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Agradecimentos: This work was supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), and the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Abstract: Chronic graft-versus-host disease (cGvHD), an immunological complication of allogeneic cell transplantation, is the principal cause of non-relapse mortality and morbidity. Even though advances have been made in understanding the pathophysiology of this disorder, many questions remain. We sought to evaluate gene expression of transforming growth factor ß (TGF-ß) pathway components, through quantitative RT-PCR and PCR array, in patients with cGvHD with different disease activity. We observed an upregulation of SMAD3, BMP2, CDKN1A, IL6, and TGF-ß2 genes in the clinical tolerance group, which had never developed cGvHD, or which had been withdrawn from all immunosuppressive treatments (IST) for at least 1 year. In addition, SMAD5 gene upregulation was observed in cGvHD patients undergoing IST, and ordinal regression showed a correlation between SMAD5 expression and disease severity. Our data support the evidence of the important role of TGF-ß effects in the pathological process of cGvHD FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO (FAPESP) CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO (CNPQ) Fechado

Agradecimentos: The authors would like to thank Raquel S Foglio (Hematology and ransfusion Medicine Center, University of Campinas, São Paulo, Brazil) for the English revision; Ana Leda Longhini (University of Alabama, Birmingham, AL, USA) and Irene Santos (Hematology and Transfusion Medicine Center, University of Campinas, São Paulo, Brazil) for ow cytometry assistance; Renata Giardini Rosa and Juares Ednaldo Romero Bianco for the evelopment of scaffold material; and Alessio Molinari and Maurizzio Bottas (in memoriam) Dipartimento di Biotecnologie, Chimica e Farmacia-Università degli Studi di Siena, Siena, Italy) or the synthesis of iHCK-37 compound. We also thank the National Institute of Science and echnology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) at UNICAMP for the access to quipment and confocal assistance and analysis (FAPESP Grants 2014/50938-8 and CNPq Grants 465699/2014-6) and the Hemostasis Laboratory of Hematology and Transfusion Medicine enter (FAPESP Grants 2016/14172-6) at UNICAMP for cell proliferation analysis by IncuCyte S3 system (Sartorius). The authors also thank CNPq, FAPESP, and INCT-Sangue for the fnancial support Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML) are characterized by risk of relapses, poor survival, unwanted side efects and high toxicity with the current therapies. In light of these facts, there are eforts to develop new drugs specifc for deregulated molecules that participate in leukemia pathogenesis. Hematopoietic cell kinase (HCK), an Src kinase family member, is overexpressed on hematopoietic stem cells of MDS and de novo AML patients and involved in the oncogenic process. Thus, we investigated in vitro, ex vivo and in vivo efects of a novel chemical compound targeting HCK inhibition (iHCK-37), in combination with the most used drugs for the treatment of MDS and de novo AML, 5-Azacytidine and Cytarabine. Herein, the combination treatment with iHCK-37 and 5-Azacytidine or Cytarabine demonstrated additive efects against leukemia cells, compared to either drug alone. iHCK-37 plus 5-Azacytidine or Cytarabine treatment was able to reduce the activation of oncogenic pathways, MAPK/ERK and PI3K/AKT, leading to reduction of ERK and AKT phosphorylation, and increased BAX and decreased BCL-XL protein expression. Moreover, treatment with iHCK-37 reduced MDS and AML CD34-positive cell numbers inside a 3D-structure but did not afect normal CD34-positive cell numbers. In vivo analysis showed that leukemic mice treated with iHCK-37 had reduced ERK and AKT proteins phosphorylation levels and leukocyte numbers. In conclusion, the iHCK-37 inhibitor has anti-neoplastic activity in leukemia cells without altering apoptosis and survival rate of normal cells, suggesting on-target malignant cell killing activity as a single agent or in combination with 5-Azacytidine or Cytarabine FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Fechado

Orientador : Marco A. Zago Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A etiopatogenia das úlceras de perna nas doenças falciformes é, até o momento, desconhecida, ainda que a vasooclusão possa ser reconhecida como fator causal. Com o objetivo de avaliar o possível papel de obstrução ao fluxo circulatório na gênese das úlceras de perna na anemia falciforme, foi empregado o método de medida da depuração de Tc99m, injetado no tecido muscular, no repouso e após exercício. Neste estudo, foram demonstradas diferenças na velocidade de eluição de Tc99m injetado na musculatura gastrocnêmica de pacientes com anemia falciforme quando comparados a indivíduos sem anemia e obstrução arterial ou pacientes com anemias adquiridas, indicando a ocorrência de anormalidades do fluxo circulatório periférico. O estudo incluiu 27 pacientes com anemia falciforme em fase estável (88), dos quais 13 nunca haviam apresentado úlceras de perna, 20 controles sem anemia e doença vascular (N) e 20 pacientes com anemias adquiridas (AA) .Para padronização do método foram estudados 20 pacientes com doença vascular obstrutiva periférica (C I>. No repouso, os dois grupos de indivíduos anêmicos apresentaram velocidade de eluição de Tc99m superior ao grupo N. No entanto, esta diferença só foi significativa para aqueles com anemia falciforme. Nestes últimos, por sua vez, foi demonstrada correlação significativa da velocidade de eluição do isótopo no ...Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The causes of leg ulceration in the sickIe cell diseases are not known, although a role of vasooclusion is generally assumed. In this study we demonstrated differences of the clearence of Tc99m from the calf muscle of sickle cell anemia patients as compared with normals and patients with acquired anemias, which indicate the occurrence of abnormalities of peripheral blood flow in sickle cell anemia (SCA), 20 controls without anemia and vascular disease (N) and 20 patients with acquired anemia (AA); 20 patients with peripheral arterial disease (CI) were studied for method standardization. The clearence rates for the SCA and AA groups at rest were higher than for the controls. This difference, however, was significant only for SCA, and for this group there was a negative correlation between hemoglobin levels and clearence rate at rest. These results are probably the consequence of the decrease of the peripheral resistance in anemia. After exercise Tc99m clearence rate was significantly higler for controls N than for the other groups, which seems to reflect the lower increment of cardiac output of anemic patients. The peripheral vascular reserve (maximal clearence rate/clearence rate at rest) was significantly lower for patients Doutorado Doutor em Medicina

Loss of endoplasmic reticulum (ER) homeostasis leads to ER stress, thus prolonged activation can lead to apoptosis. Herein, artesunate (ART) induced ER stress in leukaemia cells, resulting in eIF2a phosphorylation, activation of transcription factor 4, subsequent CHOP upregulation and XBP1 splicing. Furthermore, in vitro cyclin/CDKs reduction induced G1-phase arrest. An in vivo xenograft model showed a consistent pattern of ART in reducing tumour burden, supporting roles in the UPR pathway, which we speculate could lead to apoptosis by NOXA activation. Moreover, ART were capable of increasing the survival of mice. Taken together, our data indicate that ART may represent an interesting weapon to fight leukaemia CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Aberto

Agradecimentos: Te authors would like to thank Raquel S. Foglio for English review, and Márcio Alves da Cruz for his technical assistance with the animal’s care. Molecular structure of EGCG was produced using ChemDraw 19.0 sofware. Tis work was funded by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq/MCT) [Grant Number 303405/2018-0]; the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) [Grant Numbers 11/51959-0 and 17/21801-2]; and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior—Brasil (CAPES) [Finance Code 001] Abstract: (–)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), the major active polyphenol extracted from green tea, has been shown to induce apoptosis and inhibit cell proliferation, cell invasion, angiogenesis and metastasis. Herein, we evaluated the in vivo efects of EGCG in acute myeloid leukaemia (AML) using an acute promyelocytic leukaemia (APL) experimental model (PML/RARa). Haematological analysis revealed that EGCG treatment reversed leucocytosis, anaemia and thrombocytopenia, and prolonged survival of PML/RARa mice. Notably, EGCG reduced leukaemia immature cells and promyelocytes in the bone marrow while increasing mature myeloid cells, possibly due to apoptosis increase and cell diferentiation. The reduction of promyelocytes and neutrophils/monocytes increase detected in the peripheral blood, in addition to the increased percentage of bone marrow cells with aggregated promyelocytic leukaemia (PML) bodies staining and decreased expression of PML-RAR oncoprotein corroborates our results. In addition, EGCG increased expression of neutrophil diferentiation markers such as CD11b, CD14, CD15 and CD66 in NB4 cells; and the combination of all-trans retinoic acid (ATRA) plus EGCG yield higher increase the expression of CD15 marker. These fndings could be explained by a decrease of peptidyl-prolyl isomerase NIMA-interacting 1 (PIN1) expression and reactive oxygen species (ROS) increase. EGCG also decreased expression of substrate oncoproteins for PIN1 (including cyclin D1, NF-?B p65, c-MYC, and AKT) and 67 kDa laminin receptor (67LR) in the bone marrow cells. Moreover, EGCG showed inhibition of ROS production in NB4 cells in the presence of N-acetyl-L-cysteine (NAC), as well as a partial blockage of neutrophil diferentiation and apoptosis, indicating that EGCG-activities involve/or are in response of oxidative stress. Furthermore, apoptosis of spleen cells was supported by increasing expression of BAD and BAX, parallel to BCL-2 and c-MYC decrease. The reduction of spleen weights of PML/RARa mice, as well as apoptosis induced by EGCG in NB4 cells in a dose-dependent manner confrms this assumption. Our results support further evaluation of EGCG in clinical trials for AML, since EGCG could represent a promising option for AML patient ineligible for current mainstay treatments CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO (CNPQ) FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO (FAPESP) COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Aberto

Agradecimentos: The author(s) disclosed receipt of the following financial support for the research, authorship, and/or publication of this article: This work was supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/MCT) [grant number PQ 301676/2013-5]; the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [grant numbers 11/51959-0, 12/06675-7]; and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Abstract: Green tea (GT) treatment was evaluated for its effect on the immune and antineoplastic response of elderly acute myeloid leukemia patients with myelodysplasia-related changes (AML-MRC) who are ineligible for aggressive chemotherapy and bone marrow transplants. The eligible patients enrolled in the study (n = 10) received oral doses of GT extract (1000 mg/day) alone or combined with low-dose cytarabine chemotherapy for at least 6months and/or until progression. Bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) were evaluated monthly. Median survival was increased as compared to the control cohort, though not statistically different. Interestingly, improvements in the immunological profile of patients were found. After 30 days, an activated and cytotoxic phenotype was detected: GT increased total and naïve/effector CD8+ T cells, perforin+/granzyme B+ natural killer cells, monocytes, and classical monocytes with increased reactive oxygen species (ROS) production. A reduction in the immunosuppressive profile was also observed: GT reduced TGF-ß and IL-4 expression, and decreased regulatory T cell and CXCR4+ regulatory T cell frequencies. ROS levels and CXCR4 expression were reduced in bone marrow CD34+ cells, as well as nuclear factor erythroid 2–related factor 2 (NRF2) and hypoxia-inducible factor 1a (HIF-1a) expression in biopsies. Immune modulation induced by GT appears to occur, regardless of tumor burden, as soon as 30 days after intake and is maintained for up to 180 days, even in the presence of low-dose chemotherapy. This pilot study highlights that GT extracts are safe and could improve the immune system of elderly AML-MRC patients CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Aberto

Agradecimentos: This study was funded in part by the grant #2011/51959-0 and 2017/21801-2d, the São Paulo Research Foundation (FAPESP) and the Ministry of Science, Technology, Innovations and Communications (CNPq) grant # 301676/2013-5 Abstract: Inspiratory muscle training (IMT) has been shown to be an efficient method of improving exercise tolerance and inspiratory and expiratory muscle strength in several diseases. The effects of IMT on patients with sickle cell anemia (SCD) are relatively unknown. Our study aimed to evaluate the effects of IMT on adult SCD patients, regarding respiratory muscle strength (RMS) variables, lung function, exercise tolerance, blood lactation concentration, limitation imposed by dyspnea during daily activities and impact of fatigue on the quality of life. This was a randomized single-blind study, with an IMT design comprising true load (TG) and sham load (SG) groups. Initial assessment included spirometry, volumetric capnography (VCap) and measurement of RMS by maximal inspiratory and expiratory pressure (PImax and PEmax). The Medical Research Council dyspnea scale and modified fatigue impact scale were also applied and blood lactate concentration was measured before and after the 6-minute walk test. After this initial assessment, the patient used the IMT device at home daily, returning every 6 weeks for RMS reassessment. Both groups used the same device and were unaware of which group they were in. After a period totaling 18 weeks, patients underwent the final evaluation, as initially performed CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO (CNPQ) FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO (FAPESP) Aberto

Agradecimentos: This study was supported by São Paulo Research Foundation (FAPESP processes 17/21801-2, 2013/13022-2 and 17/19674-2), National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) and Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES). The authors would like to thank Mariana Pissarra and Mariana Ozello Baratti for their valuable technical assistance. We also thank Raquel S Foglio for the English revision Abstract: Background: Microtubules, actin and Rho GTPase proteins are essential players in the megakaryocyte biology for platelet formation and function. Objectives: To investigate the role of ARHGAP21, a RhoGAP protein, in megakaryocytic differentiation and platelet function. Methods: Cytoskeletal proteins were investigated in HEL cells silenced for ARHGAP21 and submitted to megakaryocyte differentiation. The role of Arhgap21 in platelet function was accessed using haploinsufficient (Arhgap21+/-) mice. Arhgap21+/- platelet aggregation and p-selectin exposure were evaluated in response to thrombin. Vessel occlusion time and thrombus formation were detected after injury of the carotid artery. Platelet morphology was accessed by electronic microscopy. Results: ARHGAP21 was upregulated during megakaryocytic differentiation of the cell line and primary mouse cells. In the HEL cell model, ARHGAP21 was detected in the cytoplasmic protrusions, colocalized and associated with a-tubulin and was mostly detected in the protein cell fraction containing the polymerized tubulin. Silencing of ARHGAP21 decreased the expression of Glu-tubulin, suggesting microtubule instability, and enhanced cell spreading. Platelets from Arhgap21+/- mice presented enhanced thrombin-induced aggregation and p-selectin exposure associated with increased size of a-granules. Arhgap21+/- mice also showed increased CDC42 and RHOA activities, shorter tail-bleeding and accelerated thrombus formation. Conclusions: Our results indicate that ARHGAP21 may be a critical protein in the regulation of platelet production and function through the control of cytoskeletal rearrangement CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Despite being initially considered at higher risk for severe COVID-19, sickle cell disease (SCD) patients have mostly presented clinical severity similar to the general population. As their vulnerability to become infected remains uncertain, we assessed the seroreactivity for SARS-CoV-2 to estimate the prevalence of infection and possible phenotypic and socioeconomic determinants for their contagion. Serologic evaluation was performed on 135 patients with an overall prevalence of 11%; positivity was associated with older age and use of public transportation. We speculate that social distancing instructions recommended by our clinic may have contributed to lower levels of infection, but potential protection factors need further investigation FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Aberto

Agradecimentos: This study was kindly funded by FAPESP # 2020/12622-0, #2019/25125-7, #2020/04133-9, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico ' (CNPq), Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico – FCF-UNESP (PADC) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001 Abstract: Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common primary brain cancer. GBM has aggressive development, and the pharmacological treatment remains a challenge due to GBM anatomical characteristics’ (the blood–brain barrier and tumor microenvironment) and the increasing resistance to marketed drugs, such as temozolomide (TMZ), the first-line drug for GBM treatment. Due to physical–chemical properties such as short half-life time and the increasing resistance shown by GBM cells, high doses and repeated administrations are necessary, leading to significant adverse events. This review will discuss the main molecular mechanisms of TMZ resistance and the use of functionalized nanocarriers as an efficient and safe strategy for TMZ delivery. GBM-targeting nanocarriers are an important tool for the treatment of GBM, demonstrating to improve the biopharmaceutical properties of TMZ and repurpose its use in anti-GBM therapy. Technical aspects of nanocarriers will be discussed, and biological models highlighting the advantages and effects of functionalization strategies in TMZ anti-GBM activity. Finally, conclusions regarding the main findings will be made in the context of new perspectives for the treatment of GBM using TMZ as a chemotherapy agent, improving the sensibility and biological anti-tumor effect of TMZ through functionalization strategies FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO (FAPESP) CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO (CNPQ) COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Fechado

Agradecimentos: The authors would like to thank Prof. Benedicto de Campos Vidal from University of Campinas for providing collagen type II, and Tereza Salles and Paulo Latuf Filho for their valuable technical assistance. We also thank Raquel Foglio for English review and Michel Moraes for figure formatting and design. This work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq/MCT), Fundavao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) and Fundacao de Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES) Abstract: Objective. Articular cartilage is an avascular tissue with limited ability of self-regeneration and the current clinical treatments have restricted capacity to restore damages induced by trauma or diseases. Therefore, new techniques are being tested for cartilage repair, using scaffolds and/or stem cells. Although type II collagen hydrogel, fibrin sealant, and adipose-derived stem cells (ASCs) represent suitable alternatives for cartilage formation, their combination has not yet been investigated in vivo for focal articular cartilage defects. We performed a simple experimental procedure using the combination of these 3 compounds on cartilage lesions of rabbit knees. Design. The hydrogel was developed in house and was first tested in vitro for chondrogenic differentiation. Next, implants were performed in chondral defects with or without ASCs and the degree of regeneration was macroscopically and microscopically evaluated. Results. Production of proteoglycans and the increased expression of collagen type II (COL2 alpha 1), aggrecan (ACAN), and sex-determining region Y-box 9 (SOX9) confirmed the chondrogenic character of ASCs in the hydrogel in vitro. Importantly, the addition of ASC induced a higher overall repair of the chondral lesions and a better cellular organization and collagen fiber alignment compared with the same treatment without ASCs. This regenerating tissue also presented the expression of cartilage glycosaminoglycan and type II collagen. Conclusions. Our results indicate that the combination of the 3 compounds is effective for articular cartilage repair and may be of future clinical interest CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Fechado

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In sickle cell/ß-thalassemia, mutations in the corresponding ß-globin genes are responsible for complex pathological events resulting in diverse clinical complications. The objective of this study was to provide an overview of the clinical and laboratory characteristics of patients with the syndrome, and of the degree of severity of clinical manifestations resulting from the ß-thalassemia mutation. A retrospective chart review was performed on 46 patients with sickle cell/ß-thalassemia (31 Sß° and 15 Sß+), evaluating hematological parameters and end organ damage. Statistical analyzes were carried out in order to highlight differences between the two groups according to the nature of the thalassemia mutation. As expected, patients with the Sß0 phenotype had a higher degree of hematological involvement in comparison to Sß+ patients; with lower hemoglobin levels, and signs of more intense chronic hemolysis. However, Sß+ patients were more prone to the occurrence of acute chest syndrome. The impact of the thalassemia mutation upon total body and bone composition was also evident, as Sß0 patients presented lower body mass index (BMI) and bone mineral density. The degree of bone damage correlated to lower BMI and hemoglobin levels, as well as plaquetosis, monocytosis and elevated lactate dehydrogenase, possibly reflecting the effects of hemolysis and inflammation upon bone metabolism and body constitution. This study identified significant differences among sickle cell/ß-thalassemia patients according to the beta mutation involvement, pointing to an important predictor of disease severity Fechado

