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197 p. Las células "natural killer" (NK) son un componente clave del sistema inmunitario innato y una de sus funciones es reconocer y eliminar células malignas. El trasplante autólogo de precursores hematopoyéticos (TASPE) es un tratamiento establecido en todo el mundo para muchos tumores hematológicos, incluyendo el mieloma múltiple (MM). Se ha descrito que la reconstitución temprana de las células NK tras el TASPE tiene un papel muy importante en el pronóstico de los pacientes con MM. El objetivo principal de este trabajo ha sido estudiar los cambios en las subpoblaciones de células NK durante su reconstitución tras un TASPE en pacientes diagnosticados con MM. En esta tesis doctoral, en primer lugar, observamos que la expresión del receptor NKp80 en la superficie de las células NK no se veía alterada en diferentes condiciones y que, además, era más específico que el marcador CD16 tradicionalmente usado para identificar las células NK CD56neg. Además, mediante el uso de la citometría de flujo y el análisis del trascriptoma mediante secuenciación de ARN (ARN-seq), demostramos que las células NK experimentan un cambio tanto fenotípico como a nivel de perfil de expresión génica tras el TASPE. De este modo, los experimentos de ARN-seq demostraron que las células NK adquieren un fenotipo similar al de las células NK deciduales. Por último, descubrimos que la frecuencia de células NK con el fenotipo NKG2A-CD57+ se asocia al pronóstico de pacientes con MM sometidos a TASPE.

La gripe pandémica causó una gran morbilidad durante la temporada 2009-2010 y en determinados pacientes en edades medias de la vida, causó neumonía viral primaria que en algunos casos requirió ingreso en la UCI. Nuestro grupo de investigación objetivó, en los pacientes más graves (aquellos que necesitaban de ventilación mecánica), niveles elevados de citocinas y quimiocinas pro-inflamatorias en plasma, acompañando a la presencia de infiltrados neumónicos. Esta tesis pretende comprobar el papel de la inflamación en la patogénesis de la infección por el virus de la gripe pandémica de 2009, utilizando un modelo de ratón C57BL6 infectado y un grupo de ratones control. El análisis de expresión génica a nivel pulmonar mediante microarrays de transcriptoma completo demostró la presencia de una marcada activación de genes de la inmunidad innata a día 5 post-infección, coincidiendo con la existencia de infiltrados neumónicos extensos, infiltración celular intensa en el pulmón y replicación viral activa. Este programa transcriptómico relacionado con la inmunidad innata se normalizó a día 10, coincidiendo con la desaparición de los infiltrados neumónicos y del virus. En este trabajo se diseccionó a nivel molecular las rutas de señalización celular alteradas a nivel pulmonar tras la infección por este virus, lo cual será útil para diseñar modelos de inmunomodulación de estas rutas en el futuro. En conclusión, la inducción de una reacción exacerbada de la inmunidad innata/inflamación se asocia con la génesis de la neumonía tras la infección por el virus de la gripe pandémica de 2009, pero también parece ser necesaria para eliminar el mismo., Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología

La neumonía adquirida en la comunidad es una de las patologías que causa más morbimortalidad a nivel mundial, aproximadamente el 10% de los pacientes con neumonía desarrollan enfermedad grave que requiere el ingreso en UCI. Un tercio de las neumonías son producidas por virus, siendo el más frecuente el virus de la gripe, aunque los nuevos métodos de diagnóstico molecular están permitiendo diagnosticar cada vez más neumonías causadas por virus distintos al gripal (rinovirus, virus respiratorio sincitial, etc.) En el año 2009 apareció un nuevo virus gripal, el virus A/H1N1pdm09, el cual causo una pandemia durante la temporada 2009-10 y en la temporada siguiente se estacionalizó siendo el responsable de la epidemia anual gripal en Europa. En este trabajo se reclutaron pacientes con neumonía viral grave durante la temporada postpandémica (2010-2011) con el objetivo de estudiar el papel que juega el sistema inmune en la gravedad y mortalidad de la neumonía vírica grave, así como analizar los factores diferenciales según la etiología de la neumonía. Para lograr estos objetivos se midieron los niveles de diversas citoquinas, de todos los isotipos de inmunoglobulinas y de todas las subclases de la IgG en el plasma de los pacientes. Los pacientes con neumonía gripal grave presentan frecuentemente inmunosupresión previa. Los niveles de citoquinas en el plasma de los pacientes se encuentran elevados mientras que por el contrario, sus niveles de inmunoglobulinas están disminuidos. Dentro de las inmunoglobulinas, la IgM y la IgG2 juegan un papel protector, ya que los pacientes con menores niveles de estas inmunoglobulinas muestran menor tiempo de supervivencia. Además los niveles de IgM en plasma son un factor predictor de mortalidad. La neumonía grave por virus distintos al gripal ha sido escasamente estudiada. Este trabajo ha permitido definir importantes características sobre los pacientes afectados por esa patología, como son que presentan mayor edad que los pacientes infectados por el virus gripal y un peor estado basal con numerosas comorbilidades, pese a lo cual la tasa de mortalidad es muy inferior a la de la neumonía gripal. Por primera vez se han identificado dos citoquinas, MCP-1 y MIP-1ß, y una inmunoglobulina, IgA, cuyos niveles permiten diferenciar si el paciente está infectado por el virus de la gripe u otro virus., Departamento de Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina legal y Forense

