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Resumo Fundamento: A taxa de falha de enxerto de veia safena um ano após a cirurgia de revascularização do miocárdio varia de 10% a 25%. O objetivo deste estudo foi de investigar se a atorvastatina pode reduzir o acúmulo de células musculares lisas vasculares para inibir a hiperplasia intimal por meio da inibição da via p38 MAPK. Métodos: Quarenta e cinco ratos Sprague-Dawley foram randomizados em três grupos. Trinta ratos foram submetidos à cirurgia de enxerto de veia e randomizados para tratamento com veículo ou atorvastatina; quinze ratos foram submetidos à cirurgia sham. Detectamos a hiperplasia intimal por meio de coloração com hematoxilina-eosina e a expressão de proteínas relacionadas por meio de análise imuno-histoquímica e Western blot. Foram realizadas as comparações por análise de variância de fator único e pelo teste da diferença mínima significativa de Fisher, com p < 0,05 considerado significativo. Resultados: A íntima analisada pela coloração com hematoxilina-eosina era dramaticamente mais espessa no grupo controle que no grupo atorvastatina e no grupo sham (p < 0,01). Os resultados da coloração imuno-histoquímica de α-SMA demonstraram que a porcentagem de células positivas para α-SMA no grupo controle era mais alta que no grupo atorvastatina (p < 0,01). Nós também avaliamos α-SMA, PCNA, p38 MAPK e fosforilação de p38 MAPK após o tratamento com estatina por meio de análise de Western blot e os resultados indicaram que a atorvastatina não levou à redução de p38 MAPK (p < 0,05); no entanto, resultou na inibição da fosforilação de p38 MAPK (p < 0,01) e reduziu significativamente os níveis de α-SMA e PCNA, em comparação com o grupo controle (p < 0,01). Conclusão: Nós demonstramos que a atorvastatina pode inibir o acúmulo de células musculares lisas vasculares por meio da inibição da via p38 MAPK e é capaz de inibir a hiperplasia intimal em modelos de enxerto de veia em ratos. Abstract Background: The rate of saphenous vein graft failure one year after coronary artery bypass grafting ranges from 10% to 25%. The aim of this study was to explore whether atorvastatin can reduce accumulation of vascular smooth muscle cells to inhibit intimal hyperplasia via p38 MAPK pathway inhibition. Methods: Forty-five Sprague-Dawley rats were randomized to three groups. Thirty rats received a vein graft operation, and they were randomized to be treated with vehicle or atorvastatin; fifteen rats received a sham operation. We detected intimal hyperplasia by hematoxylin-eosin staining and related protein expression by immunohistochemical and Western blot analysis. Comparisons were analyzed by single-factor analysis of variance and Fisher's least significant difference test, with p < 0.05 considered significant. Results: The intima analyzed by hematoxylin-eosin staining was dramatically thicker in the control group than in the atorvastatin group and sham group (p < 0.01). The outcomes of immunohistochemical staining of α-SMA demonstrated that the percentage of α-SMA-positive cells in the control group was higher than in the atorvastatin group (p < 0.01). We also evaluated α-SMA, PCNA, p38 MAPK, and phosphorylation of p38 MAPK after statin treatment by Western blot analysis, and the results indicated that atorvastatin did not lead to p38 MAPK reduction (p < 0.05); it did, however, result in inhibition of p38 MAPK phosphorylation (p < 0.01), and it significantly reduced α-SMA and PCNA levels, in comparison with the control group (p < 0.01). Conclusion: We have demonstrated that atorvastatin can inhibit accumulation of vascular smooth muscle cells by inhibiting the p38 MAPK pathway, and it is capable of inhibiting intimal hyperplasia in a rat vein graft model.

