Search

HLA-F belongs to the non-classical HLA-Ib molecules with a marginal polymorphic nature and tissue-restricted distribution. HLA-F is a ligand of the NK cell receptor KIR3DS1, whose activation initiates an antiviral downstream immune response and lead to delayed disease progression of HIV-1. During the time course of HIV infection, the expression of HLA-F is upregulated while its interaction with KIR3DS1 is diminished. Understanding HLA-F peptide selection and presentation is essential to a comprehensive understanding of this dynamic immune response and the molecules function. In this study, we were able to recover stable pHLA-F*01:01 complexes and analyze the characteristics of peptides naturally presented by HLA-F. These HLA-F-restricted peptides exhibit a non-canonical length without a defined N-terminal anchor. The peptide characteristics lead to a unique presentation profile and influence the stability of the protein. Furthermore, we demonstrate that almost all source proteins of HLA-F-restricted peptides are described to interact with HIV proteins. Understanding the balance switch between HLA-Ia and HLA-F expression and peptide selection will support to understand the role of HLA-F in viral pathogenesis. Electronic supplementary material The online version of this article (10.1007/s00251-019-01112-1) contains supplementary material, which is available to authorized users.

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015, Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2015, Çevresel stres faktörleri arasında kuraklık tarımda en şiddetli etkiye sahip olan faktörler arasındadır ve buna bağlı olarak kuraklık stresi altında verimi arttırmak tarımda en önemli hedeflerden biri haline gelmiştir. Kuraklık ya da su yetersizliği bitkinin hücresel metabolizmasını doğrudan etkiler. Büyüme indisinde ve böylece verimde ciddi bir azalmaya yol açar. Pek çok çalışma, kuraklık stresine cevap sürecinde hücrede karmaşık bir ağın varlığını vurgulamıştır. Protein ekspresyonundaki değişiklikler bu ağda esas rolü üstlenmektedir. Tarımsal verim artışının sağlanmasında ana strateji, kuraklık altında verimin sürdürülebilmesi için gereken özelliklerin bir araya getirilmesi ve en etkili genlerin ve dolayısıyla proteinlerin, verim potansiyeli üzerinde zararlı etkileri olmadan elit genotiplerde biriktirilmesidir. Bu yaklaşım, kurak çevrede stabil kalabilen ve yüksek verim potansiyeli sunabilen yeni bitki varyetelerinin geliştirilmesine olanak tanıyacaktır. Bitkilerde kuraklık stresine cevap mekanizmasının aydınlatılabilmesi için transkriptom düzeyinde çok sayıda araştırma gerçekleştirilmiştir. Ancak mRNA seviyesindeki değişiklikler transkripsiyon ve translasyon sonrası modifikasyonlara bağlı olarak, her zaman protein seviyesiyle korelasyon göstermemektedir. Bu nedenle transkriptom çalışmaları, stres cevabına ilişkin ağın anlaşılmasında yetersiz kalmaktadır. Dolayısıyla kuraklık stresine ilişkin mekanizmaların aydınlatılabilmesi için proteom düzeyinde bilgiye ihtiyaç vardır. Akdeniz ve Ortadoğu bölgesi yerel bitkisi olan Brachypodium distachyon, buğday, arpa, yulaf ve çavdar gibi beslenmede temel öneme sahip tahılların da içinde bulunduğu çim ailesinin (Poaceae) bir üyesidir. Brachypodium distachyon, kompakt bir genoma sahip olma (272 Mb), 5 çift kromozom (2n=10), kısa yaşam döngüsü (~12 hafta), kolay gen aktarımı, kendi kendine döllenmesi ve basit büyüme koşulları gibi özellikleri ile model organizma olmak için gereken bütün vasıflara sahiptir. Model bitki özellikleri ve önemli tahıllar ile yakın akrabalığı, Brachypodium distachyon’u tüm serin iklim tahıl türlerinin, özellikle de hububatların geliştirilmesi için dikkat çekici bir model bitki haline getirmektedir. Ayrıca, yabani bir tür olan Brachypodium distachyon’un kuraklık stresine cevapta fizyolojik olarak geniş varyasyon gösterdiği bilinmektedir ve bu çeşitlilik stres koşulları altında ifade edilen yeni genlerin, dolayısı ile çeşitli proteinlerin bulunabilmesine olanak sağlayacaktır. Brachypodium distachyon’un süregelen transkriptomik analizleri mevcuttur ancak yukarıda belirtildiği gibi transkriptomdaki değişiklikler proteom seviyesindeki sonuçları her zaman birebir yansıtmadığından, proteomun incelenmesine yönelik analizlerin gerekliliği bu bitki için de söz konusudur. Proteinler sinyalizasyonun ve biyokimyasal yolakların önemli bileşenleridir, bu nedenle protein seviyesindeki çalışmalar bitkilerin büyüme, gelişme ve çevreyle etkileşimlerinin altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması için gereklilik arz etmektektedir. Örnek hazırlama, yüksek çözünürlüklü protein ayrıştırma, protein karakterizasyonu için MS yazılımı ve donanımı ve biyoinformatik araçlardaki gelişmelere büyük ölçüde bağlı olarak bitki proteom çalışmalarında son yıllarda büyük bir ilerleme kaydedilmiştir. Bitki proteomu çalışmalarında amaç protein türlerinin kataloglanması ile sınırlı değildir, fonksiyonel biyoloji altında proteinlerin kalitatif ve kantitatif analizlerini de kapsar. Proteomik çalışmalardan elde edilen zengin