OBJETIVOS. 1. Determinar el papel de los mecanismos autoinmunes en la patogenia de la fibromialgia. Evaluar la presencia de anticuerpos anti-serotonina, anticuerpos anti-gangliósidos y otros autoanticuerpos en sangre periférica de pacientes con fibromialgia y controles sanos así como analizar la variación de estos anticuerpos en función del estado clínico de los pacientes. 2. Evaluar la presencia de disbalances entre citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias y estudiar la asociación de los polimorfismos genéticos de estas citoquinas con la susceptibilidad y manifestaciones clínicas de la fibromialgia. 3. Analizar el polimorfismo de los genes KIR y HLA de clase I y clase II en pacientes con fibromialgia y controles sanos con el objetivo de conocer su posible asociación con la susceptibilidad y manifestaciones clínicas de la enfermedad. METODOLOGÍA Determinación de anticuerpos IgG e IgM anti-serotonina: ELISA tipo sándwich y anticuerpos anti-Gangliósidos mediante dot-blot. Los niveles de serotonina en suero se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La determinación de citoquinas en suero se realizó con tecnología Luminex, con la excepción del TGF-β1 que se realizó mediante ensayo ELISA tipo sándwich. El polimorfismo de los genes de las citoquinas se determinó mediante un ensayo de discriminación alélica con sondas Taqman específicas. El estudio del polimorfismo VNTR del gen de la IL-4 se realizó PCR convencional empleando cebadores específicos para amplificar la región de interés El tipaje de los genes HLA-A, B, C, y KIR se realizó mediante las técnicas de PCR-SSO y PCR-SSP. CONCLUSIONES: 1. Los niveles de serotonina se encuentran disminuidos en el suero de los pacientes con FM pero no parecen asociarse con la severidad de las manifestaciones clínicas. 2. La prevalencia de anticuerpos anti-serotonina IgG e IgM y los niveles séricos de estos anticuerpos se encuentran aumentados en pacientes con FM respecto a la población sana. 3. La prevalencia de anticuerpos anti-serotonina IgG e IgM es mayor en pacientes de FM con niveles de ansiedad moderada, severa o grave que en pacientes con niveles de ansiedad leve, lo que sugiere una asociación de estos anticuerpos con formas más severas de la enfermedad. 4. Los niveles séricos de las citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias estudiadas son similares en pacientes con FM y en la población sana. 5. Los SNPs de los genes de las citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias estudiadas no parecen asociarse con la susceptibilidad al desarrollo de FM. 6. El genotipo AA del SNP rs16944 del gen de la IL-1β se asocia con una manifestación grave o muy grave de la enfermedad según el test FIQ en pacientes con FM, por el contrario, la presencia del genotipo GA de este SNP se asocia con una manifestación más leve de la enfermedad. 7. El genotipo AA del SNP rs1143634 del gen de la IL-1β se asocia con una manifestación moderada o grave de la FM según el test CGI. 8. El genotipo 3R/3R de la región VNTR del gen de la IL-4 se asocia con una peor calidad de vida en pacientes con FM, por el contrario el genotipo 2R/3R se asocia a una mejor calidad de vida de los mismos. 9. El genotipo GG del SNP rs1800469 del gen del TGF-β se asocia a una mejor calidad de vida de los pacientes con FM, por el contrario el genotipo AG se asocia con niveles de ansiedad severa o grave en estos pacientes. 10. El polimorfismo de los genes KIR y HLA no se asocia con la susceptibilidad a desarrollar FM ni con las manifestaciones clínica de la misma. 11. Este trabajo confirma que la FM, además de estar condicionada por factores genéticos, desde el punto de vista inmunológico puede tener mecanismos etiopatogénicos diferentes como son los fenómenos autoinmunes o los fenómenos de desregulación de los mecanismos inflamatorios, hecho que puede tener relevancia clínica a la hora de evaluar adecuadamente a los pacientes así como para poder diseñar tratamientos más personalizados. OBJECTIVES 1. Determine the role of autoimmune mechanisms in the pathogenesis of fibromyalgia. To evaluate the presence of anti-serotonin antibodies, anti-ganglioside antibodies and other autoantibodies in peripheral blood of patients with fibromyalgia and healthy controls, as well as to analyze the variation of these antibodies according to the clinical status of patients. 