Orientador: Marta Helena Krieger Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O óxido nítrico (NO) é um multifuncional agente biológico que nas últimas décadas tem sido alvo de uma infinidade de estudos e constitui hoje um dos mais importantes mediadores de processos intra e extracelulares. Diversos estudos demonstram sua capacidade de prevenção da ativação e adesão plaquetária ou leucocitária e inibição da proliferação e migração de células musculares lisas vasculares (VSMCs), entretanto, em condições de baixa disponibilidade do NO esses processos são prejudicados. Atualmente há o grande interesse no desenvolvimento de compostos capazes de liberar NO de forma modulada e estável, e, nesse sentido, os complexos nitrosilos de rutênio têm se destacado por suas características excepcionais. É amplamente reconhecido que a modulação fenotípica de VSMCs tem papel crítico na progressão de diversas doenças vasculares proeminentes. Sabe-se que o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) é um dos principais estimulantes desse processo. Este estudo se propôs a caracterizar os efeitos inibitórios do complexo de rutênio trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, nomeado Ru(cyclam)NO, na modulação fenotípica, resposta proliferativa e migratória de VSMCs induzidas por PDGF-BB. VSMCs foram obtidas por técnica de cultura primária. A citotoxicidade do complexo, na faixa de concentração de 100 ?M a 1500 ?M, foi determinada em ensaios de redução do MTT e incorporação neutral red (NR), e comparadas a do nitroprussiato de sódio (SNP). A concentração 100 ?M foi definida para os demais protocolos experimentais. Western blotting, ensaios transwell e wound healing, e incorporação de timidina triciada foram utilizados para determinação da modulação fenotípica, migração e proliferação celular, respectivamente, e níveis de nitrato no meio foram determinados por quimiluminescência para avaliação do perfil de liberação de NO. O complexo demonstrou baixa citotoxicidade, mesmo na maior concentração e após 48 horas de exposição, reduzindo ao máximo em 30% a porcentagem de células viáveis em ambos os ensaios, demonstrando ser menos tóxico que o SNP. Níveis de nitrato no meio atigiram a concentração máxima após 30 minutos (11 ?M ± 4,8), de maneira mais lenta em relação ao SNP, cuja concentração máxima foi após 5 minutos (13 ?M ± 3,7). A proliferação das VSMCs induzida por PDGF-BB foi inibida, reduzindo à metade a radioatividade incorporada, bem como a expressão do marcador de proliferação PCNA. Observou-se redução de 45% na migração induzida por PDGF-BB nos ensaios transwell, e no wound-healing, embora qualitativo, a redução é notável. A modulação fenotípica da VSMC foi observada pela redução em 60% da expressão da proteína alfa-actina, característica do fenótipo maduro, e foi quase totalmente prevenida pelo tratamento com o complexo. Tal prevenção pode ser mediada pelo fator de transcrição ELK-1, que favorece a expressão de genes de diferenciação, e cuja fosforilação foi estimulada pelo PDGF-BB, porém inibida em quase 50% pelo pré-tratamento com Ru(cyclam)NO. As respostas observadas nos tratamentos com Ru(cyclam)NO foram promissoras, e, embora seu mecanismo de ação x ainda não esteja completamente esclarecido, este complexo demonstrou atividade biológica singular, e sua aplicação em condições clínicas onde há descontrole de processos de proliferação e migração de VSMCs, como a reestenose, apresenta-se como uma proposta interessante Abstract: Nitric oxide (NO) is a multifuctional biological agent that in the recent decades has been the subject of a plethora of studies and today is one of the most important intracellular and extracellular processes mediators. Several studies have demonstrated its ability to prevent leukocyte or platelet adhesion and activation, and inhibition of vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and migration. However, low availability of NO conditions determines impairement of these processes. There is a keen interest in the development of compounds capable of releasing NO modulated so stable, and the nitrosyl ruthenium complexes have gained prominence for its exceptional features. It is widely recognized that the phenotypic modulation of VSMCs, and its uncontrolled proliferation and migration, plays a critical role in the progression of several prominent