Search

This is the peer reviewed version of the following article: Molins, E., Cobo, E., Ocaña, J. Two-stage designs versus European scaled average designs in bioequivalence studies for highly variable drugs: which to choose?. "Statistics in medicine", Desembre 2017, vol. 36, núm. 30, p. 4777-4788, which has been published in final form at http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sim.7452/pdf. This article may be used for non-commercial purposes in accordance with Wiley Terms and Conditions for Self-Archiving. The usual approach to determine bioequivalence for highly variable drugs is scaled average bioequivalence, which is based on expanding the limits as a function of the within-subject variability in the reference formulation. This requires separately estimating this variability and thus using replicated or semireplicated crossover designs. On the other hand, regulations also allow using common 2 × 2 crossover designs based on two-stage adaptive approaches with sample size reestimation at an interim analysis. The choice between scaled or two-stage designs is crucial and must be fully described in the protocol. Using Monte Carlo simulations, we show that both methodologies achieve comparable statistical power, though the scaled method usually requires less sample size, but at the expense of each subject being exposed more times to the treatments. With an adequate initial sample size (not too low, eg, 24 subjects), two-stage methods are a flexible and efficient option to consider: They have enough power (eg, 80%) at the first stage for non-highly variable drugs, and, if otherwise, they provide the opportunity to step up to a second stage that includes additional subjects.

La agencia europea del medicamento, EMA, y la estadounidense FDA, propusieron límites de bioequivalencia (BE) “escalada” para facilitar la declaración BE de genéricos de drogas de alta variabilidad (HVD). La determinación de la BE para una (HVD) fue una cuestión ampliamente debatida en los años finales del siglo XX y la primera década del siglo XXI (p.e. Shah et al. 1996, Tothfalusi et al, 2001, Tothfalusi et al. 2003). A principios de la presente década, tanto la EMA como la FDA presentaron regulaciones, que se basan en criterios escalados, sobre HVD. Ambos enfoques entran dentro de lo que se denomina bioequivalencia promedio escalada (Scaled Average Bioequivalence, SABE). Estos límites de BE se definen en función de la variabilidad intrasujeto de la formulación de referencia. Cabe mencionar, que cada uno de estos métodos presentan ciertas objeciones, por ejemplo: estas funciones son poco regulares, discontinuas en el método FDA y además el test de BE asociados al método de EMA aplica de forma incorrecta el principio de inclusión de intervalos (CIIP) ya que se utiliza sobre límites aleatorios y no constantes prefijadas que son los que se deber´ıan utilizar en el CIIP, y por lo tanto, todos estos métodos mencionados tienen problemas de control del error de tipo I. En esta memoria se proponen mejoras en las metodolog´ıas de ambas agencias reguladoras y un ajuste de nivel de significacio´n. Las alternativas que se mencionan son utilizar variantes continuas del enfoque FDA, y en el caso de la EMA, es usar el método Howe para aplicar el principio de inclusión de intervalos sobre límites constantes. Otra mejora que se propone aquí es utilizar límites regulares que fueron mencionados por los autores Karalis et al. 2011 y Kytariolos, J. et al. 2006, en el enfoque EMA (Karalis et al. 2011), que se basan en la función Sigmoidea. Estos autores utilizan métodos empíricos para estimar los parámetros que emulan los límites lineales de la EMA. Por otra parte, otra propuesta en esta memoria es aplicar el método Howe a estos límites regulares y observar si hay más control con el error de tipo I. Finalmente, otro enfoque que se expone es corregir el sesgo de algunas estadísticas que se aplican con el método Howe sobre límites más regulares. Entre los métodos propuestos “ContFDA”, “ContFDA2” y “HoweEMA”, mejoran los resultados al considerar el método de ajuste del nivel de significancia, ya que son los que menor pérdida de potencia presentan logrando obtener métodos estadísticamente válidos. Queda como futuro trabajo ver qué se obtendría con el método “bcHoweLO” (corregido por el sesgo) pues como se puede ver en los resultados, al aplicar este método pero sin ajustar el nivel de significancia, presenta un mejor control del error de tipo I aunque persiste cierta oscilación en el mismo. Por lo tanto, se esperaría que este método proporciona un test estadísticamente válido con un menor grado de pérdida de la potencia. En todas estas propuestas se utilizan como métodos de estimación de parámetros el enfoque de contraste intrasujeto (ISC), excepto para la EMA, que se debe utilizar el ajuste ANOVA en la estimación de parámetros cuyo enfoque de estimación queda como tema futuro en esta memoria. Además se realizan dos packages de R simcrossover y adjustalpha las que contienen las funciones simCrossover y adjAlpha. La primera función simula datos de un diseño crossover dado un modelo lineal que se le indique, y la segunda, realiza un ajuste del nivel de significancia en un test de bioequivalencia promedio escalada de referencia (RSABE) que se basa en datos de un diseño crossover con el objetivo de controlar su error de tipo I., The European Medicines Agency, EMA, and the U.S. FDA pro- posed scaled average bioequivalence (SABE) limits, in function of the variability, in to facilitate the bioequivalence declaration of generic highly variable drugs. It should be noted that each of these methods have certain objections, for example: these functions are non-regular, and discontinuous in the FDA method. Additionally the BE test as- sociated with the EMA method incorrectly applies the “confidence interval inclusion principle” (CIIP) since it is used on random limits. As a consequence, that are the ones that should be used in CIIP and therefore, all these mentioned methods have type I error control prob- lems. This thesis proposes improvements in the methodologies of both regulatory agencies and a adjustment of the significance level. More precisely, we propose to use continuous variants of the FDA approach and, in the case of EMA, to use the Howe’s method to apply the confidence interval inclusion principle over constant limits. Another improvement proposed here is to use mathematically regular limits those introduced by Karalis et al. 2011 in the approach EMA, which are based on the Sigmoid function. These authors use empirical meth- ods to estimate the parameters that emulate the linear limits of the EMA. Another proposal in this thesis is to apply the Howe’s method to these regular limits in order to reach greater control of the type I error. Finally, another improvement on these regular limits is to correct the bias of some statistics when applying the Howe’s method. Adjusting the significance level makes all these methods statistically correct, at the expense of some penalty in power. The lesser penalty in power is observed in our new method proposals: “ContFDA”, “Con- tFDA2” and “HoweEMA”, since they require the lesser adjustment. It remains as future work to see what would be obtained with the our new method “bcHoweLO” (corrected by the bias) since it presents the lesser type I error probability inflation, even without adjusting.

[cat] El sarcoma d’Ewing (SE) és el segon tumor ossi més freqüent en nens i adults joves, i presenta una incidència d’un màxim de 5 casos per milió en adolescents. Una de les característiques principals del SE és la seva gran capacitat metastàtica, aproximadament un 30 % dels casos en el moment del diagnòstic. Aquest fet és especialment greu ja que fa caure la taxa de supervivència fins a un 20 %. A nivell molecular, el SE es caracteritza per la presència d’una translocació cromosòmica que, en la majoria dels casos, dóna com a resultat la proteïna de fusió EWS/FLI1. La proteïna de fusió actua com a factor de transcripció aberrant i esdevé el promotor de la malaltia, controlant processos tan diversos com la transformació o la resistència a quimioteràpia. Una altra molècula que contribueix a la patogènesi és el receptor de membrana EPHA2. El nostre grup de recerca va descriure prèviament que EPHA2 s’expressa àmpliament en pacients de SE i que té un paper clau en el procés d’angiogènesi en aquests tumors. A més, aquest receptor també es troba sobreexpressat en altres tumors com els de pàncrees o ovari i ha estat implicat en la majoria de processos de malignitat tumoral. EPHA2 pertany a la família de receptors tirosina quinasa, essent el seu lligand principal la Efrina-A1. No obstant, les característiques pro-oncogèniques d’EPHA2 han estat relacionades amb les funcions independents del seu lligand, i està descrit que aquestes depenen de la fosforilació de la serina 897 del receptor. La presència d’un receptor de membrana que es troba sobreexpressat en les cèl·lules tumorals i l’existència d’una proteïna de fusió que està directament relacionada amb l’inici i progressió del SE, suggereixen la idea de desenvolupar una teràpia dirigida per aquests tumors. Per això, es va proposar el disseny d’una quimera que constava d’un ARNi contra EWS/FLI1, unit a un aptàmer específic per EPHA2. Els aptàmers són molècules d’ADN o ARN, seleccionades pel mètode SELEX, capaces de reconèixer una molècula diana amb una elevada afinitat i especificitat. En els últims anys, s’han posicionat com una eina molt prometedora, ja que