2. Evaluate the presence of imbalances between pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines and to study the association of cytokine genetic polymorphisms with the susceptibility and clinical manifestations of fibromyalgia. 3. To analyze the polymorphism of KIR and HLA class I and class II genes in fibromyalgia patients and healthy controls in order to investigate their potential association with the susceptibility and clinical manifestations of the disease. METHODOLOGY The determination of anti-serotonin IgG and IgM antibodies was performed bysandwich ELISA, and the determination of anti-Ganglioside antibodies was performed by dot-blot. Serum levels of serotonin were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Serum cytokine determination was performed using Luminex technology, with the exception of TGF-β1 that was performed by sandwich ELISA. The cytokine gene polymorphisms were determined by allelic discrimination assay, with specific Taqman probes and alternatively by Sanger sequencing. The study of the IL-4 gene VNTR polymorphism was performed by conventional PCR using the specific primers to amplify the region of interest. Typing of the HLA-A, B , C, and KIR genes was performed using PCR-SSO and PCR-SSP techniques. CONCLUSIONS: 1. Serotonin levels are decreased in the serum of FM patients but doesn´t appear to be associated with the severity of clinical manifestations. 2. The prevalence and serum levels of IgG and IgM anti-serotonin antibodies are increased in patients with FM compared to the healthy population. 3. The prevalence of IgG and IgM anti-serotonin antibodies is higher in FM patients with moderate or severe anxiety levels than in patients with mild anxiety levels, suggesting an association of these antibodies with more severe forms of the disease. 4. Serum levels of the studied pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines are similar in patients with FM and in healthy population. 5. SNPs of the studied pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine genes doesn´t appear to be associated with susceptibility to FM development. 6. The AA genotype of the IL-1β gene SNP rs16944 is associated with a severe or very severe manifestation of the disease according to the FIQ test in patients with FM, by contrast, the presence of GA genotype in this SNP is associated with a milder manifestation of the disease. 7. The AA genotype of the IL-1β gene SNP rs1143634 is associated with a moderate or severe manifestation of FM according to the CGI test. 8. The 3R/3R genotype of the IL-4 gene VNTR region is associated with a worse quality of life in patients with FM., by contrast the 2R/3R genotype is associated with a better quality of life. 9. The GG genotype of the TGF-β gene SNP rs1800469 associated with a better quality of life in patients with FM, by contrast the AG genotype is associated with severe anxiety levels in these patients. 10. KIR and HLA genes polymorphism is not associated with the susceptibility and clinical manifestations of FM. 11. This work confirms that FM is conditioned by genetic factors, but also may be related to immunological factors such as autoimmune phenomena or a deregulation of inflammatory mechanisms, which may be relevant for an adequate clinical assessment of patients as well as for the design personalized treatments

Estudio de cohorte prospectivo, multicéntrico, de pacientes coinfectados por VIH /VHC procedentes de 9 centros sanitarios en la región de Castilla la Mancha tratados con agentes antivirales directos (AADs) de segunda generación. Se incluyeron todos los pacientes con ARN del VHC sérico detectable naïves a AADs de segunda generación (se incluyeron aquellos que habían fracasado a terapias con boceprevir y/o telaprevir). Nuestros objetivos fueron: evaluar la eficacia y la seguridad de los AADs y compararla con datos procedentes de ensayos clínicos y estudios observacionales; identificar los factores asociados al fracaso terapéutico y analizar la evolución de la fibrosis y los factores asociados a una disminución de la rigidez hepática medida por elastografía. Recogimos variables demográficas, biológicas, analíticas y elastográficas basales y en visitas sucesivas. La elastografía hepática se realizó mediante FibroScan®. El objetivo primario fue la evaluación de la respuesta viral sostenida (RVS) en la semana 12 después de finalizar el tratamiento. Se realizaron análisis por intención de tratar (AIT) y por datos observados (ADO). Se utilizaron modelos bivariables y multivariables para ajustar los efectos de los factores de confusión. Los modelos se desarrollaron a partir de variables significativas del análisis bivariable (p