vascular diseases. It is known that the platelet-derived growth factor (PDGF) is a primary stimulant of the process. This study aimed to determine the inhibitory effects of the ruthenium complex NO donor trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, named Ru(cyclam)NO, in the phenotypic switching, on migratory and proliferative responses of VSMCs induced by PDGF-BB, and its biological response. VSMCs were obtained from primary culture methodology. The complex cytotoxicity were determined by MTT reduction and incorporation of neutral red (NR) assays, in the range of concentration from 100 ?M to 1500 ?M, and compared to sodium nitroprusside (SNP). For the following experimental protocols the concentration of the 100 ?M was set. Western blotting, transwell and wound healing assays, and incorporation of tritiated thymidine were used for determination of phenotypic switching, cell migration and proliferation, respectively. Evaluation of the NO profile release was determined as nitrate levels in the culture medium by chemiluminescence. The complex Ru(cyclam)NO showed low cytotoxicity even at the highest concentration evaluated and after 48 hours of exposition, reducing only 30% the percentage of viable cells in both trials, showing be less toxic than the SNP. Medium nitrate levels exibhited the highest concentration after 30 min (11 ?M ± 4.8), slower when compared to SNP, which reached the maximum concentration after 5 minutes (13 ?M ± 3.7). The proliferation of VSMCs induced by PDGF-BB was inhibited by half of the radioactivity incorporated counting, as well as the reduction on the expression of the proliferation marker PCNA. Observed a reduction by 45% in the migration induced by PDGF-BB determined in transwell assays, and on the wound-healing, although a qualitative result, the reduction of migration induced by PDGF-BB. The 60% reduction by PDGF-BB treatment of the contractile protein expression ?-SMA, characteristic of mature phenotype, revealed the modulation of VSMCs phenotype, and it was almost completely prevented by treatment with the complex. Such prevention was associated with inhibition by almost 50% of phosphorylation of the transcription factor ELK-1 stimulated by PDGF-BB. The responses determined with complex treatments revealed promising for future development of cardiovascular devices. Although its xii mechanism of action is not completely understood, this complex showed singular biological activity, and its application in some clinical conditions where there is uncontrolled proliferation and migration of VSMCs presents as a substancial proposal Mestrado Fisiologia Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O hialuronam (ou ácido hialurônico, AR) é um importante componente do espaço matrice1ular, estando presente tanto na matriz extracelular, como na superficie das células. Suas funções são variadas, mas estão sempre associadas à criação de um espaço pouco denso e extremamente hidratado, permitindo a proliferação e migração celular, típicas de processos como a embriogênese, cicatrização e invasão tumoral. Neste trabalho foi desenvolvido um estudo do metabolismo do ácido hialurônico na próstata ventral de ratos. Numa primeira etapa foi verificado o efeito da castração por 7, 14 e 21 dias sobre. o conteúdo e distribuição do AR, assim como uma avaliação do papel da HA. sintase 2 (HAS2) e da hialuronidase 1 (Hyall). Para tanto, foram empregados ensaios de marcação tecidual de AH com a utilização de sonda marcada com fluoresceína, quantificação deAH por ensaio competitivo, determinação dos tamanhos das cadeias de AH por cromatografia em gel filtração, determinação dos níveis de expressão das enzimas HAS2 e Hyall por Real Time PCR, localização desta expressão por hibridação in situ e localização do receptor CD44 por imunohistoquímica. Na segunda etapa, foram estudadas células musculares lisas (CML) isoladas de ratos e mantidas em cultura, quanto à expressão de marcadores da diferenciação deste tipo celular e quanto à produção de AH, utilizando. imunocitoquímica e RT-PCR para marcadores de CML, imunocitoquímica para o receptor CD44, quantificação de AH por ensaio competitivo e por medida de área de coat. Os resultados demonstram que o AR é encontrado tanto no epitélio quanto no estroma prostático e que há uma redução no conteúdo total de AR na próstata ventral, com um predomínio