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Orientador: Marcelo Giannini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: O objetivo desse trabalho in vitro foi avaliar a incorporação de dois agentes anti-cárie, Apigenin (Api) e tt-Farnesol (Far), em adesivos dentinários, resina composta (CO) e cimento resinoso (CE), e o seu efeito na redução da virulência do Streptococcus mutans, na adesão dos adesivos à dentina, e nas propriedades mecânicas dos CO e CE. Api (1 mM) e Far (5 mM) foram adicionados separados ou em combinação à um adesivo autocondicionante (Clearfil S3 Bond Plus: CS3) e à um convencional (OptiBond S: OPT). Api (5 mM) e Far (5 mM) também foram adicionados separados ou em combinação, com ou sem flúor (F) ao CO e CE e comparados aos controles sem adições. Biofilme de S. mutans foi crescido na superfície de discos de adesivo-hidroxiapatita e em discos de CO e CE. Após 115h de incubação, a viabilidade bacteriana, peso seco, polissacarídeos (insolúveis, solúveis e intracelulares), e proteína foram quantificados. Imagens qualitativas em MEV foram obtidas do biofilme. Resistência de união foi avaliada e imagens em MEV da interface adesivo-dentina foram obtidas. S. mutans foi crescido na superfície de cavidades classe I restauradas com CO ou CE. Após incubação, foram observados a desmineralização cariosa e a infiltração bacteriana ao longo do gap de contração em microscopia confocal. Em adição, a resistência à flexão e modulo de elasticidade do CO e CE foram determinados. Os adesivos, CS3 com Api ou Api+Far, e OPT com Api ou Far reduziram o peso seco do biofilme de S. mutans. Os polissacarídeos insolúveis reduziram com a adição de Api ao CS3 e Far ao OPT. Os polissacarídeos intracelulares reduziram com a adição de Api e Api+Far ao CS3. Nenhuma diferença foi observada nas proteínas ou nos polissacarídeos solúveis. A resistência de união ou a interface adesivo-dentina não foram alterados comparados aos grupos controles. No caso do CO e CE, a viabilidade bacteriana reduziu para o CE com Api+Far+F. O peso seco e os polissacarídeos insolúveis e intracelulares foram reduzidos com a adição de Api, Api+Far ou Api+Far+F para ambos os materiais. As proteínas reduziram com a adição de Api ou Api+Far ao CO, e Api ou Far ao CE. Nenhuma diferença foi observada nos polissacarídeos solúveis, resistência flexural, modulo de elasticidade, ou infiltração bacteriana para o CO e CE. Entretanto, uma menor fluorescência do esmalte remanescente foi observada para o CO e CE contendo as adições, e as imagens de MEV confirmaram um biofilme mais denso dos grupos controles para todos os materiais testados. CS3 com Api ou Api+Far e, CO ou CE com Api, Api+Far ou Api+Far+F mostraram uma maior redução na virulência do S. mutans. O efeito da incorporação desses compostos naturais é material dependente; entretanto, as adições não interferiram com a performance de adesão dos adesivos ou com as propriedades mecânicas do CO ou CE. Nenhuma adição foi capaz de suprimir a atividade do S. mutans, mas a incorporação de Api e Far em materiais restauradores pode ser uma abordagem promissora para melhorar as propriedades cariostáticas quando o esmalte ainda está presente Abstract: The aim of this in vitro study was to evaluate the incorporation of two anti-caries agents, Apigenin (Api) and tt-Farnesol (Far) into dental adhesives, a resin composite (CO), and a resin cement (CE), and its effect on the virulence of Streptococcus mutans, bonding performance to dentin, and mechanical properties of the CO and CE. Api (1 mM) and Far (5 mM) were incorporated separately, or in combination, into a self-etch adhesive (Clearfil S3 Bond Plus: CS3), and an each-and-rinse adhesive (OptiBond S: OPT). Api (5 mM) and Far (5 mM) were also incorporated separately or in combination, with or without fluoride (F), into CO and CE and compared to controls without additives. S. mutans was grown to form a biofilm on the surface of adhesive-coated hydroxyapatite, on CO or CE disks. Following 115 h of incubation, bacterial viability, dry-weight, polysaccharide composition (alkali soluble, water soluble and intracellular), and total protein content were quantified. Qualitatively SEM images from the biofilms were obtained. Bond strength was measured and SEM images of the dentin-adhesive interface were obtained. S. mutans biofilm was grown on