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Esse trabalho investiga o efeito protetor do tratamento com diferentes doses (50, 100 e 250 mg/Kg) do extrato padronizado de Chá Verde (GTE) em camundongos infectados com Listeria monocytogenes (LM). A eficácia terapêutica foi avaliada para uma dose letal de LM por sete dias consecutivos com diferentes doses de GTE. A proteção significativa do extrato foi verificada durante a fase aguda da infecção e um mecanismo de ação foi proposto a partir da análise dos efeitos do GTE sobre o crescimento e a diferenciação de progenitores hematopoéticos para granulócitos e macrófagos (CFU-GM) da medula óssea e do baço, sobre a atividade estimuladora de colônias (CSA) do soro, sobre a atividade lítica de células NK, sobre a proliferação de linfócitos e sobre a produção de citocinas de padrão Thl (IFN-y) / Th2 (IL-10) em animais normais e infectados com LM. Os resultados demonstraram que a resistência dos animais infectados com uma dose letal de LM tratados com GTE está relacionada com a modulação da mielossupressão e diminuição da hematopoese extramedular produzidas pela infecção. Também foi verificado um aumento da atividade lítica de células NK, da capacidade proliferativa de linfócitos e da polarização da resposta imunológica para Thl. O GTE não apresentou toxicidade sobre o estroma medular e estimulou a geração de progenitores para granulócitos-macrófagos em sistema de cultura líquida de longa duração (LTBMC). O mecanismo de ação da atividade imunomoduladora do GTE ainda não está completamente definido. No entanto, os mecanismos de ação apresentados neste trabalho são de fundamental importância para a atividade antibacteriana in vivo do GTE Abstract: In the present study we investigated the protective effects of the oral administration of Green tea (GTE) (50, 100 and 250mg/Kg) in mice infected with Listeria monocytogenes (LM). We demonstrated that GTE protects mice from a lethal dose of LM when administered prophylactically for seven consecutive days. To determine the mechanism of action of GTE, we examined the effect of GTE on the number of granulocyte and macrophage colony-forming units (CFU-GM) from bone marrow and spleen, on the colony-stimulating activity (CSA) of serum, on natural killer (NK) cell activity, on lymphocyte proliferation and on Thl/Th2-based cytokine production in normal and LM infected mice. Myelosuppression and extramedular hematopoiesis/splenomegaly were the major features of LM infection, in association with NK cell activation and alteration of lymphocyte proliferation. The resistance of mice infected with a lethal dose of LM but treated prophylactically with 100 and 250mg/Kg of GTE could be related to the modulation of myelosuppression and extramedular hematopoesis induced by the infection, and to an increase in NK cell activity, lymphocyte proliferation and polarization of the Thl-based immune response. The GTE extract was not toxic to either the stromal cell layer or to GM progenitors generated from long-term bone marrow culture (LTBMC). In this way, the mechanism of action through GTE exerts its pharmacological effect is not completely elucidated, although the parameters mentioned here are essential for its antibacterial effect in vivo Doutorado Doutor em Farmacologia

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Citocinas inflamatórias como IL-1a e ß, IL-1RA, IL-6, IL-10 e TNF estão envolvidas na resposta imune inclusive na ocorrência de reação febril não hemolítica. Podem acumular nos concentrados de plaquetas (CPs) durante o armazenamento ou serem liberadas por células do receptor de transfusão. Alguns polimorfismos dos genes destas citocinas interferem na produção frente a estímulos. O presente trabalho tem como objetivo avaliar a importância dos polimorfismos IL1B-511C/T, IL1+3953C/T, IL1RN intron2 VNTR, IL6-174G/C, IL10-1082G/A, IL10-819C/T, TNF308G/A e TNF+252G/A em pacientes multitransfundidos e em doadores de sangue, utilizado para produção de CPs, através da avaliação da ocorrência precoce de RFNH associada a transfusão de concentrado de hemácias ou do acúmulo de IL-1a e ß, IL-1RA e TNF nos CPs. Utilizamos o método PCR e digestão com enzimas de restrição (PCR-RFLP) ou sequenciamento automatizado para identificações destes polimorfismos. Em nossa amostra de população da região de Campinas, São Paulo, encontramos freqüências genotípicas comparáveis às populações européia e norte americana e diferenças significativas das populações asiática e de origem africana. O raro alelo IL1RN*0 foi identificado em nosso grupo, não foi demonstrado interferência deste alelo, em heterozigose, na expressão do gene IL1RN em modelo in vitro. Nos CPs obtidos de plasma rico em plaquetas (CP-PRP) foi observado maior acúmulo de IL-1ß nos doadores IL1B-511CC, evidenciado no D5 e D7 de armazenamento. Foi observada correlação inversa entre o conteúdo de plaquetas nos CP-PRP e o acúmulo de IL-1ß e TNF, não havendo correlação com a contaminação leucocitária. Não houve acúmulo de IL-1a e IL- 1RA durante o armazenamento. No grupo de pacientes multitransfundidos, o alelo IL1RN*2 e o genótipo IL1RN*2.2 correlacionaram-se com a ocorrência de RFNH precoce. Concluímos que, o estudo de características genéticas dos doadores de sangue e pacientes pode ajudar a esclarecer as variações de ocorrência e gravidade dos efeitos adversos associados à transfusão de sangue, identificando grupos de maior risco e delineia uma nova linha de investigação Abstract: Inflammatory cytokines such as IL-1a e ß, IL-1RA, IL-6, IL-10 and TNF have been related with immune responses including febrile non-hemolytic reactions. These biological mediators may accumulate in platelet concentrates (PCs) during storage or be secreted by receptor immune cells. Many cytokine gene polymorphisms interfere in the production of cytokines after stimulus. The present study aims to value the significance of polymorphisms IL1B-511C/T, IL1B+3953C/T, IL1RN intron2 VNTR, IL6-174G/C, IL10-1082G/A, IL10-819C/T, TNF308G/A and TNF+252G/A in multitransfused patients and in PCs donors using the evaluation of precocious FNHTR occurrence associated with red blood cells (RBCs) transfusion or accumulations of IL-1a e ß, IL-1RA and TNF in PCs during storage. The methods used were based on PCR and restriction enzymes (PCR-RFLP) or automated DNA sequencing for polymorphism characterizations. In our population sample from Campinas, southeast Brazilian region, we detected similar genotype frequencies to European and North American populations and significant differences to the Asiatic and African ones. A rare allele IL1RN*0 was detected in our control group, we did not demonstrate the interference of this allele in heterozygousity, in the IL1RN gene expression in the in vitro model. In PCs from plasma rich in platelet (PRP-PC), we observed increased IL-1ß accumulation in PCs from IL1B-511CC blood donors on storage days 5 and 7 (D5 and D7). IL-1ß and TNF levels were inversely correlated with platelet content in PRP-PCs and no correlation with leukocyte content. There was no increase in IL-1a e IL-1RA levels during storage. In the multitransfused patients group, the IL1RN*2 allele and IL1RN*2.2 genotype were correlated with the occurrence of precocious FNHTR. We concluded that studies of genotypic characteristics of blood donors and patients might contribute to explain the variations in frequencies and gravity of side effects related with blood transfusion characterizing high risk groups and may outline a new and promising investigation field Doutorado Hematologia e Hemoterapia Doutor em Clínica Médica

Orientador: Jose Andres Yunes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Neste trabalho criou-se uma ferramenta de simulação e modelos computacionais para estudo da carcinogênese a fim de se responder a perguntas biológicas pertinentes ao tratamento desta doença. Os modelos computacionais se basearam no modelo teórico de Evolução Somática e Invasão Mediada por Acidez, proposto por Gatenby e Gillies, e foi implementado em uma ferramenta desenvolvida pelo autor deste trabalho no âmbito deste projeto, o Tissue Simulator (TSim, www.i-genics.com). O modelo teórico de invasão mediada por acidez propõe que células tumorais possuem maior resistência a acidez, assim como produzem quantidade de ácido lático, originado da glicólise anaeróbica, suficiente para acidificar o meio extracelular, causando assim morte do tecido saudável por apoptose induzida por acidez, e facilitando a invasão do tecido saudável pelo tumor. Estudos experimentais, na literatura, mostraram que a administração de bicarbonato de sódio na água em ratos portadores de tumores reduz o número de metástases, o que seria uma indicação de que a hipótese sobre a importância da acidez na invasividade tumoral é válida. Neste estudo, criou-se um primeiro modelo computacional para testar se o aumento da concentração de bicarbonato no sangue poderia influenciar no gradiente de acidez entre o tumor (micrometástases) e o tecido saudável, e também identificaram-se as características físico-químicas de um tampão ideal a ser usado com esse propósito. O modelo teórico de Evolução Somática, adotado neste projeto, propõe que para que um tumor epitelial se torne invasivo, é necessário que suas células adquiram três fenótipos: hiperplasia, hiperglicólise e resistência a acidez. O segundo modelo criado neste trabalho consistiu na identificação de quais seriam os valores mínimos de hiperglicólise e resistência à acidez para o aparecimento da característica de invasividade em um tumor em desenvolvimento dentro de um duto epitelial (DCIS). Uma vez identificados os fenótipos mínimos para a invasão tumoral de um DCIS, restaria saber quais as mutações em enzimas ou transportadores específicos dessa via metabólica para que o dito fenótipo seja atingido. A título de exemplo de um estudo para responder perguntas desse tipo, fez-se uma análise comparativa da robustez do fluxo glicolítico em duas células distintas: uma levedura (S. Cerevisiae) e uma célula humana especializada (célula beta pancreática), cujas enzimas principais são reguladas por estratégias distintas. Este estudo foi implementado em uma ferramenta computacional disponível na literatura (Jarnac e Matlab) e resultou na publicação de um artigo. No todo, os resultados desta tese mostram que, com o uso de ferramentas computacionais e dados quantitativos da literatura, é possível criar modelos teóricoquantitativos que podem ser usados para validar teorias sobre fenômenos biológicos assim como extrapolar novas hipóteses e testá-las, integrando-se assim a modelagem computacional no processo de pesquisa científica Abstract: In this work, we created a piece of software and computer models for studying carcinogenesis, in order to answer biological questions related to the treatment of this disease. The computer models were inspired in the theory of Somatic Evolution and Acid Mediated Tumor Invasion, proposed by Gatenby and Gillies, and were implemented in a tool developed by the author under the scope of this thesis, Tissue Simulator (TSim, www.i-genics.com). The theory of Acid Mediated Tumor Invasion proposes that cancer cells are more resistant to toxicity of an acidic environment that they help create by producing excess of lactic acid through anaerobic glycolysis. Acidification of the extra-cellular environment causes death of healthy tissue through acid-induced apoptosis and ultimately facilitates tumor invasion. Experimental studies, from literature, showed that administration of sodium bicarbonate in water to mice bearing tumors reduced the number of metastases, thus supporting the importance of acidity in tumor invasion. In this study a computer model was built to test if an increase in concentration of bicarbonate in blood serum could alter the pH gradient between the tumor (micrometastases) and halthy tissue, as well as to identify the chemical properties of and ideal buffer with this purpose. The theory of Somatic Evolution, proposes that epithelial tumor cells are submitted to environmental barriers and are selected for three main phenotypes: hyperplasia, hyperglycolysis and acid resistance. A second computer model was created in order to identify the minimum values of these phenotypes that allowed a DCIS to change into an invasive tumor. Once the minimum phenotypic values identified, one can study how mutations on specific enzymes can alter the flux of a metabolic pathway, such as glycolysis, to produce the altered phenotype. As an example of this, we performed a comparative study of robustness of glycolytic flux in two different cells: yeast (S. cerevisiae) and pancreatic human beta-cell, whose enzymatic regulatory strategies differ. This computer model was implemented on Matlab and Jarnac. Overall, our results show that the use of computational tools and quantitative data may be used to create theoretical-quantitative models that help adressing theories about biological systems, as well as to extrapolate and tes new hypothesis, integrating the approach of computational modeling in the scientific research process Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Sara T. O. Saad Deissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Para que a terapia gênica seja aplicada à terapêutica clínica, é necessário o desenvolvimento de um sistema que permita a eficácia biológica e segurança no caso de efeitos tóxicos. O gene da eritropoetina (EPO) pode ser utilizado para o tratamento de anemias crônicas, porém estudos in vivo têm demonstrado que efeitos tóxicos, como trombose e policitemia fatal, são freqüentes devido ao descontrole da expressão da EPO e alta elevação do hematócrito (Hct). O objetivo deste estudo foi buscar um sistema capaz de induzir a apoptose de células transformadas com o gene da EPO, baseado na ativação artificial da caspase9, através de indutores químicos de dimerização (CIO), comparando este sistema ao do Tet-Off. Duas construções foram utilizadas: a primeira contendo o cDNA da EPO murina (pBS-mEpoD) sob o controle do sistema Tet-off (ptetTA) e o segundo contendo o cDNA da caspase9 ligado a duas moléculas de FKBP em tandem (iCasp9). As moléculas de FKBP contêm uma mutação F36V que permite a ligação específica do indutor químico de dimerização (CIO) AP20187, gentilmente cedido pela ARIAD Pharmaceutics (Cambridge, MA). Estudos in vitro mostraram que, em células murinas C2C12 transfectadas estavelmente, o vetor icasp9 apresentou expressão adequada e 90% das células entraram em apoptose após a administração do AP 20187. Os ensaios in vivo foram realizados, inicialmente, com 3 grupos de camundongos (11/grupo), que receberam '5mu¿p pBS-mEpoD , '0,5mu¿g ptet-tTA e diferentes concentrações de iCasp9: grupo 1: zero, grupo 2= '6mu¿g e grupo 3= '10mu¿ g. As injeções intramusculares foram seguidas de eletroporação (8 pulsos, 30mseg , 200V/cm, 1Hz). Após cinco semanas, os animais apresentaram aumento no Hct de 33% (Student T test p=0.0013), 36.8% (p=0.0004) e 12.8% (p=0.0374) nos grupos 1,2 e 3 respectivamente, sugerindo que a administração de '6mu¿g de icasp9 não altera a expressão do vetor pBSmEpoD, enquanto que '10mu¿g de iCasp9 reduz sua eficiência. Novo experimento foi realizado, onde 49 animais participaram do estudo, sendo que treze destes receberam as concentrações administradas ao grupo 1, acima descrito, e 36 receberam as concentrações do grupo 2. Através deste experimento, foi possível verificar a eficiência do sistema na elevação e sustentação do hematócrito, assim como comparar os sistemas iCasp9/AP20187 e Tet-Off, no controle da expressão da eritropoetina. ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: In order to apply gene therapy to clinical practice, it is necessary to develop a system establishing biological efficiency and safety in case of toxic effects.The erythropoietin gene (EPO) can be used in the treatment of chronic anemia, however in vivo studies have revealed that toxic effects, such as thrombosis and fatal polycythemia, are frequent due to uncontrolled EPO expression and a high increase in the hematocrit (Hct) levels.The aim of this study was to search for a system capable of inducing apoptosis in cells transformed by the EPO gene, based on the artificial activation of caspase-9, using chemical inducers of dimerization (CIO), comparing this system to Tet-Off. Two constructions were used: the first one containing the cONA of murine EPO (pBSmEpoO) under Tet-Off system (ptet-tTA) control and the second containing the cONA of caspase-9 connected to two FKBP molecules in tandem (iCasp9). The FKBP molecules contain a F36V mutation that permits a specific connection to the chemical inducer of dimerization (CIO) AP20187, kindly provided by ARIAO Pharmaceutics (Cambridge, MA). Studies in vitro demonstrated that, in stably transfected murine cells C2C12,the icasp9 vector presented and adequate expression and 90% of the cells entered apoptosis after AP20187 administration. The in vivo assays were performed, initially, with 3 groups of mice (11/group) that received '0,5mu¿g pBS-mEpoO, '0,5mu¿g ptet-tTA and different concentrations of iCasp9: group 1: zero, group 2='6mu¿g, and group 3='10mu¿g.The intramuscular injections were followed by electroporation (8 pulses, 30mseg, 200V/cm, 1Hz). After five weeks, the animais demonstrated a 33% increase in Hct (Student T test p=0.0013), 36.8% (p=0.OO04)and 12.8% (p=0.0374) in groups 1, 2, and 3 respectively, suggesting that the administration of '6mu¿g of icasp9 does not alter the pBS-mEpoO vector expression, although '10mu¿g of iCasp9 reduces its efficiency. A new assay was performed, the study involved 49 animais, thirteen of which received the same concentrations administered in group 1, described above, and 36 received the same concentrations as group 2. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Sara Terezinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Estímulo mecânico é um dos principais eventos envolvidos na hipertrofia cardíaca que afeta vários componentes de vias de sinalização do miocárdio. Recentemente, um novo transcrito altamente expresso em músculo cardíaco, denominado de ARHGAP21, foi descrito como um membro da família de proteínas Rho GAP, que demonstrou atividade catalítica sobre Cdc42 e interação com ARF1, ARF6 e a-catenina, proteínas importantes do remodelamento do citoesqueleto e junções aderentes. No presente estudo, tivemos como objetivo analisar a expressão da ARHGAP21 em resposta ao estresse mecânico agudo em corações de ratos adultos, e sua associação com FAK e PKC?. Utilizando-se fracionamento subcelular, microscopia confocal e eletrônica, demonstramos que ARHGAP21 relocaliza-se das regiões nucleares e miofilamentos para linhas Z, discos intercalares e costâmeros de cardiomiócitos submetidos à sobrecarga de pressão, sugerindo que esta roteína pode desenvolver uma importante função no remodelamento cardíaco. Além do mais, ensaio de imunoprecipitação mostrou que ARHGAP21 interage com PKC? e FAK em ratos controle, submetidos à coarctação da aorta e espontaneamente hipertensos (SHR). Três diferentes regiões de FAK, contendo cauda de GST acoplada, foram utilizadas em ensaio de ligação in vitro, demonstrando que ARHGAP21 se liga à porção carboxi terminal de FAK. Além disso, ARHGAP21 associa-se à PKC? fosforilada em Thr410 em o-imunoprecipitados de extratos protéicos de ratos controle e SHR. Entretanto, ARHGAP21 associa-se apenas à FAK fosforilada em Tyr925 em SHR. Também foi verificado que PKC? é fosforilada por estímulo mecânico. Estes resultados sugerem que ARHGAP21 pode atuar como uma molécula sinalizadora ou proteína adaptadora das vias de sinalização de FAK e PKC? em cardiomiócitos, provavelmente desempenhando importante função durante estresse cardíaco Abstract: Mechanical stimulus is one of the major events involved in cardiac hypertrophy, and affects components of essential myocardium signaling pathways. Recently, we described a highly expressed mRNA in the cardiac muscle as a member of the RhoGAP family of proteins, ARHGAP21, which demonstrated GAP activity over Cdc42 and interacted with ARF1, ARF6 and a-catenin important proteins of the cytoskeleton assembly and adherent junctions. In the present work, we aimed to analyze the expression of ARHGAP21 in response to acute mechanical stress in the adult rat heart and its association with FAK and PKC? proteins. By subcellular fractionation, confocal and immunoelectron microscopy, we demonstrated that ARHGAP21 is relocated from the nucleus to the plasma membrane, Z-lines and costameres of cardiomyocytes submitted to pressure overload conditions, suggesting that this protein may develop a role in cardiac remodeling. Furthermore, immunoprecipitation assay showed that ARHGAP21 interacted with PKC? and FAK in control rats, rats submitted to aortic clamping and spontaneously hypertensive rats (SHR). Using three different GST-tagged regions of FAK, we found that ARHGAP21 binds to the carboxyl terminal portion of FAK. Moreover, ARHGAP21 binds to PKC? phosphorylated on Thr410 in co-immunoprecipitates of protein extracts from sham control rats and SHR. However, ARHGAP21 only binds to FAK phophorylated on Tyr925 of SHR. We have also shown that PKC? is phosphorylated by mechanical stimuli. Altogether, these results suggest that ARHGAP21 may act as a signaling molecule or scaffold protein of FAK and PKC? signaling pathways in cardiomyocytes, probably developing an important function during cardiac stress Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: As proteínas da família MEF2 são fatores de transcrição do tipo MADS-box que desempenham papéis importantes na regulação da miogênese e da morfogênse do miocárdio. Trabalhos desenvolvidos no nosso laboratório anteriormente, demonstraram que a rápida ativação de MEF2 por estímulo hipertrófico exerce um papel principal na ativação de c-jun, sugerindo sua importância na regulação da expressão de genes de resposta imediata por estímulo hipertrófico. o presente trabalho teve como objetivo estudar a expressão e regulação dos fatores MEF2 frente à sobrecarga mecânica. Foi demonstrado que os fatores MEF2 são ativados em resposta à sobrecarga mecânica em coração de rato. Essa ativação não ocorreu por um aumento na expressão de MEF2, mas provavelmente, por alguma modificação póstranscricional na proteína, aumentando assim a afinidade ao seu DNA consenso em ensaio de EMSA o método de duplo-híbrido em levedura foi utilizado para encontrar proteínas que interajam com MEF2 e atuem na sua regulação em resposta ao estímulo mecânico. Numa triagem de biblioteca de coração de rato previamente submetido à coarctação da aorta com uma "isca" de MEF2C, foram encontrados 4 c1ones de cDNA contendo a região C-terminal de miosina de cadeia pesada e 4 c1onescontendo a região Nterminal da proteína regulatória Ki-1I57. A interação entre MEF2C e miosina foi confirmada por imunoprecipitação em coração de rato e a interação entre MEF2C e Ki-1I57 foi confirmada por imunoprecipitação, ensaio de co-precipitação e análise microscópica de imunolocalização. A interação entre MEF2 e Ki-1I57 é dependente de estímulo mecânico no coração. Um ensaio de imunoprecipitação com anticorpo anti-MEF2 demonstrou uma associação basal entre essas duas proteínas no ventrículo esquerdo de ratos controle. No entanto, o estímulo mecânico causou uma redução significativa nesta associação. Ki-l/57 se apresentou co-Iocalizado com MEF2 no núcleo de miócitos de ratos controle. Porém, ao submeter ratos a coarctação da aorta, essa co-Iocalização não foi mais observada no núcleo dos miócitos. Ki-1I57 também exerce um efeito inibitório sobre a ligação de MEF2 a sua região consenso de DNA em ensaio de EMSA Esses resultados sugerem que a interação de Ki-l/57 com :MEF2é inibitória e que esteja envolvida com a regulação de MEF2 em resposta ao estímulo mecânico no coração Abstract: The MEF2 proteins family is composed of MADS box transcription factors that plays important roles in the regulation of myogenesis and morphogenesis of myocardium. Previous work developed in our laboratory showed that the early activation of MEF2 proteins by mechanical overload plays a main role in the actívation of c-jun, suggestíng its importance in the regulation of irnmediate early genes response to mechanical overload The present work objective was to study the expression and regulatíon of MEF2 factors in face of mechanical overload. 1t was demonstrated that the MEF2 factors are activated in response to mechanical overload in rat heart This activation did not occur by an increase in MEF2 expression, but probably by some kind of post-transcriptíonal modification in the protein, raising the affinity ofMEF2 to its DNA in EMSA experiments. The yeast two-hybrid system was used to find proteins that interact with MEF2 and act in its regulation in response to mechanical overload In a rat heart library screening witb MEF2C as bait, four cDNA c1ones encoding a C-terminal region of Myosin Heavy Chain were isolated, as well as four c1ones encoding the N-terminaI region of the regulatory protein Ki-l/57. Tbe interaction between MEF2C and myosin was confirmed by irnmunoprecipitation in rat beart and the interactíon between MEF2C and Ki-1I57 was confirmed by immunoprecipitation, pull down assay and immunlocalization by laser confocaI microscopic analysis. The interactíon of :MEF2with Ki-l/57 is dependent on mechanical overload in the beart. An immunoprecipitation assay using anti-MEF2 antibody sbowed a basal association between these two proteins in left ventric1eof control rats. However, the mecbanical overload caused a significant reduction in this association. Ki-l/57 co-Iocalizes with MEF2 in the nuc1eusof myocytes of control rats. On the other hand, after submitting the animais to transverse aortic constriction, this co-Iocalization in the nucleus was no longer observed. Ki-1I57 also exerts an inhibitory effect upon MEF2C's DNA binding activity. These results suggest that the interaction between MEF2 and Ki-l/57 is inhibitory and that it may be involved in the regulation ofMEF2 in response to mechanical stimulus in the heart Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador : Lilian Maria de Castilho Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O sistema de grupo sanguíneo Diego é constituído por 21 antígenos localizados na glicoproteína banda 3 da membrana eritrocitária. Compreende 4 antígenos antitéticos Dia/Dib e Wra/Wrb e 17 antígenos de baixa incidência populacional. O fenótipo Dia resulta de uma mutação de ponto no nucleotídeo 2561 (T>C) que leva à substituição do aminoácid6 Prolina (Dib) para Leucina (Dia) na posição 854. O antígeno Dib é um antígeno de alta incidência na população geral, enquanto que o antígeno Dia é de baixa incidência em caucasianos, mas pode ser comum entre índios e japoneses. A mutação 166A>G no gene SLC4A1 (AE 1) que codifica a banda 3 dá origem a uma proteína variante, chamada banda 3-Memphis. Podem ser distinguidos dois tipos de banda 3 Memphis: variantes 1 e 11. A banda 3 Memphis II está associada a presença do antígeno Dia e apresenta maior afinidade de reação covalente com o H2DIDS do que a Memphis 1 e a banda 3 normal. De acordo com a literatura, o antígeno Dia está sempre associado a presença da banda 3-Memphis, caracterizando a variante Memphis 11. Entretanto, nenhum estudo de freqüência dos alelos DI A e 166G foi realizado até o momento. Com a finalidade de determinar a freqüência dos alelos DI A/DI B e da mutação 166A>G na população brasileira por métodos moleculares, estudamos 318 amostras de DNA de 4 diferentes populações (93 doadores voluntários de sangue, 71 descendentes de japoneses, 84 descendentes de africanos e 70 índios da tribo dos Parakanãs).Nossos resultados demonstraram que existe forte associação entre os alelos DI A e 166G e que o alelo DI A pode também ocorrer sem o alelo 166G. Em nosso trabalho foram identificadas 4 formas alélicas da associação DI / Memphis na população brasileira: alelo DI A 1 66A, DI A 1 66G, DI B166A e DI B166G . Os resultados da genotipagem 166A/G demonstraram que a banda 3-Memphis é um polimorfismo comum entre as populações estudadas. Devido a alta freqüência da mutação 166A>G encontrada, o alelo 166G pode ser considerado como um bom marcador genético de populações não miscigenadas e que o alelo 166G pode também ser considerado um protótipo do gene SLC4A1. Além disso, considerando a importância clínica dos antígenos Dia e Dib, a possibilidade em determinar os genótipos DI A/DI B, poderá contribuir substancialmente na segurança transfusional e materno-fetal Abstract: The Diego blood group system consists of21 antigens located on band 3 of the red blood cell membrane. It includes the 4 antithetical antigens Dia / Dib and Wra / Wrb, and 17 low incidence antigens. The Dia phenotype results from a point mutation at nucleotide 2561 (T>C) leading to a single amino acid substitution from Leu (Dia) to Pro (Dib) in position 854. Dib is a high incidence antigen while Dia has low incidence among Caucasians but is particularly common among American Indians and Japanese. The Memphis variants of band 3 result from a point mutation 166 A>G in SLC4Al leading to an amino acid substitution (56 Lys>Glu). There appears to be a strong association of Memphis (56Glu) with Dia (854Leu) among Native Americans. The initial aim of this study was to determine the frequency of Diego (DI A/DI B) and Memphis (166A>G) mutations in the Brazilian population. We studied samples from 70 Amazonian Indians, 71 individuals of Japanese descent, 93 regular blood donors and 84 Sickle Cell Disease patients by PCR-RFLP. PCR assays were designed to amplify a sequence of 149 bp from exon 18 (DI A/DI B alleles), and of 84 bp from exon 3 SLC4Algene that determine band 3-Memphis. Al1eles were identified by digestion of amplified products with the restriction enzymes Msp I to discriminate DI A from DI B in exon 18, and Mnl I to identify band 3-Memphis in exon 3. Both the DI A allele and band 3-Memphis had high gene frequency among Amazonian Indians (0.571 and 0,543, respectively). Unexpectedly, four Amazonian Indians had the DI A allele without the band-3 Memphis mutation Mestrado Clínica Médica Mestre em Clínica Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O presente estudo teve por objetivo a análise molecular de 28 pacientes não relacionados, atendidos no Hemocentro-UNICAMP, portadores de Esferocitose Hereditária (EsH) diagnosticada a partir de dados clínicos, esfregaço de sangue periférico e curva de fragilidade osmótica. Na maioria destes casos, a quantificação das proteínas de membrana das hemácias através da densitometria de gel de políacrilamida-SDS corado pelo azul de Coomassie, detectou deficiência de espectrina e/ou anquirina. O rastreamento de mutações foi feito através de SSCP e confirmadas por sequenciamento. Duas novas mutações foram encontradas em nossa população, ambas tratando-se de substituição de um nucleotídeo com alteração do aminoácido. A primeira no exon 9 (His -> Arg, CAC->CGC) e a segunda no exon 28 (lle->Thr ATC->ACC), totalizando uma frequência de 7.2% de mutações no gene da anquirina na população com Esferocitose Hereditária estudada. Foram também encontrados dois novos polimorfismos: no exon 6 (codon 197, CCG ->CCA) e no exon 29 (codon 1162, AGT -> AGC), além de outros polimorfismos já descritos, no exon 4 (codon 105, AAT->AAC), no exon 16 (codon 594, TCC -> TC A), e no exon 18 (codon 691, GGT -> GGC). Foi ainda realizada a análise da expressão de RNAm do gene da anquirina através de SSCP. Um paciente apresentou defeito na transcrição de um dos alelos, conforme evidenciado pela análise da repetição de nucleotídeos AC na região 3' não transcrita. Assim nossos dados indicam que, diferente da literatura, mutações no gene da anquirina podem não ser frequente em todas as populações Abstract: In this study, we carried out the molecular analysis of 28 unrelated patients seen at the Hemocentro-UNICAMP with Hereditary Spherocytosis diagnosed by clinical data, peripheral blood smear and osmotic fragility test. Spectrin and/or ankyrin deficiency was detected in these patients, by densitometry of SDS-PAGE stained by Coomassie blue. By SSCP and DNA sequencing, two novel mutations were identified: In exon 9 (His ->Arg, CAC->CGC) and in exon 28 (lle-*Thr ATC->ACC) totalizing a frequency of 7,2% of ankyrin mutations in the Hereditary Spherocytosis population studied. Two novel polymorphisms were also observed: in exon 6 (codon 197,CCG ->CCA) and in exon 29 (codon 1162, AGT -" AGC), besides other polymorphisms already described in exon 4 (codon 105, AAT -> AAC), exon 16 (codon 594, TCC -> TCA), and exon 18 (codon 691, GGT -> GGC). Expression of ankyrin mRNA by SSCP-PCR of the AC repeat at the 3'ut region showed, in one patient, a defect in the transcription of one allele. Then, our data indicated that ankyrin defects might be not frequent in all populations Mestrado Mestre em Ciências Médicas