després de reconèixer un marcador a les cèl·lules diana, són capaços d’alliberar diferents substàncies citotòxiques dins les cèl·lules. El conjunt de resultats d’aquest treball demostren que EPHA2 es troba fosforilat en el residu S897 en un panell de línies de SE i que aquesta fosforilació depèn de la via de les MAPK. De forma consistent, la sobreexpressió estable d’EPHA2 en cèl·lules amb nivells baixos del receptor va promoure la proliferació i la migració cel·lular. A més, el silenciament d’EPHA2 en dues línies de SE va reduir la capacitat tumorígenica, la migració i la invasió cel·lular in vitro, així com també la incidència de metàstasis pulmonars en dos models de metàstasi in vivo, un experimental i un altre ortotòpic. Per analitzar més profundament l’efecte del silenciament d’EPHA2 en cèl·lules de SE, es va realitzar un microarray d’expressió gènica. Les anàlisis funcionals van revelar una implicació d’aquest receptor en senyalització, motilitat i supervivència cel·lular. Tanmateix, l’estudi d’EPHA2 en un altre sarcoma pediàtric va reproduir el paper oncogènic del receptor i la seva regulació mitjançant la via de les MAPK. Globalment, aquests resultats evidencien que EPHA2 i els seus efectors poden ser noves dianes a estudiar per la teràpia contra el SE. De fet, aptàmers seleccionats contra EPHA2 van revertir la seva funció oncogènica en termes de proliferació i migració cel·lular. De forma paral·lela, aquests aptàmers també van resultar efectius per alliberar un ARNsi contra EWS-FLI1 a l’interior de les cèl·lules de SE. Així, els resultats serveixen com a prova de concepte que l’ús d’aptàmers contra EPHA2 és una aproximació factible per alliberar substàncies citotòxiques a les cèl·lules de SE. Conjuntament, la inhibició d’EPHA2 i EWS-FLI1, podria aportar benefici terapèutic en un futur pels pacients de SE on el tractament convencional no resulta efectiu., [eng] Ewing sarcoma (ES) is the second most common bone malignancy affecting mostly children and young adults. Aggressive manifestation of ES, largely in the form of metastasis, portends poor survival for these patients. ES is characterized by a chromosomal translocation between EWS and FLI1 genes. The resulting fusion protein acts as an aberrant transcription factor and becomes the principal driver of this tumor. EPHA2 is a tyrosine kinase receptor that is overexpressed in a wide variety of tumors and correlates with the malignant phenotype. Accordingly, our group previously described the implication of EPHA2 receptor in promoting angiogenesis in ES cells via ligand-dependent signaling. Otherwise, EPHA2 ligand-independent activity, controlled upon phosphorylation at serine 897 (S897), has been linked to metastasis in several types of cancer. In this context, we propose to develop a new targeted therapy consisting of an RNA aptamer against EPHA2 linked to a siRNA against EWS/FLI1. Here, we report that EPHA2 receptor is phosphorylated at S897 in a panel of ES cell lines, suggesting a potential role for EPHA2 in ES oncogenic progression. Consistently, stable overexpression of EPHA2 in ES cells enhanced proliferation and migration. Moreover, silencing of EPHA2 in two different ES cell lines resulted in reduced tumorigenicity, inhibition of migration and invasion capacities of ES cells in vitro, and reduction in the lung metastasis incidence in experimental and spontaneous metastasis assays. To further study the effect of EPHA2 silencing in ES cells, we performed a genome-wide gene expression microarray. Ingenuity pathway analysis revealed the implication of this receptor in cell signaling, cellular movement, and survival. Altogether, our results suggest that EPHA2 expression correlates with aggressive behavior in ES. In fact, EPHA2 aptamers reversed its aggressive function in terms of cellular migration and proliferation. Moreover, a multifunctional molecule aptamer-siRNA was useful for EWS/FLI1 silencing. Altogether, blocking EPHA2 function and EWS/FLI1 expression may be promising for the treatment of ES.

Equivalence testing is the natural approach to many statistical problems. First, its main application, bioequivalence testing, is reviewed. The basic concepts of bioequivalence testing (2×2 crossover designs, TOST, interval inclusion principle, etc.) and its problems (TOST biased character, the carry- over problem, etc.) are considered. Next, equivalence testing is discussed more generally. Some applications and methods are reviewed and the relation of equivalence testing and distance-based inference is highlighted. A new distance-based method to determine whether two gene lists are equivalent in terms of their annotations in the Gene Ontology illustrates these ideas. We end with a general discussion and some suggestions for future research.