verisetleri protein kimliği, miktarı, hücredeki lokalizasyonu, proteinin post-translasyonel modifikasyonu, protein-protein etkileşimleri ve kompleks proteomun oluşumunu kapsar. Bitki proteomik çalışmalarının sistem biyolojisiyle bütünleşmesi pek çok moleküler mekanizmanın anlaşılmasına öncülük edecek ve sonunda bitki verimi, gıda ve savunma için önemli olan süreçlerin mühendisliğini sağlayacaktır. Bu çalışmada, Brachypodium distachyon bireylerinin zamana bağlı kuraklık uygulamasına maruz bırakılmasının ardından (4, 8 ve 12 günlük kuraklık uygulaması), protein repertuarında meydana gelen değişiklikler belirlenmiştir. Söz konusu amaç için, iki boyutlu jel elektroforezi (2D-DIGE) ve kütle spektrometrisine (MS) dayalı proteomik yaklaşım gerçekleştirilmiştir. Elde edilen proteom verilerinin karşılaştırılması sonucunda kuraklığa bağlı farklı düzeylerde anlatım gösteren proteinlerin varlığı saptanmıştır. Otuz yedi protein spotu kuraklık koşulu altında anlamlı varyasyon göstermiştir. Kütle spektrometresi ile tanımlanan on üç protein fonksiyonlarına göre sınıflandırılmış ve Brachypodium distachyon’un kuraklığa cevap mekanizmasındaki rol ve ilişkileri tartışılmıştır. Kuraklık stresine cevap olarak çakışan metabolizmaların varlığı belirlenmiştir. Çalışmanın neticesinde tespit edilen proteinler kuraklığa tolerans gösteren bitkilerin belirlenebilmesi için biyomarkör olma potansiyeli teşkil etmektedir. Ayrıca, belirlenen proteinler Brachypodium distachyon’un yakın akrabalık gösterdiği tahıllarda (buğday, arpa, yulaf, çavdar vb.) kuraklık stresine direnç geliştirilmesi çalışmalarına katkıda bulunacaktır., Among the environmental stress factors, drought is the one that has the most severe effect on agricultural production. Hence, improving the yield under drought stress is one of the most important challenges in agriculture. Drought or water deficit has a direct impact on the cellular metabolism of plant. This impact significantly reduces the growth index and crop yield. A number of studies highlighted the existence of a complex network in the cell upon drought stress. Changes in protein expression play the major role in this complex network. The main strategy to improve crop yield is to integrate all the properties that are required to sustain yield under drought stress and accumulate the most powerful genes and proteins in elite genotypes without any harmful effect on the potential crop yield. This approach will provide the improvement of new plant cultivars that are stable and exhibit high yield potential under drought conditions. In plants, there are number of studies on transcriptome level to elucidate the mechanisms underlying stress response. However, alterations in mRNA levels do not always correlate well with protein levels in the cell due to the post-transcriptional and post-translational modifications. Therefore, transcriptome studies are insufficient for understanding the complex network of stress response, causing a lack of knowledge for the enlightenment of the mechanisms related to stress response. Brachypodium distachyon, model plant for monocot species, exhibits a close relationship to agriculturally and economically important crops. It is also known that Brachypodium distachyon displays high variation in the response against drought stress. This variation will potentially lead to identify new stress-responsive genes and thus proteins. Ongoing transcriptomic analyses in Brachypodium distachyon are available. However, requirement of proteomic analyses is an emerging subject for this plant species. In this study, changes in protein repertoire of Brachypodium distachyon leaves after exposing individuals to time-dependent drought stress (4, 8 and 12 day application of drought) were described. Based on two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), constructed with 3 replicates, and combined mass spectrometry (MS) experiments, a proteomic approach was carried out for this purpose. The comparison of the resulting proteomic data highlighted differentially expressed proteins (DEPs) upon drought stress. 37 differentially expressed proteins were detected via statistical evaluation of relative spot densities and among these one, thirteen DEPs were identified by MS and classified according to their functions. The role and relation of DEPs in drought response of Brachypodium distachyon were discussed. The biological functions of DEPs included roles in photosynthesis, protein folding, antioxidant mechanism and metabolic processes. It has been highlighted that there is a significant degree of overlapping between metabolic alterations induced by drought stress. The identified proteins in this study could serve as potential biomarkers for the selection of drought-tolerant Brachypodium distachyon plants as well as its relatives like wheat, barley and rye. Furthermore, identified proteins will contribute on the studies on development of drought-resistant crop species such as wheat, oat and barley, which are close relatives of Brachypodium distachyon., Yüksek Lisans, M.Sc.