Orientadores : Irene Lorand-Metze, Carmen Silvia Passos Lima Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Síndromes mielodisplásicas (SMD) são um grupo heterogêneo de doenças clonais caracterizadas por citopenias periféricas persistentes de uma ou mais linhagens e com possibilidade para transformação leucêmica. Níveis aumentados de apoptose nas células precursoras hematopoéticas (células CD34l foram observados em pacientes com SMD de baixo risco (AR e ARSA), sugerindo esse mecanismo como o responsável pela hematopoes e ineficaz nessa doença. A Amifostina (AMF) é considerada um agente citoprotetor, com ação antioxidante, potente estimulador da hematopoese normal e supressor apoptótico nos precursores mielodisplásicos. Analisamos a expressão dos marcadores da apoptose, (Fas e FasL) nas células CD34+ em pacientes com SMD de baixo risco, submetidos ao tratamento com a AMF. Foram estudados 17 pacientes, sendo 11AR e 6 ARSA. A resposta terapêutica em relação ao nível da hemoglobina, ao número de neutrófilos e às plaquetas, aos critérios de inclusão e às respostas foi definida pelo protocolo de tratamento da AMF. Dos 17 pacientes tratados, 10 apresentaram critérios de resposta em pelo menos uma série do hemograma após 2 ciclos de AMF, os quais receberam mais 4 ciclos adicionais. Quatro pacientes (3 não respondedores e um respondedor) apresentaram evolução da SMD (aumento de blastos medulares) durante ou após o tratamento. As atipias celulares na medula óssea (MO) e o número de células CD34+ diminuíram nos pacientes respondedores após o ciclo 2. No grupo dos não respondedores não houve alterações significativas em nenhum desses parâmetros. Os pacientes que responderam à amifostina tinham, antes do tratamento, uma percentagem menor de expressão de Fas e FasL nas células CD34+ e de linfócitos na medula óssea em relação aos que não responderam. A percentagem de linfócitos aumentou ainda mais após o tratamento neste último grupo. Esse resultado sugere que, no grupo que não respondeu à amifostina o sistema imune pode estar impedindo a resposta ao tratamento. Esses resultados favorecem a hipótese de que a resposta à AMF é influenciada pela expressão dos marcadores apoptóticos e/ou pela percentagem de linfócitos na MO. A resposta à AMF não depende apenas da supressão apoptótica. Um seguimento maior de pacientes é necessário para observar a durabilidadede resposta Abstract: Not informed. Mestrado Ciências Básicas Mestre em Clínica Médica

Orientador: Sara T. O. Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O Mercúrio (Hg) é empregado em diversas atividades humanas. A exposição primária ao metal ocorre através da alimentação contaminada e da liberação de mercúrio pelo amálgama dentário. A exposição ocupacional ao vapor de mercúrio, substância inodora e incolor, é hoje a via mais freqüente de intoxicação. O Hg associa-se fortemente aos grupamentos sulfidrilas (SH) presentes nas proteínas da membrana plasmática, enzimas, substâncias de baixo peso molecular, como a cisteína e glutationa, também pode formar ligações covalentes com o enxofre. Quando se liga aos eritrócitos, atua como um agente oxidante. O presente estudo teve o objetivo de avaliar o sistema antioxidativo eritrocitário através da medida da atividade da Superóxido Dismutase, Catalase e Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase e da concentração da Glutationa Reduzida nos seguintes grupos de trabalhadores: Grupo 1 (Expostos) - 16 trabalhadores, sendo 14 do sexo masculino e 2 do feminino, expostos ao vapor de Hg por um período variá~el de 0.5 a 8 anos (3.37 :I: 2.40) na faixa etária de 18 a 48 anos (32:1: 8.86), e que apresentaram concentração urinária de Hg de 1.6 a 35 (10.73:1: 9.88) 1l9/g creatinima. Grupo 2 (Afastados) - 7 trabalhadores do sexo masculino(M) trabalhadores com idade variando de 42 a 61 (46.42:1: 8.61) anos afastados da exposição ocupacional há pelo menos 6 meses e que ficaram expostos ao metal por um período de 4 a 10 anos, apresentaram uma concentração urinária do metal 5.0 -19.1 1l9/g creatinima. Grupo 3 (controle Normais) - constituídos de 8 técnicos e alunos (6 do sexo masculino e 2 do sexo feminino) do Departamento de Hematologia e Farmacologia da FCM-UNICAMP, com idade variando de 22 a 45 anos, possuidores de próteses dentárias conténdo Hg , não expostos ocupacionalmente ao metal. Nestes indivíduos não foi avaliada a concentração urinária do Hg. Em todos os grupos foi realizado hemograma completo e no G1 também levamos a efeito a análise da presença de corpos de Heinz. Nossos resultados demonstram que a atividade da SOD do G1 e G2 apresentou-se igual à do grupo G3. Por outro lado, a atividade da Catalase do G1 está aumentada sigmificativamente quando comparada ao G2 e teve uma forte tendência de aumento quando comparada ao G3. Já os níveis de GSH estiveram reduzidos significativamente no grup? G1, mas normal no G2, quando comparados ao G3. Assim os resultados apresentados neste trabalho indicam que níveis urinários de mercúrio dentro do Limite de Tolerância Biológica podem comprometer o sistema antioxidante eritrocitário Abstract: Mercury (Hg) is used in different human activities. The primary exposition to this metal has its origin from the ingestion of contaminated food and odontologic amalgam. The occupational exposure is the most frequent via in cantamination. Mercury tightly binds to sulfidric groups (SH) presenting cell membrane proteins, enzymes, and low molecular weight substances such as cistein and gluthation. It can form cavalent bonds with sulphur and acts as an oxidant agent when it binds to erythrocytes. The purpose of this study is to investigate the erythrocyte antioxidative system by measurement of Catalase, Superoxide Dismutase (SOD) , Gluthation (GSH) and Glicose-6-Phosphate Dehydrogenase activities in the following groups: Group 1 (EXPOSED)- 16 workers, 14 men and 2 women, exposed to mercury vapors over a period of 0.5 - 8 (3.37 :t 2.40) years. These individuais had 18-48 (32 :t 8.86) years and presented urinary concentrations of mercury lower than the Limit of Biological Tolerance (LBT) 35 - 1.6 (10.73 :t 9.88) ~g/g creatinin. Group 2 (No-EXPOSED)- 7 (M) workers with 42 - 61 ( 46.42 :t 8.61) years without occupational exposed ave r a period of 6 months. They were previously exposed to Hg for 4 to 10 years and presented urinary concentration of mercury of 5.0-19.1 ~g/g creatinin.' Group.3 (Normal controls)- composed by technicians and students, 6 men and 2 women, from the Department of Hematology and Pharmacalogy of the State University of Campinas, with 22 - 45 years. They had dental prothesis containing Hg and were not occupationally exposed to this metal. There were no urinary concentrations of mercury in these individuais. Hematologic analysis was carried out in ali the previous groups besides the detection of Heinz bodies. Our results demonstrate that the activity of SOD in exposed and non-exposed individuais presented the same values of the contrai group. Conversely the Catalase activity demonstrated an increasement in group 1 when compared with group 3 and a significantly augmented when compared to group 2. The levels of GSH were significantly reduced in group 1 and normal in group 2. We conclude that the urinary levels of mercury inside the Limit of Biological Tolerance can affect the erytrocyte antioxidant system Mestrado Mestre em Farmacologia