de cadeias curtas. Além disto, foi verificado que estas modificações são, ao menos em parte, devidas à manutenção da expressão da HAS2 e um aumento na expressão da Hyall. Foi observado também, por outro lado, que ocorre uma diminuição na atividade da hialuronidase lisossomal. Experimentos de hibridação in situ demonstraram a presença da HAS2 no epitélio e em diversas células do estroma, com exceção das células musculares lisas e endoteliais. Com a castração, a expressão da HAS2 e da Hyall aumenta no estroma. Foi demonstrado também que as células musculares lisas prostáticas de rato em cultura mantêm a expressão de marcadores da diferenciação (smoothelin, SM22 e calponina) e que esta expressão não foi dependente de insulina-nemtestosterotta. A concentração de ácido hialurônico no meio de cultura variou nas diferentes passagens (0-8), assim como variou o tamanho do coa! ao redor das células. Surpreendentemente, nas passagens 3 e 4 houve uma queda brusca na síntese de HA Os- resultados demonstram uma modificação no padrão expressão e de distribuição do ácido hialurônico na próstata ventral de ratos, com o comprometimento de diversos tipos celulares, que resultam na diminuição do conteúdo total. Conclui-se também que células musculares lisas em cultura mantêm-se diferenciadas e que são capazes de sintetizar e formar um coa! na sua superficie Abstract: Hyaluronan (or hyaluronic acid, HA) is an important component ofthe matricellularspace. It is found in both extracelular matrix and at the cell surface. It has many functions, but is always associated with the establishment of a looser and hydrated space, allowing the cells to proliferate and migrate, in processes such as embryogenesis, healing and tumor invasion. In this work, we have studied some aspects ofHA metabolism in the rat ventral prostate. In a firt series of experiments, the effect of castration for 7, 14 and 21 days on the content and distribution of HA, as well as an evaluation of the function of HA synthase 2 (HAS2) and hyaluronidase 1 (Hyall). For this, were done tecidual HA localization with fluorescein probe, measurement of HA content in a competitive binding assay, determination of HA chain size variation using gel filtration cromatography, determination of expression levels ofHAS2 and Hyall enzymes by Real Time PCR, localization ofthese expression by in situ hybridization and CD44 localization by immunohistochemistry. In a second series of experiments, the rat prostatic smooth musc1e cells (SMC) were isolated and maintainedin vitro for the study of the expression of molecular markers of the differentiated state and of the production of HA, using immunohistochemistry e RT-PCR for SMC markers, immunocitochemistry for CD44 receptor, HA quantification by competitive bindingassay and measurement of coat area. The results demonstrate that HA is found in both epitheJium and stroma and that there is a decrease in the total amount of HA in the organ afier castration, with a predominance of short chains. Besides, it was observed that these modifications are, at least in part, due to a sustained expression of HAS2 and an increased expression of Hyall. On the other hand, a reduction in lysosomal hyaluronidase activity was also observed. In situ hybridization showed the presence of HAS2 mRNA in both epithelium and stroma. Different stromal cells, with the exception of SMC and endothelial cells, expressed HAS2. Castration resulted in increased expression of HAS2 and Hyall in the stroma. It was also demonstrated that SMC kept inculture express the differentiation markers smoothelin, SM22 and calponin and that this expression pattern was not dependent on either insulin or testosterone. The concentration of HA in the culture medium and the size of the cell coat varied as cells were subcultured through passages 0-8. Surprisingly; a severe drop in HA synthesis was observed at passages 3 and 4. The results demonstrate a modification in the pattem of expression and distribution of HA in the rat ventral prostate in response to castration, and the involvement of different cell types in the decreasing amount ofHA. lt is also concluded that SMC preserve the differentiated state in culture and that they are able to assemble a HA coat Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O crescimento e função prostática dependem da estimulação androgênica