En los últimos años se ha avanzado en el conocimiento del proceso patogénico que ocurre en la afectación vasculítica renal, implicando a nuevos mecanismos de daño molecular y celular. Entre ellos destaca el papel de los macrófagos como células efectoras con un rol primario en el proceso patogénico. Los estudios histológicos han demostrado que los macrófagos CD163 son el tipo de célula infiltrante predominante en las biopsias de pacientes con vasculitis, donde parecen infiltrar en estadios precoces de la enfermedad. Modelos experimentales han analizado la presencia de CD163 soluble (CD163s) en la orina de ratas a las que se les ha inducido vasculitis, demostrando concentraciones elevadas al mes de la inmunización con ANCA-MPO. Estos hallazgos posicionan al CD163s como un posible biomarcador de actividad vasculítica y la medición de las concentraciones urinarias de CD163s durante el seguimiento de pacientes con vasculitis asociada a ANCA (VAA) podría ser de utilidad para la monitorización de la respuesta al tratamiento, la identificación de actividad vasculítica residual y el diagnóstico de recidiva renal. Partiendo de esta hipótesis, estudiamos los niveles urinarios de CD163s en una cohorte prospectiva de 24 pacientes incidentes con brote de vasculitis renal, un grupo control de 23 pacientes con vasculitis renal en remisión, y un grupo control de 20 sujetos sanos. En los pacientes incidentes se realizaron determinaciones de CD163su al debut de la enfermedad y posteriormente cada 3 meses hasta el final del seguimiento. El CD163 soluble urinario (CD163su) se analizó mediante ELISA y los valores fueron normalizados según concentración de creatinina urinaria. Se identificó la aparición de recaídas durante el seguimiento estudiando los cambios en las concentraciones del CD163su en estos pacientes y su correlación con otros parámetros de actividad vasculítica Los 24 pacientes con brote renal de vasculitis mostraron al diagnóstico unos niveles elevados de CD163su en comparación con los pacientes en remisión y los controles sanos. Las concentraciones de CD163su decrecieron progresivamente tras el tratamiento en todos los enfermos que alcanzaron remisión, mientras que permanecieron elevados a pesar del tratamiento cuando no existió respuesta al mismo. En los pacientes que presentaron una recaída renal se produjo una elevación significativa de las concentraciones de CD163su con respecto a los valores previos. Un incremento absoluto de 20 ng/mmol o un incremento relativo del 20% con respecto a las concentraciones previas de CD163su permitió discriminar la presencia de recaída renal de la vasculitis con una sensibilidad del 100%, y una especificidad del 89,3% para los cambios absolutos y del 87,5% para los cambios relativos. El AUC del cambio absoluto y relativo de las concentraciones de CD163su con respecto al valor previo para discriminar una recaída renal fue de 0.9679 (IC 95% 0,915-1.000; p=0.001) y 0,9571 (IC 95% 0,9032-1,000, p=0,001), respectivamente. Las concentraciones de CD163su se correlacionaron con el valor del score BVAS al 6º mes (r=0,737, p=0,006) y al 12º mes (r=0,804, p=0,005), demostrando la capacidad del CD163su para monitorizar actividad vasculítica. Nuestros resultados posicionan al CD163su como un biomarcador fiable y preciso para monitorizar la respuesta al tratamiento, identificar actividad vasculítica residual y diagnosticar la presencia de recaídas renales durante el seguimiento de pacientes con VAA

El Factor XII (FXII) continúa siendo un elemento desconocido y enigmático a pesar de ser una molécula pleiotrópica y de estar implicado en diversos sistemas como coagulación, inflamación, fibrinólisis y complemento. Para obtener nueva información sobre esta proteína, decidimos estudiar 3 patologías con presencia de moléculas de FXII aberrantes. La caracterización de dicho FXII aberrante podría aportar nueva información molecular, bioquímica, funcional y patológica. En primer lugar, identificamos fortuitamente, un paciente con leucemia aguda que presentaba todo su FXII plasmático 5 KDa mayor que el FXII silvestre. La base congénita de este defecto se demostró al observar el mismo FXII en su hermano. Sin embargo, la secuenciación completa del gen F12 no identificó ninguna alteración molecular que explicara el FXII aberrante. Además, ante ciertas condiciones (activación con sílica o dextrán sulfato (DXS); incremento del % de SDS, o purificación del FXII por cromatografía de afinidad), se detectaba el FXII silvestre. Este resultado sugiere que el FXII aberrante podría explicarse por una interacción casi covalente del FXII silvestre con un péptido de 5 KDa. La purificación y análisis proteómico del FXII aberrante sugirió que podría ser un péptido de GRIP1. De hecho, la secuenciación completa del exoma identificó una mutación en este gen que compartían los dos hermanos. Funcionalmente, el FXII aberrante parece ser menos sensible a la activación con dosis bajas de sílica y DXS, lo que podría contribuir a explicar las casi nulas complicaciones que ha presentado el paciente a lo largo de un extenso y agresivo tratamiento oncológico que incluyó dos trasplantes alogénicos. En segundo lugar, estudiamos 58 pacientes con desórdenes congénitos de glicosilación (CDGs). Demostramos que este defecto no provoca deficiencia de FXII, pero si la aparición en plasma de una forma de FXII