Orientador: Sara T. O. Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Os inibidores da enzima conversora da angiotensina 11 (o captopril e o enalapril) têm sido utilizados para reduzir a microalbuminúria, a proteinúria não ne&ótica e a proteinúria ne&ótica nos diabéticos, e nos portadores de estenose renal, arteriolone&oesclerose e insuficiência renal de outras etiologias. Esta redução se deve às alterações nas pressões dos fluxos renais, diminuíndo possívelmente o tono da arteríola eferente glomerular, reduzindo assim a pressão hidrostática intraglomerular. A abertura de novos capilares glomerulares redistribuiriam os fluxos plasmáticos renais, modificando a permeabilidade e seletividade das membranas basais, e o transporte das macromoléculas pelas células mesangiais. Estes fatores diminuiriam a expansão do mesângio e assim reduziriam a proteinúria, com melhora, algumas vezes, do quadro histológico. Este trabalho teve como objetivo avaliar a &equência de microalbuminúria em pacientes com doenças falciformes e o efeito do uso prolongado de inibidores da enzima conversora da angiotensina (ENALAPRIL) na concentração de albumina urinária desses pacientes. Para a pesquisa da &equência da albuminúria nas doenças falciformes, a medida da concentração de albumina urinária foi determinada por radioimunoensaio, em três amostras da primeira Urina do dia, coletadas com intervalo de 15 a 30 dias. Foram estudados 10 controles negróides normais e 56 pacientes portadores de.hemoglobinapatias S ( 42 SS, 10 SC, 4 S~) e desses 22 (19 SS, 2 se e 1 S~) apresentaram concentração de albumina urinária maior do que 30 mgll nas 3 amostras testadas. Para avaliação da resposta ao uso de enalapril, nove pacientes (8 SS, 1 S~) com concentração de albumina urinária anormal, receberam placebo (Complexo B) durante 60 dias e a seguir enalapril (Renitec@) 5mg ao dia por 180 dias ( 6 meses), e foram reavaliados a cada 15 ou 30 dias. Observamos que houve redução significativa da concentração de albumina urinária durante o uso da medicação (Renitec@), com normalização dos valores da albuminúria em 6 pacientes. Num paciente que abandonou o trabalho no terceiro mês de seguimento, observamos uma redução de 70% na albumina urinária em relação aos níveis pré-tratamento. Em 2 pacientes, cujos níveis da albumina urinária excederam o limite de sensibilidade do nosso método, não se observou redução concentração de albumina urinária. Dois anos após a suspensão da droga, a concentração de albumina urinária se manteve nos níveis normais em 2 pacientes; em 2 doentes, voltou aos valores pré-tratamento, e nos demais indivíduos que participaram do estudo, assim como em 2 indivíduos que não utilizaram a droga, houve aumento da concentração de albumina urinária em relação aos níveis iniciais. o clearance de creatinina e lítio, fração de excreção de sódio, potássio e lítio, assim como o sódio e o potássio sérico, não se alteraram durante o uso do enalapril. Entretanto houve redução da pressão arterial média (70,4:t 5,5 mmHg x 61,7:t 3,4 mmHg P = 0,004). Nossos resultados demonstram que o enalapril reduz a concentração de albumina urinária nos pacientes com anemia falciforme. Entretanto, após a suspensão da medicação, a albumina urinária pode aumentar. Estudos prospectivos de longa duração são necessários para avaliar se o uso dos inibidores da enzima conversora da angiotensina pode retardar o desenvolvimento da insuficiência renal crônica em pacientes com doenças faIciformes Abstract: The angiotensin - converting enzyme inhibitor (captopril and enalapril) are able to reduce albuminuria and proteinuria in patients with diabetic nephropathy as well as proteinuria in patients with renal disease of various origins. The reduction. of proteinuria is most likely related to decreased renal vascular resistance, particularly in postglomerular arterioles, which results in a fali in intraglomerular capillary pressure. The purpose of this study was to determine the prevalence of microalbuminuria and to evaluate the effects of enalapril, an angiotensin - converting enzyme inhibitor, on albuminuria associated with sickle cell anemia. The microalbuminuria was measured by radioimmunoassay. The urine samples were collected on three separate occasions at intervals of 15 to 30. days. The study included 42 patients with sickle cell anemia (SS), 10. patients with hemoglobin SC disease (SC), 4 patients with S~ thalassenrnia (S~) and 10. normal controls. Nineteen SS patients (45%) and 2 SC (20.%) and 1 S~ (25%) patients presented mean urinary albumin excretion above normal values (30. mg/l). Nine patients with sickle cell anemia and albuminuria received B complex for 60. days and after tha~, they took oral enalapril (Renitec@) 5 mg daily for 180. days. Ali measurements were repeated every 15 to 30. days. Enalapril reduced in 6 patients, the pretreatment hyperalbuminuria to normal values and one patient had a 70. % reduction. In two patients it was not possible to demonstrate a variation in the albuminuria because the values were above the limit of detection by our method. Two years after enalapril was discontinued, we repeated ali measurements in 6 patients who had received the drug and in 2 sickle cell anemia patients who presented hyperalbuminuria, but did not participate in the study. Urinary albumin concentration increased in all individuais, except for 4 patients who had received enalapril. The urinary albumin concentration retumed to pretreatment levels in 2. The other 2 still had values below 30. mg/l. There were no change in sodium, potassium or creatinine levels and fractional excretion of sodium, potassium, and lithium during the treatment. Mean arterial pressure decreased by 8,6 :f: 0.,42 mm Hg. Qur results demonstrate that enalapril reduced albuminuria in patients with sickle cell anemia. After discontinuation ofthe drug, howéver, the albuminuria may increase to pretreatment levels or higher. Whether the reduction in urinary albumin concentration by angiotensin converting enzyne inhibitors can delay the developrnent of progressive renal failure in sickle cell anemia patients rernains to be established. Mestrado Medicina Interna Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Não há consenso quanto à terapia para pacientes idosos com leucemia aguda, pois são inelegíveis às terapias agressivas como a quimioterapia e o transplante de medula óssea. Tal fato demonstra a necessidade da busca de compostos mais eficazes e com menos efeitos adversos. Os polifenóis são compostos importantes, que têm se destacado nos últimos anos e está distribuído em muitos chás. A (-)-Epigalocatequina-3-gallato (EGCG) é o principal polifenol presente no chá verde, e tem demonstrado atividade em inibir a formação e o crescimento de tumores em diferentes modelos animais de câncer humano. Esta inibição é associada com a diminuição da proliferação, aumento da apoptose e a supressão da angiogênese. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da EGCG no tratamento da leucemia mielóide aguda utilizando como modelo experimental camundongos PML/RAR? que desenvolvem um tipo de leucemia mielóide aguda tipo M3. A análise hematológica relevou que o tratamento com EGCG reverteu a leucocitose, anemia e plaquetopenia dos animais. A redução de células leucêmicas, como um aumento de neutrófilos também foram detectados no sangue periférico. Notavelmente, a EGCG reduziu as células leucêmicas (CD45+CD34+ e CD45+CD117+) na medula óssea enquanto aumentou as células mieloides maduras (Gr-1+CD11b+) possivelmente devido à diferenciação celular. A apoptose, no entanto, não foi detectada nas células totais da medula óssea, porém o tratamento induziu a apoptose nas células totais do baço. Além disso, um aumento significativo na produção intracelular de ROS foi detectado nas células leucêmicas e nos neutrófilos (CD45+Gr-1+) da medula óssea. O ROS pode induzir a apoptose através da perda do potencial transmembrana mitocondrial e ativação de caspases. Além disso, altos níveis de ROS podem induzir a diferenciação de células leucêmicas. Observamos ainda que EGCG aumentou de forma significativa a sobrevida dos animais. Tomados em conjunto, os resultados demonstram que a EGCG é eficaz no tratamento de leucemia mielóide aguda, seja por diminuição de proliferação celular, aumento da apoptose ou da diferenciação, sugerindo que a EGCG, associada ou não a quimioterápicos, possa ser uma estratégia para o tratamento das leucemais meilóides agudas Abstract: There is no consensus regarding therapy for older patients with acute leukemia, as they are ineligible for aggressive therapies such as chemotherapy and bone marrow transplantation. Thus, the search for effective compounds with less adverse effects is required. Polyphenols are major compounds which have been attracting attention over the last years and are distributed in many teas. (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), the major polyphenol present in green tea, has been shown to inhibit tumor formation and growth in different animal models for human cancer. The inhibition is associated with decreased cell proliferation, increased apoptosis and suppression of angiogenesis. The aim of this study was to evaluate the effects of EGCG in the treatment of acute myeloid leukemia using PML/RAR? mice as an experimental model that develops a type of acute myeloid leukemia type M3. Hematological analysis revealed that the treatment with EGCG reversed leukocytosis, anemia and thrombocytopenia. A reduced number of undifferentiated cells and an increase of neutrophils were also detected in peripheral blood. Notably, EGCG also reduced the expression of leukemic cells (CD45+CD34+ and CD45+CD117+) in the bone marrow while increasing mature myeloid cells (Gr-1+/Mac-1+) possibly due to cellular differentiation. Apoptosis however, was not detected in the bone marrow cells, despite the fact that EGCG treatment induces apoptosis of total spleen cells. In addition, a significant increase in reactive oxygen species (ROS) production was detected in leukemic cells (CD45+CD34+ and CD45+CD117+) and Gr-1+ cells bone marrow. ROS induces apoptosis through the loss of mitochondrial transmembrane potentials and activation of caspase. Moreover, excess of ROS might also induce differentiation of myeloid leukemic cells to mature cells. We further observed that EGCG treatment significantly increased the survival of APL mice. Taken together, our results demonstrate that epigallocatechin-3-gallate is effective in the treatment of acute myeloid leukemia, either by decreasing proliferation, increasing apoptosis or differentiation, suggesting that EGCG, associated or not with chemotherapeutics, may be an interesting strategy for the treatment of acute myeloid leukemias Mestrado Clínica Médica Mestre em Ciências CAPES 3370/2017 FAPESP 11/51959-0 CNPQ

Orientadores: Antonio Sergio Ramalho, Sara T. O. Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Doutorado Genética Doutor em Ciências Biológicas

Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Irene Lorand Metze Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A inativação de genes supressores de tumores cujos produtos exercem uma influencia inibitória na progressão do ciclo celular pode levar ao processo de malignização. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Inactivation of tumor suppressor genes, whose products exert an inhibitory influence on cell cycle progression, can lead to neoplastic transformation. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic document Doutorado Genética Doutor em Ciências

Orientadores: Sara T. O. Saad, Carlos Lenz Cesar Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Lasers têm sido uma ferramenta cada vez mais utilizada na área da Biologia Celular e Medicina para medidas, diagnóstico e manipulação. Dentre essas utilizações destaca-se o trabalho pioneiro de A. Ashkin e colaboradores em 1986 que demonstraram o uso de uma técnica baseada na transferência de momentum dos fótons para capturar partículas dielétricas. Logo a seguir eles utilizaram essa técnica para capturar e manipular partículas biológicas com tamanhos variando de décimos a centenas de micra, demonstrando, desta forma, que este sistema funciona como uma "pinça óptica" para realizar manipulações intra e extracelulares sem causar prejuízo algum ao organismo vivo. Neste trabalho, a pinça óptica foi empregada para a análise do comportamento mecânico de hemácias normais, portadoras de hemoglobina 5 (homozigotos e heterozigotos) no estado normal e em crise falcêmica, esferocitose hereditária e anemia ferropriva. Foi ainda estudada a ação da hidroxiureia na reologia dos eritrócitos, da irradiação gama e da heterozigose para hemoglobina 5 em células estocadas em bolsas de doação de sangue. As análises foram feitas com um feixe de laser fortemente focado por uma objetiva de x100 de um microscópio, acoplado a um sistema de vídeo utilizado para gravar as imagens e posteriormente envia-Ias para análise em um computador. Pelo menos 20 células de cada participante foi pinçada pelo laser e arrastada contra plasma humano AS + com viscosidade conhecida em 6 velocidades constantes variando de 150 J.1m1s a 250J.1m1s (150, 170, 190, 210, 230, 250J.1m1s). A análise da deformação celular em razão da velocidade nos permitiu ter uma visão da elasticidade celular. A pinça óptica apresenta uma vantagem em relação as técnicas comumente utilizadas para aferir a deformabilidade celular, a análise das células é individual, levando em consideração a interação do citoplasma e da membrana. Os resultados sugerem que alterações na membrana da hernácia ou da hemoglobina causam um distúrbio no comportamento mecânico normal dos eritrócitos,. tomando-os mais rígidos, algumas vezes ultrapassando a capacidade de medida da metodologia. Com a pinça foi possível caracterizar a ação da HU no comportamento mecânico das células HbSS. A metodologia de pinça óptica pode ser muito útil para se verificar o efeito de outras drogas na deformabilidade de hemácias normais ou em pacientes com alterações da hemoglobina ou da membrana celular e também, estudar o efeito de diferentes conservantes para estocagem de hemácias Abstract: The deformability of erythrocytes is a critical determinant of blood flow in microcirculation. By capturing red blood cells with optical tweezers and dragging them through a viscous fluid we were able to measure their overall elasticity. Laser optical tweezers, based on photon momentum transfer, have been used successfully in a variety of biological applications. This technique is capable of measuring the whole red blood cell elasticity and viscosity. The optical trap was performed with a Nd:YAG laser strongly focused in a microscope connected to a CCD camera. A computer captured the images, where they were quantitatively and qualitatively analyzed. The elasticity measurement was obtained by dragging the RBC with the optical tweezers through the plasma fluid with a known viscosity. It should be pointed out that the laser does not exert any pressure or photo-damage on the cell. The analysis of the cell deformation vs velocity allowed us to obtain cell elasticity expressed in dyn/cm. The model we used to extract the values for the membrane elasticity and viscosity assumed that the cell is a parallelepiped with length lo, width W and negligible thickness which is located at distance Z1 trom the bottom of the Neubauer chamber and Z2 trom the cover slip. We assumed that the elastic response to an applied force is given by F=J.1(WILo)~L, where F is the force, J.1 is the elasticity and ~L is the cell length deformation. We assumed a drag force F given by F=TI(Wl.o(kq)V, where TI is the plasma viscosity, (1/Zeq)= (11Z1)+ (11Z2) and Vis the drag velocity. The equilibrium occurs when one force cancels the other. Therefore the elongation ~L as a function of drag velocity is given by ~L= (Tllo 1(J.1Zeq)] V, which can be used to extract a value for J.1 provided by the plasm viscosity TI, length lo and Zeq which are easily measured. We measured, and compared, the red blood cell deformability trom normal contrais (HbAA) , patients with: homozygous (HbSS) and heterozygous (HbAS) sickle hemoglobin, HbSS subjects on sickling crisis, hereditary spherocytosis and with iron deficiency anemia. We also studied ,the action of hydroxyurea on rheologic behavior of HbSS cells, the gamma irradiation and the heterozygosis for sickle hemoglobin on cells storage on blood donation bags. Our results showed that the red blood cell deformability was significantly lower in HbS subjects (HbSS and HbAS) , except for HbSSIHU cells, whose deformability was similar to the normal controls. Our data showed that the laser optical tweezers technique is able to detect differences in HbS red blood cells trom subjects taking hyd,roxyurea as well as to differentiate red blood cells trom normal controls and HbAS, indicating that this is a very sensitive method and can be applied for detection of drug-response in sickle cell disease. The sensitivity of the laser optical tweezers method showed that there is no significant change in elasticity over time up to 14 days of storage, regardless of whether the unit was irradiated or not. However, beyond 21 days of storage, irradiated units demonstrate decreased elasticity. RBCs elasticity trom AS units stored for 1, 14 and 21 days presented significantly lower elasticity when compared to HbAA cells stored for the same period. Mostly of RBcs trom HbAS units stored for 28 and 35 days, Hereditary spherocytosis cells and sickle crisis cells were very rigid or escaped trom the optical trapo So these cells did not stay in the trap when the velocities were increased. Hence, the accuracy of elasticity measurement was impaired. Doutorado Clínica Médica Doutor em Clínica Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Doutorado Genética Humana e Medica Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: José Butori Lopes de Faria Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O estresse oxidativo é um dos mecanismos subjacentes mais importantes na patogênese da proteinúria em pacientes diabéticos. A epigalocatequina galato é uma substância que se mostrou efetiva na redução do estresse oxidativo e da doença renal em estudos pré-clínicos. Além disso, a redução na atividade da AMPK foi proposta como o ponto crítico na fibrose renal em modelos experimentais de DRC. A metformina foi capaz de melhorar a doença renal e reduzir a fibrose em estudos pré- clínicos de DRC, quando administrada antes ou no momento do insulto renal. Na presente série de estudos, propusemos investigar o efeito do polifenon E (epigalocatequina galato) na albuminúria de pacientes diabéticos com nefropatia e possível mecanismo envolvido. Investigamos, ainda, se a metformina é capaz de reduzir a progressão da DRC já estabelecida em ratos submetidos à nefrectomia subtotal 5/6 (Nx) e se tal efeito está associado à ativação da AMPK. Os estudos foram descritos nos seguintes artigos publicados: Artigo 1- Os pacientes foram randomizados para 2 grupos: polifenon E (contendo 800 mg de epigalocatequina galato) e placebo. Após 12 semanas de tratamento, o polifenon E reduziu a albuminúria em 41%, enquanto no grupo placebo foi observado aumento de 2% (p = 0,019). A apoptose dos podócitos (p = 0,001) e a permeabilidade da albumina in vitro (p < 0,001) foram maiores em podócitos humanos imortalizados expostos ao plasma de indivíduos diabéticos em comparação aos podócitos tratados com plasma de indivíduos normais. Neste artigo, concluímos que a administração de polifenon E reduz a albuminúria em pacientes diabéticos com dose máxima recomendada de inibidores do sistema renina- angiotensina (SRA). A ativação da via Wnt e a consequente redução na apoptose dos podócitos pode ter contribuído para tal efeito. Artigo 2 - Ratos machos Munich-Wistar adultos foram submetidos às cirurgias de nefrectomia subtotal 5/6 (Nx) ou sham. Trinta dias após a cirurgia, os ratos Nx que apresentavam pressão arterial sistólica > 170 mmHg e níveis de albuminúria >40mg/24h foram randomizados para 3 grupos: Sham, Nx e Nx + metformin (300mg/Kg/dia). Após 60 dias de tratamento, não observamos diferenças nos parâmetros da doença renal entre os ratos tratados com metformina e os não tratados. No entanto, após 120 dias, os ratos Nx tratados com metformina apresentaram reduções significativas nos níveis de albuminúria e em marcadores de fibrose renal. Esses efeitos foram independentes de quaisquer outros efeitos sobre a pressão arterial ou a glicemia. O tratamento com metformina também foi capaz de ativar a AMPK renal e, portanto, melhorar a biogênese mitocondrial. Concluímos que a metformina pode interromper a progressão da doença renal estabelecida no modelo Nx, provavelmente, via ativação da AMPK. Em resumo, a presente tese fornece evidências de que o Polifenon E, associado aos inibidores do SRA, é capaz de reduzir a albuminúria de pacientes com nefropatia diabética e de que tal efeito pode ser devido à ativação da via Wnt, com consequente redução na apoptose de podócitos. Adicionalmente, a metformina reduz a fibrose renal em ratos Nx e doença renal estabelecida, possivelmente pela ativação da AMPK Abstract: Oxidative stress is one of the most important underlying mechanisms in the pathogenesis of proteinuria in diabetic patients. The epigallocatechin gallate is a substance that has been shown to be effective in reducing oxidative stress and kidney disease in preclinical studies. In addition, the reduction in AMPK activity has been proposed as a mechanism involved in renal fibrosis in experimental models of chronic kidney disease (CKD). Metformin was able to improve kidney disease and reduce fibrosis in preclinical studies of CKD, when administered before or at the time of renal insult. In the present series of studies, we proposed to investigate the effect of polyphenon E (epigallocatechin gallate) on albuminuria in diabetic patients with nephropathy and to investigate the possible mechanism involved. We furthermore investigated whether metformin is able to reduce the progression of CKD already established in rats submitted to 5/6 subtotal nephrectomy (Nx) and whether this effect is associated with AMPK activation. The studies were described in the following published articles: Article 1 - Patients were randomized to two groups: polyphenon E (containing 800 mg of epigallocatechin gallate) or placebo. After 12 weeks of treatment, polyphenon E reduced albuminuria by 41%, while in the placebo group an increase of 2% was observed (p = 0,019). Apoptosis of podocytes (p = 0,001) and permeability to albumin in vitro (p < 0,001) were greater in immortalized human podocytes exposed to the plasma of diabetic individuals compared to podocytes treated with plasma from normal individuals. In this article, we concluded that the administration of polyphenon E reduces albuminuria in diabetic patients who receive the maximum recommended dose of renin-angiotensin system inhibitors. The activation of the Wnt pathway and the consequent reduction in apoptosis of podocytes may have contributed to thiseffect. Article 2 - Adult male Munich-Wistar rats underwent 5/6 subtotal nephrectomy (Nx) or sham surgery. Thirty days after surgery, Nx rats with systolic blood pressure> 170 mmHg and albuminuria levels> 40 mg / 24 h were randomized into three groups: Sham, Nx and Nx + metformin (300mg/Kg/day). After 60 days of treatment, we found no differences in renal disease parameters between rats treated with metformin and untreated rats. However, after 120 days, Nx rats treated with metformin showed significant reductions in albuminuria levels and in renal fibrosis markers. These effects were independent of any other effects on blood pressure or blood glucose. In addition, metformin treatment was also able to activate renal AMPK and therefore improve mitochondrial biogenesis. We conclude that metformin can halt the progression of kidney disease established in the Nx model, probably via AMPK activation. In summary, the present thesis provides evidence that Polyphenon E associated with RAS inhibitors is able to reduce albuminuria in patients with diabetic nephropathy and this effect may be secondary to the activation of the Wnt pathway with a consequent reduction in podocyte apoptosis. Additionally, metformin reduces renal fibrosis in Nx rats and established kidney disease, possibly by activating AMPK Doutorado Clínica Médica Doutora em Ciências FAPESP 2014/22687-0