e interação epitélio-estroma. Além dos andrógenos, outros fatores interagem com a próstata e são igualmente importantes para sua fisiologia. Sabe-se que os estrógenos exercem um importante papel no desenvolvimento prostático e que, combinados com andrógenos, podem contribuir para o aparecimento de patologias. A insulina é outro hormônio que afeta a atividade destes hormônios sexuais nos tecidos, inclusive na próstata. Os níveis séricos de esteróides sexuais estão intimamente relacionados com a sensibilidade a insulina, embora esta relação ainda seja pouco esclarecida. No estroma prostático, as células musculares lisas são o tipo celular predominante, influenciando a atividade do epitélio por mecanismos parácrinos e modificando a matriz extracelular em situações de remodelação, como no crescimento, na regressão e na invasão tumoral. Sabe-se que estas células apresentam receptores de andrógeno (AR) e que respondem à privação androgênica, alterando sua morfologia. O presente estudo buscou verificar a influência da testosterona, estradiol e insulina sobre a expressão e localização do AR em células musculares lisas da próstata ventral de ratos Wistar cultivadas in vitro. Os resultados mostraram que o estradiol causou alterações nos níveis protéicos, os níveis de RNAm do AR foram pouco afetados e a localização do AR foi predominantemente nuclear independente da dose de estradiol. Os tratamentos feitos com insulina mostraram que a sua presença causou uma queda da expressão da proteína e uma localização predominante nuclear do AR na situação em que os dois hormônios, insulina e testosterona, foram administrados juntamente. Os resultados permitem sugerir que a expressão do AR pode ser modulada por outros fatores como estrógeno e insulina Abstract: The prostate function and growth depends on the androgenic stimulation and epitheliumstroma interaction. Besides androgens, other factors interact with the prostate and are also important for its physiology. It is known that estrogens exert an important role in prostate development, and combined with androgens they can contribute for the appearance of pathologies. The insulin is another hormone that interacts with these sexual hormones in tissues, and also in the prostate. The serum levels of sexual steroids are closely related with the sensitivity to the insulin, even though this relation is not yet clear. In prostatic stroma, smooth muscle cells are the predominant cell type. They influence the activity of the epithelium through paracrine mechanisms and modify the extracellular matrix in remodeling situations, such as gland growth and regression, and during tumor invasion. It is known that these cells express androgen receptor (AR) and respond to androgen deprivation by modifying its phenotype. The present study was undertaken to verify the influence of testosterone, estradiol and insulin on the expression and localization of the AR in the smooth muscle cells from the Wistar rat ventral prostate cultured in vitro. The results showed that estradiol caused alterations in the AR protein levels, the mRNA level was less affected and AR localization was predominantly nuclear irrespective of the estradiol dose. Insulin treatments caused a decrease in the expression of the protein and a predominant nuclear localization of AR in the presence of testosterone. The results suggest that AR expression and regulation might be modulated by others factors such as estrogen and insulin Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Maria Edwirges Hoffmann, Marta Helena Krieger Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O óxido nítrico é uma molécula multifuncional, a qual está envolvida numa extensa variedade de funções fisiológicas, estendendo-se da neurotransmissão, citotoxicidade de macrófagos e modulação das funções fisiológicas do sistema cardiovascular. Devido às ações benéficas do NO nas diversas disfunções vasculares, há um grande interesse no desenvolvimento em dispositivos que possam liberar NO de maneira controlada no sistema cardiovascular e tecido-específica. Por exemplo, 'stents¿ intracoronarianos recobertos por materiais com liberação de NO, podem reduzir a incidência da reestenose e inibir a formação da neoíntima após angioplastia percutânea coronariana. O objetivo deste estudo foi o de estabelecer protocolos para avaliação da citotoxicidade e