Mitochondriopathien sind Multisystemerkrankungen die durch verschiedene Defekte in den Energie (ATP) produzierenden Stoffwechselwegen der Mitochondrien verursacht sind. Will man Mitochondriopathien auf molekularer Ebene diagnostizieren, stößt man auf folgende Schwierigkeiten: (A) Ungefähr 1000 Gene sind an der Biogenese des Mitochondriums beteiligt. Die Dysfunktion jedes einzelnen dieser Gene kann potentiell zur Mitochondriopathie führen. (B) Mitochondriale Proteine werden durch zwei Genome, durch die mitochondriale und durch die nukleäre DNA kodiert. (C) Die klinischen Symptome der Patienten weisen selten auf die molekulare Diagnose, da der Phänotyp oft nur auf einem sekundären Energiemangel beruht. In der Regel besteht keine sichere Genotyp-Phänotyp-Relation. Mit den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Methoden lassen sich bei nur 20% der Patienten Mutationen finden. Wir wollten daher eine neue Screening-Methode entwickeln, mit deren Hilfe wir hoffen, die Aufspürungsrate für mitochondriale Mutationen zu erhöhen. Die Gesamtheit der Proteine einer Organelle oder einer ganzen Zelle (ihr "Proteom") stellt das Verbindungsglied zwischen Geno- und Phänotyp dar. Aus diesem Grunde wollten wir das mitochondriale Proteom von gesunden Kontrollpersonen und von Patienten mit Mitochondriopathien untersuchen. Protein-Muster, die zwischen diesen beiden Gruppen abweichen, könnten die Aufmerksamkeit auf Gene und Proteine richten, die an der Entstehung des Krankheits-Phänotyps beteiligt sind. Um solch eine vergleichende Studie durchzuführen, muß zunächst eine Referenzkarte des normalen mitochondrialen Proteoms erstellt werden. In meinem Dissertationsprojekt habe ich diese grundlegende Arbeit durchgeführt und zahlreiche Proteine auf der Proteomkarte menschlicher Mitochondrien identifiziert, die aus Epstein-Barr-Virus-transformierten lymphoblastoiden Zellen gewonnen worden waren. Ich wählte diese Zellsorte als Untersuchungsmaterial, da sie nicht nur einfach von Patienten gewonnen werden, sondern auch potentiell permanent wachsen kann. Dies erlaubt die Züchtung einer hohen Zellzahl ohne übermäßigen Aufwand. Ich optimierte ein Protokoll zur Zentrifugation in einem hybriden Gradienten, mit dem genug gereinigte Mitochondrien aus 108 Zellen gewonnen werden konnten. Für die Referenzkarte benutzte ich die lymphoblastoide Zellline einer gesunden Kontrollperson. Die Methode der Wahl zur Proteinidentifikation in Proteom-Projekten ist die zweidimensionale Proteinelektrophorese gekoppelt mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Ich entdeckte mehr als 400 Punkte in meinem silbergefärbten zweidimensionalen Gel und analysierte die 141 stärksten Punkte nach in-gel Trypsin-Verdau und anschließender MALDI-TOF-Massenspektrometrie in einem Verfahren, das als "Peptide Mass Fingerprinting" (Peptidmassen-Fingerabdruck) bezeichnet wird. Mit Hilfe entsprechender Datenbanken konnte ich schließlich 115 verschiedene Proteinpunkte (entsprechen 95 verschiedenen Proteinen) identifizieren. 90 dieser Punkte (entsprechend 74 verschiedenen Proteinen) waren sicher mitochondrialer Herkunft und sind Komponenten aller wesentlichen im Mitochondrium lokalisierten Stoffwechselwege. 16 der 74 identifizierten mitochondrialen Proteine gehören zur Atmungskette. Obwohl 18 mitochondriale Proteine in der Datenbank SWISS-PROT als "Membran-assoziiert" annotiert sind, identifizierte ich nur vier Proteine mit sicheren Transmembrandomänen. Ich entdeckte keine der 13 durch die mitochondriale DNA kodierten Proteine, die alle stark hydrophobe Membranproteine sind. Andere Forscher sind bei dem Versuch diese Proteine zu identifizieren, auf die gleichen Schwierigkeiten gestoßen. Mit meiner Dissertationsarbeit habe ich unsere eigene Datenbank und Referenzkarte des mitochondrialen Proteoms lyphoblastoider Zellen erstellt. Diese Daten ermöglichen nun die Analyse des mitochondrialen Proteoms von Patienten. Meine weiteren Untersuchungen auf diesem