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Dissertação de mestrado em Marketing e Estratégica, Esta dissertação tem como objetivo analisar o impacto que a reputação e imagem de marca (pessoal) dos líderes de uma organização têm nas perceções que os consumidores desenvolvem relativamente às marcas corporativas que eles representam. Vivemos num mundo de marcas. As marcas pessoais são uma parte inevitável do mundo atual. Os consumidores tendem a humanizar as marcas corporativas com que se relacionam de forma a torná-las mais próximas de si, através dos valores que estas tentam passar. Os líderes têm um papel fundamental neste processo de humanizar as marcas, na medida em que representam a marca e, por vezes, são a face visível da mesma, fomentando uma relação mais próxima entre o cliente e a própria marca corporativa. É, assim, fundamental que os líderes tenham uma marca pessoal carismática, com a qual os consumidores se identifiquem e que os mercados respeitem, de forma a dar ainda mais credibilidade e notoriedade à marca corporativa que representam. Este estudo, de natureza exploratória, contou com entrevistas semiestruturadas dirigidas a jornalistas e especialistas em marketing pessoal, de forma a tentar compreender as suas perceções relativamente às marcas pessoais dos líderes. Paralelamente foi realizado um inquérito ao público com o intuito de perceber de que forma a marca pessoal se relaciona com o sucesso das marcas corporativas a que estão associadas. Este estudo indicou que as marcas pessoais podem ser mais fortes do que as marcas corporativas. Os líderes influenciam a imagem e a reputação das suas organizações de uma forma direta e essa reputação está relacionada com a forma como os consumidores vão encarar as marcas corporativas. As marcas corporativas constroem-se em grande parte pela influência das marcas pessoais dos seus líderes. Os líderes afetam sempre a marca corporativa com que se relacionam, seja de forma positiva ou negativa., This dissertation aims to analyze the impact of reputation and brand image (personal image) of the leaders of an organization on consumers’ perception of their corporate brand. We live in a world of brands. Personal brands are an inevitable part of this world. Consumers tend to humanize corporate brands that they are related to, in order to bring them closer through the values that they try to pass. Leaders play a critical role in this process since they are the face behind the brand, for better or worse, nurturing a closer relationship between client and the corporate brand itself. Therefore it is of utmost interest that leaders possess a charismatic branding, one that will gain the respect and admiration of consumers in such way that it provides the corporate brand they represent more credibility and visibility. This exploratory study included semi-structured interviews to journalists and experts in personal marketing in order to understand their perceptions of the personal brands of leaders. In parallel a public survey was realized to understand how personal branding relates to the success of corporate brands that they are associated. This study demonstrates that personal brands could be stronger than corporate brands. Leaders influence the image and reputation of their organizations directly and this reputation is related to how consumers will face with corporate brands. Corporate brands are largely built by the influence of the personal brands of their leaders. Leaders always affect the corporate brand to which they are related in a positive or negative way.

http://www.ijesit.com/Volume%203/Issue%202/IJESIT201402_52.pdf, Commercial stents commonly used nowadays, especially metallic ones, present several disadvantages, such as corrosion, infection and restenosis, leading to health complications for the patient, or even to his death. Although there are different kinds of stents, like pharmacological stents, that can deliver drugs, there is not an “ideal” stent being able to avoid these disadvantages, of commercial ones. Thus, in order to minimize the reaction of human body and fight the adhesion of microorganisms to stent surface, some stent coatings have been developed. This review paper describes some antibacterial agents, like antibiotics, quaternary ammonium compounds (QACs), silver and silver nanoparticles, that can be coated on stent surface, in order to avoid infection, as also as their behavior in presence of bacterial microorganisms. Additionally, some results of incorporation of these antibacterial agents in implantable devices will be discussed. Finally, it will be designated some of principal methods of nanoparticles implementation, such as impregnation, layer by layer(LBL) technique, thiol chemistry and physical vapor deposition (PVD) method. The inclusion of antimicrobial agent in nanoparticles increases its antimicrobial effect, due to the major surface area.

PhD thesis in Biomedical Engineering, The rise of the worldwide dental implant market constantly increases the concerns regarding the quality, efficiency and lifetime of dental implants. Titanium based materials have shown proven ability for application in this field, essentially due to their adequate mechanical properties, corrosion behavior and biocompatibility. However, and despite the high success rates associated with dental implants, failures still continue to occur. Among the problems affecting the performance of dental implants, one can find: lack of osteointegration, propensity for bacterial colonization and corrosion/tribocorrosion processes. All these aspects are highly dependent on the surface properties of the implant. Ideally, implant surfaces should simultaneously promote adhesion of osteoblasts and inhibit the colonization by unwanted microorganisms. Furthermore, it is also necessary to minimize combined actions between corrosion and wear (tribocorrosion) that can cause degradation of the implant surface and ultimately lead to its failure. This thesis presents an approach to develop multifunctional titanium oxide surfaces with excellent tribocorrosion performance, while promoting a bio-selective behavior between the adhesion of osteoblastic cells and the minimization of bacterial colonization. For that purpose, surface modification of titanium by Micro-Arc Oxidation was performed, allowing the formation of a thick, adherent and porous titanium oxide structure with incorporated bioactive elements such as calcium, phosphorous, magnesium and zinc. A detailed characterization of the surfaces provided important insights for the understanding of the mechanisms of film formation. Moreover, the results allowed the correlation between chemical/structural properties of the oxide, and their effect on biological and tribocorrosion mechanisms. The surfaces developed in this work presented excellent tribocorrosion resistance, good interactions with osteoblastic cells, and promising antimicrobial properties., O crescimento do mercado mundial de implantes dentários cria condições para um maior desenvolvimento deste tipo de restaurações e uma crescente exigência em relação à qualidade, eficiência e tempo de vida dos implantes. Materiais à base de titânio mostraram ao longo do tempo que possuem uma eficácia comprovada para uso em implantes devido às suas boas propriedades mecânicas, comportamento à corrosão e biocompatibilidade. No entanto, apesar da elevada taxa de sucesso, são ainda reportadas algumas falhas em sistemas de implantes. Entre os problemas que afetam a performance dos implantes podem encontrar-se: a falta de osseointegração, a possibilidade de colonização bacteriana e também processos de corrosão e tribocorrosão. A superfície do implante é um fator transversal, que influencia todos estes aspetos. Idealmente, esta deverá promover a adesão de células ósseas ao mesmo tempo que minimiza a colonização e proliferação de microrganismos prejudiciais. Além disso, deverá também minimizar processos de tribocorrosão (ação simultânea de mecanismos de corrosão e desgaste mecânico) que podem causar a degradação do implante e potencialmente levar à sua falha. Esta tese apresenta uma solução para o desenvolvimento de superfícies multifuncionais de óxido de titânio com excelente resistência à tribocorrosão e um comportamento bio-seletivo através da promoção da adesão de células ósseas e diminuição da atividade bacteriana. Para este fim, a modificação superficial do titânio foi conseguida através da técnica eletroquímica de anodização, permitindo a formação de um filme de óxido de titânio com uma estrutura porosa e dopado com elementos bioativos, como cálcio, fósforo, magnésio e zinco. Uma caracterização detalhada das superfícies produzidas, permitiu obter informação essencial para a compreensão dos mecanismos de formação do filme. Adicionalmente, os resultados permitiram ainda correlacionar as propriedades químicas e estruturais dos filmes com o comportamento biológico e os mecanismos de tribocorrosão identificados. As superfícies desenvolvidas neste trabalho apresentam uma excelente resistência à tribocorrosão, boa interação com células ósseas e ainda propriedades antibacterianas promissoras., Portuguese Foundation for Science and Technology – FCT Portugal, through grant SFRH/BD/70857/2010.