Orientador : Mary Luci de Souza Queiroz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Neste trabalho, dando prosseguimento a estudos prévios realizados em nosso laboratório investigamos os efeitos do composto diciclopentadienildiclorotitânio IV, DDCT, (15 mg/kg/dia/ dois dias) sobre a capacidade funcional das células ¿natural killer¿ (NK) e a produção das citocinas do perfil Th1 [interleucina (IL)-2 e interferon-g (IFN-g)] e do perfil Th2 (IL-4 e IL-10) de animais normais e portadores do tumor ascítico de Ehrlich (TAE). Além disso, para efeito comparativo, acrescentamos ao nosso estudo o diciclopentadienilditiocianatotitânio IV, BCDT, o qual é um derivado do DDCT com substituições dos radicais halogênios do DDCT por pseudo-halogênios. Com o composto BCDT, além dos parâmetros imunológicos acima mencionados, avaliamos, os efeitos do tratamento com uma, duas e três doses de BCDT (10, 15 ou 30 mg/kg/dia) sobre o crescimento e diferenciação de precursores hematopoiéticos [Células formadoras de colônias de granulócitos/macrófagos (CFU-GM)], de animais normais e portadores do TAE, os quais foram previamente realizados com o DDCT. Nestes animais, avaliamos ainda a celularidade da medula óssea, a presença de fatores estimuladores de colônias hematopoéticas (CSFs ) e a sobrevida. Nossos resultados demonstraram uma maior eficácia do composto DDCT em relação ao BCDT. No entanto, apesar das diferenças encontradas, verificamos que estes titanocenos compartilham a habilidade de regular positivamente os desequilíbrios hematopoiéticos e imunológicos envolvidos na evolução temporal do TAE. Como já esperado, o TAE produziu, concomitante à mielossupressão, um aumento no número de CFU-GM esplênico e uma diminuição da celularidade da medula óssea. O tratamento dos animais portadores do TAE com o BCDT produziu, de forma dose-dependente, paralelamente a um aumento na sobrevida, um aumento da mielopoiese, uma redução no número de colônias esplênicas e uma restauração no número total e diferencial da medula óssea. A maior eficácia foi encontrada com a dose de 10 mg/kg/dia/ três dias, a qual, em animais normais, produziu melhor recuperação no número de CFU-GM na medula óssea e estimulou a produção de CSFs. Efeitos tóxicos foram observados nas maiores doses do composto associado à presença de hematopoiese esplênica e uma menor sobrevida dos animais. Quanto à produção das citocinas, o tratamento com os compostos impediu a polarização Th1-Th2 encontrada nos animais portadores do TAE. Neste sentido, o tratamento destes animais com o DDCT (15 mg/kg/dia/por dois dias) ou com o BCDT (10 mg/kg/dia/por 3dias), aumentou os níveis de secreção de IL-2, regulou positivamente a secreção atípica de IFN-g e reduziu os níveis de IL-10 aumentados durante a evolução temporal do TAE. O estudo da atividade funcional das células NK em animais portadores do TAE e tratados com os titanocenos demonstrou, especialmente com o DDCT, um aumento na capacidade citotóxica das células NK, a qual se encontrava reduzida. Estes resultados são encorajadores, uma vez que favorecem a utilização dos titanocenos em combinações terapêuticas com outros quimioterápicos visando reduzir a mielotoxicidade e suplementar a eficácia tumoricida destes agentes Abstract: In this work, as a continuation of previous studies in our laboratory, we investigated the effects of the titanocene dicyclopentadienyldichlorotitanium IV compound, DDCT, (15 mg/kg/day/ per two days) on the natural killer cell activity (NK) and on Th1 [interleukin (IL)-2 and interferon-g (IFN-g)] and Th2 (IL-4 and IL-10) responses in normal and Ehrlich ascites tumor (EAT)-bearing mice. Moreover, for comparative effect, we also studied the dicyclopentadienylditiocianatetitanium IV, BCDT. The structural difference between these compounds is the substitution of the halides halogens present in DDCT by pseudo halogens in BCDT. With the BCDT compound, besides the immunological parameters mentioned above, we evaluated the effect of the treatment using one, two or three doses of BCDT (10, 15 or 30 mg/kg/day) on the growth and differentiation of granulocyte-macrophage progenitor cells [colony-forming units of granulocyte-macrophage (CFU-GM)], of normal and EAT-bearing mice. As studied previously with the DDCT compound, we also evaluated the bone marrow cellularity, the presence of colony stimulating factors (CSFs) and survival of these animals. Our results demonstrated that the DDCT compound is more effective than the BCDT one. In despite of the differences found, we observed that these compounds share the ability of regulating positively the hematopoietic and immunologic unbalance during the EAT evolution. As expected for the EAT-model, concomitant myelosuppression, increased number of spleen CFU-GM and changes in bone marrow cellularity were observed. The treatment of EAT-bearing mice with BCDT produced a dose-dependent increase in myelopoiesis, a reduction in splenic colonies and a restoration of the total and differential marrow cell counts. In addition, BCDT treatments also increased the survival of these animals. The most effective dose schedule was 10 mg/kg/day/per three days, which, in normal animals, also produced increased bone marrow CFU-GM numbers along with a CSF production boost. High doses of BCDT cause toxic effects and induced extramedular hematopoiese. Regarding the production of cytokines, the treatment with the titanocene compounds blocked the Th1-Th2 polarization found during the EAT progression. In this respect, the treatment of these animals with DDCT (15 mg/kg/day/per two days) or BCDT (10 mg/kg/day/per three days) increased the IL-2 levels, regulated the atypical IFN-g secretion positively and reduced the levels of IL-10, increased during the temporal evolution of EAT. In relation to the functional activity of NK cells, the treatment with both compounds enhanced the NK cell function, reduced during the EAT growth. Only the DDCT compound rescued to normal values the activity of NK cells. These up-modulatory effects demonstrated in this study, specially using the DDCT compound, indicated a new aspect of the antitumoral action mechanism of the titanocenes. Thus, it is encouraging, in this context, to consider these compounds for combination chemotherapy, protecting the host from hematotoxicity as well as supplementing tumoricidal efficacy Doutorado Doutor em Farmacologia

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A interação entre as células-tronco hematopoéticas (HSCs) e o microambiente da medula óssea (MO) é essencial para a regulação da hematopoese; e a interação entre as células leucêmicas e o microambiente é essencial para a leucemogênese. O microambiente é composto por diversos tipos celulares como: células endoteliais, osteoblastos e células mesenquimais estromais (MSCs). As células leucêmicas são capazes de modificar a interação com as MSCs e promover a leucemogênese. Nosso grupo de pesquisa identificou, por ensaio de microarranjo, a hiperexpressão do fator de crescimento vascular endotelial A (VEGFA) em células CD34+ e a hiperexpressão de Semaforina 3A (SEMA3A) em MSCs da MO de pacientes com síndrome mielodisplásica (SMD) do tipo ARSA. VEGFA é o fator pró-angiogênico mais estudado, está aumentado em pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) e correlaciona-se com pior prognóstico. SEMA3A é uma proteína secretada que parece ter efeitos antiangiogênicos em tumores sólidos. A competição entre VEGFA e SEMA3A pelo receptor neuropilina 1 (NRP1) tem sido discutida. O objetivo desse estudo foi entender a interação entre VEGFA e SEMA3A na MO de pacientes com SMD e LMA e sua função na patogênese. Para investigar a expressão gênica de VEGFA em células CD34+, recrutamos 18 pacientes com SMD e 16 com LMA e descrevemos, por RT-PCR, aumento da expressão de VEGFA em pacientes com LMA de novo comparado ao grupo controle (5,06 [0,42¿57,52] vs 1,00 [0,8¿2,19], P=0,0073). Para investigar a expressão gênica de SEMA3A em MSCs, recrutamos 25 pacientes com SMD e 17 com LMA e encontramos aumento da expressão de SEMA3A em todas as amostras comparando ao grupo controle: SMD de baixo risco (2,97 [0,64¿24,39] vs 0,83 [0,43¿2,86], P=0,028); SMD de alto risco (9,50 [2,34¿22,60] vs 0,83 [0,43¿2,86], P=0,005); LMA secundária (3,07 [0,97¿6,97] vs 0,83 [0,43¿2,86], P=0,05) e LMA de novo (5,73 [1,10¿28,21] vs 0,83 [0,43¿2,86], P=0,007). Para investigar os efeitos de VEGFA em células CD34+ normais e em células leucêmicas, nós hiperexpressamos VEGFA em células leucêmicas KG1 e células CD34+ de sangue de cordão umbilical. A hiperexpressão de VEGFA aumentou a viabilidade de células KG1 (124,4± 23,03% vs 100± 0,62%; P=0,03) e de células CD34+ (159,6± 41,2% vs 102,5 ± 16,93%; P=0,045); e a proliferação de células KG1 (107,7± 2,82%; P=0,042) e de células CD34+ (134,0± 7,68%; P=0,047); comparado ao controle. Para estudar a interação entre VEGFA e SEMA3A, hiperexpressamos SEMA3A em células HS5 e realizamos ensaios de cocultura. A cocultura de células KG1 ou CD34+ hiperexpressando VEGFA com células HS5 aumentou a proliferação (176,9± 46,34%; P=0,045) de células KG1 de células CD34+ (131,8± 7,9%; P=0,02). A cocultura de células KG1 ou CD34+ com células HS5 hiperexpressando SEMA3A diminuiu a proliferação (93,15± 0,79%; P=0,004) de células KG1; e de células CD34+ (72,73± 4,72%; P=0,009). Quando combinamos a hiperexpressão de VEGFA e de SEMA3A, os efeitos de SEMA3A são dominantes. Para investigar se o efeito dominante de SEMA3A está relacionado a competição por NRP1, realizamos ensaio de imunoprecipitação utilizando células HS5 e KG1 tratadas com as proteínas recombinantes VEGFA e SEMA3A. No tratamento combinado das duas proteínas recombinantes, há maior formação de complexos entre os receptores Plexina A4 e NRP1, favorecendo a sinalização de SEMA3A. Nossos resultados sugerem que a hiperexpressão de VEGFA confere vantagens às células leucêmicas, aumentando a proliferação, e que SEMA3A parece anular os efeitos causados por VEGFA. Portanto, acreditamos que o uso de inibidores de VEGFA combinado com a proteína SEMA3A pode ser benéfico no tratamento dos pacientes Abstract: The cross-talk between hematopoietic stem cells (HSCs) and the bone marrow (BM) microenvironment is essential for hematopoiesis regulation; and the cross-talk between leukemic stem cells (LSCs) and the bone marrow (BM) microenvironment is essential for leukemogenesis. The BM microenvironment compromises several cellular types such as endothelial cells, osteoblasts and mesenchymal stromal cells (MSCs). LSCs are capable of modifying the interaction with MSCs and promoting leukemogenesis. Our group performed a microarray assay and identified VEGFA overexpression in CD34+ cells and SEMA3A overexpression in MSCs from bone marrow of myelodysplastic syndrome RARS patients. VEGFA is the most studied angiogenic factor; is increased in acute myeloid leukemia (AML) patients, and correlates with a worse prognosis. SEMA3A is a secreted protein that appears to have antiangiogenic effects in solid tumors. A competition between VEGFA and SEMA3A for the neuropilin 1 (NRP1) receptor binding has been reported. The aim of this study was to reach a better understanding of VEGFA and SEMA3A interaction in the bone marrow of MDS and AML patients and the role of this interaction in pathogenesis. To investigate VEGFA expression in CD34+ cells, we recruited 18 MDS and 15 AML patients and described, by RT-PCR, increased VEGFA expression in de novo AML patients compared to the control group (5.06 [0.42¿57.52] vs 1.00 [0.8¿2.19], P=0.0073). To investigate SEMA3A expression in MSCs, we collected 25 MDS and 17 AML bone marrow samples and we found increased SEMA3A expression in all samples compared to the control group: low-risk MDS (2.97 [0.64¿24.39] vs 0.83 [0.43¿2.86], P=0,028); High-risk MDS (9.50 [2.34¿22.60] vs 0.83 [0.43¿2.86], P=0.005); secondary AML (3.07 [0.97¿6.97] vs 0.83 [0.43¿2.86], P=0.05) and de novo AML (5.73 [1.10¿28.21] vs 0.83 [0.43¿2.86], P=0.007). In order to investigate VEGFA effects in AML cells and CD34+ normal cells, we overexpressed VEGFA in KG1 leukemic cells and in CD34+ from umbilical cord blood. The VEGFA overexpression increased KG1 (124.4± 23.03% vs 100± 0.62%; P=0.045) and CD34+ cells (159.6± 41.2% vs 102.5 ± 16.93%; P=0.042) viability; and KG1 (107.7± 2.82%; P=0.042) and CD34+ cells (134.0± 7.68%; P=0.047) proliferation compared to control cells. In order to investigate the interaction between SEMA3A and VEGFA, we overexpressed SEMA3A in HS5 stromal cell line and performed co-culture assays. The co-culture of KG1 or CD34+ cells overexpressing VEGFA with HS5 cells showed increased KG1 proliferation (176.9± 46.34%; P=0.045) and CD34+ proliferation (131.8± 7.9%; P=0.02). The co-culture of KG1 or CD34+ cells with HS5 cells overexpressing SEMA3A showed decreased KG1 proliferation (93.15± 0.79%; P=0.004) and CD34+ proliferation (72.73± 4.72%; P=0.009). When we combined VEGFA and SEMA3A overexpression, the effects of SEMA3A were dominant over VEGFA. To investigate whether the dominant effect of SEMA3A could be due to NRP1 competition, we performed immunoprecipitation assay using KG1 and HS5 treated with VEGFA and SEMA3A recombinant proteins. The combined treatment of VEGFA and SEMA3A proteins induced increased complex formation between NRP1 and Plexin A4 receptors, favoring SEMA3A signaling. Ours results suggest that VEGFA overexpression confer AML cells advantages by increasing proliferation. SEMA3A seems to reverse the effects of VEGFA. We suggested that the use of SEMA3A protein combined with VEGFA inhibitors could be beneficial to AML patient¿s treatment Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2012/00529-9 CAPES