hipoglicosilada. Las características de la cadena pesada del FXII tras su activación demostró que todo el FXII hipoglicosilado carece del N-glicano localizado en posición Asn414. La expresión recombinante de variantes mutadas en células de insecto afectando a los dos sitios de N-glicosilación descritos en el FXII confirmó que la ausencia de N-glicano en Asn230 es clave para el correcto plegamiento y/o secreción de la molécula. Además, el FXII hipoglicosilado parece más sensible a su activación y a la generación de calicreína. Por último, nuestro proyecto reclutó 33 pacientes con angioedema hereditario tipo III (FXII-HAE) portadores de la variante patogénica p.Thr309Lys. Esta patología es hasta la fecha la única claramente asociada con variantes patogénicas en el gen del F12. Todos menos 3 portadores de esta mutación presentaban dos formas de FXII en plasma. El tamaño del FXII aberrante no podía justificarse por un defecto de O-glicosilación como se había propuesto. De hecho, la forma recombinante mutada, también expresada en células de insecto, tenía el mismo tamaño que la forma silvestre. Los estudios realizados sugirieron que esta forma aberrante podría ser resultado de un procesamiento alternativo del exón 9. El FXII aberrante tanto el plasmático como el recombinante, era más sensibilidad a activarse ante menores estímulos, generando calicreína, pero sin causar activación de la coagulación. En conclusión, el estudio del FXII aberrante en diferentes patologías nos ha permitido conocer la complejidad de esta proteína, sus interacciones y la repercusión que una modificación postraduccional, como la glicosilación, tiene en su secreción y funcionalidad. Factor XII (FXII) remains an unknown and enigmatic element despite being a pleotropic molecule and being involved in various systems such as coagulation, inflammation, fibrinolysis and complement. To obtain information about this protein, we decided to study 3 patterns with the presence of aberrant FXII molecules. The characterization of this aberrant FXII could provide new molecular, biochemical, functional and pathological information. First, we identified a patient with acute leukemia who presented all of his FXII in plasma 5 KDa greater than the wild FXII. The congenital basis of this defect was demonstrated by observing the same FXII in his brother. However, the complete sequencing of the F12 gene did not identify any molecular alteration that would explain the aberrant FXII. In addition, under certain conditions (activation with silica or dextran sulfate (DXS), increase in SDS %, or purification of FXII by affinity chromatography), wild FXII was detected. This result suggests that aberrant FXII could be explained by an almost covalent interaction of wild FXII with a 5 KDa peptide. The purification and proteomic analysis of the aberrant FXII suggests that it could be a GRIP1 peptide. In fact, the complete sequencing of the exome identifies a mutation in this gene shared by the two brothers. Functionally, aberrant FXII seems to be less sensitive to activation with low doses of silica and DXS, which could contribute to explain the almost zero complications that the patient has presented throughout an extensive and aggressive oncological treatment that included two allogeneic transplants. Second, we studied 58 patients with congenital glycosylation disorders (CDGs). This defect does not cause FXII deficiency but the appearance in plasma of a hypoglycosylated form of FXII. The characteristics of the heavy chain of FXII after its activation showed that all the hypoglycosylated FXII lacks the N-glycan located in position Asn414. The recombinant expression of mutated variants in insect cells affecting the two N-glycosylation sites described in FXII confirms that the absence of N-glycan in Asn230 is key for the correct folding and/or secretion of the molecule. In addition, hypoglicosylated FXII seems more sensitive to its activation and to the generation of kallikrein. Finally, our project included 33 patients with hereditary angioedema type III (FXII-HAE) carrying the p.Thr309Lys mutation. Until now, this pathology is clearly associated with mutations in the F12 gene. All patients, except 3 who were carriers of this mutation, presented two forms of FXII in plasma. The size of the aberrant FXII could not be justified by a defect in O-glycosylation as proposed. In fact, the mutated recombinant form, also expressed in insect cells, had the same size as the wild type. The studies carried out suggest this aberrant form could be the result of an alternative processing of exon 9. The aberrant FXII, both plasma and recombinant, is more sensitive to activation in response to lower stimulation, generating kallikrein but without causing coagulation activation. In conclusion, the study of aberrant FXII in different pathologies has allowed us to know the complexity of this protein, its interactions and the repercussion that a post-translational modification, such as glycosylation, has on its secretion and functionality.

