Search

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Pediatría. Fecha de lectura: 13-07-2017

Aquesta tesi és part d’un projecte d’investigació més general que té com a objectiu estudiar el paper de la serina/treonina quinasa CK2 en el desenvolupament de les plantes, utilitzant Arabidopsis thaliana com a model. Malgrat ser una de les primeres quinases identificades, les vies de senyalització en què participa la CK2 encara no estan completament caracteritzades. En la primera part d’aquesta tesi es descriu la implicació de la quinasa CK2 en la via de senyalització de l’àcid salicílic (SA) i, el control exercit per aquesta hormona en l’expressió dels gens que codifiquen per les proteïnes PIN (exportadores d’auxina), i per a la quinasa reguladora d’aquests transportadors, la proteïna PINOID (PID). Antics membres del laboratori on s’ha realitzat aquesta tesi havien previament obtingut un mutant dominant negatiu de la CK2 (CK2mut) en Arabidopsis (Moreno-Romero et al., 2008). En aquest treball mostrem que aquestes plantes contenen nivells elevats de SA i que l’acumulació de SA a les arrels és el responsable del fenotip radicular alterat (disminucio de la longitud de l’arrel i absència d’arrels lateral). També demostrem que tractaments amb SA exogen redueixen la transcripció dels gens que codifiquen per als transportadors PIN1-PIN4 i PIN7, mentre que estimulen la transcripció del gen que codifica per la quinasa PID. Aquest efecte és similar a l’observat en les arrels de les plantes CK2mut, exceptuant als gens PIN4 i PIN7 que es mostren sobreexpressats. Aquest resultat, suggereix que l’efecte repressor de SA en l’expressió de PIN4 i PIN7 requereix que la quinasa CK2 sigui funcional. D’altra banda, SA estimula l’expressió de les subunitats de CK2, mentre que la pèrdua d’activitat CK2 a les plantes CK2mut produeix un augment de la transcripció de gens relacionats amb la biosíntesi de SA. Aquests resultats suggereixen l'existència d’un loop de retroalimentació negatiu entre la CK2 i el SA, necessari per mantenir la homeostasi de SA. En aquest capítol també es mostra que la sobreexpressió d’una subunitat CK2α catalíticament activa provoca un increment del sistema radicular de les plantes. En la segona part d’aquesta tesi, ens hem centrat en la recerca i caracterització de substrats de la CK2 en Arabidopsis. Amb aquest objectiu, vam realitzar un assaig de doble híbrid en llevat, que ens va permetre identificar, entre d’altres, a la proteïna NPH3 com a possible substrat de la CK2. NPH3 és un element essencial de la via de senyalització del fototropisme; la seva activitat en aquesta via depèn del seu estat de fosforilació i del seu paper com a adaptador de substrat d’un complex d’ubiquitinació del tipus Cullin3-Ring E3 lligasa (CRL3NPH3). Aquest complex ubiquitina al fotoreceptor de llum blava phototropin 1, el qual es troba associat a la membrana plasmàtica. En la foscor, la proteïna NPH3 està fosforilada i inactiva, mentre que en condicions de llum, està defosforilada i activa, i dirigeix la ubiquitinació de phot1. Recentment, s’ha proposat que la ubiquitinació de phot1 promou la seva internalització des de la membrana cap al citoplasma. Els resultats obtinguts en aquest treball demostren que la quinasa CK2 fosforila NPH3 in vitro i que l’activitat d’aquesta quinasa és necessària per a la fosforilació in vivo en condicions de foscor. A més, la fosforilació de NPH3 per part de la CK2 és important per a mantenir la proteïna NPH3 inactiva. D’altra banda, la manca d’activitat CK2 provoca l’internalització de phot1, inclús en foscor, fet que podria estar relacionat amb el fenotip no fototròpic de les plantes sense activitat CK2. Aquesta internalització és independent de la presència de NPH3 i, per tant, independent d’ubiquitinació. Sorprenentment, la internalització de phot1 observada en condicions de llum, també és independent de la presència de NPH3., This thesis is part of a research project that aims to study the role of the serine/threonine protein kinase CK2 in plant development, using Arabidopsis thaliana as a model. Despite being one of the first kinases identified, the signaling pathways in which CK2 is involved are not yet fully characterized. The first part of this thesis describes the involvement of CK2 in the signaling pathway of salicylic acid (SA), and the control exercised by this hormone in the expression of genes coding for auxin membrane transporters (the PIN proteins) and their regulatory kinase PINOID (PID). Former members of the group where this thesis was carried out had obtained a dominant negative mutant of CK2 (CK2mut plants). These plants showed altered root phenotypes (decrease of the main root length and absence of lateral root formation) and changes in the transcription levels of genes encoding several of the PIN