Tese de Doutoramento em Engenharia Biomédica, The oral cavity is a complex environment where corrosive substances from dietary, human saliva and oral biofilms may accumulate in retentive areas of dental implant systems and prostheses promoting corrosion at their surfaces. Additionally, during mastication, micro-movements may occur in artificial joints causing a relative motion between contacting surfaces, leading to wear. Both processes (wear and corrosion) result in a biotribocorrosion system. Previous studies have reported the corrosion of titanium in fluoride solutions. Nevertheless, the biotribocorrosion of titanium in fluoride solutions and in the presence of biofilms has not yet been reported to the authors’ best knowledge. Thus, the novelty of this work is to investigate the in-vitro corrosion and wear behavior of titanium in fluorinated artificial saliva solutions, and in presence of biofilms. In order to evaluate the corrosion behavior of titanium, electrochemical tests were performed on commercially pure (CP) titanium and Ti6Al4V in artificial saliva solutions without and containing different fluoride concentrations. After, electrochemical tests were carried out on CP titanium covered with biofilms composed of Streptococcus mutans and Candida albicans, and immersed in artificial saliva free of fluorides. In corrosion measurements, the following techniques were used: open-circuit potential (OCP), impedance spectroscopy (EIS) measurements and potentiodynamic polarization. Subsequently, sliding wear was assessed in the same media using a tribometer equipped with test viewer software . Also, OCP and EIS tests were carried out during the wear sliding tests. After corrosion-wear tests, worn and unworn surfaces were analyzed by atomic force (AFM) and scanning electron (SEM) microscopy. Localized corrosion of titanium was only observed at high fluoride concentration (12,300 ppm F-) although a decrease of the corrosion resistance of titanium was noticed when the fluoride concentration increased. As a consequence, metallic ions were released from the materials and, it should be highlighted, that these ions can become toxic for human tissues depending on their concentration. Under wear sliding tests, a progressive degradation of titanium by wear and corrosion (tribocorrosion) mechanisms can take place being harmful for titanium-based implant and prostheses. Also, the formation of wear debris due to the tribocorrosion phenomena can become toxic for human tissues. The presence of biofilms affected negatively the corrosion resistance of titanium probably due to acids release from the microorganisms. Moreover, the corrosion resistance of titanium was further affected in the presence of S. mutans biofilms as well as of mixed biofilms composed of C. albicans and S. mutans. Under wear sliding tests, biofilms generated an ultra-low friction on titanium immersed in artificial saliva solution, which can be compared to the effect of commercial lubricant agents. In dental implant systems, ultra-low friction on sliding contact areas might therefore cause a loss of the mechanical integrity ending up in a loosening of the implant internal connections. Concerning the biofilm structure, the extracellular matrix reveals interesting properties to produce novel materials for several applications ranging from tissue engineering to mechanical engineering. On the other hand, the improvement of the design of joint-based systems in different industrial sectors might be stimulated from this study, reducing the risks of failures caused by friction., A cavidade oral é um complexo onde substâncias corrosivas oriundas da dieta, saliva humana e biofilmes orais podem ser acumulados em áreas retentivas de sistemas de implantes e próteses promovendo a corrosão de suas superfícies. Por outro lado, durante o processo mastigatório, micro-movementos podem ocorrer em juntas artificiais causando um movimento relativo entre superfícies em contato. Ambos os processos (desgaste e corrosão) resultam em um fenômeno conhecido como biotribocorrosão. Estudos prévios têm reportado a corrosão do titânio em soluções fluoretadas. Entretanto, a biotribocorrosão do titânio em tais soluções, e em presença de biofilmes não têm sido ainda investigados. O objetivo deste trabalho é investigar a corrosão e desgaste invitro em soluções de saliva artificial fluoretadas, e em presença de biofilmes. Testes electroquímicos de superfícies de titânio foram realizados em soluções de saliva artificial contendo diferentes concentrações de fluor para avaliar o comportamento de corrosão do titânio. Após esta etapa, testes electroquímicos foram realizados em saliva artificial com superfícies de titânio cobertas com biofilmes. Para os testes de corrosão, os seguintes testes foram realizados: potencial em circuito aberto (OCP), espectroscopia de impedância eletroquimica (EIS) e polarização potenciodinâmica. Posteriormente, testes de desgaste foram realizados nas mesmas soluções usando um tribômetro conectado a um computador. OCP e EIS foram emplementados para os ensaios de desgaste. Após os testes de corrosão-desgaste, superfícies danificadas e não danificadas foram analizadas por microscopia de foça atômica (AFM) e de varrimento (SEM). Corrosão localizada foi somente detectada em alta concentração de fluor (12,300 ppm F-). Embora, a diminuição da resistência à corrosão do titânio foi observado com o aumento da concentração de fluor. Consequentemente, íons metálicos foram liberados das superfícies dos materiais o que pode ser tóxico para os tecidos humanos, dependendo da concentração de íons. Sob testes de desgaste, uma progressiva degradação do titânio por mecanismos de desgaste e corrosão foi constatada o que pode ser prejudicial para próteses e implantes de titânio. Ainda, a formação de particulas de desgaste devido ao fenômeno de tribcorrosão pode se tornar tóxico para os tecidos humanos. A presença de biofilmes afetou negativamente a resistência à corrosão do titânio provavelmente devido a substâncias ácidas liberadas a partir do metabolismo microbiano. Mais ainda, a resistência à corrosão foi menor na presença dos biofilmes mistos compostos de S. mutans e C. albicans do que na presença de biofilmes compostos apenas de S. mutans. Sob testes de desgaste, biofilmes promoveram uma ultra-baixa fricção sobre titânio imerso em solução de saliva artificial comparável àquela promovida por agentes lubrificantes. Em sistemas de implantes dentários, ultra-baixa fricção sobre áreas em contacto poderiam causar uma perda da integridade mecânica, no que levaria a falhas em conexões internas dos implantes. Considerando a estrutura dos biofilmes, a matriz extracelular revela interessantes propriedades para produção de materiais para diversas aplicações em engenharia de tecidos animais ou/e em engenharia mecânica. Por outro lado, a optimização do desenho de sistemas de juntas em diferentes setores industriais poderia ainda ser estimulado a partir deste estudo, reduzindo os riscos de falhas causados por fricção e desgaste., Alban Program (cod. E06D103407BR), Erasmus student exchange program of the CEC, FCT (PTDC/CTM/67500/2006), Scientific Research Community on Surface Modification of Materials funded by the Flemish Science Foundation (WOG-FWO-Vlaanderen)

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica), A vaginose bacteriana (VB) é um distúrbio da flora vaginal normal e um importante problema de saúde pública em mulheres de idade reprodutiva. A VB é caracterizada pela substituição de lactobacilos vaginais por microrganismos, predominantemente, anaeróbios. Desconhecendo-se a etiologia da VB, duas hipóteses tentam explicar esta condição: a hipótese polimicrobiana, que infere que a VB é causada por uma mistura de bactérias patogénicas, principalmente anaeróbias; e outra hipótese que aponta para a Gardnerella vaginalis como o verdadeiro agente causador da VB. No entanto o isolamento frequente desta espécie em mulheres aparentemente saudáveis lançou dúvidas sobre essa afirmação. Assim, num esforço para se compreender a etiologia desta doença, foram realizados ensaios de adesão in vitro para comparar a capacidade de adesão de vários isolados vaginais provenientes de exsudados vaginais de mulheres que foram diagnosticadas como tendo VB e de mulheres saudáveis. No total, foram caracterizados 15 isolados vaginais quanto à sua capacidade de adesão inicial numa monocamada de células HeLa. Estes ensaios revelaram que os isolados de G. vaginalis apresentaram uma capacidade de adesão inicial mais forte do que os outros isolados analisados. Além disso, estirpes de G. vaginalis isoladas de pacientes com VB apresentaram uma maior capacidade de adesão inicial do que as estirpes de G. vaginalis que foram isoladas de mulheres saudáveis. Assim, a fim de compreender as diferenças verificadas, foi estudada a competição entre lactobacilos (Lactobacillus iners, Lactobacillus crispatus e Lactobacillus casei) e estirpes de G. vaginalis (não-patogénicas e patogénicas). Todos os ensaios de competição foram quantificados por microscopia de fluorescência, usando DAPI para contar as células totais e uma sonda de PNA-FISH para quantificar G. vaginalis. Os resultados mostraram que a adesão de L. iners não diminuiu na presença de estirpes patogénicas de G. vaginalis. Pelo contrário, o L. crispatus mostrou uma diminuição na capacidade de adesão às células epiteliais na presença de estirpes patogénicas de G. vaginalis. O L. crispatus mostrou, também, que tem uma grande capacidade de inibir a adesão de isolados patogénicos de G. vaginalis. Por sua vez, o L. casei foi o lactobacilos menos aderente de todos os utilizados no presente estudo. Como resultado, estes estudos de adesão ajudam a fornecer informações sobre a situação clínica na qual os lactobacilos vaginais indígenas podem interferir com a presença de G. vaginalis na microflora vaginal., Bacterial vaginosis (BV) is an unhealthy disturbance of the normal vaginal flora and an important public health problem in women in reproductive age. BV is characterized by the replacement of vaginal lactobacilli by predominantly anaerobic microorganisms. The lack of basic information about the etiology of BV has lead to the postulation of two hypotheses. The first is the polymicrobial hypothesis, which infers that BV is caused by a mixture of pathogenic bacteria, mainly anaerobes. The second is that a single pathogenic species, in many cases Gardnerella vaginalis is the causative agent of BV, but frequent isolation of this species from seemingly healthy women has cast doubt on this claim. So, in an effort to tease apart the aetiology of this disorder, in vitro adherence assays were performed to compare the initial adhesion, the first step of biofilm formation, of G. vaginalis relative to other microorganisms isolated from vaginal swabs from patients with BV and healthy women. In total, 15 unique vaginal isolates were characterized for their initial adhesion ability to a monolayer of the HeLa cells. These assays revealed that G. vaginalis isolates had a stronger initial adhesion capability than the other isolates recovered. Furthermore, G. vaginalis strains isolated from BV patients had stronger initial adhesion ability than G. vaginalis isolated from healthy women. In order to understand these differences, the competition between lactobacilli (Lactobacillus iners, Lactobacillus crispatus and Lactobacillus casei) and G. vaginalis strains (non-pathogenic and pathogenic) was studied. All competition assays were quantified by fluorescence microscopy, using DAPI for total cell count and PNA-FISH probe for G. vaginalis quantification. The results showed that L. iners did not decrease in presence of pathogenic G. vaginalis strains. In contrast, L. crispatus showed a decreased adherence capacity to epithelial cells in the presence of pathogenic G. vaginalis strains. Furthermore, the results showed that L. crispatus could be important for antagonizing the pathogenic strains of G. vaginalis. In turn, L. casei was the least adherent of the all lactobacilli used in this study. As a result, adherence studies help to provide insight into the clinical situation in which indigenous vaginal lactobacilli can interfere with G. vaginalis presence in vaginal microflora., Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Projeto FCOMP-01-0124-FEDER-008991 (PTDC/BIA-MIC/098228/2008)., This work was supported by European Union funds (FEDER/COMPETE)