do potencial anti-reestenótico e anti-trombogênico de formulações eluidoras de NO para aplicações em dispositivos intravasculares. As formulações eluidoras de NO foram avaliadas por meio de: A) citotoxicidade através dos ensaios da redução do MTT e da captação do vermelho neutro (NR) com as linhagens celulares: 3T3 e RASM, B) potencial anti-reestenótico utilizando-se o ensaio de inibição da proliferação celular com células de musculatura lisa de coelho (RASM) e C) potencial anti-trombogênico, utilizando-se plaquetas humanas em ensaios de agregação e adesão plaquetária. Foram testadas S-nitrosoglutationa (GSNO), solução polimérica contendo poli (vinil álcool) PVA e poli (vinil pirrolidona) (PVP), e formulação contendo PVA, PVP, GSNO. O ensaio da captação do vermelho neutro mostrou que a GSNO e GSNO/PVA/PVP não apresentaram citotoxicidade em concentrações até 30 mg/mL de GSNO, em ambas as linhagens celulares. Enquanto que o ensaio de redução do MTT mostrou que apenas a solução contendo GSNO apresentou citotoxicidade com EC50=2,75±0,05 mg/mL em células 3T3. A sensibilidade da linhagem 3T3 foi maior do que =2,3±0,4 µg/mL), e GSNO (EC= 2,5±0,3 µg/mL). O ensaio da adesão plaquetária mostrou que a inibição superior a 50% causada pela GSNO só foi obtida em concentração acima 6,72 mg/mL, mas nesta concentração não foram encontradas plaquetas viáveis. Os resultados mostraram que a metodologia adotada foi apropriada para a avaliação do potencial anti-reestenótico e anti-trombogênico e também para estabelecer a margem de segurança de novas formulações envolvendo S-nitrosoglutationa e soluções poliméricas. para células RASM, enquanto que células RASM foram mais sensíveis à alteração de permeabilidade de membrana. A GSNO per se promoveu inibição da proliferação celular no ensaio da proliferação celular e este efeito foi potencializado em presença dos polímeros PVA/PVP em concentrações superiores a 22,7 mg/mL. Foi verificada inibição da agregação plaquetária para ambas as soluções, GSNO/PVA/PVP (EC5050 =2,3±0,4 µg/mL), e GSNO (EC= 2,5±0,3 µg/mL). O ensaio da adesão plaquetária mostrou que a inibição superior a 50% causada pela GSNO só foi obtida em concentração acima 6,72 mg/mL, mas nesta concentração não foram encontradas plaquetas viáveis. Os resultados mostraram que a metodologia adotada foi apropriada para a avaliação do potencial anti-reestenótico e anti-trombogênico e também para estabelecer a margem de segurança de novas formulações envolvendo S-nitrosoglutationa e soluções poliméricas Abstract: Nitric oxide (NO) is a multifunctional molecule which is involved in a wide variety of physiological functions, ranging ftom neurotransmission, macrophage cytotoxicity, and modulation of physiological functions of the cardiovascular system. Due to NO beneficial action in various vascular pathological conditions, there is a great interest on development in devices that can release NO by a controlled manner and tissue-specific. For example, intracoronary stents coated with NO releasing materials, may reduce the incidence of restenosis and inhibit neo-intima formation after following percutaneous angioplasty. The aim of this study was to establish protocols for evaluation of NO eluting formulations cytotoxicity and antirestenotic and antithrombotic activities which have potential for application in intravascular devices. NO releasing formulations were evaluated regarding to following aspects: A) cytotoxicity measured by MTT reduction and Neutral Red uptake assays with 3T3 and RASM celllines, B) antirestenotic potential by using cell proliferation assay, with rabbit smooth muscle cells ~M), and C) antithrombogenic potential, by using a human platelet aggregation and adhesion assays. S-nitrosoglutathione (GSNO), polymer solutions containing poly(vinyl alcohol) (pV A) and poly(vinyl pyrrolidone) (pVP), and formulation containing GSNO, PV A and PVP were tested. Neutra! Red uptake assays showed that .GSNO and GSNOIPV A/P)'P-solutions presented no cytotoxicity up to 30 mg /mL GSNO, in both celllines. While, MTT reduction assays showed that only the solution of GSNO alone presented cytotoxicity with ECso=2.75± 0,05 mg/rnL, in 3T3 cell line. The sensitivity of3T3 cells to cytotoxicity was higher than that ofRASM cells, while RASM cells were more sensitivity to membrane permeation alterations. GSNO per se presented inhibition