proteins (PIN1-PIN4 and PIN7) and of the kinase PINOID (PID) (Marques-Bueno et al., 2011). Here, we show that CK2mut plants contain high levels of salicylic acid, which are responsible for the root phenotype of CK2mut plants. We also demonstrate that treatment of Arabidopsis wild-type plants with exogenous SA inhibits the transcription of genes coding for proteins PIN1-PIN4 and PIN7, while it stimulates the transcription of the PID encoding gene. This effect is similar to that observed in roots of CK2mut plants, except for PIN4 and PIN7 genes, which are overexpressed, suggesting that the repressive effect of SA on PIN4 and PIN7 expression requires a functional CK2. Moreover, SA stimulates the expression of CK2 subunits, whereas the loss of CK2 activity in CK2mut plants produces an increase in the transcript levels of genes related to SA biosynthesis. We propose the existence of a negative feedback loop between CK2 and SA, needed to maintain the homeostasis of SA. This chapter also shows that overexpression of a catalytically active α subunit of CK2 improves the root system of Arabidopsis plants. The second part of this thesis focuses on the searching and characterization of plant CK2 substrates. For this purpose, we performed a large scale yeast two-hybrid screen that resulted in the identification of 28 potential CK2 substrates. Among them, we found four members of the same protein family, called NPH3/RPT2 (NRL), including NPH3, the founder member of the family. NPH3 is an essential element of the phototropic signaling pathway, and its activity in this pathway depends on its phosphorylation state and on its role as a substrate adapter within the Cullin3-Ring E3 ligase (CRL3NPH3) ubiquitination complex. CRL3NPH3 ubiquitinates the membrane-associated blue light photoreceptor phototropin 1. In the dark, NPH3 is phosphorylated and inactive, while in light conditions it is defosforilated and active and directs ubiquitination of phot1. Recently, it has been proposed that ubiquitination of phot1 promotes its internalization from the plasma membrane into the cytoplasm. Here we show that CK2 phosphorylates NPH3 in vitro, and that CK2 activity is required for the in vivo NPH3 phosphorylation in darkness. In addition, phosphorylation of NPH3 by CK2 is important to keep the protein inactive. Moreover, we observe that the lack of CK2 activity causes internalization of phot1 even in darkness, which could be responsible for the aphotrotropic phenotype of plants without CK2 activity. This internalization is, however, independent of the presence of NPH3 and therefore independent of ubiquitination. Surprisingly, internalization of phot1 observed in light conditions is also independent of the presence of NPH3.

Aquesta tesi s’emmarca dins d’un projecte d’investigació més general que té per objectiu caracteritzar i estudiar la funció de la proteïna quinasa CK2 de sistemes vegetals. La CK2 és una Ser/Thr quinasa present a tots els eucariotes estudiats fins al moment. Estudis fets en diversos eucariotes han evidenciat la importància d’aquesta quinasa en el creixement i en el control del cicle cel·lular, no obstant, les vies de senyalització en que participa aquesta quinasa encara no estan caracteritzades per complet. Al primer capítol d’aquesta tesi es descriu per primera vegada la involucració de la proteïna quinasa CK2 d’Arabidopsis en la via de senyalització de les auxines, en particular, del transport d’auxina. En plantes, la fitohormona auxina és la principal reguladora del creixement cel·lular. Recentment s’ha demostrat que la distribució asimètrica de l’auxina en els diferents òrgans de la planta és essencial per al desenvolupament vegetal i, aquesta distribució depèn principalment del transport polar de l’auxina. Per dur a terme aquesta investigació hem utilitzat un mutant dominant negatiu de la proteïna quinasa CK2 d’Arabidopsis thaliana (la línia CK2mut); aquest mutant té uns trets fenotípics que estan lligats a alteracions en processos dependents d’auxina, com són la inhibició del creixement de l’arrel principal, l’absència d’arrels laterals i el fenotip wavy. No obstant, s’ha comprovat que la percepció de l’auxina no està afectada ja que les plantes CK2mut responen al tractament exogen amb aquesta hormona. Hem demostrat que aquest mutant no té defectes en la síntesi de l’auxina, però si en el transport d’aquesta hormona. Eliminant l’activitat CK2 utilitzant eines genètiques (línia CK2mut) i eines farmacològiques (tractament amb TBB, un inhibidor específic de la CK2) hem demostrat que hi ha anomalies en la formació dels gradients d’auxina i canvis en l’expressió de gens relacionats amb les auxines; en particular, en membres de la família de transportadors de sortida d’aquesta hormona cap a l’exterior cel·lular (PINs) i en la proteïna quinasa