the surface of class-I cavities restored using CO or CE. After incubation, was observed the carious demineralization and bacteria infiltration through a contraction-formed gap along the restoration margin, using confocal microscopy. In addition, the flexural strength and elastic modulus of CO and CE were determined. The adhesives, CS3 with Api or Api+Far, and OPT with Api or Far, reduced the dry-weight of S. mutans biofilm. Insoluble polysaccharide reduced with the addition of Api to CS3 and Far to OPT. Intracellular polysaccharide was also decreased by the addition of Api and Api+Far to CS3. No differences were observed in the total amount of protein or soluble polysaccharide. In addition, neither the bond strength nor the dentin-adhesive interfacial morphology was altered compared to the control groups. In the case of CO and CE, the bacterial viability reduced for CE with Api+Far+F. Dry-weight and insoluble and intracellular polysaccharides were reduced by the addition of Api, Api+Far or Api+Far+F for both materials. The amount of protein declined with the addition of Api or Api+Far to CO, and Api or Far to CE. No differences were observed in the soluble polysaccharides, flexural strength, elastic modulus, or bacteria infiltration for CO or CE. However, lower fluorescence of the remaining enamel was observed for both CO and CE groups with additives, and SEM images confirmed that the densest biofilms were observed in the control groups for all materials tested. CS3 with Api or Api+Far and, CO or CE with Api, Api+Far or Api+Far+F showed the greatest reduction of S. mutans virulence. The effect of incorporation of these natural compounds is material-dependent; however, the additives did not interfere with adhesive-bonding performance or with the mechanical properties of the CO or CE. No additive was able to completely suppress S. mutans activity, but the incorporation of Api and Far into restorative materials appears to be a promising approach for enhancing cariostatic properties when remaining enamel is present Doutorado Dentística Doutora em Clínica Odontológica CNPQ 140698/2013-2 FAPESP 2013/22813-9, 2014/17543-9

Orientadores: Fernanda Miori Pascon, Marcelo Giannini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: Os objetivos nesta tese foram: (1) investigar o efeito de FeCl3 na atividade da Catepsina K (CT-K) e capacidade de prevenir degradação do colágeno solúvel (CS) e insolúvel (CI); (2) comparar os efeitos do ácido fosfórico a 35% (AF) e soluções condicionantes contendo ácido cítrico (AC) e FeCl3 na resistência da união a dentina e degradação do colágeno. A tese foi apresentada em dois artigos: (1) para avaliar a atividade enzimática da CT-K e efeito de FeCl3 utilizou-se a espectrofluorimetria. Para avaliar a degradação do CS e CI (fibras de tendões de cauda de camundongo - FTCCs), os substratos foram incubados com CT-K e concentrações de 0,02% a 2% de FeCl3. O sobrenadante foi submetido à eletroforese de proteínas. Os experimentos foram feitos em triplicata. As FTCCs foram caracterizadas em microscopia eletrônica de varredura (MEV). A quantidade de Fe absorvida foi determinada pela espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX). Os dados foram submetidos à análise de variância (Brown-Forsythe), normalidade (Shapiro-Wilk ou Anderson-Darling), ANOVA um fator + Holm-Sidak ou Tukey (?=5%). (2) para avaliar a resistência da união a microtração (?TBS), 78 dentes foram distribuídos em 13 grupos de soluções contendo AC e/ou FeCl3 nas concentrações: 10%-1,8%, 10%-0,6%, 10% AC, 5%-1,8%, 5%-0,6%, 5% AC, 1%-1,8%, 1%-0,6%, 1% AC, 1,8% FeCl3, 0,6% FeCl3 (aplicadas por 15 segundos) e com AF (aplicado por 5 ou 15 segundos). Utilizou-se o sistema adesivo Adper Scotchbond Multi-Purpose, fotoativado por 20 segundos com o aparelho Bluephase G2 (1200Mw/cm2). A ?TBS foi avaliada em 24 horas e 9 meses de armazenamento. Para a degradação do colágeno dentinário, fatias de dentina (n=3) foram tratadas com e sem FeCl3 e incubadas com CT-K. O sobrenadante foi submetido à eletroforese de proteínas. A dentina foi caracterizada após a incubação utilizando MEV. Outras fatias foram submetidas às soluções condicionantes por 15 segundos e analisadas utilizando EDX. Os dados foram submetidos aos testes: normalidade, ANOVA dois fatores + Holm-Sidak, ANOVA um fator + Tukey ou Fisher (?