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica), O objetivo deste trabalho foi analisar as possíveis fontes de infeções nosocomiais numa clinica de Hemodiálise, uma vez que se trata de um ambiente onde os pacientes se encontram com o sistema imunitário debilitado, devido ao tratamento a que são submetidos. Tendo em conta que estas infeções podem resultar da formação de biofilmes, e devido à sua perigosidade, torna-se ainda mais imperativo o seu estudo para a sua redução. Neste âmbito foram realizadas diferentes abordagens, incluindo a avaliação da adesão microbiana a materiais usados em hemodiálise, determinação da eficácia dos antimicrobianos mais usados e verificação da existência de contaminações nos materiais usados em prática clinica. Para os ensaios de adesão, foram usadas culturas simples e mistas de Staphylococcus epidermidis 1457 e Candida albicans SC5413. Foram efetuados ensaios dinâmicos com recirculação e também ensaios estáticos, ambos realizados por um período de 4 horas e recorrendo a linhas de hemodiálise. Neste estudo foi possível concluir que a existência de caudal de circulação é um dos fatores que evitam a adesão de microrganismos. Também se verificou, em ambos os ensaios, que, quando em culturas mistas, a adesão era ligeiramente inferior quando comparada com as mesmas espécies em culturas puras, indicando haver uma certa competição entre as espécies. A avaliação dos agentes antimicrobianos utilizados na clínica de hemodiálise foi efetuada em biofilmes simples e mistos de Staphylococcus epidermidis 1457 e Candida albicans SC 5413. Avaliou-se o crescimento celular após o contacto do biofilme com dois agentes antimicrobianos variando o tempo de contacto entre o agente e o biofilme e posteriormente variando a concentração. Verificou-se que, apesar dos dois agentes utilizados serem bastante eficazes, um deles (antimicrobiano 2) demonstrava uma maior eficácia, o que se pode dever à sua composição, dada a presença de digluconato de cloro-hexidina, que lhe confere melhores propriedades antimicrobianas. Na fase final efetuou-se a recolha de material utilizado nos tratamentos efetuados na clinica para avaliar se estes tinham alguma contaminação microbiana. Foram então recolhidas válvulas Q-site e agulhas de fístula arteriovenosas. Para analisar possível crescimento celular colocou-se o material em questão em contacto com meio rico. Também foi avaliada a biomassa presente nas agulhas de fístula arteriovenosas referidas anteriormente recorrendo ao método de Violeta Cristal. Assim, verificou-se que tanto nas válvulas Q-Site como no interior das agulhas de fístula arteriovenosas não foram detetadas células viáveis, no entanto, no seu interior, detetou-se presença de biomassa. No exterior das agulhas de fístula arteriovenosas foram detetadas duas espécies de microrganismos possivelmente resultantes do seu contacto com o paciente e do facto de estes estarem expostos ao ar durante os tratamentos. Sendo assim, e apesar dos testes in vitro indicarem que o material utilizado nas linhas de hemodiálise para o tratamento de hemodiálise favorecerem a adesão microbiana, a alta eficácia dos antimicrobianos associada às boas práticas clínicas, fazem com que na realidade, durante os tratamentos, não se verifique adesão que seria de esperar pelos testes in vitro., The main objective of this study was the analysis of possible sources of nosocomial infections in a hemodialysis clinic, since it is an environment in which patients have a weakened immune system due to the treatment to which they are subjected. Given that these infections can result from the biofilm formation, and due to its hazard, this study becomes imperative. In this context, different approaches were performed, including assessment of microbial adhesion to the materials used in hemodialysis, determination of the efficacy of antimicrobials commonly used in clinical pratice and evaluation of hemodialysis material’s contamination. For the adhesion assays, simple and mixed cultures of Staphylococcus epidermidis 1457 and Candida albicans SC5413 were used. Both dynamic, with recirculation, as static tests were performed using hemodialysis lines and over a period of 4 hours. In this study it was concluded that the existence of continuous flow is one of the factors that prevents microbial adhesion. It was also found in both tests that when in mixed cultures, the adhesion was slightly lower as compared with the same species in pure cultures, indicating it might be present some competition between the species. The evaluation of antimicrobial agents used in a hemodialysis clinic was conducted using pure and mixed biofilms of Staphylococcus epidermidis 1457 and Candida albicans SC 5413. Cell growth was assessed after contact of the biofilm with two agents, varying the time of contact and antimicrobials concentration. It was found that although both agents are quite effective, one showed greater effectiveness, maybe due to its composition, since it had chlorhexidine digluconate which provide greater antimicrobial properties. In the final stage some materials used in the clinical treatments were collected and the microbial contamination was evaluated. So, Q-valves and vascular access sites used in patients with fistulas were collected. To analyze possible cell growth, the material in question was placed in contact with rich medium. The biomass present in vascular access was determined using the Crystal Violet staining methodology. Thus, it was found that in devices there were no viable cells. However in the interior of the vascular access some biomass was detected. Outside of accesses two species of microorganisms have been detected possibly resulting from its contact with the patient and the fact that they are exposed to air during the treatments. Thus, despite the in vitro tests indicate that the material used in hemodialysis lines favors microbial adhesion, the high efficacy of antimicrobials associated with a good clinical practice, explains that during treatment, it was not detected cellular adhesion expected from the in vitro tests.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biológica (área de especialização em Tecnologia Química e Alimentar), Os consumidores demonstram cada vez mais interesse em produtos da pesca, reconhecendo os seus benefícios para a saúde, e associando cada vez mais o consumo destes produtos a uma alimentação saudável. Paralelamente, a transformação de pescado em diversos tipos de produtos de valor acrescentado e consequentemente a sua expansão no mercado ao longo do tempo, permite a valorização das diferentes espécies e o aumento do consumo per capita de pescado. No presente trabalho destaca-se o processamento de pescado congelado, responsável por 29 % de pescado comercializado globalmente, correspondendo à maior parcela de todo o tipo de pescado transformado. A realização do trabalho na unidade transformadora Vanibru teve como principal objetivo o apoio na gestão da produção de pescado congelado. Para tal, foi necessário proceder a ações de planeamento e controlo de produção, envolvendo a elaboração de planos de produção, a criação e atualização de etiquetas para o produto acabado e de todo o fluxo documental (fichas técnicas de produção, de produto acabado e fichas de custos). Procedeu-se também à otimização do processo de transformação do camarão de modo a tornar este processo contínuo, garantindo um teor de vidragem equivalente ao processo original (entre 15 % a 20 De modo a ir ao encontro dos objetivos definidos, realizou-se o cálculo das produtividades por etapa para cada produto auxiliando, desta forma, o preenchimento do plano de produção. Relativamente ao controlo da produção houve a necessidade de criar uma ficha de produto, para facilitar a atualização e criação de etiquetas para o produto acabado, bem como de todo o fluxo documental, tendo-se atualizado e criado, aproximadamente, 50 etiquetas e 300 fichas. A informação referente às fichas técnicas de produção, produto acabado e fichas de custos foi reunida numa "plataforma" com o intuito de facilitar a consulta das mesmas por parte dos destinatários principais. No que diz respeito à otimização do processo de transformação do camarão, constatou-se ser possível a realização deste processamento em contínuo. Concluindo-se, desta forma, que os tempos de passagem no túnel e de imersão no tanque do próduto em estudo que melhor otimizaram este processo foram 4,7 min e 93 s, respetivamente., Consurners have shown increasing interest in fishery products, recognizing its health benefits, and involving more and more the consumption of these products to a healthy diet. At the sarne time, processing seafood into various types of value-added products and therefore its expansion in the rnarket over time, ailows the appreciation of the different species and the increase in per capita consumption of seafood. The present study highlights the processing of frozen seafood, accounting for 29 percent of the seafood traded giobaily, corresponding to the largest proportion of ali types of processed seafood. The compietion of this report on the processing plant Vanibru aimed to support the rnanagement of the frozen seafood production. To this end, it was necessary to undertake planning actions and production control, invoiving the elaboration of production plan, the creation and update of labeis for the finished product and the entire docurnent flow (datasheets of production, datasheets of finished product and chips of the cost). it was also a goal to optimize the transformation process of the shrirnp to make this continuous process, ensuring a glazing content equivalent to the original process (between 15 percent and 20 percent). In order to rneet the defined objectives, productivities were deterrnined by aiding a step for each product, thereby cornpleting the production plan. Regarding the control of production, it was necessary to create a product sheet, to facilitate the updating and creating labels for the finished product, as weii as the ernpire document fiow, having updated and created approximately 50 tags and 300 sheets. The information reiatéd to the technicai production of sheets, finished product and cost sheets was gathered in a "platforrrr" in order to facilitate their visualization, by the main recipients. With respect to optirnizing the shrirnp processing process, it found to be possible to carry out this process in continuous. Concluding, therefore, the passage of time in thé tunnel and the irnmersion time in the tank in the product at best optirnized study, this process were 4.7 min and 93 s, respectively.