma grande diversidade estrutural, o que contribui para as diferentes atividades biológicas que elas exercem. São conhecidos os efeitos de algumas chalconas hidroxiladas na posição 2' sobre células tumorais, contudo sabese pouco em relação aos efeitos citotóxicos sobre células tumorais promovidos com a adição de grupamento nitro na estrutura das chalconas. A presença do grupo nitro pode contribuir para aumentar a reatividade da região da carbonila ?,?-insaturada (sistema ceto-enona) das chalconas. Neste estudo foi avaliada a citotoxicidade da 2'- hidroxi-3-nitrochalcona (HNC) em células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2). A HNC foi capaz de induzir citotoxicidade de forma estatisticamente significativa a partir da concentração de 15 ?M após 24 horas de incubação pelo método do MTT e 20 ?M pelo método da LDH. A HNC (15 e 20 ?M) foi capaz de promover o aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo esse aumento parcialmente revertido pela pré-incubacão com o antioxidante NAC na concentração de 20 ?M da HNC, sugerindo a participação de EROs no mecanismo citotóxico. O mecanismo de morte celular induzido pela HNC (15 e 20 ?M) foi investigado, utilizando marcação com anexina-V / iodeto de propídio e inibidores específicos de vias de sinalização de ferroptose, necroptose e autofagia, e os resultados mostram um possível processo apoptótico. Foi demonstrado através da avaliação da respiração celular que a HNC (15 e 20 ?M - 24 horas) provocou disfunção mitocondrial, diminuindo o consumo de oxigênio no estado basal e com a adição de substratos para o complexo I e II, porém essa diminuição não foi observada com a adição de substrato para o complexo IV. Também foi observada uma diminuição no potencial da membrana mitocondrial com a concentração de 20 ?M. Diante dos resultados, pode-se concluir que a HNC exerce atividade citotóxica por alterar os níveis de EROs, promover disfunção mitocondrial e possivelmente causar morte celular por apoptose Abstract: Chalcones are intermediate compounds in the synthesis pathway of flavonoids. Chalcones have great structural diversity, contributing to the different biological activities that they display. It is known that hydroxyl group in chalcones contributes to the cytotoxic effect in cancer cells. The nitro group is widely found in various pharmacological compounds. However, little is known about its effect on chalcones. In this study, the cytotoxicity of 2'-hydroxy-3-nitrochalcone was evaluated in human hepatocellular carcinoma cells (HepG2). HNC was able to induce cytotoxicity from the 15 ?M concentration assessed by the MTT method and 20 ?M by the LDH method in 24 hours of treatment. The effect of HNC (15 and 20 ?M) on the increase of reactive oxygen species (ROS) was evaluated, and an increase in ROS caused by both concentrations was observed. This increase was partially reversed with the preincubation of the antioxidant NAC at the concentration of 20 ?M, suggesting the participation of ROS in the cytotoxic mechanism. The results of the experiment using annexin-V/propidium iodide indicate that the possible mechanism of cell death induced by HNC (15 and 20 ?M) in 24 hours is apoptosis. Results from the cell viability assay using inhibitors of ferroptosis, necroptosis and autophagy suggested that these mechanisms are not involved in the cytotoxic effect caused by HNC. It was demonstrated by the cellular respiration evaluation that HNC (15 and 20 ?M - 24 hours) caused mitochondrial dysfunction, reducing the oxygen consumption in the basal state and with the addition of substrates for the complexes I and II, but this decrease was not observed with the addition of substrate for IV complex. A decrease in the mitochondrial membrane potential with the concentration of 20 ?M was also observed. Thus, we conclude that HNC exerts cytotoxic activity by altering ROS levels, mitochondrial function and possibly causing apoptosis cell death

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santos Coorientadores: Profª Drª Leda Satie Chubatsu, Prof. Dr. Glaúcio Valdameri Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica) . Defesa : Curitiba, 26/03/2018 Inclui referências: p.158-178 Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio, endofítica, promotora de crescimento vegetal e produtora de um polímero estocado internamente, denominado polihidroxibutirato (PHB). O PHB é produzido a partir da condensação de monômeros de ácido 3-hidroxibutírico e estocado na forma de grânulos insolúveis. Bactérias acumulam maior quantidade de PHB, geralmente, em situações de excesso de carbono ou falta de algum outro nutriente essencial como fosfato e nitrogênio. O PHB estocado pode ser utilizado como uma reserva energética, sendo mobilizado quando a bactéria se encontra em situações de estresse. A superfície dos grânulos de PHB é revestida por várias proteínas, principalmente aquelas envolvidas na síntese e na degradação do polímero. As proteínas de superfície mais abundantes são as fasinas, que têm um papel fundamental na manutenção do número e do tamanho dos grânulos no interior da célula. Além das fasinas, PHA sintases, PHA depolimerases e o regulador transcricional PhaR também são encontrados associados à superfície. Recentemente, o papel do PHB na interação planta-bactéria passou a ser novamente discutido, devido a alguns microrganismos mobilizarem os grânulos de PHB como forma de defesa antioxidante durante a colonização de raízes de plantas. Além disso, dados de análise transcriptômica apontam que a síntese e a degradação de PHB podem ocorrer durante a colonização de plantas por H. seropedicae e Azospirillum brasilense. Sendo assim, nesse trabalho de tese objetivou-se avançar no entendimento do papel do PHB para a proteção de H. seropedicae contra o estresse celular e para a colonização de plantas. Nessa tese serão apresentados resultados relacionados a (i) uma metodologia criada para uma rápida