PINOID (PID). Aquestes proteïnes són reguladores dels fluxos d’auxina. Estudis fets amb plàntules PIN4::PIN4-GFP i PIN7::PIN7-GFP han permès detectar que l’eliminació de l’activitat CK2 provoca l’acumulació d’aquestes proteïnes en vesícules endosomals. La formació de vesícules endosomals va fer pensar que la CK2 tenia algun paper en la via de tràfic vesicular d’aquests transportadors, i aquest ha estat el tema d’estudi del segon capítol d’aquesta tesi. S’han emprat diversos inhibidors de diferents punts de la via de tràfic vesicular per tal de poder discriminar a quin punt d’aquesta via actua la CK2. Aquests experiments s’han realitzat utilitzant plantes PIN7::PIN7-GFP i utilitzant com a model les plantes PIN1::PIN1-GFP, ja que PIN1 és el transportador d’auxina més ben caracteritzat. Amb el tractament amb tyrphostin A23 hem observat que les vesícules endosomals que es formen per eliminació de l’activitat CK2 estan revestides de clatrina. Amb els tractaments amb brefeldin A (BFA) i wortmannin hem determinat que la CK2 actua en algun punt de la via d’endocitosi diferent al d’aquests inhibidors. S’ha detectat que aquests endosomes no es tenyeixen amb el colorant específic de lípids FM4-64 i que són més grans que els endosomes obtinguts pel tractament amb BFA. Per últim, el tractament amb cicloheximida ens ha permès observar dos efectes: el primer és que la formació d’endosomes no depèn de la síntesi de proteïnes de novo i el segon, és que la inhibició de la CK2 no compromet la degradació al vacúol d’aquestes proteïnes. Així doncs, amb els resultats obtinguts podria ser que l’eliminació de la CK2 provoqués la formació d’endosomes sorting nexin aberrants, indicant així, que aquesta quinasa estaria intervenint en la via del retròmer., This thesis is involved in a more general project that aims to characterise and study the protein kinase CK2 in vegetal systems. Protein kinase CK2 is a pleiotropic Ser/Thr kinase and evolutionary conserved in eukaryotes. Studies performed in different organisms, from yeast to humans, have highlighted the importance of CK2 in cell growth and cell-cycle control. However, the signalling pathways in which CK2 is involved have not been fully identified. The first chapter of this thesis involves for first time the protein kinase CK2 in the auxin signaling pathway. In plants, the phytohormone auxin is a major regulator of auxin cell growth. Recent discoveries have demonstrated that differential distribution of within plant tissues is essential for developmental processes, and that this distribution is dependent on polar auxin transport. We report here that a dominant-negative mutant of CK2 (CK2mut) in Arabidopsis thaliana shows phenotypic traits that are typically linked to alterations in auxin-dependent processes. However, CK2mut plants exhibit normal responses to exogenous indole-3-acetic acid (IAA) indicating that they are not affected in the perception of the hormone, but upstream in the pathway. We demonstrate that mutant plants are not deficient in IAA but are impaired in its transport. Using genetic and pharmacological tools we show that CK2 activity depletion hinders correct formation of auxin gradients and leads to widespread changes in the expression of auxin-related genes. In particular, members of the auxin efflux carrier family (PINs), and the protein kinase PINOID, both key regulators of auxin fluxes, were misexpressed. PIN4 and PIN7 were also found mislocalized, with accumulation in endosomal bodies. The endosomal bodies formation lead to think that CK2 has a role in vesicular traffic pathway of these carriers and this was the topic of the study of the second chapter of this thesis. We have used several inhibitors in order to identify the point of the pathway in which acts the CK2. We performed these experiments using both PIN7::PIN7-GFP and PIN1::PIN1-GFP as a model, because PIN1 is the carrier more characterized. The tyrphostin A23 treatment reveals that these endosomal vesicles formed by the CK2 inhibition are clathrin coated. The brefeldin A and wortmannin treatments have determined that CK2 acts in a different point of the pathway than these inhibitors. We have detected that the endosomal bodies obtained by CK2 inhibition are not stained by FM4-64 dye and are enlarged compared with the endosomes obtained by the BFA treatment. Finally, the cicloheximide treatment has allowed observing two effects. The first is that the formation of endosomes does not depend on de novo protein synthesis. The second one is that CK2 inhibition does not compromise the degradation of the PIN proteins in the vacuole. Therefore, our results seem to indicate that inhibition of CK2 entails the formation of aberrant sorting nexin endosomes, which may lead to think that this kinase would be involved in the retromer complex.