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica, Oral health problems affect a large part of the world population and despite the numerous developments on technologies and products, there is still a need to know and understand those diseases. The recurring demands from society led to the development of new medical treatments and new materials used in dental implants. So, in this context, it became very important to evaluate the microbial colonization of implant materials because these materials can be important for future dental applications being necessary know the microbial adhesion. Therefore, the present dissertation aimed to improve the knowledge on oral microbial colonization of oral cavity. The first goal was the evaluation of microbial colonization of different titanium surfaces (anodized and etched) that are normally used in implant applications. The bacteria studied (Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum) were able to form biofilms on both surfaces, although biofilm formation on anodized samples result in a higher amount of biomass than in the etched samples, although with a similar number of viable cells, indicating the higher presence of extracelular matrix in the former, which could induce lower mechanical friction on these samples. In addition this study also evaluated the influence of fluoride and probiotic bacteria (Streptococcus salivarius) on biofilm formation. The presence of fluoride showed to inhibit biofilm formation on these biomaterials. The effect of probiotic bacteria has been evaluated on biofilm formation and S. salivarius had a direct influence on reducing the growth of pathogenic bacteria, such as F. nucleatum. However, these interactions are still unclear and there is a need to study these in greater detail. Moreover, dental implants infection can also be reduced by controlling the presence of pathogenic species in oral environment, so another aim was the evaluation of the use of a sugar (C7) as a prebiotic agent. The different sources of energy (C7 sugar and glucose) had different influences on growth of pathogenic and probiotic bacteria. So, the sugar, C7, can be used to favour the growth of the beneficial oral bacteria. In conclusion it can be pointed out that Ti anodized samples may be a good material for the production of dental implants due to their topography and also that the use of different energy sources allied with probiotics may be a start point for the development of new therapies., Os problemas de saúde oral afectam grande parte da população mundial e apesar do grande desenvolvimento nas tecnologias e nos produtos aplicados a esta, existe ainda a necessidade de conhecer e compreender melhor as doenças orais de origem bacteriana. Assim, a presente dissertação teve como objectivo geral contribuir para melhorar o conhecimento sobre a interação bacteriana na cavidade oral. O primeiro objectivo deste trabalho foi a avaliar a formação de biofilme em diferentes superfícies de titânio (anodizadas e com tratamento químico) normalmente utlizadas em implantes dentários. As bactérias estudadas (Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum) foram capazes de formar biofilme em ambas as superfícies, embora nas amostras anodizadas a quantidade de biomassa formada tenha sido maior que nas com tratamento quimico. No entanto, o número de células viáveis nos biofilmes formados em ambas as superfícies foi semelhante, indicando maior presença de matriz nas amostras anodizadas, o que pode induzir menor fricção nestas amostras. Além deste estudo foi também avaliada a influência da adição flúor e a presença de uma bactéria probiotica (Streptococcus salivarius) nos biofilmes formados nas mesma amostras. A presença de flúor no meio de cultura mostrou ter uma influencia negativa na formação de biofilme. Quanto à presença de bactéria probiotica esta foi avaliada em relação a formação de biofilme pelas mesmas bactérias patogénicas. A bactéria probiotica teve influência direta na redução da proliferação das bactérias patogénicas em especifico da F. nucleatum. As infecções orais podem também ser controladas alterando o equilíbrio entre a flora patogénica e probiótica. Assim sendo, foi também avaliada a influência de um açúcar (C7) neste equilíbrio, funcionado este como um agente prebiótico. As diferentes fontes de energia (glucose - controlo - e C7), tiveram diferentes influências sobre o crescimento das bactérias patogénicas e probioticas. A fonte energia, C7, poderá ser assim usada para favorecer o crescimento da bactéria probiotica e assim contribuir para uma melhoria da saúde oral. Portanto, neste trabalho concluiu-se que as amostras de Ti anodizado poderão ter maior potencial na produção de implantes dentários devido à sua topografia e além disso o uso de diferentes fontes de energia aliada ao uso de bactérias probióticas pode ser um início de um desenvolvimento de uma nova terapia.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biológica (área de especialização em Tecnologia Química e Alimentar), O bacalhau salgado seco tem uma grande importância na gastronomia portuguesa, sendo considerado um dos peixes mais consumidos no nosso país. No entanto, Portugal necessita de importar quase a totalidade do bacalhau consumido no país, sendo a Noruega uma das origens mais comuns dessa importação. Neste trabalho foi estudado o bacalhau salgado verde que difere do bacalhau salgado seco na percentagem de humidade. O objetivo deste estudo foi perceber e interpretar a contaminação microbiológica proveniente do bacalhau, no processo de demolha. Para tal, foram realizadas várias análises de carácter microbiológico ao bacalhau salgado verde (matéria prima) e ao bacalhau nos diferentes dias de demolha, para compreender de que forma e quais as bactérias responsáveis por esta contaminação. As análises dividiram-se em três fases: (i) análises ao bacalhau da Noruega, fazendo as análises à contagem de microrganismos totais; contagem de Staphylococcus e análise aos cloretos, humidade e bactérias halófilas ao sal proveniente do bacalhau. Numa segunda fase do estudo foi efetuada uma contagem de microrganismos totais, no entanto, desta vez, ao bacalhau da Islândia. Numa terceira e última fase do estudo foram realizadas uma segunda fase de análises ao bacalhau da Noruega, efetuando as seguintes análises: pesquisa de Salmonella e Listeria monocytogenes; contagem de enterobactérias, bactérias halófilas e psicotróficas. Nesta fase do estudo também se realizaram análises, por zaragota, aos tanques e aos cestos de demolha. Através das análises efetuadas ao longo de todo o estudo, foi possível perceber que, as enterobactérias e as bactérias psicotróficas seriam as principais responsáveis pela contaminação. Foi também observado alguma presença de microrganismos nos tanques e cestos de demolha, tendo sido tomadas, de imediato, medidas para a correção deste problema. Em suma, a contaminação dos microrganismos encontrada no bacalhau, no processo de demolha, parece estar relacionada com a contaminação por parte das bactérias que sobrevivem a ambientes com uma quantidade de sal considerada e, em segundo lugar, com os utensílios usados durante o processamento da empresa., The dried salted cod has a great importance in the gastronomy of the Portuguese people once it is considered one of the most consumed fish in our country. Portugal needs to import almost all of the cod consumed in the country, and Norway is one of the most common origins of that importation. In this project, it was studied the “raw” salted cod which is different from the dried salted cod, as far as the percentage of percentage of humidity is concerned. The processing of salted cod has been enriched throughout the years with new techniques of improvement in the different processes. The aim of this study was to understand and analyse the cod’s microbiological contamination that arises from the soaking process. For this purpose, were performed several microbiological analyses to the raw salted cod (raw material) and to the cod of different soaking days, in order to understand how and which bacteria are the responsible ones for this contamination. The analyses were divided into three phases: (i) analyses of Norway´s cod, analysing the counting of the total number of microorganisms; counting the Staphylococcus and analysis of the chlorides, humidity and the halophytic bacteria that arise from cod. In a second phase of the study, it was performed an analysis to the total number of microorganisms, but at this time, it was Icelandic´s cod the analysed cod. In a third and final phase of the study, were performed one second phase of analysis to the Norway´s cod, performing the following analyses: Salmonella and Listeria monocytogenes research; counting the number of enterobacteria, halophilic and psychotrofic bacteria. In this phase of the study, were also performed “zaragatoa” to the tanks and baskets. In spite of the analyses conducted throughout the study, it was revealed that enterobacteria and psychotropic bacteria were the major responsible for the contamination detected in the tanks and baskets, and some measures were immediately taken to prevent this situation. In short, we can say that the microorganisms’ contamination found in cod during the soaking process was related to several reasons: first, with contamination caused by bacteria that survive in environments with a great amount of salt and secondly, with the tools used during processing.