Un hecho característico de la cirrosis hepática es la susceptibilidad incrementada a la infección por bacterias de origen entérico. Las bases patogénicas de esta alteración pudieran ser anomalías en la función de diversas poblaciones del sistema inmune (SI) que se han descrito en la cirrosis, tanto a nivel local, en el intestino, como a nivel sistémico. Sin embargo, son escasos los estudios que han caracterizado los cambios inmunológicosa nivel peritoneal, a pesar que la peritonitis bacteriana espontánea (PBE) es la infección más frecuente y característica de la cirrosis. Tampoco se han estudiado las alteraciones producidas, tanto a nivel peritoneal como sistémico, tras la inducción de peritonitis bacteriana (PBI), y que podrían explicar la incapacidad del SI para contener la diseminación de las bacterias en la cirrosis. Con el objeto de responder a estos interrogantes, analizamos la traslocación bacteriana (TB) y la diseminación de bacteriasen un modelo experimental de cirrosis biliar, caracterizamos las alteraciones de las células del SI a nivel peritoneal y sistémico, y evaluamos el efecto de la PBI en los parámetros anteriormente mencionados. La hipótesis defendida en esta Tesis Doctoral establece que la cirrosis se asocia a un estado crónico de inflamación del SI, tanto a nivel peritoneal como sistémico, que es consecuencia del estímulo bacteriano persistente, que podría dar lugar a una incapacidad de las células inmunitarias de responder a la infección, y que favorecería la diseminación bacteriana. Entre los resultados más relevantes de este estudio destacanque las ratas con cirrosis sufren una mayor tasa de TB y una mayor diseminación de bacterias después de la PBI, además de una alteración de las células del SI tanto en la circulación sistémica como en la cavidad peritoneal, que provoca una hipersensibilidad del SI en ambos compartimentos. Las conclusiones de esta Tesis Doctoral son: i) la TB y ladiseminación sistémica de bacterias intestinales y exógenas tras la PBI está aumentada en la cirrosis biliar experimental, lo que traduce un defecto en la función del SI;ii) la cirrosis se asocia a un estado persistente de inflamación del SI, tanto peritoneal como sistémico, caracterizado por un aumento en la concentración de citoquinas proinflamatorias y expansión de células inmunitarias activadas; iii) en la cirrosis biliar experimental existe una hipersensibilidad del SI peritoneal y sistémico al estímulo bacteriano, que paradójicamente se asocia a una incapacidad para expandir simultáneamente el compartimento monocitario.