in a cell proliferation assay and this effect was potentialized with PV AIPVP in concentrations up 'to 22.7 mglmL. Concentration-dependent inhibition of platelet aggregation was verified for both GSNO/PV AIPVP (ECso of 2.3±0.4 JlglmL), and GSNO alone (ECso of 2.5±0.3 JlglrnL) solutions. Platelet adhesion assay showed that the inhibition above 50% caused by GSNO only in concentration up to 6.72 mglmL was found, but in this concentration range, decrease of viable platelets was presented. The results showed that the methodology adopted was suitable to evaluate antirestenotic and antithrombotic potential, and to establish security margins for the development of new formulations involving GSNO and polymers in solution Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Resumo Fundamento: A taxa de falha de enxerto de veia safena um ano após a cirurgia de revascularização do miocárdio varia de 10% a 25%. O objetivo deste estudo foi de investigar se a atorvastatina pode reduzir o acúmulo de células musculares lisas vasculares para inibir a hiperplasia intimal por meio da inibição da via p38 MAPK. Métodos: Quarenta e cinco ratos Sprague-Dawley foram randomizados em três grupos. Trinta ratos foram submetidos à cirurgia de enxerto de veia e randomizados para tratamento com veículo ou atorvastatina; quinze ratos foram submetidos à cirurgia sham. Detectamos a hiperplasia intimal por meio de coloração com hematoxilina-eosina e a expressão de proteínas relacionadas por meio de análise imuno-histoquímica e Western blot. Foram realizadas as comparações por análise de variância de fator único e pelo teste da diferença mínima significativa de Fisher, com p < 0,05 considerado significativo. Resultados: A íntima analisada pela coloração com hematoxilina-eosina era dramaticamente mais espessa no grupo controle que no grupo atorvastatina e no grupo sham (p < 0,01). Os resultados da coloração imuno-histoquímica de α-SMA demonstraram que a porcentagem de células positivas para α-SMA no grupo controle era mais alta que no grupo atorvastatina (p < 0,01). Nós também avaliamos α-SMA, PCNA, p38 MAPK e fosforilação de p38 MAPK após o tratamento com estatina por meio de análise de Western blot e os resultados indicaram que a atorvastatina não levou à redução de p38 MAPK (p < 0,05); no entanto, resultou na inibição da fosforilação de p38 MAPK (p < 0,01) e reduziu significativamente os níveis de α-SMA e PCNA, em comparação com o grupo controle (p < 0,01). Conclusão: Nós demonstramos que a atorvastatina pode inibir o acúmulo de células musculares lisas vasculares por meio da inibição da via p38 MAPK e é capaz de inibir a hiperplasia intimal em modelos de enxerto de veia em ratos.

Introduction: Vascular calcification is a common complication of chronic kidney disease. Osteoblast differentiation factor (Cbfa1) is present in histologic sections of arteries from patients with end-stage renal disease. Vascular smooth muscle cells (VSMC) can dedifferentiate to osteoblast-like cells, possibly by up-regulation of Cbfa1. There is evidence that the production of nitric oxide (NO) may have an important role in the regulation of osteoblast metabolism. The aim of this study is to evaluate whether increased NO/iNOS expression causes an increase in cbfa1 expression in VSMC. Methods: VSMC were obtained from renal artery of Wistar male rats, treated for 72 hours with lipopolysaccharide (LPS), ß-glycerophosphate (BGF), a donor of phosphate and aminoguanidine (AG), an inhibitor of iNOS, in the following groups: CTL (control), LPS, BGF, LPS + BGF, and LPS + AG. NO synthesis was determined by chemiluminescence. Cbfa1 and iNOS mRNA expressions were analyzed by RT-PCR, Cbfa1 protein expression by immunohistochemistry and cellular viability by acridine orange. Results: Cbfa1 and iNOS mRNA expressions were higher in LPS and LPS+ BGF vs CTL (p < 0.05), and they were lower in LPS+AG vs LPS (p < 0.05). The Cbfa1 in the groups LPS and LPS+BGF also resulted in a higher value compared to CTL (p < 0.05), and in LPS+AG it was lower compared to LPS (p < 0.05). NO was higher in LPS and LPS+BGF compared to CTL group (p < 0.05) and lower in LPS + AG compared to LPS group (p < 0.05). Cellular viability showed no statistical difference among groups. Conclusion: This study showed that increased NO/iNOS expression causes an increase in cbfa1 expression in VSMC.