Doctoral dissertation for PhD degree in Biomedical Engineering, The advent of therapeutic recombinant proteins has revolutionized modern medicine. Since the approval of recombinant insulin in 1982 to treat diabetes, many other recombinant proteins have emerged for a diversity of previously incurable conditions. In these years, the manufacturing processes have greatly evolved, but have also often disregarded product quality, an issue only recently addressed and currently a major challenge in biopharmaceutical industry. Regulatory agencies require now a tight control of product quality during production, which typically involves characterization of the protein’s glycosylation, known to affect properties like serum half-life, biological activity and immunogenicity. However, control of this property is not simple due to its intrinsic high variability and its high sensitivity to small changes in the manufacturing process, in ways that are far from being understood. Therefore, the development of products of consistent high-quality requires a deeper understanding on the effect of the production parameters/ processes on glycosylation. In this context, the work described in this thesis intended to contribute to this field of knowledge by evaluating changes on glycosylation of a monoclonal antibody (mAb) produced by Chinese hamster ovary (CHO) cells during different stages of process development, namely cell line transfection, serum-free media adaptation and culture. To accomplish the main goal, a mAb-producing CHO-K1 cell line was initially established, through a novel expression system (OSCARTM), potentially more expeditious than the traditional methods. OSCARTM was indeed considerably faster, requiring about two months to obtain producer cells compared to the minimum six months usually required. OSCARTM did not affect cell growth and reached high levels of productivity (10 pg/cell/day) without requiring the typical processes of amplification. The levels of productivity were initially difficult to stabilize, with a 10- fold decay observed in the first weeks of culture, but remained stable thereafter for at least two years. Furthermore, minigene selection was critical and seemed to be cell/product-specific. This work also evaluated two methods for the initial selection of the highest producer clones obtained after transfection, based on: absorbance values of supernatants; or mAb productivity calculated using mAb yield determined by enzyme-linked immunosorbent assay and cell concentration obtained from cell counting with a haemocytometer. It was shown that the methodology chosen is highly influential on the product yield achievable in the final process of production, and that the productivity-based method, albeit more laborious, is much more reliable than the commonly used absorbance method. Additionally, the highest-producer clones were evaluated for mAb glycosylation by high-performance liquid chromatography, with no differences detected. Glycosylation was also assessed during the adaptation of mAb-producing cells to serum-free medium using a gradual methodology and supplementation with trace elements. This process was long and highlighted the importance of using proper media supplements, avoiding aggressive procedures (centrifugation, enzymes), and giving cells enough time to adapt at each stage. More importantly, it was shown that adaptation alters glycosylation: in the middle stages, fucosylation decreased and galactosylation, sialylation and glycoform heterogeneity increased, with the first two being positive and the last two undesirable for efficacy; in the final stages and after full adaptation, fucosylation returned to the initial (serum-supplemented) levels, while galactosylation, fucosylation and heterogeneity decreased, with the last two being positive. Divergences between the stages were related to lower cell concentrations and viabilities in the middle stages of adaptation, and to a shift of the growth mode of cells from adherent to suspended. The impact of a microporous microcarrier culture on mAb glycosylation was evaluated and compared to common T-flask cultures. The influence of several culture conditions was assessed, including initial culture volume and cell concentration, rocking mechanism and speed, and culture vessel. The microcarrier cultures led to a different mAb glycosylation compared to that obtained in the T-flask culture, attributed to different mAb productivities, as well as to the use of rocking and the generation of microenvironments (pH, accumulation of extracellular enzymes) in the microcarrier cultures. Specifically, higher galactosylation and decreased fucosylation, both beneficial changes, and a variable sialylation were found in the microcarrier cultures. Sialylation was more sensitive to the culture parameters, particularly the type of culture vessel, being almost absent in shake flask cultures. In addition to this advantageous modification, shake flasks also led to a more homogeneous glycosylation, potentially due to improved cell densities. In summary, the work described in this thesis contributes to a better understanding of how glycosylation is affected by technologies used in process development, highlighting the need to implement quality control at early stages. By increasing knowledge on this subject, it will be possible to control and improve the quality and efficacy of therapeutic proteins, which will ultimately lead to their administration at lower doses and frequency

Dissertação de mestrado em Bioengenharia, Candidiasis is the most prevalent opportunistic fungal infection of humans and has been increasing in the last decades, namely due to Candida tropicalis species. Its pathogenicity can be strongly related to their potential virulence factors, as adhesion and biofilm formation, secretion of hydrolytic enzymes and filamentous forms development. Biofilm formation is a potent virulent factor for a number of Candida species, as it confers significant resistance to antifungal therapy, due to, among other factors, limiting the penetration of substances throughout the matrix. However, the exact mechanism of biofilm resistance to antifungals is not yet fully understood, especially for C. tropicalis, and, as such, it is essential to enhance the knowledge on its virulence factors and resistance mechanisms. Thus, the main aim of this work was to understand the mechanisms behind C. tropicalis tolerance, to fluconazole (Flu), voriconazole (Vcz) and amphotericin B (Amp B). In order to accomplish this main goal, three approaches were performed. Firstly, the effect of the Flu and Vcz on ERG genes expression was determined on both planktonic and biofilm cells; secondly, the influence of azole antifungals on C. tropicalis virulence factors expression was analyzed; and finally, the role of the C. tropicalis biofilm matrices on its resistance to Amp B was evaluated. With this work it was possible to demonstrate that C. tropicalis resistance to Flu, Vcz and Amp B is strain dependent. Moreover, it was also observed that all the three antifungal agents were able to control moderately the biofilm formation, but were unable to eradicate C. tropicalis pre-formed biofilms. Biofilms treated with Flu presented significant damage in its overall structure in opposition to Vcz, however both lead to a slight reduction on its compact structure. The results showed that the ERG genes were more expressed in planktonic cells than in biofilm cells. Additionally, these azoles had no influence on main C. tropicalis virulence factors. Candida tropicalis biofilms treated with Amp B lead to an increase of matrix production and, consequently, to an increase in its amount of protein and carbohydrate. This is an indicative that the C. tropicalis biofilm matrices have an important role in its resistance to Amp B. This work demonstrated that C. tropicalis biofilms respond to treatment with different antifungals in different forms, so its resistance mechanism to antifungals seems to be a multifactorial phenomenon, such as reported for C. albicans. Thus, by increasing our knowledge on C. tropicalis resistance to antifungals, potential targets may well be identified that can be used as adjuvant for new therapies., A candidíase é a infeção fúngica oportunista mais prevalente em seres humanos e tem vindo a aumentar nas últimas décadas, nomeadamente devido à espécie Candida tropicalis. A sua patogenicidade pode estar fortemente relacionada com os seus potenciais fatores de virulência, como adesão, formação de biofilme, e produção de enzimas hidrolíticas e formas filamentosas. A formação de biofilme é importante para espécies de Candida, conferindo-lhes significativa resistência à terapia antifúngica, devido, entre outros fatores, à limitação da penetração de substâncias pela matriz. Contudo, o mecanismo exato de resistência do biofilme aos antifúngicos não está totalmente compreendido, especialmente para C. tropicalis, e, como tal é essencial compreendê-lo melhor. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi compreender os mecanismos inerentes à tolerância de C. tropicalis ao fluconazol (Flu), voriconazol (Vcz) e anfotericina B (Amp B). De forma a alcançá-lo, três abordagens diferentes foram realizadas. Inicialmente foi determinado o efeito do Flu e Vcz na expressão de genes ERG em células plantónicas e de biofilme; de seguida, foi analisada a influência destes azóis na expressão dos seus fatores de virulência; e, finalmente foi avaliado o papel das matrizes de biofilmes de C. tropicalis na sua resistência à Amp B. Este trabalho demonstrou que a resistência de C. tropicalis aos antifúngicos é dependente da estirpe. Foi também observado que estes antifúngicos foram capazes de controlar moderadamente a formação de biofilme, mas incapazes de erradicar biofilmes pré-formados. Os biofilmes tratados com Flu apresentaram danos na sua estrutura em oposição aos tratados com Vcz, mas ambos levaram a uma ligeira redução da sua estrutura. Os resultados mostraram que os genes ERG foram mais expressados em células plantónicas do que em biofilme. Adicionalmente, os azóis testados não tiveram influência nos principais fatores de virulência de C. tropicalis. Foi também mostrado que os biofilmes tratados com Amp B apresentaram um aumento de produção de matriz e da quantidade de proteínas e carbohidratos. Isto é indicativo que as matrizes destes biofilme têm um papel importante na resistência à Amp B. Este trabalho demonstrou que os biofilmes de C. tropicalis responderam diferentemente ao tratamento com diferentes antifúngicos, pelo que seu mecanismo de resistência parece ser um fenómeno multifactorial, como relatado para C. albicans. Assim, aumentando o conhecimento sobre a sua resistência aos antifúngicos, melhora-se a identificação de novos potenciais alvos, que podem vir a ser usados como adjuvantes para novas terapias.