El virus de la Fiebre del Valle del Rift (RVFV) es un flebovirus zoonótico transmitido por mosquitos que afecta a los rumiantes causando abortos y hepatitis aguda con necrosis multifocal. Los síntomas de la RVF varían desde el síndrome gripal hasta la retinitis y la encefalitis. En esta tesis, mostramos la susceptibilidad leve-subaguda de las ovejas Ripollesas de 9-10 semanas de edad a la infección por RVFV. Cuatro aislamientos virales diferentes de brotes de campo se replicaron de forma eficiente in vivo tras la inoculación subcutánea experimental, detectándose viremia y diseminacion viral dependientes del aislado de RVFV. Se demostró la transmisión horizontal a un cordero centinela no infectado. La infección en corderos únicamente causó pirexia transitoria, aunque se observó opacidad corneal ("ojo azul") en 3 de 16 ovejas inoculadas subcutáneamente. En una aproximación preliminar, se investigó el tejido formolado y parafinado procedente de estos animales afectados por la opacidad corneal mediante histopatología y qRT-PCR, para su caracterización. En cuatro corderos infectados se diagnosticó uveítis anterior con endotelitis linfoplasmocítica. Para evaluar la protección conferida por una única dosis subcutánea de una vacuna de virus Ankara modificado (MVA) que codifica las glicoproteínas Gn y Gc de RVFV en corderos, se inmunizaron 3 grupos de 6 a 7 corderos de 5-7 semanas de edad de la siguiente manera: Un grupo vacunal (denominado rMVA-GnGc), un segundo grupo control vectorial (vector MVA) y un tercer grupo control no vacunado (solución salina). Catorce días más tarde, todos los animales se sometieron a un desafío subcutáneo con 105 TCID50 del aislamiento virulento RVFV 56/74 y se evaluó la eficacia de la vacuna usando puntos finales estándar. Dos corderos (uno del grupo vacunado y uno del control vectorial) sucumbieron al desafío, mostrando lesiones hepáticas características. Los corderos de los grupos control vectorial y control no vacunado fueron febriles de los días 2 a 5 después del desafío (pc) mientras que los del grupo rMVA-GnGc mostraron un único pico de pirexia al día 3 pc. Se detectó ARN de RVFV en ambos hisopados nasal y oral de los días 3 a 7 pc en algunos corderos de los grupos control vectorial y no vacunado, pero no se pudo detectar diseminación viral en los corderos supervivientes vacunados. Caracterizamos patológicamente la nueva lesión ocular detectada en un abordaje secundario. Se seleccionaron 2 grupos de 5 corderos por grupo (n = 10) de la base de datos histórica de infecciones experimentales de RVFV realizadas en el Centro de Investigación en Sanidad Animal (España, NBS3), en base a sus datos clínicos, viremia y diagnóstico de lesiones ocular y hepática. Se caracterizó la uveítis anterior diagnosticada (8 de 10) con endotelitis linfoplasmocítica (2 de 10). CD3, CD20 e infiltrados inflamatorios mononucleares positivos a la lisozima se observaron en ojos parafinados RVFV-positivos. El marcaje positivo de CD20 sólo se observó en los infiltrados en uvea anterior. También se diagnosticó una nueva retinitis T dependiente (CD3 positivo) en 5 de 10 corderos infectados con RVFV. Se desarrolló un protocolo de inmunoquímica contra RVFV basado en un anticuerpo monoclonal murino. En conclusión, la raza Ripollesa se infecta fácilmente con RVFV sin manifestaciones clínicas evidentes. Un modelo de desafío con corderos de 5 a 10 semanas de edad ha demostrado ser eficaz para testar vacunas. Se sugiere que una sola dosis de la vacuna rMVA-GnGc puede ser suficiente para reducir la diseminación de RVFV y la duración de la viremia, pero no proporciona inmunidad estéril ni protección contra la enfermedad. Hasta donde sabemos, esta es la primera descripción patológica de uveítis anterior con lesión retiniana en un modelo ovino, muy parecida a las lesiones oculares humanas., Rift Valley Fever Virus (RVFV) is a mosquito-borne zoonotic phlebovirus that primarily affects ruminants by causing abortions and acute hepatitis with multifocal necrosis as major findings. Human RVF symptoms range from flu-like syndrome to retinitis and encephalitis. The increasing interest in RVFV deserve revisiting experimental sheep infection. In this thesis, we show the susceptibility of 9–10 weeks old European sheep (Ripollesa breed) to RVFV infection, showing a mild, subacute form of disease. Four different viral isolates from field outbreaks efficiently replicated in vivo after subcutaneous experimental inoculation, and consistent viral loads in blood and RVFV-isolate dependent virus shedding were detected, showing horizontal transmission to a noninfected, sentinel lamb. RVFV infection caused transient pyrexia in old lambs and no other clinical symptoms were observed, although corneal opacity (“blue eye”) was found in 3 out of 16 subcutaneously inoculated sheep. To better characterize this corneal opacity, in a preliminary approach, formalin-fixed paraffin wax-embedded tissue from these ocular condition-affected animals was investigated by histopathology and quantitative real time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Anterior uveitis with lymphoplasmacytic endotheliitis was diagnosed in these four RVFV-infected lambs. To