Orientador: Lilian Maria de Castilho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Neste século uma nova tecnologia está gradativamente se infiltrando na medicina transfusional e complementando as técnicas sorológicas: a genotipagem de grupos sanguíneos através de diferentes métodos moleculares. O futuro dos grupos sanguíneos sem dúvida envolve a biologia molecular. Neste contexto, novos procedimentos técnicos se tornam necessários para possibilitar a introdução da genotipagem de grupos sanguíneos na rotina transfusional bem como, a investigação de novos polimorfismos característicos de duas diferentes populações: doadores de sangue e pacientes. A tecnologia baseada em "microarrays" tem sido avaliada para detecção de polimorfismos de grupos sanguíneos. Com a perspectiva de que esta metodologia permitirá a realização da genotipagem de grupos sanguíneos em larga escala de forma automatizada e rápida, os objetivos deste trabalho foram: validar em uma população brasileira os chips de DNA para a genotipagem dos principais alelos de grupos sangüíneos; determinar a freqüência genotípica dos principais alelos de grupos sanguíneos em doadores voluntários de sangue e, viabilizar a criação de um banco de dados eletrônico com as características genotípicas comuns e raras de doadores voluntários de sangue, possibilitando a compatibilidade sanguínea mais exata entre doadores e pacientes portadores de anemia falciforme. Os resultados obtidos durante a validação do "microarray" mostraram concordância com os resultados da genotipagem convencional e a fenotipagem. A genotipagem de grupos sanguíneos em larga escala utilizando a plataforma HEA BeadChip possibilitou a determinação da freqüência dos principais genótipos dos sistemas de grupos sanguíneos em uma população brasileira de doadores voluntários de sangue e demonstrou agilidade na identificação de alelos raros. Esta metodologia possibilitou também a criação de um banco de dados de doadores genotipados, através do qual foi possível promover a compatibilidade mais exata entre doadores de sangue e os pacientes falciformes. A partir deste banco de dados composto por 948 doadores, foi possível encontrar sangue fenótipo compatível (RhCc, RhEe, Do(a/b), Jk(a/b), Fy(a/b), S/s e K1/K2) para 134 dos 144 pacientes falciformes avaliados. Onze (11/144) pacientes aloimunizados, que apresentavam discrepâncias entre os resultados da fenotipagem e da genotipagem passaram a receber sangue compatível levando em consideração os resultados do genótipo. Estes pacientes se beneficiaram das transfusões recebidas, uma vez que houve aumento dos níveis de hemoglobina e aumento no intervalo entre as transfusões. Estes resultados nos levam a crer que esta metodologia poderá ser utilizada como complemento à hemaglutinação e possível substituição da mesma para alguns sistemas de grupos sanguíneos. Este trabalho que utilizou a metodologia de "microarray" para genotipagem de grupos sanguíneos pela primeira vez no Brasil abre a possibilidade de determinar os alelos de grupos sanguíneos em larga escala e constituir um banco de genótipos de grupos sanguíneos raros que poderão ser disponibilizados para consulta pela internet em situações onde a hemaglutinação não forneça resultados seguros para a realização da transfusão sanguínea. Esta tecnologia demonstrou ser um procedimento rápido e eficiente para busca de sangue fenótipo compatível para pacientes portadores de anemia falciforme permitindo assim a redução da aloimunização e a compatibilidade mais exata diminuindo o risco de reações transfusionais hemolíticas Abstract: Not informed Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Síndromes mielodisplásicas (SMD) abrangem um espectro de doenças hematológicas caracterizadas por hematopoese ineficaz e risco de evolução para leucemia mielóide aguda (LMA). As leucemias agudas apresentam altas taxas de mortalidade devido, principalmente, à sua capacidade de resistir a diversos tipos de quimioterápicos, sendo necessário buscar novos compostos capazes de interferirem no crescimento tumoral. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos da quercetina in vitro e in vivo, na linhagem celular P39/Tsugane, a qual foi estabelecida a partir de células leucêmicas do sangue periférico de paciente que possuía síndrome mielodisplásica, como modelo. O desenho experimental compreendeu o tratamento in vitro e in vivo com quercetina das células leucêmicas, verificando-se vias de apoptose, ciclo celular e autofagia. O modelo xenográfico de tumor de células leucêmicas subcutâneo foi utilzado para os ensaios in vivo. A quercetina induziu pronunciada apoptose das células leucêmicas P39, seguida por supressão da expressão de BcL-2, BclxL, Mcl-1, aumento da expressão de Bax e modulação do potencial de membrana mitocondrial com liberação de citocromo c e ativação de caspases. O tratamento com quercetina resultou em retenção das células na fase G1 do ciclo celular, com pronunciada diminuição das proteínas CDK2, CDK6, ciclina D, ciclina E e ciclina A, diminuição na fosforilação de Rb e aumento na expressão de p21 e p27. Quercetina induziu a formação do autofagossomo nas células P39, com ativação de PI3K classe III, Beclina 1, Atg5-Atg12, Atg7, conversão de LC3-I em LC3-II e desfosforilação de Akt e mTOR. A inibição da autofagia induzida por cloroquina juntamente com quercetina viii desencadeou aumento na apoptose, mas não alterou a modulação da fase G1 do ciclo celular induzida por quercetina. As células P39 tratadas com a combinação de quercetina e inibidores seletivos de ERK1/2 e/ou JNK (PD184352 e SP600125, respectivamente) apresentaram diminuição na retenção em fase G1 do ciclo, Este tratamento combinado, entretanto, não alterou a percentagem de células apoptóticas. Além disso, administração in vivo de quercetina reduziu significativamente o volume tumoral em camundongos inoculados com células P39 e confimar os resultados in vitro relacionados com apoptose, autofagia e ciclo celular. Assim, quercetina demonstra uma potente atividade antileucêmica através de sinalizações que causam parada do ciclo celular, apoptose e indução da autofagia. Esta última, por sua vez, parece proteger as células do alto grau de apoptose Abstract: This study proposes to investigate quercetin antitumor efficacy in vitro and in vivo, using P39 cell line as a model. The experimental design comprised leukemic cells or xenografts of P39 cells, treated in vitro or in vivo, respectively, with quercetin; apoptosis, cell cycle and autophagy activation were then evaluated. Quercetin caused pronounced apoptosis in P39 leukemia cells, followed by Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 downregulation, Bax upregulation and mitochondrial translocation, triggering cytochrome c release and caspases activation. Quercetin also induced the expression of FasL protein. Furthermore, our results demonstrated an antioxidant activity of quercetin. Quercetin treatment resulted in an increased cell-arrest in G1 phase of the cell cycle, with pronounced decrease in CDK2, CDK6, cyclin D, cyclin E and cyclin A proteins, decreased Rb phosphorylation and increased p21 and p27 expression. Quercetin induced autophagosome formation in P39 cell line, with upregulation of PI3K class III proteins, Beclin-1, Atg5-Atg12, Atg7, conversion of LC3-I to LC3-II, and dephosphorylation of Akt and mTOR. Autophagy inhibition induced by quercetin with chloroquine triggered apoptosis but did not alter quercetin modulation in the G1 phase. P39 cell treatment with a combination of quercetin and selective inhibitors of ERK1/2 and/or JNK (PD184352 or SP600125 respectively), significantly decreased cells in G1 phase, this treatment however did not change the apoptotic cell number. Furthermore, in vivo administration of quercetin significantly reduced tumor volume in P39 xenografts and confirmed in vitro results regarding apoptosis, autophagy and cell cycle arrest Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A identificação e caracterização estrutural e funcional de genes diferencialmente expressos entre tecidos tumorais e normais constituem etapas fundamentais para permitir a compreensão do processo neoplásico e o desenvolvimento de novas estratégias antitumorais. Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), no ano de 2003. Entretanto, seu padrão de expressão e sua função ainda não haviam sido caracterizados. A ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Multiple Ankyrin repeat and single KH domain (Mask) da Drosophila melanogaster. Mask foi identificada através de um rastreamento genético utilizado para detectar novas proteínas associadas à proteína tirosina fosfatase Corkscrew (CSW), homóloga à Src Homology-2 domain-containing protein tyrosine Phosphatase-2 (SHP2) humana. SHP2 é uma fosfatase de tirosina citoplasmática codificada pelo gene PTPN11 e exerce papel fundamental no desenvolvimento da hematopoese normal e leucêmica. Os objetivos gerais do presente estudo foram caracterizar o padrão de expressão gênica de ANKHD1 em células hematopoéticas normais e leucêmicas e verificar sua função nos processos celulares. Neste estudo foi demonstrado que o gene ANKHD1localiza-se no cromossomo 5, possui vários transcritos variantes possivelmente gerados por mecanismos de clivagem alternativa e codifica proteínas com domínios de repetições de anquirina. A região promotora desse gene possui vários elementos regulatórios importantes como sítios de ligação ao fator de transcrição GATA-1 e sequências ricas em dinucleotídeos CG, as ilhas CpG. A expressão do gene ANKHD1 e de algumas de suas variantes em tecidos normais e em linhagens de células neoplásicas foi detectada em intensidades variáveis. Em modelos de diferenciação e proliferação celular foi demonstrado o aumento da expressão desse gene ao longo desses processos. No entanto durante o processo de apoptose observou-se diminuição na expressão de ANKHD1 e transcritos variantes. Em células de pacientes diagnosticados com Síndrome Mielodisplásica (SMD) foi constatada baixa expressão de ANKHD1. Durante a diferenciação eritróide de células CD34+ obtidas de medula óssea desses pacientes não foi observado o aumento da expressão do gene ANKHD1 e do fator de transcrição GATA-1 como era esperado. As células mononucleares de pacientes com SMD tratadas com decitabina, um agente desmetilante, apresentaram aumento na expressão do gene ANKHD1 em comparação às células não tratadas. O mesmo foi observado em células CD34+ tratadas durante a diferenciação eritróide. No entanto em células de pacientes com Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e com Mieloma Múltiplo (MM), caracterizadas pela proliferação e resistência aos mecanismos de apoptose, foi demonstrada a alta expressão do gene ANKHD1 e de seus transcritos variantes. A associação da ANKHD1 com SHP2 foi identificada através de Western Blotting, em células da linhagem de MM denominada RPMI 8226. Foi observada a diminuição da expressão do gene ANKHD1 nessas células quando induzidas ao processo de apoptose por dexametasona. Em conclusão o presente estudo identificou ANKHD1 e alguns de seus transcritos variantes como um novo gene com perfis de expressão variados em células hematopoéticas normais e neoplásicas, demonstrou seu envolvimento em processos celulares básicos à manutenção da homeostase e a sua associação com SHP2 em Mieloma Múltiplo. ANKHD1 pode estar envolvida com o fenótipo anormal da célula neoplásica através de uma possível função na via da apoptose. Os achados aqui descritos sugerem que ANKHD1 pode ser uma molécula alvo para a terapia de neoplasias, e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 em diferentes células hematopoéticas normais e neoplásicas. Abstract: The identification and the structural and functional characterization of genes differentially expressed between tumors and normal tissues are fundamental steps towards the understanding of the neoplastic process and the development of new anti-cancer strategies. The Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) was first described in humans in a prostate carcinoma cell line LNCaP, in 2003; however, the expression pattern and function of ANKHD1 have not yet been described. ANKHD1 is an orthologous protein of the Drosophila melanogaster, MASK (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), where it was first identified using a genetic screen designed to discover proteins that interact with the protein tyrosine phosphatase Corkscrew (CSW), which is a homolog to the SH2-containing protein tyrosine phosphatase (SHP2) in humans. SHP2 is a cytoplasmic protein-tyrosine phosphatase, coded by the PTPN11 gene and plays an important role in the development of normal hematopoiese and leukemogenesis. The aim of the present study was to characterize the gene expression pattern of ANKHD1 in normal and leukemic hematopoietic cells and to determine their function in cellular process.This study has demonstrated that the ANKHD1 gene is located on chromosome 5, this gene has several possible variant transcripts generated by splicing alternative mechanisms and encodes proteins with domains of ankyrin repeats. The promoter region of this gene has several regulatory elements such as the transcription factor GATA-1 binding sites and rich sequences in dinucleotide CG, CpG islands.The expression of the ANKHD1 gene and some of the gene's variants in normal tissues and neoplastic cell lines was detected in different intensities. The increase in the expression of this gene was demonstrated using cellular differentiation and proliferation models. However, during the process of apoptosis, a decrease in the expression of ANKHD1 transcripts variants was observed. In the cells of patients with myelodysplastic syndrome (MDS), a low expression of ANKHD1 was observed. During erythroid differentiation of CD34+ cells obtained from the bone marrow of these patients, no increase in the expression of ANKHD1 gene and transcription factor GATA-1 was observed, as expected. The mononuclear cells of MDS patients were treated with decitabine, a demethylation agent, and showed an increase in the ANKHD1 gene expression compared to untreated cells. The same was observed in CD34+ cells treated during erythroid differentiation. However in cells of acute myeloid leukemia (AML) or Multiple Myeloma (MM) patients, characterized by proliferation and resistance mechanisms of apoptosis, the high expression of gene transcripts ANKHD1 and its variants was demonstrated. The association of SHP2 with ANKHD1 was identified by Western Blot in RPMI 8226 MM cell line. A decrease in the ANKHD1 gene expression in these cells when the process of apoptosis was induced by dexamethasone was observed. In conclusion, this study identified ANKHD1 and some of gene's transcripts variants as a new gene with a variable expression profile in normal and neoplastic hematopoietic cells. The study has also demonstrated the involvement of the ANKHD1 in basic cellular processes, which maintain homeostasis and the association of ANKHD1 with SHP2 in multiple myeloma. ANKHD1 may be involved with the abnormal phenotype of tumor cells through a possible role in the apoptosis pathway. The findings herein described suggest that ANKHD1 could be a molecular target for neoplasic disease therapy and could guide further studies towards a better elucidation of the specific functions of ANKHD1 in normal and neoplasic hematopoietic cells. Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A avulsão de raízes motoras, na interface do sistema nervoso central e periférico, já bem descrito na literatura, promove uma significativa perda sináptica com degeneração de cerca de 80% dos motoneurônios afetados. Não existem estratégias eficazes que propiciem uma reversão ou amenização deste quadro, mas alguns estudos já mostram que o passo fundamental é preservar os motoneurônios afetados. Pesquisas em diferentes áreas com células-tronco (CT) adultas estão sendo realizadas nos últimos anos e apresentam resultados promissores para a medicina regenerativa. Investigações recentes têm apontado para diferentes fontes de CT em tecidos adultos tais como de medula óssea, de sangue de cordão umbilical, tecido muscular, tecido nervoso, líquido amniótico entre outras. De modo geral, estas células apresentam como características principais a capacidade de proliferação e a diferenciação para outros tipos celulares. Entretanto, os principais problemas para o uso clínico das CT adultas são: i) pequena quantidade de células multipotentes, ii) o controle da diferenciação, iii) insuficiência no número de células viáveis e iiii) difícil obtenção. Como alternativa às dificuldades anteriormente citadas, o tecido adiposo tem sido foco de intensos estudos, pois este tecido possui rica fonte de células pluripotentes, além de apresentarem características positivas como fácil acesso ao tecido adiposo subcutâneo, obtenção em quantidade abundante e processo de isolamento celular relativamente simples. Apesar deste tecido apresentar organização complexa, é na fração celular do estroma vascular que se encontra uma rica população de células pluripotentes. Dados de literatura demonstram que as células mesenquimais derivadas de tecido adiposo (AT-MSC - Células mesenquimais de tecido adiposo), mediante incubação com meios de cultura variados, diferenciam-se em adipócitos, osteócitos, mioblastos, hepatócitos, células vasculares entre outras. A diferenciação de AT-MSC em células neuronais ainda é alvo de discussões e críticas na literatura, pois não há protocolos estabelecidos que induzam a diferenciação em células neuronais funcionais absolutas. Ainda, recentes estudos atribuem um potencial neuroprotetor e uma capacidade imunomodulatória à produção de fatores neurotróficos e a produção de fatores solúveis pelas AT-MSCs, constituindo talvez o principal mecanismo de ação destas células in vivo. O xenotransplante também é alvo de criticas de diversos trabalhos. Células humanas em modelo animal têm sido usadas constantemente em diversos trabalhos e o uso ou não de imunossupressores é um dos motivos de questionamento dos resultados, uma vez que sistemas imunológicos diferentes podem causar reações imunológicas não pretendidas nos estudos e, consequentemente, os resultados não seriam confiáveis. Entretanto, artigos de revisões x bibliográficas demonstram que diversos estudos envolvendo células-tronco mesenquimais e modelos animais têm resultados promissores e corroboram entre si. Com objetivo de investigar a ação de células-troncos de tecido adiposo de lipoaspirado humano em modelo animal, o presente trabalho propôs analisar a capacidade de sobrevivência das AT-MSCs humanas no modelo de avulsão da raiz ventral de ratos, bem como sua capacidade de neuroproteção dos motoneurônios lesionados e sua competência de imunossupressão no período de 2 semanas pós lesão (período agudo). Análise da dinâmica das sinapses, da reação astroglial e microglial e da reação de linfócitos T tiveram o objetivo de identificar condições que promovessem a sobrevivência e regeneração dos motoneurônios axotomizados assim como a capacidade de atuação das células humanas em ratos. Deste modo, foi observado que o tratamento com as AT-MSC humanas tiveram efeito neuroprotetor, uma vez que houve aumento significativo de sobrevivência neuronal e promoveram a estabilidade sináptica. As células humanas também tiveram ação imunomodulatória, reduzindo a astrogliose reativa e ativação microglial, bem como inibiu a atividade de linfócitos T. Pode-se dizer que no modelo a ação das células-tronco mesenquimais humanas ocorre semelhante ao de transplantes alogênicos em modelos animais Abstract: It is well described in the literature that avulsion motor at the interface of the central and peripheral nervous system, promotes a significant loss of synaptic degeneration and 80% of motor neurons death. There is no effective strategies that favor a reversal or mitigation of this framework, but some studies have shown that the key step is to preserve motor neurons affected. Researches in different areas with stem cell (CT) adults are being undertaken in recent years and show promising results for regenerative medicine. Recent investigations have pointed to different sources of CT in adult tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, brain, muscle tissue, amniotic fluid, among others. Generally, these cells have as main characteristics capacity for proliferation and differentiation to other cell types. However, the main problems for the clinical use of adult SC are: i) small amount of multipotent cells, ii) differentiation control, iii) low number of viable cells and iiii) difficulty to obtain. As an alternative to the difficulties mentioned above, adipose tissue has been the focus of intense study, because this tissue has a rich source of stem cells, in addition to having positive characteristics such as easy access to subcutaneous adipose tissue, obtained in abundant quantities and isolation process relatively simple. Despite the complex tissue organization, the stromal vascular fraction is rich of pluripotent population cells. Literature data show that stromal cells derived from adipose tissue (AT-MSC-adipose tissue mesenchymal stem cells) can differentiate by incubation with various culture media into adipocytes, osteocytes, myoblasts, hepatocytes, vascular cells, among others. The AT-MSC differentiation into neuronal cells is still subject of discussion and criticism in literature, since no established protocol has induced differentiation into function neuronal cells. Still, many studies attribute a potential neuroprotective and immunomodulatory capacity for the production's AT-MSC of neurotrophic factors and the soluble factors, constituting perhaps the main mechanism of action of these cells in vivo. Xenotransplantation is the target of criticism of many studies. Human cells constantly used in animal models have been used in several works and the use of immunosuppressants or not is subject to questioning of the results, since different immune systems can cause unwanted immune reactions in studies and, consequently, the results would not be reliable. Literature reviews show that several studies involving mesenchymal stem cells and animal models have shown promising results and corroborate each other. xii To investigate the action of stem cells from human adipose tissue lipoaspirate animal model, this study proposes to analyse the survivability of the human AT-MSC in ventral root avulsion model in rats as well as its ability to neuroprotection in moto neurons and their competence in the period of immunosuppression 2 weeks post injury (acute period). To identify conditions that promote the survival and regeneration of axotomized motoneurons as well as the capacity for action of human cells in mice, synapses dynamic analysis, astroglial and microglial reaction and reaction of T lymphocytes was examined. Thus, it was observed that treatment with AT-MSC had neuroprotective effect, since there was a significant increase in neuronal survival and the AT-MSC human promoted synaptic stability. Human cells also have immunomodulatory action, reducing reactive astrogliosis and microglial activation and inhibited the activity of T lymphocytes. It is possible that the model action of human mesenchymal stem cells is similar to that of allogeneic Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Joyce Maria Annicchino Bizzacchi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A caracterização molecular na hemofilia A é dificultada pela grande extensão do gene do fator VIII (186Kb e 26 exons) e pela grande heterogeneidade das mutações nos pacientes de diferentes grupos étnicos estudados. Inicialmente a identificação da portadora do gene da hemofilia foi realizada em 24 famílias de pacientes com hemofilia A utilizando-se os polimorfismos de restrição para as endonucleases BclI e HindIII. Foi possível identificar ou excluir portadoras do gene em 70% das famílias estudadas. Com o objetivo de definir as alterações genéticas de uma população distinta e realizar um aconselhamento genético preciso, foi levado a efeito um estudo das mutações no gene do fator VIII em 42 pacientes brasileiros portadores de hemofilia A. A análise por Southern hlot foi realizada nos pacientes com a forma grave da hemofilia para a detecção de inversão do gene do fator VIII com ruptura do gene do fator VIII e foi detectada em 13 de 21 do grupo com hemofilia grave. A metodologia incluiu a amplificação dos 26 exons do gene do fator VIII em quatro combinações diferentes de exons (Multiplex-PCR) e posterior análise do polimorfismo de conformÇlção em hélice simples do DNA (SSCP) não-radioativo no sistema PhastSystem@ Pharmacia com coloração pela prata. A confirmação do defeito molecular foi realizada pelo sequenciamento do exon com padrão eletroforético anormal no SSCP. O SSCP revelou um padrão anormal de migração em 85% dos casos de hemofilia moderada-leve e em 50% nos casos de hemofilia grave. Foram detectadas 16 mutações de ponto diferentes sendo que 11 não previamente descritas. Com essa combinação de metodologias foi possível identificar as alterações moleculares em 80% dos pacientes brasileiros com hemofilia A. O grande número de novas mutações está em acordo com a grande heterogeneidade das mutações descritas em outras populações Abstract: The molecular characterization of the mutations in hemophilia A patients is hampered the large size of the factor VIII gene and the great heterogeneity of mutations. First of all we carried out a study of RLFPs for the enzymes BelI and HindIII in 24 families of hemophilia A patients and was possible to detect carriers in 70% of the families. Further in a attempt to elucidate the genetic basis of a distinct population and to perform a precise carrier detection we carried out a study of Brazilian patients with hemophilia A. In this study, we have carried out a protoeol involving multiplex PCR in which 19 exons were amplified in four different combinations followed by non-radioactive SSCP in order to screen for mutations. Southern blotting was used to detect inversion of the factor VITI gene resulting from recombination between copies of the F8A gene located in intron 22 of the factor VITI gene and two copies close telomeric region of chromosome. Forty-two hemophilia A patients (21 with severe and 21 with mild-to-moderate disease) were studied. The inversion of factor VITI occurred in 13 out of 21 patients affected by severe hemophilia A. One patient showed a large extra band in addition to the three bands observed following Southern blotting with the F8A probe. An abnormal electrophoretic pattem of SSCP was detected in 85% and 50% of the patients affected by mild-to-moderate and severe disease, respectivelly. Sixteen different mutations were identified. Eleven mutations were novel and comprised nine point mutations and two small deletions. This study demonstrates that the methodology employed is safe and rapid and has a potential in detecting almost all the genetic defects of the studied hemophiliacs patients Doutorado Doutor em Clínica Médica

Orientador : Antonio Condino Neto Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A anemia falciforme é uma alteração genética das hemácias, caracterizada por hemólise crônica e episódios de crises de oclusão vascular. O defeito genético consiste em uma mutação na posição 6 da cadeia f3da hemoglobina, que confere às hemácias alterações na sua forma e estrutura, tornando-as mais rígidas, deformadas e distorcidas, com tendência para a formação de polúneros e conseqüente obstrução do fluxo sanguíneo. Um simples ponto de mutação transforma a anemia falciforme em uma entidade clínica heterogênea, sugerindo a idéia de que diferentes mecanismos possam estar envolvidos. O mecanismo exato, pelo qual o fluxo sanguíneo normal é interrompido pelas hemácias, ainda não é totalmente esclarecido. Numa doença como a anemia falciforme, na qual a velocidade da passagem das hemácias rígidas pelos vasos sanguíneos tem importância relevante, o tônus e a regulação vascular assumem papel primordial, sendo este controle mediado, em parte, pelo óxido nítrico, cuja ação é inibidapelo superóxido. Diversos estudos têm indicado o envolvimento da lesão endotelial e do processo inflamatório subclínico no desencadeamento e progressão dos processos da oclusão vascular. A participação dos leucócitos no dano aos tecidos dos pacientes com anemia falciforme é objeto de investigação, sendo a leucocitose um fator de mau prognóstico na doença. Investigou-se inicialmente a liberação do óxido nítrico pelos leucócitos, analisando sua capacidade de inibir a agregação de plaquetas lavadas induzida pela trombina. Os resultados mostram que os granulócitos de pacientes com anemia falciforme (n=9) liberam óxido nítrico de maneira similar aos granulócitos de controles sadios (n=9), pois foi necessário um número semelhante de células para inibir a agregação plaquetária (mediana de 4,4 x 106e 4,3 x 106,respectivamente). Na ausência de SOD, não foi detectada liberação de óxido nítrico pelos leucócitos mononucleares de pacientes com anemia falciforme (n=9), pois eles não afetaram a agregação de plaquetas nesta situação. Na presença de SOD, não houve diferença na liberação do óxido nítrico entre leucócitos mononucleares de pacientes com anemia falciforme e controles, pois o número de leucócitos mononucleares necessário para inibir a agregação de plaquetas foi semelhante entre os pacientes (mediana de 3,4 x lO6ml, n=9) e os controles sadios (mediana de 3,3 x lO6ml,n=9). Os fagócitos contêm uma nicotinamida adenina inuc1eotídeofosfato (NADPH) oxidase (forma reduzida) associada à sua membrana citoplasmática, que gera superóxido e outros reativos intermediários tóxicos do oxigênio, os quais apresentam potencial de injúria aos tecidos. O sistema NADPH-oxidase é composto por cinco subunidades: p40-pho Abstract: Sickle cell anemia is a genetic disorder of red blood cells characterized by chronic hemolysis and episodic vaso-oclusive crisis. The molecular defect is caused by a point mutation at the 6thposition ofthe f3chain ofhemoblobin, which leads erythrocytes to abnormal sickle shape, rigidity, deformability and distortion with consequent blood flow obstruction. A single point mutation leads sickle cell disease to a clínical heterogenous disorder, supporting the idea that a different set of mechanisms might be involved in this disease. It is still not completely understood how sickle erythrocytes interrupt blood flow. Current evidence indicate that endothelium damage, and a subclínical inflammatoryprocess take place in the initiation and progression of vascular occlusion. The role of leukocytes in the tissue injury of sickle cell anemia patients is a current subject of investigation. The NADPH-oxidase system of professional phagocytes catalyzes the production of superoxide by the one-eletron reduction of oxigen (respiratory burst). This is the starting point for the production of reactive oxidants species, which are potential tissueinjury mediators. The NADPH-oxidase system is composed by tive components: p40-Phox p4TPh°x,p6Tphoxexist in the cytosol as a complexoThe other two components gp91-phoxandp22-PhOX form the cytocrome b558in the cell membrane and function as the terminal electron carrier ofthe oxidase. Afier activation, the cytosolic complex migrate to membrane binding to citocrome b558and assemblythe active oxidase. The involvement of the leukocyte NADPH-oxidase system has not been investigated before in sickle cell anemia. The experimental approach was focused on: a) the release of nitric oxide by neutrophils and mononuclear leukocytes ITom sickle cell anemia patients. It was assayed by the ability of leukocytes to inhibit thrombin-induced washed platelet aggregation. Neutrophils ITom sickle cell anemia patients released nitric oxide in a similar manner to those ITomhealthy controls. The inhibition of platelet aggregation by neutrophils ftom sickle cell anemia or ftom hea1thycontrols was blocked by L-NAME (300JlM), but not by D-NAME (300JlM), and was reversed by L-arginine (lmM). Additionaly, a similar number of neutrophils ftom sickle cell anemia patients and írom healthy controIs was required to inhibit platelet aggregation. Mononuc1ear leukocytes írom sickle cell anemia patients inhibited platelet aggregation only in the presence of superoxide dismutase (60 U rnl-I) b) the release of superoxide by neutrophils and mononuc1earsickle cell anemia leukocytes. lt was assassed by the SOD specific inhibition of cytochrome c reduction assay. PMA (30nM) or ZYM (100 partic1es/cell)-induced release of superoxide by mononuc1ear leukocytes :lTomsickle cell anemia patients was significant1yhigher than that observed in mononuc1ear leukocytes írom healthy controIs (p