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biológica (área de especialização em Tecnologia Química e Alimentar), Nas últimas décadas tem-se assistido a importantes desenvolvimentos na área dos materiais têxteis funcionais bem como na crescente aplicação biotecnológica de nanopartículas. Além disso, nos dias de hoje, a principal preocupação neste tipo de materiais recai sobre a durabilidade do agente antimicrobiano presente nos diferentes materiais têxteis. Assim, o objetivo da presente dissertação consistiu no estudo da eficácia e durabilidade de nanopartículas com diferentes agentes antimicrobianos, peróxido de hidrogénio e ácido peracético, incorporadas em materiais têxteis funcionais. A fixação das nanopartículas contendo os diferentes agentes antimicrobianos foi feita recorrendo a duas técnicas: esgotamento e pad-batch. A eficácia da atividade antibacteriana dos materiais têxteis funcionais foi realizada de acordo com a norma JIS L 1902:2008, em Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae. Além do estudo da atividade antibacteriana, realizou-se a caracterização das nanopartículas e dos materiais têxteis funcionalizados por diferentes técnicas: Espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), microscópia eletrónica de varrimento (SEM), microscopia eletrónica de transmissão (TEM) e dispersão de luz dinâmica (DLS). De maneira a fazer um estudo comparativo entre a atividade antibacteriana e a presença do agente antimicrobiano, realizou-se a quantificação do princípio ativo no material têxtil por iodometria. Após estes testes iniciais as amostras sofreram 20 lavagens e quer a atividade antimicrobiana quer a quantificação do agente foram realizadas de novo. Pela análise da atividade antimicrobiana dos materiais têxteis funcionais foi possível verificar uma taxa de redução de 100 % nas amostras produzidas inicialmente. Estes resultados foram de encontro com os obtidos pelas técnicas de caracterização utilizadas onde foi possível verificar as diferenças entre os materiais têxteis com e sem funcionalização e a presença quer das nanopartículas quer do agente ativo nos materiais têxteis. Os materiais têxteis obtidos após as várias lavagens apresentaram um decréscimo significativo na taxa de redução de microrganismos em relação à obtida inicialmente de acordo com os testes de atividade antimicrobiana realizados. Esta análise foi comprovada com a quantificação do agente ativo onde se verificaram menores concentrações do mesmo após as lavagens. Com este estudo foi possível concluir que, embora os materiais têxteis apresentassem atividade antimicrobiana, esta diminui ou desaparece após lavagens., In recent decades major developments were performed in the area of biofunctional textiles and the application of nanoparticles in biotechnology is growing. Nowadays, the main concern in this type of material is the durability of the antimicrobial agent incorporated on textiles. So, the objective of the present work consisted on the study of the efficacy and durability of nanoparticles, with different antimicrobial agents (hydrogen peroxide and peracetic acid) incorporated into functional textiles. The incorporation of nanoparticles containing different antimicrobial agents, on the textile, was done using two techniques: exhaustion and pad-batch. The efficacy of the antibacterial activity of the functionalized textile material was performed according to the JIS L 1902: 2008 standard, using Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae. Besides the study of the antibacterial activity, the characterization of nanoparticles and functionalized textile materials was done using different techniques: Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM), and dynamic light scattering (DLS). In order to make a comparative study between the antibacterial activity and the presence of the antimicrobial agent, the quantification of the active ingredient in the textiles was done by iodometry. After these tests the samples underwent 20 washes and the antimicrobial activity tests and the quantification of the antimicrobial agent were repeated. By analyzing the antimicrobial activity of the functional textiles it was observed a complete reduction in the samples produced initially. These results were in agreement with the ones obtained with the characterization techniques since it was possible to verify the differences between the textile materials with and without functionalization and the presence of the nanoparticles as well as of the active agent on the textile materials. The textile materials obtained after several washes showed a significant decrease in the reduction rate of microorganisms compared to the one obtained initially according to antimicrobial activity tests. This analysis was confirmed by the lower concentration of the active agent obtained after washing by its quantification. With this study it was concluded that, although presenting some antimicrobial activity, the textiles lost it after several washing steps.

Doctoral dissertation for PhD degree in Chemical and Biological Engineering, Candidiasis are the most common fungal diseases, especially among immunosuppressed, hospitalized and patients with prolonged contact to medical devices. Generally, Candida albicans is the most encountered Candida spp., however, in the last decades, non-Candida albicans Candida (NCAC) spp. have been increasing their responsibility in the cases of candidiasis. In this group, one of the most important species is Candida glabrata. This species presents azole resistance, like Candida krusei and a quick capacity to develop resistance to echinocandins, similar to Candida parapsilosis. Although not having capacity to produce certain important enzymes (e.g. hydrolases), C. glabrata has an essential feature that explains part of its recalcitrance to antifungals: the capacity to form biofilms. The present thesis has the general purpose of increasing the current knowledge on the different and less explored biofilms of C. glabrata, their mechanisms of resistance to antifungal drugs, and ultimately contributing to the path into a more consistent optimization and patient response to the present therapies. Thus, to begin, a method to study the fluconazole's diffusion through the biofilm matrices was developed and then the effectiveness of voriconazole in C. glabrata biofilms was determined. It was concluded that voriconazole had higher activity than fluconazole and its diffusion was also deeper. Some changes were noticed in the ERG3, ERG6 and ERG11 genes expression. Additionally, an association of ascorbic acid (immunostimulator and β-glucan degradator) and fluconazole was applied to biofilms of C. glabrata. Biofilms C. glabrata were weakened, but not entirely degraded, and the number of cells was higher, due to the assimilation of the glucose derived from the β- glucan hydrolysis. In the context of polyenes, it was assessed the capacity of C. glabrata to form biofilms in the presence of clinical concentrations of amphotericin B. This capacity was confirmed, demonstrating the resistance of this species, even when using drugs with a good antifungal activity. In another approach, the comparison between two amphotericin B formulations – deoxycholate and liposomal – was performed in C. glabrata biofilms, and other Candida spp.. Both formulations have a good biomass reduction capacity, but the liposomal has a better activity against biofilm cells. The concomitant use of a polyene and an azole was showed to be mostly antagonist, since when applying amphotericin B and posaconazole, the effect in the number of cells, biomass reduction and Fractional inhibitory concentration index (FICI) calculation was not better than using each drug alone. Caspofungin and micafungin showed to induce great changes in C. glabrata biofilm matrices. These echinocandins were evaluated in terms of planktonic and biofilm cell susceptibility, showing to be better in the first case than in the latter. The biomass reduction was very good in both cases, but the variations regarding the quantity of proteins were variable. The amount of β-glucans generally decreased after the echinocandins’ contact, in opposition with the other drug’s response. Regarding transcriptomics, firstly a set of genes responsible for the production of matrix components was selected and their expression was assessed, on C. glabrata biofilm cells. In a general manner, all genes were overexpressed, but the ones related to the production of β-1,3- glucans revealed a higher expression. It was concluded that the cells invest more in the replacement of these biopolymers than the others and that they might have a greater impact in the biofilm cells lower susceptibility to antifungal drugs. Next, a C. glabrata mutant knocked-out on the MNN2 gene was studied in the biofilm form. The biofilm cells were evaluated in terms of drug susceptibility, cell wall, and the biofilm composition was also determined. There were no visible differences among the cell walls of the strains, but the mutant showed to have a great biomass reduction, after a drug stress. The quantity of mannans of the biofilm cells in the mutant decreased. The biofilm cell walls composition showed an increase of the quantity of β-1,3-glucans in the C. glabrata Dmnn2, when compared to the reference strain, possibly compensating the reduction of mannans. This increase in β-1,3-glucans could explain the reduction in the biofilm susceptibility. The in vivo approach permitted an exploration on the drug and immune response of an infection related solely to biofilm cells of C. glabrata and then treated with two echinocandins. The results showed that, generally, the immune response in C. glabrata is very distinctive from C. albicans. The fungal burden was higher in the liver than in the kidneys. Neither caspofungin nor micafungin was effective in fully eradicating C. glabrata biofilm cells and it was noticed a predominant mononuclear immune response in the spleen, liver and kidneys of the infected mice. In summary, the present thesis compiles important data that increase the knowledge on the mechanisms of antifungal resistance of C. glabrata biofilms, contributing to the path into a more sustained and defined understanding on how the biofilm matrices and the biofilm cells contribute to more severe infections. Moreover, it is underlined the importance on how these biofilm-derivedinfections need to be addressed differently from the the planktonic ones, replacing