quantificação de PHB através da técnica de citometria de fluxo, (ii) a influência das fasinas na produção de PHB em H. seropedicae, (iii) o papel do PHB frente a diferentes tipos de estresse in vitro e (iv) a relevância do PHB durante o processo de colonização de plantas. Os resultados do Capítulo 1 mostram que é possível substituir a técnica laboriosa de quantificação de PHB baseada em metanólise e cromatografia a gás pela citometria de fluxo de células coradas com Vermelho Nilo. Desta forma o processo de quantificação de PHB pode ser realizado em intervalos curtos de 5 min, além de permitir a quantificação de concentrações diminutas do polímero, requerendo poucas células. Tal metodologia é de extrema importância para se determinar a quantidade de PHB em populações de bactérias colonizando a superfície de raízes, o que seria inviável utilizando a metodologia por cromatografia a gás devido ao grande número de plantas necessárias para se obter a quantidade de biomassa bacteriana necessária. No Capítulo 2, demonstrou-se o papel das fasinas para a síntese de PHB e a importância da redundância genética entre os genes phaP1 e phaP2, assegurando a síntese de PHB e o fitness de H. seropedicae. No Capítulo 3, os resultados mostram que durante o choque térmico, tanto a síntese quanto a degradação do polímero são importantes para a sobrevivência da bactéria. Sendo que, as bactérias que não produzem o grânulo possuem uma taxa de sobrevivência muito menor comparado à estirpe selvagem e o mesmo ocorre com as estirpes que não conseguem mobilizar os grânulos durante o estresse. No Capítulo 4, apresentam-se resultados que demonstram a importância do metabolismo de PHB para o processo de colonização de plantas pela bactéria H. seropedicae SmR1. Realizou-se ensaios de interação planta-bactéria utilizando as estirpes mutantes defectivas na produção e degradação do polímero, e novamente foram observados resultados significativos quanto ao desenvolvimento das raízes de plantas inoculadas, assim como uma significativa redução da população endofítica das bactérias incapazes de produzir ou degradar PHB adequadamente. Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae, polihidroxibutirato, fasinas, interação planta-bactéria, citometria de fluxo. Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a nitrogen-fixing, endophytic, plant growth promoter and producer of an internally stored polymer, called polyhydroxybutyrate (PHB). This polymer is produced by the condensation of monomers of 3- hydroxybutyric acid and stored as insoluble granules. Bacteria accumulate more PHB in situations of excess carbon or lack of some other essential nutrients like phosphate and nitrogen. In this way, PHB can be used as an energy reserve and mobilized when the bacteria are in a stressful situation. On the surface of the PHB granules, there are many proteins involved in the synthesis and degradation of the polymer. The most abundant are the phasins, which play a key role in maintaining the number and size of the granules inside the cell. In addition to the phasins, PHA synthases, PHA depolymerases and the transcriptional regulator PhaR are also found associated with the surface. Recently, the role of PHB in plant-bacteria interaction has been actively discussed, because some bacteria mobilize PHB granules as a form of antioxidant defense during the colonization of plant roots. Also, data from transcriptomic analysis indicate that the synthesis and degradation of the PHB occur during the colonization of plants by H. seropedicae and Azospirillum brasilense. Thus, the objective of this thesis was to advance the understanding of the role of the PHB protecting H. seropedicae against stressful conditions and for the colonization of plants. This thesis will present results related to (i) the methodology established for a rapid quantification of PHB through the flow cytometry technique, (ii) the influence of the phasins on PHB production in H. seropedicae, (iii) the protecting role of PHB against different types of stress in H. seropedicae and (iv) the relevance of the polymer during the plant colonization process. The results of Chapter 1 showed that it is possible to replace the labour-intensive technique of quantification of PHB based on methanolysis and gas chromatography by flow cytometry of cells stained with Nile Red. In this way, the PHB quantification process can be performed at 5-min intervals, whilst allowing the quantification of PHB at low concentrations and applying a few number of cells. Such methodology is critical to determine the amount of PHB in bacterial populations colonising the root surface, which would be impracticable using the methodology by gas chromatography due to the high biomass content required (~ 5 mg of liophylized bacteria). In Chapter 2, the role of phasins for PHB synthesis and the importance of genetic redundancy between phaP1 and phaP2 genes were demonstrated, ensuring PHB synthesis and the fitness of H. seropedicae SmR1. In Chapter 3, the results show that during thermal shock, both the synthesis and the degradation of the polymer are essential for the survival of the bacterium. The bacteria that do not produce the granule have a much lower survival rate than the wildtype strain, and so do the strains that cannot mobilise the granules during stress. In Chapter 4, we present results that demonstrate the importance of PHB metabolism for the process of colonization of plants by H. seropedicae SmR1. Plantbacteria colonization assays were performed using mutants defective in the production and degradation of the polymer, and again significative results were determined for PHB-producing strains on the development of inoculated plant roots, while a significative reduction in the endophytic population of bacteria unable to produce or degrade PHB properly. Keywords: Herbaspirillum seropedicae, polyhydroxybutyrate, phasin, plant-bacteria interaction, flow cytometry.