Orientador : Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Os linfomas não-Hodgkin (LNH) agressivos constituem um grupo heterogêneo de neoplasias hematológicas. Os LNH difusos de grandes células B compreendem cerca de 20-25% dos LNH. O tratamento quimioterápico pode curar apenas 40-50% dos pacientes adultos com linfomas agressivos. São considerados indicadores prognósticos: idade, número de sítios extranodais, LDH, performance status e estadiamento clínico. Além desses fatores, anormalidades das proteínas reguladoras do ciclo celular e da apoptose parecem ser um importante mecanismo de desenvolvimento de neoplasias e podem ter um papel no prognóstico dos linfomas agressivos. A expressão das proteínas reguladoras do ciclo celular, p53, p21/WAF-1, Mdm2 , c-Myc e PCNA (proliferating cell nuclear antigen) foram avaliadas através da análise imunohistoquímica de biópsias de gânglio, fixadas em formol e embebidas em parafina de 113 casos de LNH de alto grau de malignidade histológico, sendo que em 62 pacientes com LNH agressivos a expressão das proteínas foi correlacionada com dados clínicos e de sobrevida. Expressão de p53, p21/WAF-1, Mdm2 e c-Myc foi observada em 17/ 62 (30%), 25/60 (42%), 13/44 (30%) e 39/ 51 (76.5%) dos casos, respectivamente. O fenótipo p53+/p21WAF-1 negativo, que é mais freqüentemente encontrado nos casos com mutações do p53, foi associado com menor sobrevida global (SG), (P=0.04) e uma menor taxa de remissão completa (RC) (P=0.01). Expressão negativa de p53 e c-Myc foram relacionadas a uma melhor resposta à quimioterapia (P=0.005 e 0.035, respectivamente). A expressão de p53, c-Myc e Mdm2 foi associada a uma menor SG (P < 0.001, 0.05 e 0.037 respectivamente), sugerindo que a expressão dessas proteínas poderia estar associada a um pior prognóstico nesses pacientes. Além da análise da expressão da p53, pesquisamos a presença de mutações do gene p53 nos casos com hiperexpressão da proteína (n=17). Foi possível extrair DNA de 15 casos. A amplificação dos éxons 5-9 do p53 teve êxito em 7 casos, com o achado de uma mutação de ponto no éxon 6 (Val®Glu;T®A), num paciente com hiperexpressão da p53 e expressão negativada p21/WAF-1.Avaliamos também a expressão de proteínas reguladoras da apoptose (p53, Bcl-2, Bax, Bak e Mcl-1) de 33 pacientes com LNH difusos de grandes células B e analisamos a relação entre a expressão dessas proteínas com dados clínicos e resposta à quimioterapia. Nossos resultados mostraram que a expressão da p53 foi considerada um parâmetro imunohistoquímico independente relacionado a um pior prognóstico nesses linfomas. Apesar da alta expressão observada das proteínas Bcl-2, Bax, Bak e Mcl-1, não foi encontrado associação com prognóstico ou resposta ao tratamento Abstract: Aggressive non-Hodgkin¿s lymphomas (NHL) form a heterogeneous group in terms of clinical presentation, histology, immunophenotype, response to treatment and prognosis. Diffuse large B-cell NHL (DLCL) constitute up to 20-25% of NHL in many series. Combination chemotherapy may cure 40-50% of adult patients. Several clinical prognostic factors have been described to predict clinical outcome, as age, LDH, performance status, and stage and are useful for identifying high-risk patients, who would benefit from a more intensive approach. Abnormalities of cell cycle and apoptosis regulating proteins seem to be an important mechanism of tumorigenesis and may play a role in the prognosis of aggressive NHL. The expression of p53, p21/WAF-1, Mdm2 , c-Myc and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) proteins were examined by the immunohistochemistry of paraffin embedded tissues of 113 high grade non-Hodgkin's lymphomas (NHL) and in 62 patients with aggressive NHL correlated to clinical data. Expression of p53, p21/WAF-1, Mdm2 and c-Myc protein was observed in 17 out of 62 cases (30%), 25 out of 60 (42%), 13 out of 44 (30%) and 39 out of 51 (76.5%), respectively. The p53+/p21WAF-1 phenotype, which is more frequently found in p53 mutations, was associated with a worse overall survival (P=0.04) and with a lower rate of complete response (CR)(PF=0.01). p53 and c-Myc negative expression was related to a better response to chemotherapy (PF=0.005 and 0.035, respectively). The expression of p53, c-Myc and Mdm2 was related to a shortened overall survival (P < 0.001, 0.05 and 0.037 respectively), suggesting that the expression of these proteins could be associated with a poor outcome in these patients. We looked for mutations of p53 gene in aggressive NHL patients with hiperexpression of p53 protein (n=17). DNA extraction was performed in 15 patients and PCR amplification of exons 5-9 was possible in 7 cases. We found a point mutation in exon 6 (Val®Glu;T®A), in a patient with p53 hiperexpression and p21 negative expression. We also evaluated the expression of apoptosis-regulating proteins (p53, Bcl-2, Bax, Bak and Mcl-1) of paraffin-embedded tissues of 33 patients with diffuse large B-cell NHL, and assessed the relationship of these proteins to clinical outcome and response to chemotherapy. Our results showed that p53 expression was an independent immunohistochemical parameter related to a poor prognosis in these lymphomas. Bcl-2, Bax, Bak and Mcl-1 proteins, though highly expressed in almost all cases were not associated with prognosis or response to treatment Doutorado Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Alberto Cliquet Junior Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A doença falciforme é uma doença genética, que resulta em falcização das hemácias, desencadeando fenômenos de vaso-oclusão, episódios de dor e lesão de órgãos. O comprometimento ósseo é a manifestação clínica mais comum na doença falciforme, tanto nos quadros agudos quanto nas crises vaso-oclusivas dolorosas, podendo causar deficiências crônicas e progressivas, como a necrose avascular. Raros são os estudos encontrados na literatura sobre a atuação da fisioterapia como recurso capaz de prevenir e tratar as disfunções do aparelho locomotor presentes nos indivíduos portadores de doença falciforme (DF). O objetivo deste estudo foi avaliar as respostas ao exercício terapêutico por meio da prática diária de exercícios domiciliares, realizando um "follow-up" de três meses, em comparação com um grupo controle. Para isso, foi desenvolvido um manual de orientações para a realização de exercícios terapêuticos domiciliares para portadores de DF. A pesquisa teve início com a avaliação dos pacientes, no Ambulatório de Hemoglobinopatias do Hemocentro da UNICAMP. A avaliação foi constituída de questionários funcionais para coluna lombar: Questionário de Incapacidade Roland Morris (QIRM), Índice de Incapacidade de Oswestry e Start Back Screening Tool-Brasil (SBST), questionário para avaliação da dor (Escala visual analógica de dor ¿ EVA), avaliação da amplitude de movimento articular (ADM) de flexão e extensão de tronco por meio de eletrogoniometria por fibra óptica e avaliação da força muscular (FM) de flexores e extensores de tronco por meio de célula de carga. Após as avaliações, os pacientes foram divididos em dois grupos: Grupo Intervenção (GI) e Grupo Controle (GC). Os pacientes do GI foram orientados quanto à realização dos exercícios terapêuticos domiciliares e receberam o manual de orientações para realização dos exercícios domiciliares e uma agenda para registro das atividades. O protocolo consistiu em exercícios domiciliares diários, que deveriam ser realizados de acordo com o manual de orientações. A duração total do programa foi de três meses. Após três meses (12 semanas) da primeira avaliação foi realizada a avaliação final, conforme o protocolo descrito anteriormente. Os voluntários do GC apenas participaram das avaliações, conforme descrito anteriormente. A amostra final foi constituída por 33 voluntários. O GI foi composto por 18 voluntários com mediana de idade de 44 (28-58) anos. O GC foi composto por 15 voluntários com mediana de idade de 42 (19-58) anos. Após a intervenção, os voluntários foram reavaliados para comparação dos resultados pré e pós intervenção. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Wilcoxon. O nível de significância adotado foi de 5% (p

Orientador: Maria Beatriz Duarte Gavião Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: A Doença de Gaucher (DG) e uma doença de origem genética, autossomica recessiva, causada por mutações do gene da glucocerebrosidase, o qual codifica a enzima beta-glucocerebrosidase, determinando deficiência na produção e/ou na sua atividade. O objetivo desse estudo foi avaliar a saúde oral, a qualidade vida, as condições maxilares e as características craniofaciais de indivíduos com DG. Dezessete pacientes sob tratamento medico no Centro de Hematologia e Hemoterapia (Hemocentro) da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) participaram desse estudo. Destes, oito eram crianças, entre 7 e 15 anos, e nove adultos, entre 27 e 53 anos. Todos os pacientes receberam exame clinico oral completo, avaliando-se tecidos moles e dentes cariados, perdidos ou obturados, deciduos (ceo) e permanentes (CPOD). Nos pacientes adultos realizou-se exame periodontal, avaliando-se o nível de inserção clinica (NIC), a profundidade de sondagem (PS), a posção da gengiva marginal (PGM), o índice de placa visível (PV) e de sangramento gengival (SG). Realizou-se exame radiográfico panorâmico para avaliar as condições ósseas da maxila e mandíbula, e o momento de erupção da dentição permanente nas crianças. A radiografia lateral foi realizada para avaliar as características craniofaciais pela analise cefalometrica. O crescimento das crianças foi avaliado pela comparação do peso e da altura com gráficos padrões. A idade óssea foi estimada pela radiografia do punho e da mao. A influencia da saúde oral sobre a qualidade de vida foi avaliada por questionários auto-administrados pelas crianças - Child Perception Questionnaire - CPQ 8-10 anos e CPQ 11-14 anos; e o questionário Oral Health Impact Profile - OHIP 49 - foi usado para os pacientes adultos. Aplicou-se teste Wilcoxon para se avaliar o momento de erupção dos dentes permanentes e para comparar as variáveis cefalometrica ao padrão. O ceo médio encontrado foi de 2,67 e o CPOD de 0,75. Para os pacientes adultos, um alto índice CPOD (20,44), leve doença gengival e moderada doença periodontal foram observados. As crianças mostraram retardo no crescimento e diferença de 13 e 16 meses, em media, entre a idade cronológica e a idade óssea, na primeira e segunda avaliação, respectivamente. Considerando a idade óssea, erupção precoce foi observada em 5 pacientes, principalmente nos incisivos centrais e laterais. Considerando a idade cronológica, 7 pacientes exibiram erupção atrasada, significante para o segundo pré-molar. Os achados radiográficos mais encontrados nos maxilares foram rarefação generalizada, borramento do canal mandibular e perda da estrutura trabecular. Pela analise cefalometrica, bservouse que seis crianças mostraram valores lineares de crescimento craniofacial maiores quando comparados ao padrão. O escore médio total do CPQ 8-10 anos foi 17, mostrando moderado impacto da saúde oral na qualidade de vida das crianças nessa faixa etária. O escore médio total do CPQ 11-14 anos foi 38. Os adultos demonstraram impacto expressivo na qualidade de vida relacionada a saúde oral. Concluiu-se que as crianças com DG apresentaram boa saúde oral, erupção precoce de alguns grupos dentários, importante alterações nos maxilares e alterações no crescimento craniofacial. Embora não tenham apresentado saúde oral deficiente, algumas condições orais interferiram na qualidade de vida. Os pacientes adultos apresentaram envolvimento ósseo dos maxilares, pobre saúde oral e consequentemente prejudicada qualidade de vida relacionada a saúde oral. Abstract: Gaucher disease (GD) is an autosomally recessive inherited disorder, caused by mutations of the glucocerebrosidase gene, which codify the enzyme glucocerebrosidase, determining deficiency in its production or activity. The aim of this study was to evaluate the oral health and related quality of life in patients with Gaucher disease, and to evaluate jaw conditions, growth and craniofacial development. Seventeen patients undergoing treatement at the Hematology and Blood Transfusion Center (Hemocentro) of University of Campinas (Unicamp) participated of this study. Eight were children, aged from 7 to 15 years old, and nine adults, aged from 27 to 53 years old. Each patient received a complete soft tissue examination and a clinical examination of decayed, missing and filled primary (dmft) and permanent (DMFT) teeth. Periodontal examination was performed in the adult patients evaluating clinical attachment level (CAL), probing depth (PPD), position of the gingival margin (PGM), visible plaque (VPI) and gingival bleeding index (GBI). Panoramic radiography was used to evaluate the bone conditions of the maxilla and mandible, and the eruption timing of the children's permanent dentition. Lateral radiography was used to evaluate the craniofacial characteristics by cephalometric analysis. Growth was assessed for the children through body weight and height, plotted against standard growth charts; and bone age was estimated by X-ray of the wrist and hand. The influence of the oral health about the quality of life was evaluated by a questionnaire selffilled by the children - Child Perception Questionnaire - CPQ 8-10 years and CPQ 11- 14 years - and the Oral Health Impact Profile questionnaire - OHIP 49 - was used for the adult patients. Wilcoxon test was applied to evaluate the eruption timing of the permanent dentition and to evaluate the values of the cephalometric analysis compared to the standard. The mean dmft found (2.67) was higher, and the DMFT (0.75) was lower than was counseled by the WHO. For the adults, a high DMFT index (20.44) and a slightly gingival and moderate periodontal disease were observed. The children showed growth retardation and a mean difference of 13 months on the first evaluation and of 16 months on the second between the chronologic and bone age. Considering bone age, early eruption was observed in 5 patients, mainly in the central and lateral incisors. Considering chronologic age, 7 patients showed delay eruption, significant for the second premolar. The most prevalent radiological findings in the jaw comprised generalized rarefaction, effacement of the mandibular canal and loss of trabecular structure presented by children and adults. Through the cephalometric analysis all children were observed to present higher values of craniofacial growth confronting with the standards. The mean overall score for the CPQ8-10 years was low (17), showing little impact of the oral health upon quality of life. The mean overall scale for the CPQ11-14 years was 38. According to the results obtained by adults, they perceived substantial impact of oral health upon their quality of life. We concluded that children with GD presented good oral health, early eruption of some permanent teeth groups and important alterations in the jaw. Children may manifest alterations at craniofacial growth. Although the children did not present a poor oral health, some oral conditions interfered with their quality of life. The adult patients showed bone involvement in the jaw and poor oral health, consequently poor oral health-related quality of life. Doutorado Odontopediatria Doutor em Odontologia