=5%). A análise por espectrofluorimetria revelou que o FeCl3 inibiu a atividade de CT-K nas concentrações 0,005%-0,08%e suprimiu a atividade na concentração 0,08%. FeCl3 foi capaz de prevenir a degradação do CS e CI contra CT-K para as FTCCs e para a dentina desmineralizada. As micrografias revelaram desenovelamento das FTCCs na ausência de FeCl3 e integridade quando expostas a concentrações de 0,02%-0,8%de FeCl3. Observou-se interação Fe/colágeno. Os grupos 5-0,6 e 5-1,8 de AC/FeCl3 apresentaram maiores valores de ?TBS comparados ao AF, independentemente do tempo de armazenamento. Observou-se redução da ?TBS aos 9 meses para todos os grupos. A solução contendo 1,8% de FeCl3 preservou a estrutura da dentina. Observou-se pela análise de EDX que a imersão nas soluções condicionantes com FeCl3 por 15 segundos foi suficiente para que as fibrilas de colágeno adsorvessem Fe. Concluiu-se que o FeCl3 agiu como um indutor de reticulação do colágeno e como inibidor da atividade CT-K e estas duas habilidades atuaram em conjunto para a preservação do colágeno tipo I nas FTCCs e na dentina desmineralizada Abstract: The aim of this thesis was (1) to investigate the effect of FeCl3 on Cathepsin K (CT-K) activity of and the ability to prevent degradation of soluble (SC) and insoluble collagen (IC), and (2) to compare the effects of phosphoric acid 35% and conditioning solutions containing citric acid (CA) and/or FeCl3 in dentine bond strength and collagen degradation. The thesis was presented in two articles: (1) spectrofluorimetry was used to evaluate the FeCl3 effect against CT-K enzymatic activity. To evaluate SC and IC (mouse tail tendon fibers-MTTF) degradation, the substrates were incubating with CT-K with different concentrations of FeCl3 (0.02% to 2%). The supernatant was submitted to protein electrophoresis. The experiments were done in triplicate. The fibers were characterized after incubation by scanning electron microscopy (SEM). The amount of Fe absorbed was determined by X-ray dispersive energy spectroscopy (EDX). Data were submitted to analysis of variance (Brown-Forsythe), normality test (Shapiro-Wilk or Anderson-Darling), and one-way ANOVA (Holm-Sidak or Tukey post-test) (?=5%). (2) for the microtensile bond strength (?TBS), 78 teeth were distributed into 13 groups of solutions containing citric acid (AC) and/or FeCl3 in different concentrations: 10%-1,8%, 10%-0,6%, 10% AC, 5%-1,8%, 5%-0,6%, 5% AC, 1%-1,8%, 1%-0,6%, 1% AC, 1,8% FeCl3, 0,6% FeCl3 (applied for 15 seconds) e com AF (applied for 5 and 15 seconds). The Adper Scotchbond Multi-Purpose adhesive system was used and light/cured for 20 seconds with Bluephase G2 (1200Mw/cm2). The ?TBS was evaluated at 24 hours and 9 months of storage. For the dentine collagen degradation, dentine slices (n=3) were treated with and without FeCl3 were incubated with CT-K. The supernatant was submitted to protein electrophoresis. Dentine was characterized after enzymatic treatment by SEM, and other slices were submitted to conditioning solutions and analyzed by EDX. The data were submitted to the tests: normality, two¿way ANOVA and post-test Holm-Sidak, one¿way ANOVA and Tukey or Fisher tests (?=5%). Spectrofluorimetry analysis revealed that FeCl3 inhibited CT-K activity at concentrations 0.005%-0.08% and suppressed activity when using 0.08%. FeCl3 was able to prevent the degradation of soluble collagen and collagen fibers against CT-K for the MTTF and the demineralized dentine. The micrographs revealed unraveling of collagen fibers in the absence of FeCl3 and showed fiber integrity exposed to 0.02%-2% FeCl3 concentrations. The Fe/collagen interaction was observed. AC/FeCl3 5-0.6 and 5-1.8 solutions had higher ?TBS values ??compared to the AF, regardless of storage time. A reduction of ?TBS was observed at 9 months for all groups. The treatment solution 1.8% FeCl3 preserved the dentine structure. The EDX analysis indicated that the 15 second immersion in the FeCl3 conditioning solutions was sufficient for the collagen fibrils to adsorb Fe. It was concluded that FeCl3 acted both as an inducer of collagen cross-linking and as inhibitor of CT-K activity, both abilities acted together for the preservation of collagen type I on the MTTF and on the demineralized dentine Doutorado Materiais Dentários Doutora em Materiais Dentários CAPES 99999.010711/2014-07, 1777-2014