evaluate the protection conferred by a single subcutaneous dose of a modified vaccinia virus Ankara (MVA) vectored vaccine encoding the RVFV glycoproteins Gn and Gc in lambs, 3 groups of 6 to 7 Ripollesa lambs of 5–7 weeks old were immunized as follows: one group received the vaccine (termed rMVA-GnGc), a second group received an MVA vector (vector control) and a third group received saline solution (non-vaccinated control). Fourteen days later, all animals were subcutaneously challenged with 105 TCID50 of the virulent RVFV isolate 56/74 and vaccine efficacy assessed using standard endpoints. Two lambs (one from the vaccine group and one from the vector control group) succumbed to RVFV challenge, showing characteristic liver lesions. Lambs from both the vector control and non-vaccinated groups were febrile from days 2 to 5 post challenge (pc) while those in the rMVA-GnGc group showed a single peak of pyrexia at day 3 pc. RVFV RNA was detected in both nasal and oral swabs from days 3 to 7 pc in some lambs from the vector control and non-vaccinated groups, but no viral shedding could be detected in the surviving lambs vaccinated with rMVA-GnGc. We characterize pathologically the new ocular detected condition in a secondary approach. Two groups of five lambs per group were selected (n=10) from the historical database of RVFV experimental infections performed in Center of Research in Animal Health (Spain, NBS3 facility) in the basis of their clinical data, viremia and diagnosed ocular and hepatic lesions (two previous experiments). The previously diagnosed anterior uveitis (8 out of 10) with lymphoplasmacytic endotheliitis (2 out of 10) was characterized. CD3, CD20 and lysozyme-positive mononuclear inflammatory infiltrates were observed in RVFV-positive paraffin-embedded eyes. CD20 labelling was only observed in infiltrates in anterior uvea. A novel T-cell dependent retinitis was also diagnosed in 5 out of 10 RVFV-infected lambs based on CD3-positive labelling. An immunochemistry protocol based on a murine monoclonal antibody was developed at CReSA BLS2 facility. In conclusion, Ripollesa sheep are readily infected with RVFV without apparent clinical manifestations. A 5-10 weeks old Ripollesa breed challenge model has proven to be effective in vaccine testing because of its susceptibility to virus. It is suggested that a single dose of the rMVA-GnGc vaccine may be sufficient to reduce RVFV shedding and duration of viremia but does not provide sterile immunity nor protection from disease. To our knowledge, this is the first pathological description of RVFV-related anterior uveitis with retinal injury in a RVFV-challenge sheep model, resembling ocular human lesions.

163 páginas. -- Tesis doctoral. Universidad de Valladolid. Instituto de Biología y Genética Molecular-CSIC. Leída, 18-12-2015, Las citocinas IL-12 p70 e IL-23 polarizan la respuesta inmune a los tipos Th1 y Th17. Estas citocinas comparten una subunidad, la IL-12 p40 (gen IL12/23B) y difieren en una subunidad específica, la IL-12 p35 (gen IL12A) en la IL-12 p70, y la IL-23 p19 (gen IL23A) en la IL-23. La regulación del balance IL-12 p70/IL-23 es relevante en infecciones fúngicas invasivas y enfermedades autoinmunes. La transcripción de IL23A se regula por una combinación de c-Rel con coactivadores como ATF2, que se activa por fosforilación complementaria, dependiente de PKC y MAPKs, de las Thr-71 y Thr-69. Los receptores de patrones fúngicos Dectin-1 y Dectin-2 inducen la producción de LTB4, cisteinil-leucotrienos y PAF que contribuyen a la fosforilación de ATF2. La transcripción de IL12A se reprime por el estímulo fúngico zimosano mediante la desacetilación dependiente de NAD+ de las histonas del promotor de IL12A por SIRT1, reduciendo la accesibilidad de c-Rel.

El rápido desarrollo de la Inmunología durante el pasado y presente siglo, ha hecho que la Inmunología sea actualmente la ciencia que más interrelación tiene con otras disciplinas del campo de la Biología y de la Biomedicina en general. Su carácter multidisciplinar hace que se integre y se complemente a la perfección con multitud de disciplinas biomédicas. Por otro lado, cada día aumenta el número de enfermedades en las que se reconoce que la participación del sistema inmunitario, es la causa, o contribuye de forma importante al proceso patológico. Precisamente, durante el curso 2013-2014, ha empezado a impartirse por vez primera la asignatura de Inmunología Aplicada e Inmunopatología, del Area de Inmunología del cuarto curso de Grado en Biología, que a la vez que analiza las múltiples aplicaciones de la Inmunología en distintos campos de la Biotecnología y la Biomedicina, estudia con detalle aspectos diagnósticos, pronósticos y terapéuticos de las principales enfermedades de base inmunológica. Con esta red, pretendemos aprovechar la experiencia acumulada durante el pasado año con la asignatura de Inmunología General, impartida en tercer curso del Grado en Biología, para asegurar la adecuada coordinación entre el profesorado de las dos asignaturas actuales y fomentar el trabajo en equipo, buscando con ello cumplir con las competencias previstas descritas en las guías docentes de ambas asignaturas.