the current protocols., A candidíase é a patologia fúngica mais comum, especialmente em indivíduos imunossuprimidos, hospitalizados e em doentes que necessitam de ser sujeitos a dispositivos médicos durante longos períodos de tempo. Geralmente a Candida albicans é a espécie mais identificada, no entanto, nas últimas décadas, a prevalência de espécies de Candida não albicans sofreu um aumento significativo. Neste grupo, uma das espécies mais importantes é a Candida glabrata. Esta espécie possui uma resistência inata aos azóis e uma rápida habilidade de desenvolver resistência às equinocandinas. Embora a C. glabrata não tenha capacidade para produzir certas enzimas consideradas fatores de virulência importantes (por exemplo, hidrolases), ela possui uma característica essencial que explica parte da sua resistência aos fármacos antifúngicos: a capacidade de formar biofilmes. A presente dissertação tem como objetivo geral ampliar o conhecimento atual sobre os diferentes, e menos explorados, biofilmes de C. glabrata, os seus mecanismos de resistência a fármacos antifúngicos e, por fim, contribuir para uma otimização da resposta do doente relativamente às atuais terapêuticas. Assim, começou-se por desenvolver um método que permitiu estudar a capacidade de difusão do fluconazol em matrizes de biofilmes de C. glabrata e, seguidamente, determinou-se a eficácia do voriconazol nestes biofilmes. Concluiu-se que a atividade deste fármaco era maior que a do fluconazol e sua difusão também era maior. Algumas mudanças na expressão dos genes ERG3, ERG6 e ERG11 também foram observadas. De seguida, uma associação de ácido ascórbico (imunoestimulador e degradador de β-glucanos) e fluconazol foi aplicada em biofilmes de C. glabrata, que foram enfraquecidos, mas não totalmente degradados. Verificou-se um aumento do número de células talvez devido à assimilação da glicose derivada da hidrólise do β-glucano. Foi também avaliada a capacidade de C. glabrata em formar biofilmes em presença de concentrações clínicas de anfotericina B (anf B). Esta capacidade foi confirmada, demonstrando a resistência desta espécie, mesmo usando fármacos com boa atividade antifúngica. A comparação entre duas formulações de anf B - desoxicolato e lipossomal - em biofilmes de C. glabrata mostrou que ambas as formulações têm uma boa capacidade de redução de biomassa, mas a lipossómica exibiu uma melhor atividade contra células de biofilme. O uso concomitante de um polieno e de um azole revelou-se sobretudo antagonista, pois ao aplicar anf. B e posaconazole, o efeito na contagem de células, na redução da biomassa e no cálculo do índice fracionário de concentração inibitória não foi melhor do que usar cada fármaco isoladamente. A caspofungina e a micafungina induziram grandes mudanças na composição bioquímica nas matrizes de biofilme de C. glabrata. Estas equinocandinas foram avaliadas em termos de susceptibilidade a células planctónicas e de biofilmes, mostrando-se melhor no primeiro caso do que no segundo. A redução da biomassa foi muito boa em ambos os casos, mas as variações quanto à quantidade de proteínas foram inconstantes. A quantidade de β-glucanos geralmente diminuiu após o contato das equinocandinas, em oposição à resposta de outros fármacos de classes diferentes. Foi, depois, selecionado um conjunto de genes responsáveis pela produção de componentes da matriz e foi avaliada a sua expressão, nas células de biofilme de C. glabrata. De forma geral, todos os genes foram sobreexpressos, mas os relacionados com a produção de β-1,3-glucanos tiveram uma expressão mais elevada. Concluiu-se que as células investem mais na substituição desses biopolímeros do que na dos demais, podendo ter um maior impacto nas células de biofilme, induzindo uma menor susceptibilidade a fármacos antifúngicos. Para completar este estudo avaliou-se a capacidade de formação de biofilme de um mutante de C. glabrata sem o gene MNN2. Não se detetaram diferenças visíveis entre as paredes celulares das estirpes, mas o mutante apresentou uma grande redução de biomassa, após o stress provocado pelos fármacos. A quantidade de mananos das células do biofilme no mutante diminuiu e a composição das paredes celulares do biofilme mostrou um aumento da quantidade de β-1,3-glucanos na C. glabrata Dmnn2, possivelmente compensando a redução de mananos. Este aumento nos β-1,3-glucanos poderá explicar a redução da susceptibilidade do biofilme aos fármacos. O ensaio in vivo permitiu estudar a resposta imune e das equinocandinas, relativamente a uma infeção de C. glabrata originada exclusivamente com células de biofilme. Os resultados mostraram que a resposta imune em C. glabrata é muito distinta da de C. albicans. A carga fúngica foi maior no fígado do que nos rins e nem a caspofungina nem a micafungina foram efetivas na erradicação total das células de biofilme de C. glabrata. Em resumo, a presente dissertação compila dados importantes que acrescentam conhecimento sobre os mecanismos de resistência antifúngica aos biofilmes de C. glabrata, contribuindo para uma compreensão mais sustentada e definida sobre como as células e as matrizes de biofilmes contribuem para infeções mais graves de C. glabrata. Além disso, sublinha a importância das infeções derivadas do biofilme, que deveriam ser abordadas de maneira diferente das planctónicas, sendo importante ajustar os protocolos atuais de terapêutica., This work was supported by the Programa Operacional, Fatores de competitividade – COMPETE and by national funds through FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia under the scope of the following projects: FCT PTDC/SAU-MIC/119069/2010, RECI/EBB-EBI/0179/2012, PEst- OE/EQB/LA0023/2013, UID/BIO/04469/2013 unit, COMPETE 2020 (POCI-01-0145-FEDER- 006684), BioTecNorte operation (NORTE-01-0145-FEDER-000004) funded by the European Regional Development Fund under the scope of Norte2020 - Programa Operacional Regional do Norte and Célia F. Rodrigues’ SFRH/BD/93078/2013 PhD grant. The authors also thank the Project “BioHealth - Biotechnology and Bioengineering approaches to improve health quality", Ref. NORTE-07-0124-FEDER-000027, co-funded by the Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte), QREN, FEDER.

Dissertação de mestrado em Biomedical Engineering, Monoclonal antibodies (mAbs), with their unique high specificity, are the most successful product of biopharmaceutical industry, with application in a number of diseases. Due to the high doses typically required, the industry is constantly pressured to develop processes of production that obtain high product yields at reduced costs. Many progresses have been made in this field, mainly due to the emergence of mammalian cell culture technology, and to developments on culture media, production systems, monitoring and scale-up techniques. Currently, the processes of mAb-production mostly rely on suspended mammalian cell culture under fully-defined conditions. These defined conditions are required by the regulatory agencies due to safety concerns over the presence of animal-components (e.g. serum) which may transmit diseases to humans. Furthermore, the preference for suspension over adherent cultures is mostly related to a higher surface-to-volume ratio that improves cell and product yields. However, alternative systems for highyield adherent cultures are now available, such as the microcarrier technology that allows cell growth in small carriers kept in suspension by gentle rocking. These systems can be advantageous by protecting cells from the shear-stress caused by rocking, a limiting factor in suspended cultures. Although different approaches are available for mammalian cell culture in production systems, there are many issues that still need to be addressed to reach an optimal process of production. In this context, the main goal of the present thesis was to increase the current knowhow about the application of less-explored technologies for mAb production. For this purpose, a mAb-producing Chinese hamster ovary cell line (CHO-K1) was used, and in a first stage adapted to grow in serum-free conditions to evaluate the impact on mAb production. The adaptation was performed using a gradual methodology and proved to be time-consuming (280 days), particularly at the stage of 0.31 % serum, due to a shift of cell growth from adherent to suspended. Also at this stage, major differences were obtained among the different combinations of supplements (trace elements) tested to support cells during adaptation. Only one of five combinations was successful, proving that the selection of supplement combination is critical. Additionally, this study has shown the importance of avoiding culture procedures that are too aggressive for cells during adaptation (e.g. centrifugation, trypsinization). Concerning mAb production (assessed by enzyme-linked immunosorbent assay), the adaptation to serum-free medium was favorable, showing 2-fold improvement over serum-supplemented culture, due to the shift from the common DMEM medium to the chemically-defined EX-CELL CHO DHFR- medium. Indeed, media selection is crucial for the success of production, so another aim of this work was to compare seven serum-free media for CHO-K1 cell growth (assessed by cell counting) and mAb production. Concerning both parameters, EX-CELL CHO DHFR- and CDM4CHO were the best media, further evidencing a tendency to improve performances over time, which favors their use in extended processes of production. This thesis also explored microcarrier technology for mAb production using adherent cells. Thus, two types of microcarriers were evaluated in different culture conditions, both providing productions superior to typical adherent and suspended cultures, particularly the microporous Cytodex 3. This carrier had cell proliferation, mAb production (2-fold), and culture longevity higher than the macroporous CultiSpher-S. The culture parameters divergently affected the microcarriers, with the most critical being rocking mechanism for Cytodex 3 and cell inoculum for CultiSpher-S. The viability of using CultiSpher-S for culturing suspended mAb-producing CHO-K1 cells in serum-free medium was also assessed and compared to common suspension cultures. The porous structure of these carriers allows the entrapment of the suspended cells and provides a potential advantage over suspension cultures by protecting cells from the shear stresses of rocking. The microcarrier culture had mAb productions similar to suspension cultures, but with a tendency to improve over time, being a good alternative for extended processes. Additionally, it was shown that the use of rocking significantly reduces mAb production, particularly using