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Our central nervous system relies on synaptic transmission, which is based on the release of neurotransmitters from synaptic vesicles (SVs) by Ca2+-triggered exocytosis. SV fusion with the plasma membrane at active zones is followed by endocytosis at the periactive zone. Although SV cycling is a fundamental process for neurotransmission at chemical synapses and exo- and endocytosis at the mammalian presynapse has been the subject of intense investigations over the last decades, the fate of newly exocytosed SV proteins remained largely unknown. Recent findings uncovered that upon moderate electrical stimulation, instead of newly exocytosed SV proteins, a preassembled “readily retrievable pool” of SV proteins is retrieved from the plasma membrane at the periactive zone. However, what happens to newly exocytosed SV proteins has remained unknown. To address this question, I developed an assay to spatiotemporally characterize newly exocytosed SV proteins upon moderate electrical stimulation. I furthermore identified molecular factors that mediate post-exocytic dynamics. My data demonstrates that, in hippocampal neurons, newly exocytosed SV proteins spread out from the active zone via Brownian motion. Considering, that previous research shows that the removal of released proteins from active zones is essential for effective exocytosis, it is even more remarkable that the initial spread of newly exocytosed SV proteins is not supported by active transport. After a few seconds of diffusion, most molecules remain confined within the presynaptic plasma membrane. Only ~ 10 % of the molecules escape rapidly into the axon. After confinement, SV proteins recluster slowly. Strikingly, all investigated SV proteins show similar diffusional spread, confinement and reclustering. Super-resolution microscopy reveals that reclustered SV proteins contribute to nano-clusters that are closely associated with the clathrin-based endocytic machinery at periactive zones. It is therefore conceivable that nano-clusters of endocytic proteins mediate the trapping of newly exocytosed SV proteins at the periactive zone and transform newly exocytosed SV proteins into a preassembled readily retrievable pool. I furthermore show that the confinement of newly exocytosed synaptobrevin 2 (Syb2) is reduced, but not abolished, by interfering with the interaction with the clathrin-based endocytic machinery, e. g. the Syb2-specific adaptors AP180 and CALM. A similar reduction applies to the extent of reclustering. This suggests that confinement and reclustering are mediated by the clathrin-based endocytic machinery, together with a so far unidentified diffusion barrier. Furthermore, the Syb2 diffusion is accelerated by a mutation of the binding site for AP180 and CALM. This is in agreement with an early association of AP180 or CALM with Syb2. Although the acute post- exocytic confinement of AP180- and CALM-binding deficient Syb2 is only partially impaired, this study shows that Syb2 binding to its specific endocytic adaptors finally prevents a major loss into the axon over time. Taken together, these findings demonstrate that diffusional spread, confinement and reclustering are essential processes of the SV cycle and partially rely on the clathrin-based endocytic machinery., Signale werden an den chemischen Synapsen unseres Nervensystems durch Neurotransmitter übertragen. Diese Neurotransmitter werden durch die Ca2+-abhängige Fusion von synaptischen Vesikeln (SV) mit der Plasmamembran an aktiven Zonen freigesetzt. An der periaktiven Zone werden die Bestandteile von SV wieder recycelt. Obwohl dieser Kreislauf ein elementarer Bestandteil der Signalübertragung an chemischen Synapsen ist, und die Exo- und Endozytose an der Präsynapse in der Vergangenheit eingehend untersucht wurden, ist der Verbleib von neu exozytierten SV Proteinen noch weitgehend ungeklärt. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass nach einer moderaten elektrischen Stimulation nicht die neu exozytierten SV Proteine, sondern SV Proteine des sogenannten „Readily Retrievable Pool” an der periaktiven Zone endozytiert werden. Der Verbleib der neu exozytierten SV Proteine blieb jedoch weiterhin unklar. Um den Verbleib dieser Proteine aufzuklären habe ich einen Assay entwickelt mit welchem die räumliche Ausbreitung von neu exozytierten SV Proteinen nach elektrischer Stimulation untersucht werden kann. Außerdem konnte ich molekulare Faktoren identifizieren, welche die Bewegung von SV Proteinen nach der Exozytose beeinflussen. Die vorliegende Arbeit zeigt in hippocampalen Neuronen, dass sich die neu exozytierten SV Proteine durch Diffusion ausbreiten. Frühere Arbeiten weisen darauf hin, dass das Entfernen von neu exozytierten SV Proteinen von der aktiven Zone für die effektive Exozytose essenziell ist. Daher ist es bemerkenswert, dass für die Ausbreitung von neu exozytierten SV Proteinen kein aktiver Transport benötigt wird. Nach wenigen Sekunden der Diffusion wird ein Großteil der Moleküle an der präsynaptischen Plasmamembran zurückgehalten. So gelangen nur etwa 10% der neu exozytierten Proteine in das angrenzende Axon. Nach der anfänglichen Ausbreitung kommt es zum „Reclustering“, die SV Proteine ziehen sich dabei langsam wieder auf einen engeren Bereich zurück. Alle untersuchten SV Proteine zeigten auffallende Ähnlichkeiten in der Ausbreitung und im „Reclustering“. Mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie zeigt diese Arbeit, dass neu exozytierte SV Proteine zusammen mit dem Clathrin-basierenden Endozytose- Apparat in dem Bereich der periaktiven Zone Nanocluster bilden. Daher ist es denkbar, dass ein in Nanoclustern organisierter Endozytose-Apparat in der periaktiven Zone neu exozytierte SV Proteine immobilisiert und daraus den „Readily Retrievable Pool” aufbaut. Weiterhin zeige ich, dass sobald die Interaktion zu dem Clathrin-basierenden Endozytose-Apparat durch die Syb2-spezifischen Adapter AP180 und CALM fehlt, sich neu exozytiertes Syb2 zwar weiter ausbreitet, jedoch zunächst nicht frei ins Axon diffundiert. Dieser Anstieg des Ausbreitungsbereichs bleibt auch nach dem „Reclustering“ bestehen. Dies deutet darauf hin, dass neben dem Clathrin-basierende Endozytose-Apparat eine weitere Barriere für die Begrenzung der Diffusion und das „Reclustering“ von neu exozytierten SV Proteinen verantwortlich ist. Des Weiteren zeigt diese Arbeit, dass die Diffusion von Syb2 durch die Mutation von dessen AP180- und CALM-Bindungsstelle beschleunigt wird. Daher ist eine frühzeitige Interaktion von AP180 oder CALM mit Syb2 wahrscheinlich. Obwohl die akute Begrenzung von neu exozytiertem Syb2 von einer fehlenden Interaktion mit AP180 und CALM nur teilweise betroffen ist, zeige ich, dass AP180 und CALM auf lange Sicht einen maßgeblichen Verlust von Syb2 in das Axon verhindern. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Diffusion, deren Begrenzung und das „Reclustering“ von neu exozytierten SV Proteinen wesentliche Prozesse des SV Zyklus sind und unter anderem von dem Clathrin-basierten Endozytose-Apparat vermittelt werden.