Gebiet werden sich nun auf die genetische Variabilität des Proteoms gesunder Kontrollpersonen und auf das Proteom der Patienten mit Mitochondriopathien beziehen., Mitochondrial disorders are multisystem diseases that can be caused by any defect in the energy (ATP) generating pathways in the mitochondria. The difficulty in diagnosing mitochondrial diseases on the molecular level arises from several obstacles: (A) About 1000 genes are involved in the biogenesis of mitochondria. The dysfunction of each of them may potentially cause mitochondriopathy. (B) The mitochondrial proteins are encoded by two genomes: the mitochondrial DNA and the nuclear DNA. (C) The clinical symptoms of the patients rarely suggest a molecular diagnosis since in most cases, the phenotype is a secondary phenomenon to energy depletion. Generally there is no genotype-phenotype relation. Based on current diagnostic methods in only 20% of the patients a mutation can be found. We therefore wanted to develop a new screening method by which we hope to increase the identification rate. Since the numerous proteins of an organelle or of a whole cell (its "proteome") connect the genotype with the phenotype, we set out to study the proteome of the mitochondrion in healthy individuals and in patients with mitochondrial diseases. Deviating protein patterns between the two individuals could direct the attention to disease-specific proteins and genes, which might be involved in the expression of a disease-phenotype. In order to perform such a comparison I first had to establish a normal reference map. In my dissertation project I performed this basic task and identified numerous mitochondrial proteins on the proteome-map of human mitochondria, which had been extracted from lymphoblastoid cells. I selected Epstein-Barr-Virus-transformed lymphoblastoid cells as samples not only because they are easily obtained from patients, but also due to their potential permanent growth. This approach allows the cultivation of high cell numbers without excessive expenditure of work and cost. I optimized a protocol for hybrid gradient centrifugation, by which enough mitochondria can be purified from 108 cells. I used a cultured lymphoblastoid cell line from a normal control patient and isolated mitochondria from it by using hybrid gradient centrifugation. In proteomics the combination of the high-resolution two-dimensional electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time-of-flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) is currently the method of choice for protein identification. I detected more than 400 spots in a silver-stained two-dimensional gel. I analyzed the 141 strongest spots of it by trypsin in gel digestion and subsequent MALDI-TOF mass spectrometry in a process termed "peptide mass fingerprinting". After database search, I finally identified 115 protein spots (corresponding to 95 different proteins), 90 of which (corresponding to 74 different proteins) are of confirmed mitochondrial origin. These identified proteins are components of the main biological pathways located in the mitochondrion. 16 of the 74 identified mitochondrial proteins belong to the respiratory chain. Despite the fact that 18 mitochondrial proteins are annotated in the SWISS-PROT-database as "membrane associated proteins", only four of them have clear transmembrane domains. None of the proteins encoded by the mitochondrial DNA could be detected. All of them are hydrophobic membrane proteins. A similar difficulty in resolving these proteins was encountered by other research groups. With my dissertation I established our own database and reference map of the mitochondrial proteome of lymphoblastoid cells. These data will facilitate the analysis of the mitochondrial proteome in patients. My future research based on this dissertation will mainly focus on the genetic variation of the proteome of healthy individuals and on patients with mitochondrial diseases.