the CDM4CHO medium, which benefited by microcarrier culturing due to the protection conferred against shear stress. In opposition, the EX-CELL CHO DHFR- medium favored cell growth in common suspension cultures. In the context of shear stress, the disposable Wave bioreactor has emerged for mammalian cell culture performed under low shear conditions due to an innovative mechanism of rocking based on an undulation movement. However, mixing and flow inside this reactor still need to be characterized, motivating a study of residence time distribution under the flow conditions applied in mammalian cell culture. The Wave behavior deviated from ideal models, with no correlation to the rocking mechanism, suggesting the need to develop new models to describe its performance. In summary, the present thesis compiles important data that increase the know-how about different technologies for mAb production, contributing to the evolution into a more sustained and structured optimization that will replace the current empirical and trial-and-error practices., Os anticorpos monoclonais (AcMs), com a sua elevada especificidade, são o produto de maior sucesso da indústria biofarmacêutica. As elevadas doses exigidas levam a uma constante pressão para desenvolver processos de produção com rendimentos elevados, a custos reduzidos. Neste sentido, têm-se observado avanços na tecnologia de células animais, desenvolvimento de meios de cultura, sistemas de produção e técnicas de monitorização e aumento de escala. Atualmente, os processos de produção de AcM baseiam-se na cultura de células animais em suspensão, sob condições definidas, como exigido pelos órgãos reguladores devido a preocupações de segurança sobre a presença de componentes de origem animal que podem transmitir doenças aos humanos. Já a preferência pela cultura em suspensão sobre a aderente deve-se à maior relação superfície-volume que permite obter maior concentração celular e de produto. No entanto, já estão disponíveis sistemas alternativos que permitem a cultura aderente com elevado rendimento, tal como a tecnologia de suportes microporosos que possibilita o crescimento de células em pequenos suportes mantidos em suspensão através de agitação suave. Estes sistemas têm a vantagem de proteger as células das possíveis tensões de corte provocadas pela agitação, fator limitante da cultura em suspensão. Embora estejam disponíveis diversos sistemas produtivos para cultura de células animais, existem muitas questões que ainda precisam de ser abordadas a fim de se atingir um processo de produção ótimo. Neste sentido, a presente tese teve como principal objetivo melhorar o atual conhecimento sobre a aplicação de tecnologias menos exploradas para a produção de AcM. Para este propósito, células do ovário de hamster chinês (CHO-K1) produtoras de AcM foram adaptadas a crescimento em meio sem soro, avaliando-se o impacto deste processo na produção de AcM. A adaptação foi realizada gradualmente, provando ser morosa (280 dias), especialmente na fase de 0,31 % soro, devido à alteração do crescimento das células do estado aderente para suspensão. Verificou-se ainda a importância de usar suplementos (oligoelementos) adequados no meio de cultura e de evitar procedimentos agressivos para as células (p.e. centrifugação, tripsinização). Relativamente à produção de AcM (avaliada por ensaio imunoenzimático), a adaptação permitiu duplicar a produção na passagem do meio DMEM suplementado com soro para o meio sem soro quimicamente definido EX-CELL CHO DHFR-. A seleção do meio de cultura é crucial num processo produtivo, tendo-se por isso comparado o efeito de sete meios sem soro no crescimento celular (contagem celular em hematocitómetro) e produção de AcM. Os meios EX-CELL CHO DHFR- e CDM4CHO proporcionaram os melhores resultados, com tendência de melhoria ao longo do tempo, sendo favoráveis para processos de produção longos. A tecnologia de suportes microporosos foi também explorada para a produção de AcM com células aderidas, tendo-se avaliado dois tipos de suportes em diferentes condições de cultura. Os suportes microporosos permitiram obter produções superiores às culturas tradicionais aderentes e em suspensão, particularmente com o Cytodex 3 microporoso. Este proporcionou proliferação celular, produção de AcM (2x maior) e longevidade da cultura superiores ao CultiSpher-S. Os resultados obtidos divergem com os parâmetros de cultura, sendo o mecanismo de agitação mais crítico no Cytodex 3 e a concentração de inóculo no CultiSpher-S. A viabilidade do uso de CultiSpher-S na cultura de CHO-K1 em suspensão e meio sem soro foi avaliada e comparada com culturas em suspensão comuns. A estrutura porosa do CultiSpher-S permite o encapsulamento das células em suspensão, podendo protege-las das tensões de corte provocadas pela agitação. Estas culturas permitiram produções de AcM semelhantes às culturas em suspensão comuns, mas com tendência de melhoria ao longo do tempo, tornando-se uma boa alternativa para processos extensos. Verificou-se ainda que a agitação diminuiu significativamente a produção, particularmente nas culturas em CDM4CHO que beneficiaram com o uso dos suportes. Já o meio EX-CELL CHO DHFR- favoreceu o crescimento celular nas culturas em suspensão comuns. No contexto das tensões de corte, o bioreator descartável Wave surgiu com um mecanismo de agitação inovador para a cultura de células animais com tensões reduzidas. No entanto, a mistura e o fluxo no seu interior ainda carecem de caracterização, motivando o estudo da distribuição do tempo de residência com fluxos da cultura de células animais. O desempenho do reator Wave afastou-se dos modelos ideais, sem correlação com o mecanismo de agitação, sugerindo a necessidade de desenvolver novos modelos para descrever o seu comportamento. Em suma, a presente tese compila uma série de dados que aumentam o conhecimento sobre diferentes tecnologias para a produção de AcM, encaminhando para um processo otimizado mais sustentado e estruturado, que irá substituir as atuais práticas empíricas e de tentativa-erro.

Dissertação de mestrado em Engenharia Clínica, Microorganisms have been showing augmented resistance towards antimicrobials, being microbial resistance, nowadays, one of the biggest problems of public health. Thus, there is an increasing interest in the development of new strategies of microbial control, namely the ones based on natural products, especially from plants, such as lectins. So, it is of utmost importance to test new antimicrobial compounds, especially with a wide range, against bacteria and fungi. Therefore, the main aim of this thesis was to evaluate the effect of new lectins against both Gram-negative and Gram-positive bacteria, as well, as yeast. Moreover, these lectins were assessed against planktonic and sessile cells. Four Diocleinae lectins: Canavalia ensiformis, Canavalia brasiliensis, Canavalia maritima and Canavalia boliviana, were used in this study. Their effect was assessed against two Gram-positive bacteria (Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus), two Gramnegative bacteria (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca) and two yeasts (Candida albicans and Candida tropicalis). The effect was evaluated on microbial planktonic growth, early-stage adhesion, on biofilm biomass and biofilm viable cells. The four lectins showed different activities (inhibitory or stimulatory effect) on planktonic growth, early-stage adhesion and biofilm formation, for the same microorganism. In general, the inhibitory effect of lectins was most notable on planktonic growth than on biofilm formation. Although there are few differences in the inhibitory capacity of lectins, K. oxytoca can be considered the microorganism that suffered lower inhibition. Interestingly, the results demonstrated that activities of lectins tested were species-dependent, namely, their action was different between the two Gram-negative species, as well as the two Gram-positive and the two yeasts. This highlights that the interaction between the lectin and the cell is of high specificity. So, in conclusion, due to the specificity of the lectins assayed, it could be of major interest to improve their potential (synergic effect) by using more than one at the same time or combined with conventional antimicrobial agents., A resistência exibida pelos microrganismos a agentes anti-microbianos representa um dos maiores problemas que a Saúde pública enfrenta na atualidade. Desta forma, tem-se denotado um aumento do interesse pelo desenvolvimento de novas estratégias para o controlo microbiano que passam pela procura de produtos naturais, especialmente oriundos de plantas, como as lectinas. A utilização de novos compostos antimicrobianos que possam ser usados contra uma vasta gama de bactérias e fungos, revela-se de extrema importância. Assim, o objectivo desta dissertação consistiu na verificação do efeito da aplicação de novas lectinas em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, bem como em leveduras. Além disso, estas lectinas foram testadas em células, quer no estado planctónico e quer no estado séssil. Neste estudo foram utilizadas quatro lectinas da subfamília Diocleinae: Canavalia ensiformis, Canavalia brasiliensis, Canavalia maritima and Canavalia boliviana. O seu efeito foi avaliado em duas bactérias Gram-positivas (Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus), duas bactérias Gram-negativas (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca) e em duas leveduras (Candida albicans and Candida tropicalis). A acção das lectinas foi analisada no crescimento planctónico, na adesão inicial, na biomassa de biofilme e no número de células cultiváveis dos biofilmes. As quatro lectinas demonstraram atividades distintas (efeito inibitório e de estimulação) no crescimento planctónico, na adesão inicial e na formação de biofilme, para o mesmo microrganismo. Em geral, o efeito inibitório das lectinas foi mais notório no crescimento planctónico do que na formação de biofilme. Apesar da capacidade inibitória das lectinas não diferir muito entre os microrganismos, a bactéria K. oxytoca foi a menos sensível aos compostos usados. Estes resultados demonstraram que a atividade das lectinas testadas se encontra dependente da espécie, sendo a sua ação diferente entre as duas espécies Gram-positivas, as duas Gram-negativas e as duas leveduras utilizadas. Corrobora-se, assim, a elevada especificidade existente na interação entre as lectinas e as células. Em suma, dada a especificidade das lectinas testadas, pensa-se que estas poderão ter um potencial acrescido se utilizadas em conjunto ou combinadas com agentes antimicrobianos convencionais.