Previous studies have demonstrated loss/reduction of dystrophin in cardiomyocytes in both acute and chronic stages of experimental Trypanosoma cruzi (T. cruzi) infection in mice. The mechanisms responsible for dystrophin disruption in the hearts of mice acutely infected with T. cruzi are not completely understood. The present in vivo and in vitro studies were undertaken to evaluate the role of inflammation in dystrophin disruption and its correlation with the high mortality rate during acute infection. C57BL/6 mice were infected with T. cruzi and killed 14, 20 and 26 days post infection (dpi). The intensity of inflammation, cardiac expression of dystrophin, calpain-1, NF-κB, TNF-α, and sarcolemmal permeability were evaluated. Cultured neonatal murine cardiomyocytes were incubated with serum, collected at the peak of cytokine production and free of parasites, from T. cruzi-infected mice and dystrophin, calpain-1, and NF-κB expression analyzed. Dystrophin disruption occurs at the peak of mortality and inflammation and is associated with increased expression of calpain-1, TNF-α, NF-κB, and increased sarcolemmal permeability in the heart of T. cruzi-infected mice at 20 dpi confirmed by in vitro studies. The peak of mortality occurred only when significant loss of dystrophin in the hearts of infected animals occurred, highlighting the correlation between inflammation, dystrophin loss and mortality.

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2014-02-26T17:28:56Z No. of bitstreams: 1 WOS000245694100008.pdf: 211447 bytes, checksum: 4e8a86455cc2a7c89baa974619c325dd (MD5) Made available in DSpace on 2014-02-26T17:28:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WOS000245694100008.pdf: 211447 bytes, checksum: 4e8a86455cc2a7c89baa974619c325dd (MD5) Previous issue date: 2007-04-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T15:21:06Z No. of bitstreams: 1 WOS000245694100008.pdf: 211447 bytes, checksum: 4e8a86455cc2a7c89baa974619c325dd (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T15:21:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WOS000245694100008.pdf: 211447 bytes, checksum: 4e8a86455cc2a7c89baa974619c325dd (MD5) Previous issue date: 2007-04-01 The effects of partial urethral obstruction on the detrusor muscle of rabbit urinary bladder were investigated using stereological sampling and estimation tools. Twelve female Norfolk rabbits (2.5-3.0 kg body weight) were divided into four groups: 3, 7 and 12 weeks after surgical intervention to produce a standard partial obstruction and unobstructed controls. Following removal, bladder axes (craniocaudal, dorsoventral and laterolateral) and organ weights were recorded. Bladders were prepared for light microscopy by multistage random sampling procedures. Stereological methods were used to estimate the volume of muscle and the packing density and total number of myocyte nuclei in each bladder. We also estimated mean myocyte volume and the mean cross-sectional area and length of myocytes. Group comparisons were made by one-way analysis of variance. Changes in bladder axes were mainly laterolateral and craniocaudal. Mean bladder weight increased roughly six-fold by 3 weeks and 17-fold by 12 weeks and was accompanied, on average, by 12- and 33-fold increases in total muscle volume. These variables did not differ at 3 and 7 weeks post-obstruction. Increases in muscle content were not accompanied by changes in packing densities but were associated with increases in the total numbers of myocyte nuclei (13-fold by 3 weeks, 28-fold by 12 weeks). Mean myocyte volume did not vary significantly between groups but cells in obstructed groups were shorter and wider. These findings support the notion that partial outflow obstruction leads to an increase in the number, but not mean volume, of myocytes. If due solely to myocyte mitosis, the total of 43 x 10(8) cells found at 12 weeks could be generated by the original complement of 15 x 10(7) cells if an average of only 2.1 x 10(6) new cells was produced every hour. In reality, even this modest proliferation rate is unlikely to be achieved because myocyte proliferation rates are very low and it is possible that new myocytes can arise by differentiation of mesenchymal or other precursor cells. Univ São Paulo, Dept Cirurgia, Fac Med Vet & Zootecn, Lab Stereol & Chem Anat,Coll Vet Med, BR-05508000 São Paulo, Brazil Univ Nottingham, Queens Med Ctr, Ctr Integrated Syst Biol & Med, Nottingham NG7 2RD, England São Paulo State Univ, Dept Vet Surg & Anaesthesiol, Vet Med & Zootech Coll, Botucatu, SP, Brazil Univ São Paulo, Coll Anim Sci & Food Engn, Dept Basic Sci, Pirassununga, Brazil São Paulo State Univ, Dept Vet Surg & Anaesthesiol, Vet Med & Zootech Coll, Botucatu, SP, Brazil