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A proteína humana ANKHD1 (Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1) foi inicialmente descrita em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), e sua expressão também é observada em diversas linhagens leucêmicas. ANKHD1 é homóloga a proteína Mask (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain) de Drosophila melanogaster, relacionada com diferenciação, sobrevivência e proliferação de fotorreceptores dos olhos de drosófila. Interações diretas entre ANKHD1 e SHP2, proteína que exerce um papel crítico na hematopoiese, foram descritas nas linhagens mielóide K562, de adenocarcinoma de próstata, LNCaP, e em linhagem de mieloma múltiplo RPM1 8226. Porém pouco se sabe sobre a função de ANKDH1 e seu papel na leucemogênese. O objetivo do presente estudo foi investigar o envolvimento da ANKHD1 em processos biológicos relacionados com a leucemogênese. Para tal utilizamos duas abordagens metodológicas principais: inibição e hiperexpressão de ANKHD1. A inibição de ANKHD1 em linhagem LNCaP foi seguida de rastreamento das demais alterações gênicas associadas através de microarray. O microarray realizado mostrou 706 genes cuja expressão foi aumentada e 159 genes cuja expressão foi diminuída. Os genes foram agrupados em 26 classes funcionais, sendo que diversos genes conhecidos por regularem ciclo celular e apoptose tiveram seu perfil de expressão alterada. Importante ressaltar que a inibição de ANKHD1 resultou em aumento significativo da expressão de um grande número de Histonas, sugerindo seu papel no controle epigenético. Dentre as modulações validadas, algumas foram verificadas também em amostras provenientes de portadores de leucemia. Neste estudo, foi demonstrada a baixa expressão gênica de ANKHD1 em amostras de 38 pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células de medula óssea normal. Uma vez que esta amostra leucêmica se mostrou como um modelo natural de inibição de ANKHD1, a expressão de outros genes modulados no array foi testada, e o gene BMF, que se mostrou aumentado no array, se mostrou também mais expresso em amostras de leucemias, confirmando a oposição de expressão destes dois genes. Simultaneamente, células de leucemia aguda e mielodisplasia foram submetidas à ação de diversas drogas usadas no tratamento dessas doenças mostrando aumento de expressão de ANKHD1. Estes dados em conjunto com os observados no microarray sugerem a participação da ANKHD1 na via de JAK/STAT1 e vias de controle epigenético. A segunda abordagem utilizada neste trabalho foi a hiperexpressão ANKHD1, isoformas 1 e 2, em linhagens tumorais, seguidas da detecção de expressão protéica de ANKHD1 em cotransfecção com os genes Siva e Vpr. As proteínas Siva e Vpr foram recentemente descritas como capazes de interagir fisicamente com as isoformas 1 e 2 de ANKHD1 respectivamente. Tanto a proteína a Siva quanto a Vpr foram atribuídos papéis de indução de apoptose em linfócitos T. Observou-se que ao cotransfectarmos Siva ou Vpr com ANKHD1 houve diminuição de expressão de ANKHD1 tanto para a isoforma 1 quanto para isoforma 2 (western blotting) e também se observou que a isoforma 1 de ANKHD1 é citoplasmática assim como ocorre com a Mask de drosófila, porém a isoforma 2 se mostrou predominantemente nuclear em microscopia de fluorescência. A análise funcional da hiperexpressão de ANKHD1 seguida de análise por FACS sugere diminuição de apoptose em células leucêmicas. Em conclusão, o presente estudo identificou diversos possíveis participantes da via de sinalização de ANKHD1 por análise microarray, relatou a diminuição da sua expressão em amostras de pacientes portadores de leucemia, bem como o aumento de sua expressão em linhagens leucêmicas sob a ação de diversos tratamentos correntemente utilizados no combate de desordens hematopoiéticas. Descrevemos também o aumento de expressão da expressão do gene BMF nas mesmas amostras em que há diminuição de ANKHD1, corroborando os dados encontrados no microarray da inibição de ANKHD1. Descrevemos também pela primeira vez a localização nuclear da isoforma 2 de ANKHD1, confirmando todas as previsões computacionais de localização de ANKHD1. Os resultados aqui descritos sugerem que ANKHD1 esteja envolvida com o fenótipo anormal da célula leucêmica e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 na hematopoiese Abstract: The human protein ANKHD1 (Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1) was initially described in Human prostate adenocarcinoma cells (LNCaP), and can also be expressed in many different leukemic cell lines. ANKHD1 is homologous to the Drosophila melanogaster Mask protein (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), related to differentiation, proliferation and survival in photoreceptors of Drosophila eyes. Direct interactions between ANKHD1 and SHP2, a protein that plays a critical role in hematopoiesis, have been described in the myeloid cell line K562, in prostate adenocarcinome, LNCaP, and in multiple myeloma cell line RPM1 8226. Nevertheless, little is known of the function of ANKDH1 and its role in leukemogenesis. The purpose of this work was to investigate the involvement of ANKHD1 in biological processes related to leukemogenesis. For this purpose, we used two main methodological approaches: ANKHD1 inhibition and overexpression. The inhibition of ANKHD1 in LNCaP cell lines was followed by the tracking through microarray of the remaining associated genetic alterations. Microarray revealed 706 genes with upregulated expression and 159 genes with downregulated expression; the genes were gathered in 26 functional groups and many genes, known for regulating cell cycle and apoptosis, had alterations in their expression profile. Importantly, inhibition of ANKHD1 resulted in significant increase in the expression of a large number of Histones, suggesting its role in epigenetic control. Among the validated modulations, some were also observed in the samples collected from leukemia patients. In this study, the downregulation of ANKHD1 was demonstrated in samples collected from 38 acute leukemia patients when compared to normal bone marrow cells. As this leukemic sample represented a natural model of inhibition of ANKHD1, the expression of other genes processed through array were tested, and the BMF gene, which was upregulated in the array, was also more elevated in leukemia samples. Simultaneously, cells of acute leukemia and myelodysplasia were subjected to the action of various drugs used to treat these diseases showing increased expression of ANKHD1. These data together with those observed in the microarray suggest the participation of ANKHD1 towards JAK/STAT1 and pathways of epigenetic control. The second approach used in this work was the ANKHD1overexpression, isoforms1 and 2, in tumor lines, followed by the detection of protein expression in cotransfection with Siva and Vpr genes. The proteins Siva and Vpr have been recently described as being capable of physical interaction with the isoforms 1 and 2 of ANKHD1, respectively. The role of inducing apoptosis in T lynphocytes was attributed to both Siva and Vpr. By cotrasfecting Siva and Vpr with ANKHD1 a reduction of ANKHD1 expression to isoform 1 as well as to isoform 2 (western blotting) was obtained and isoform 1 of ANKHD1 was observed to be citoplasmatic, such as occurs with drosophila Mask, although isoform 2 happened to be predominantly nuclear in the fluorescence microscope. Functional analysis of overexpression of ANKHD1 followed by FACS analysis suggests reduction of apoptosis in leukemic cells. Finally, this study identified many possible participants in the signaling pathway of ANKHD1 by microarray analysis, and related the reduction of its expression in leukemia patients, as well as the increasing of its expression in leukemic cell lines under the effect of many different treatments currently used against hematopoietic disorders. We also described the increasing of BMF expression in the same samples where we found a reduction of ANKHD1, corroborating all the data we obtained from the ANKHD1 inhibition microarray. In addition, we described, for the first time, the nuclear location of ANKHD1's isoform 2, confirming all the computer-aided predictions regarding the location of ANKHD1. The results herein described suggest that ANKHD1 could be involved with the abnormal phenotype of leukemic cells and these results could guide further studies towards elucidating the specific functions of ANKHD1 in hematopoiesis Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Iscia Teresinha Lopes Cendes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A construção de perfis de expressão usando microarrays tornou-se um método amplamente utilizado para o estudo dos padrões de expressão gênica. Estes estudos produzem uma grande quantidade de dados que faz com que a análise seja complexa e demorada. À medida que a qualidade dos arrays se torna mais confiável com a introdução dos arrays industriais, a quantidade de dados gerados aumenta e o ponto crítico dos experimentos, passa a ser garantir uma boa análise de bioinformática. Para facilitar esta análise desenvolvemos um pipeline que executa todos os passos de processamento de dados, tais como a correção de background, controle de qualidade, normalização, detecção de genes diferencialmente expressos e análises de clusterização. Além disso, nossa ferramenta permite a escolha de diversos testes estatísticos paramétricos e não paramétricos e também faz mineração de dados, buscando as informações relevantes dos genes e gerando links para diversos bancos de dados públicos. A função principal desta ferramenta é auxiliar pesquisadores que trabalham com microarrays, pois ela facilita a análise da grande quantidade de dados que este tipo de experimento gera, podendo fornecer uma análise personalizada com a escolha dos testes estatísticos e valores de corte de acordo com os parâmetros que o usuário julgar mais apropriado para as condições de seu experimento. A facilidade de uso e aplicações múltiplas implementadas apresentadas nesta ferramenta são inéditas e esperamos contribuir de maneira significativa para estimular e facilitar o uso dos estudos de expressão em larga escala Abstract: Expression profile using microarrays has become a widely used method for studying gene expression patterns. These studies produce a large amount of data which makes the analysis complex and time consuming. As the arrays' quality becomes more reliable the critical point remains the bioinformatics tools used to process and analyze the data generated in these large experiments. Therefore, we aimed to develop a pipeline that runs all the steps of data processing such as background correction, quality control, normalization, detection of differentially expressed genes and clustering analysis. In addition, our tool allows the choice of several parametric and non-parametric tests to be used for group comparisons. Furthermore, it can be used for data mining, searching for relevant information of genes as well as creating links to various public available databases. The main goal of this tool is to provide researchers working with microarray data a user friendly tool which includes customized statistical analysis. This type of research tool with this many function is not previously available and we hope to contribute to make large scale expression studies easier and faster, specially for researchers that are starting to use this type of technology Doutorado Neurociências Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Importante passo para a compreensão dos processos fisiopatológicos das neoplasias é a identificação de genes diferencialmente expressos e das funções biológicas de cada proteína codificada por estes genes. Rho GTPase activating protein 21 (ARHGAP21) é uma proteína pertencente à família RhoGAP, que interage com ARF-GTPases e com alfa-catenina, modulando a dinâmica da actina associada às membranas do Golgi e à integridade das junções aderentes. O objetivo geral do presente estudo foi investigar as funções da proteína ARHGAP21 em células endoteliais e de adenocarcinoma de próstata com relação à viabilidade celular, ciclo celular, migração, adesão e expressão gênica. Neste trabalho foi demonstrado que ARHGAP21 possui atividade RhoGAP para RhoA e RhoC. Em células HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), foi observada uma localização nuclear e citoplasmática de ARHGAP21 e sua depleção induziu alterações no ciclo celular. Além disso, ensaios de microarranjos de DNA em HUVECs demonstraram modulação de genes como PAI-1, BNIP3, staniocalcina 1 e podocalyxin. Em linhagens celulares de adenocarcinoma de próstata (LNCaP e PC-3), também foi observada uma localização nuclear e citoplasmática de ARHGAP21. A diminuição da expressão desta proteína em células PC-3 resultou em redução da viabilidade e da migração celular em fibronectina. Com relação à viabilidade celular, a inibição de ARHGAP21 tem efeito adicional ao agente quimioterápico cisplatina. Em células LNCaP, por sua vez, foi observada uma menor adesão em matrigel e fibronectina das células submetidas à inibição da expressão de ARHGAP21, em comparação às células controle. Experimentos de microarranjos de DNA e RT-PCR quantitativo em tempo real em células de adenocarcinoma de próstata submetidas à inibição de ARHGAP21 demonstraram expressão alterada dos genes TGF-beta induced e dos genes BNIP3, staniocalcina 1 e podocalyxin, que também foram modulados nas células HUVECs com inibição da expressão de ARHGAP21. Em conclusão, o presente estudo identificou ARHGAP21 como uma proteína com importantes funções em células endoteliais e de adenocarcinoma de próstata, através da regulação da viabilidade, adesão e migração celular. Os achados aqui descritos sugerem que ARHGAP21 pode ser uma molécula alvo para a terapia de neoplasias, provavelmente através da sua função como reguladora da atividade de RhoA e RhoC Abstract: One step in the path towards building a comprehensive molecular portrait of human cancer is the definition of differentially expressed genes and the function of their coding proteins. Rho GTPase activating protein 21 (ARHGAP21) is a RhoGAP protein, which interacts with ARF-GTPases and alpha-catenin, controlling actin dynamics on Golgi membranes and the integrity of adherens junctions, respectively. The aim of the present study was to investigate ARHGAP21 functions on endothelial and prostate cancer cells regarding to cell viability, cell cycle, migration, adhesion and gene expression. This study demonstrated that ARHGAP21 has RhoGAP activity for RhoA and RhoC. ARHGAP21 localized in the nucleus and cytoplasm of HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) and its depletion alteres the cell cycle phases. Furthermore, microarrays assays in HUVECs ARHGAP21 knockdown demonstrated modulation of genes such as PAI-1, BNIP3, stanniocalcin 1 and podocalyxin. In the prostate adenocarcinoma cell lines (LNCaP and PC-3), ARHGAP21 is also located in the nucleus and cytoplasm. Depletion of this protein in PC-3 cells resulted in decrease of cell viability and migration in fibronectin. Regarding to cell viability, inhibition of ARHGAP21 has an additional effect on cisplatin chemotherapeutic agent. In LNCaP cells, a lower adhesion was observed in matrigel and fibronectin of cells subjected to inhibition of ARHGAP21 expression compared to control cells. DNA microarray and quantitative RT-PCR experiments on prostate adenocarcinoma cells ARHGAP21 knockdown showed modulation of TGF-beta induced gene expression. The expression of BNIP3, stanniocalcin 1 and podocalyxin was also altered in HUVECs cells ARHGAP21 knockdown. In conclusion, this study identified ARHGAP21 as a protein with important functions in endothelial cells and prostate adenocarcinoma, by regulating cell viability, adhesion and migration. The findings described here suggest that ARHGAP21 may be a molecule target for cancer therapy, probably due to its GAP activity for RhoA and RhoC Doutorado Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Margareth Castro Ozelo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Uma complicação decorrente do tratamento da hemofilia é a formação de anticorpos neutralizadores da atividade coagulante do fator VIII ou IX (inibidores). Diversos fatores estão relacionados com o desenvolvimento desses inibidores em indivíduos com hemofilia, incluindo fatores genéticos e ambientais. Entre os fatores genéticos, a mutação associada ao diagnóstico da hemofilia é um fator de risco bem documentado. Recentemente foi observada a maior ocorrência de inibidores em indivíduos da etnia negra. O objetivo deste trabalho foi analisar os aspectos genéticos e não genéticos envolvidos no desenvolvimento de inibidores. Foram incluídos nesse estudo 411 pacientes hemofílicos, sendo 321 com hemofilia A (HA) (238 famílias) e 99 com hemofilia B (HB) (59 famílias). A presença de inibidores foi constatada apenas entre os pacientes HA graves. Do total de 220 HA graves desse estudo, 46 (20,9%) apresentaram inibidor detectado em pelo menos uma ocasião após sua inclusão no estudo. Mutações consideradas de alto-risco para o desenvolvimento de inibidores foram identificadas em 125/220 pacientes HA graves (58,8%), e 33 deles desenvolveram inibidores (26,4%). Considerando o grupo étnico de acordo com traços físicos e ancestralidade, 38% dos pacientes HA graves foram classificados como negros. A incidência de inibidores foi maior nesse grupo de pacientes (31% do total de pacientes HA graves classificados como negros) quando comparada aos pacientes caucasóides (20% do total de pacientes HA graves classificados como caucasóides). Recentemente, foi observado que a maior incidência de inibidores em uma população norte-americana de pacientes com HA, estava relacionada com a presença de determinados haplótipos no gene do fator VIII. Esta observação poderia ser explicada pelo fato dos as proteínas expressas pelos haplótipos que aparecem exclusivamente entre a população negra (denominados H3 e H4), estarem ausentes nos concentrados de fator VIII recombinantes utilizados rotineiramente no tratamento desses pacientes. Em nossa análise a presença desses haplótipos não está relacionada com a maior freqüência de inibidor na população negra desse estudo. Além disso, a distribuição dos diferentes haplótipos do gene do fator VIII, classificados de H1 a H6, foi distinta entre todos os grupos étnicos brasileiros e norte-americanos. Essa observação pode ser explicada pela origem distinta entre os negros que imigraram da África para o Brasil e para a América do Norte, assim como o alto índice de miscigenação de nossa população. Em outra fase desse estudo, foi realizada a análise comparativa da expressão gênica a partir de amostras de RNA mensageiro (RNAm) extraídas em pool leucocitário de pacientes com HA grave, com ou sem a presença de inibidores. Na avaliação que incluiu numa primeira análise pacientes de uma mesma família discordante para a presença de inibidor e, em uma segunda fase, indivíduos não relacionados, foram observados 50 genes mais expressos e 16 genes menos expressos em pacientes com inibidor em comparação aos sem inibidor. Dentre esses genes foram selecionados dez, levando-se em conta sua participação na resposta imune ou sua correlação prévia com o desenvolvimento de inibidores em outros estudos. Pela técnica de PCR em tempo real, observou-se que os genes da interleucina 8 (IL-8) e da cistatina F (CST7) demonstraram ser mais expressos em pacientes com inibidor, enquanto que o gene da interleucina 10 (IL-10) foi menos expresso nesse grupo de pacientes. Dessa forma, nossos resultados fortalecem a idéia de que o mecanismo de desenvolvimento de inibidores em hemofilia é complexo e ainda não totalmente esclarecido e que existe um grande envolvimento de diversos genes relacionados com sistema imune na formação desses inibidores. O estudo em diferentes populações é uma importante etapa para o entendimento dos fatores de risco para o desenvolvimento de inibidores. Esse foi o primeiro trabalho realizado no Brasil incluindo pacientes de diversas regiões e analisando simultaneamente diferentes fatores e seu envolvimento com o desenvolvimento de inibidores. A determinação desses fatores de risco ajudará no futuro a determinar um tratamento diferenciado para o controle e sobretudo prevenção do desenvolvimento de inibidores Abstract: The most serious complication of the treatment of hemophilia is the development of neutralizing antibodies to coagulation activity of factor VIII or IX (inhibitors). Several risk factors are related to the development of these inhibitors in patients with hemophilia, including genetic and environmental factors. Among genetic factors, the mutation associated with the diagnosis of hemophilia is a risk factor well documented. Recently, it was observed a higher incidence of inhibitors in African ancestry patients. The aim of this study was to analyze the genetic and non-genetic factors involved in the development of inhibitors. The study included 411 hemophilia patients, of which 321 with hemophilia A (HA) and 99 with hemophilia B (HB), belonging to a total of 238 and 59 families, respectively. The inhibitors were observed only in severe HA patients. From the 220 severe HA, 46 (20.9%) had inhibitor. The high risk mutation for the development of inhibitors were identified in 125 / 220 (58.8 %) severe HA patients, and 33 (26.4 %) of them developed inhibitors. Considering the ethnic group according to physical traits and ancestry, 38 % of severe HA patients were classified as black. The incidence of inhibitors is higher in this group of patients (31%) when compared to Caucasian patients (20%). The higher risk of inhibitor among African-Brazilians, could not be explained by the presence of the distinct factor VIII haplotypes, such as H3 and H4, as suggested in previous study. In fact, the prevalence rates of these haplotypes were distinct between Brazilians and North Americans, probably due to the fact that migrations of blacks to Brazil and to North America were originated from different geographic areas of Africa. In another phase of this study, we performed a comparative analysis of gene expression in samples of messenger RNA (mRNA) extracted from leukocytes of inhibitor and non-inhibitor patients with severe HA was performed. The evaluation consisted of an initial analysis of severe HA patients siblings, or from the same family, discordant for inhibitor development and in a second phase a group of unrelated individuals. Using the bioarrays technology 50 genes were upregulated and 16 were downregulated in inhibitor patients compared with non-inhibitor patients. Ten genes were selected among them, which are involved in immune response and were related to inhibitors development in other studies. It was observed by real time PCR that the genes for interleukin 8 (IL-8) and cystatin F (CST7) were upregulated and for interleukin 10 (IL-10) was downregulated in inhibitor patients. In conclusion, our results strengthen the idea that the mechanism of inhibitor development in hemophilia is complex, not clear and there is a large involvement of several genes related to the immune system in the development of these inhibitors. The study in different populations is important to understand the risk factors for the development of inhibitors. This is the first work in Brazil, to study patients from various regions and to performe analysis of different factors and their involvement in the development of inhibitors. The determination of these risk factors will help in the future to determine differential treatment for the control and in particular, for preventing the development of inhibitors Doutorado Clínica Médica Doutor em Clínica Médica

Orientador : Lilian Maria de Castilho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O sistema de grupo sangüíneo Dombrock é constituído por um par de antígenos antitéticos, Doa e Dob, e três antígenos de alta freqüência populacional, Gregory (Gya), Holley (Hy) e Joseph (Joa). O gene DO, que codifica os antígenos do sistema Dombrock, foi recentemente clonado e suas bases moleculares foram elucidadas. Os antígenos Doa e Dob. são controlados pelos alelos DOA e DOB que estão associados à troca de três nucíeotídeos no exon 2 do gene DO: 378C/T, 624T/C e 793A/G, respectivamente. O fenótipo Jo(a-) está associado com a substituição 350C/T que caracteriza o alelo JO. O fenótipo Hy-negativo está associado à presença de um dos alelos: HY1 ou HY2. O alelo HY2 é caracterizado pela substituição 323G/T. Uma substituição adicional 898C/G, no exon 3, caracteriza o gene HY/1. Recentemente dois novos alelos foram descritos: DOB- SH (378C, 624C, 793G) e DOA-HA (378T, 624T, 793A). Considerando que: as bases moleculares dos antígenos Dombrock foram elucidadas; que novos alelos têm sido descritos; a miscigenação da população brasileira e que até o momento nenhum estudo foi realizado sobre a freqüência dos genes Dombrock na nossa população, estudamos 450 amostras de DNA, através das técnicas de PCR-RFLP e Microarrays® - HEA Beadchip para determinar a freqüência dos aletos DO {DOA, DOB, HY1, HY2, JO). Dois novos alelos foram identificados baseados em novas combinações de SNPs: alelo DOB- WL (793G, 898G, 323C) e alelo DOA-SH (378C, 624C, 793A). Nossos dados demonstram uma grande complexidade e heterogeneidade dos alelos Dombrock na população brasileira e confirmam a necessidade do estudo molecular em diferentes populações Abstract: Background: The molecular basis of the Doa and Dob polymorphism, are associated with three single-nucleotide polymorphisms (SNPs) on exon 2 of DO gene: 378C>T, 624T>C and 793A>G, DOA and DOB alleles, respectively. The SNPs 350OT (JO allele) and 323G>T (HY allele) are associated with: Jo(a-) and Hy-negative phenotype. Recently, two new DO alleles were identified using the microarray technology, DOB-SH (378C, 624C, 793G) and DOA-HA (378T, 624T, 793A). Although the molecular background of Dombrock system is well defined, no studies were carried out in the Brazilian population. Methods: We employed PCR-RFLP based assays and a microarray assay to determine the frequency of the DO alleles {DOA, DOB, HY1, HY2 and JO) in Brazilians. We tested DNA of 288 Brazilians people by PCR-RFLP to determine the 793A>G (DOA/DOB), 323G>T {HY), 350OT (JO) and 8980G {HY1IHY2) SNPs. We also tested DNA from 162 blood donors by the HEA Beadchip¿ (BioArray Solutions, USA) to determine the 3780T, 624T>C, 793A>G (DOAIDOB), 350OT (JO allele) and 323G>T (HY) SNPs. Results: Two novel alleles combinations were found in our samples: the 793G SNP (DOB allele) associated with 898G and 323G (DOB-WL) and the SNPs 378C, 624C, 793A and 323G (DOA-SH). We also found the DOB-SH and DOA-HA alleles recently reported. Conclusion: Our data demonstrate high heterogeneity of DO alleles in the Brazilian population and highlight the importance of testing a cohort of different populations to determine the DO allele combinations and establish reliable genotyping to predict the Doa/Dob antigen status Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica