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Orientador : Wanderley Dias da Silveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Mestrado Genética Mestre em Ciências Biológicas

Agradecimentos: This study was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (15/02395-8) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (141298/2017-0). The authors thank the Centroflora group for their assistance in the collection of passionflower leaves, as well as to Ph.D. Glyn Maria Figueira of the Agricultural, Biological and Chemical Research Center (University of Campinas) for the expertise on the biology of the plant Abstract: Plants and endophytic microorganisms have coevolved unique relationships over many generations. Plants show a specific physiological status in each developmental stage, which may determine the occurrence and dominance of specific endophytic populations with a predetermined ecological role. This study aimed to compare and determine the structure and composition of cultivable and uncultivable bacterial endophytic communities in vegetative and reproductive stages (RS) of Passiflora incarnata. To that end, the endophytic communities were assessed by plating and Illumina-based 16S rRNA gene amplicon sequencing. Two hundred and four cultivable bacterial strains were successfully isolated. From the plant’s RS, the isolated strains were identified mainly as belonging to the genera Sphingomonas, Curtobacterium, and Methylobacterium, whereas Bacillus was the dominant genus isolated from the vegetative stage (VS). From a total of 133,399 sequences obtained from Illumina-based sequencing, a subset of 25,092 was classified in operational taxonomy units (OTUs). Four hundred and sixteen OTUs were obtained from the VS and 66 from the RS. In the VS, the most abundant families were Pseudoalteromonadaceae and Alicyclobacillaceae, while in the RS, Enterobacteriaceae and Bacillaceae were the most abundant families. The exclusive abundance of specific bacterial populations for each developmental stage suggests that plants may modulate bacterial endophytic community structure in response to different physiological statuses occurring at the different plant developmental stages CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Aberto

Agradecimentos: Authors would like to thank FAPESP for financial support and to CAPES for fellowship. Authors also thank to Dr. Roberto Berlinck for providing the marine bacteria Abstract: Microbial-derived surfactants are molecules of great interest due to their environmentally friendly nature and low toxicity; however, their production cost is not competitive when compared to synthetics. Marine microorganisms are exposed to extremes of pressure, temperature, and salinity; hence, they can produce stable compounds under such conditions that are useful for industrial applications. A screening program to select marine bacteria able to produce biosurfactant using low-cost substrates (mineral oil, sucrose, soybean oil, and glycerol) was conducted. The selected bacterial strain showed potential to synthesize biosurfactants using mineral oil as carbon source and was identified as Brevibacterium luteolum. The surface-active compound reduced the surface tension of water to 27 mN m-1 and the interfacial tension (water/hexadecane) to 0.84 mN m-1 and showed a critical micelle concentration of 40 mg L-1. The biosurfactant was stable over a range of temperature, pH, and salt concentration and the emulsification index (E24) with different hydrocarbons ranging from 60 to 79 %. Structural characterization revealed that the biosurfactant has a lipopeptide nature. Sand washing removed 83 % of crude oil demonstrating the potential of the biosurfactants (BS) for bioremediation purposes. The new marine B. luteolum strain showed potential to produce high surface-active and stable molecule using a low-cost substrate COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Orientador: Wanderley Dias da Silveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Bactérias do ¿gênero¿ Shigella spp. apresentam-se como bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos, imóveis, não formam esporos e pertencem à família Enterobacteriaceae. De acordo com testes de aglutinação com anti-soros específicos, estas bactérias são classificadas em quatro sorogrupos: Sorogrupo A (Shigella dysenteriae), Sorogrupo B (Shigella flexneri), Sorogrupo C (Shigella boydii) e Sorogrupo D (Shigella sonnei). Estas bactérias são responsáveis pela Shiguelose ou Disenteria Bacilar enfermidade endêmica que anualmente acomete milhões de pessoas em todo o mundo, sendo que mais de 70% de todos os casos ocorrem em crianças de 1 até 5 anos de idade, possuindo grande importância epidemiológica devido à alta morbi-mortalidade. Os principais determinantes de patogenicidade neste grupo bacteriano são: o plasmídio de alto peso molecular, que determina o fenótipo invasivo desta espécie; genes cromossômicos, que regulam a expressão dos genes de virulência no plasmídio e a produção de uma exotoxina que atua destruindo a barreira de células epiteliais. No Brasil, até então, não foram encontrados trabalhos publicados que comparem as diferentes amostras bacterianas de Shigella spp. isoladas de casos de Shiguelose, relacionando suas características biológicas e estrutura clonal. Sendo assim, neste trabalho, estudamos as características biológicas (sorotipagem, perfil de resistência a antimicrobianos, adesão e invasão, análise do perfil de DNA plasmidial) de diferentes amostras de Shigella spp. relacionando-as através de técnicas de Biologia Molecular (ERIC-PCR, REPPCR e DRE-PCR) permitindo, assim, determinar a clonalidade epidemiológica destas. As amostras de Shigella spp. foram isoladas de diferentes surtos, de diversas cidades das regiões de Campinas e de São João da Boa Vista, e pertencem à coleção do Instituto Adolfo Lutz de Campinas Abstract: Shigella spp are gram-negative, anaerobic facultative, non-motile, and non-sporulated bacilli of the Enterobacteriaceae family, responsible for ¿Shigellosis¿ or the Bacillary Dysentery (BD) disease, an important cause of worldwide morbidity and mortality. The pathogenic determinants of Shigella spp include high molecular weight plasmids responsible for the bacterial invasive capacity, as well as chromosomal genes encoding for different pathogenic, factors such as exotoxins that destroy epithelial host cells. Little is known about the antibiotic resistance profiles and the population structure of Shigella species isolated from humans in Brazil. In this work, we have studied the antibiotic resistance profiles and the clonal structure of Shigella strains isolated from humans in different cities located in the region of Campinas, a city in the state of São Paulo, Brazil. We have also related the antibiotic resistance of these strains with the bacterial clonal groups determined by the molecular techniques ERIC, REP, and DRE-PCR. Our data indicate that many strains of S. flexneri and S. sonnei are multiresistant, and our results also support the circulation of specific clones among the cities. These data indicate that the human sanitary conditions in the cities analyzed herein should be improved. Doutorado Microbiologia Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gilson Paulo Manfio, Valeria Maia de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Trinta linhagens de bactérias acidotermofílicas isoladas do processamento industrial de suco de laranja concentrado congelado (Frozen Concentrated Orange Juice, FCOJ) em diferentes regiões do estado de São Paulo foram estudadas, utilizando-se uma abordagem polifásica, a fim de se determinar a diversidade e potencial deteriogênico destas em processos de produção de FCOJ no país. A caracterização dos isolados envolveu a determinação da capacidade de crescimento e produção de odor em suco reconstituído, análises fenotípicas (padrão de utilização de carboidratos, sistema API 50 CH), quimiotaxonômicas (perfil de FAMES, sistema MIDI) e de caracterização molecular (ARDRA de região espaçadora DNAr 16S-23S com Hae III, Hha I e Msp I, e análise filogenética de DNAr 16S). Todos os isolados foram identificados como pertencentes ao gênero Alicyclobacillus pelos padrões característicos de ácidos graxos. Diferentemente de relatos de literatura, foi confirmada a presença de omega-ciclohexil-C17:0 e omega-ciclohexil-C19:0 em amostras identificadas como A. pomorum. Das 30 amostras ambientais de aliciclobacilos analisadas, 21 foram capazes de se multiplicar em suco de laranja reconstituído após 24 ou 48 h de incubação a 45 °C, mas apenas 10 produziram odor característico de biodeterioração. Seis ribotipos de ARDRA foram obtidos para os isolados, permitindo a alocação destes nas espécies A. acidocaldarius e A. acidoterrestris, e em grupos relacionados a espécies válidas designados como A. acidocaldarius-like e A. pomorum-like Abstract: Thirty strains isolated from industrial processing of frozen concentrated orange juice (FCOJ) in different regions of the state of São Paulo were studied using a polyphasic approach with the goal of determining the diversity and deteriogenic potential of isolates from FCOJ production in Brazil. Characterization of isolates involved determining their ability to grow and produce odor in reconstituted orange juice, and phenotypic (carbohydrate utilization, API 50 CH), chemotaxonomic (FAMES, MIDI system) and molecular analyses (ARDRA of 16S-23S rDNA spacer region, Hae III, Hha I and Msp I, and 16S rDNA phylogenetic analysis). All isolates were identified as Alicyclobacillus spp. according to the characteristic fatty acid patterns. Contrary to literature data, omega-cyclohexyl-C17:0 and omega-cyclohexyl-C19:0 were confirmed in samples identified as A. pomorum. From the 30 environmental alicyclobacili samples analyzed, 21 were able to grow in reconstituted orange juice after 24 or 48 hs incubation at 45 °C, but only 10 isolates yielded a characteristic biodeterioration odor. Six ARDRA patterns were obtained for the isolates analyzed, enabling them to be assigned to A. acidocaldarius and A. acidoterrestris, and to groups related to valid species named A. acidocaldarius-like and A. pomorum-like Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O vírus da Hepatite C (família Flaviviridae, gênero Hepacivirus) é causador de infecções crônicas em humanos, que podem evoluir para quadros de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. Até o momento, não há vacina disponível contra essa infecção e o tratamento disponível é caro, tem eficácia limitada e gera uma vasta gama de efeitos secundários, o que dificulta a continuidade do tratamento. Como esse vírus não replica eficientemente em cultura de células e em animais, o vírus da diarréia viral bovina é utilizado como modelo substituto para ensaios de avaliação de atividade antiviral e em ensaios de mecanismo de ação. A partir de invertebrados e micro-organismos marinhos, foram preparados extratos e frações, e algumas substâncias foram isoladas para a avaliação da sua possível atividade antiviral. Dos 422 testados, 5% foram considerados promissores e, destes, 20% mostraram-se ativos apresentando uma proteção de mais de 97% às células frente ao vírus. Os melhores resultados foram obtidos dos extratos produzidos a partir das amostras de esponjas Hyrtios sp. (BA07ES-56: PI=99%, IS=25), Aaptos sp. (BA07ES-59: PI=99%, IS=8,25) e de bactérias Bacillus sp. (555: PI=98%, IS>18; 584: PI=98%, IS=27) isoladas da esponja Petromica citrina. Os extratos e compostos promissores foram capazes de atuar em diversas etapas do ciclo replicativo viral (adsorção, penetração, etapas intracelulares do ciclo replicativo e também inativação da partícula viral), levando à sua interrupção quase completa nas condições analisadas. Desse modo, diversas substâncias presentes nesses organismos estudados são ativas e podem levar ao desenvolvimento de fármacos que garantam uma terapia alternativa para o tratamento da hepatite C Abstract: The Hepatitis C virus (family Flaviviridae, genus Hepacivirus) causes chronic infections in humans, which can develop to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. This represents a major public health problem worldwide. To this moment, there is no vaccine available against this infection and the treatment available is expensive, has limited efficacy and generates a wide range of side effects, making it difficult to continue the treatment. All this reflects the need to seek new agents with antiviral action against this virus. As this virus does not replicate efficiently in cell culture and in animals, bovine viral diarrhea virus is used as a surrogate model for screening assays of antiviral activity, and mechanism of action assays. From marine invertebrates and micro-organisms isolated from them, extracts and fractions were prepared, and substances were isolated for assessment of their possible antiviral activity. Of the 422 tested, 5% were considered promising, and of these, 20% were active presenting a protection percentage of more than 97%. The best results were obtained from the extracts produced from the samples of sponge Hyrtios sp. (BA07ES-56: IP=99%, SI=25), Aaptos sp. (BA07ES-59: IP=99%, SI=8,25) and bacteria Bacillus sp. (555: IP=98%, SI>18; 584: IP=98%, SI=27) isolated from the sponge Petromica citrina. The promising extracts and compounds acted in several stages of viral replicative cycle (adsorption, penetration, intracellular steps of the replicative cycle and also inactivation of the viral particle). Thus, various substances are active and may lead to the development of drugs which ensure an alternative therapy for the treatment of hepatitis C Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Fabiana Fantinatti Garboggini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O ambiente marinho representa uma importante fonte de diversidade biológica com grande potencial para descoberta de novos metabólitos secundários biologicamente ativos. Dentro desse ambiente, pode-se destacar os actinomicetos marinhos, cujos estudos podem contribuir para a melhor compreensão de suas funções ecológicas e para seu uso como uma fonte importante de novos metabólitos. A taxonomia dos actinomicetos é bastante complexa e a metodologia de MLSA, ferramenta alternativa em estudos de sistemática microbiana, pode ser uma técnica importante na caracterização de actinomicetos. Novos metabólitos secundários tem sido isolados de actinomicetos marinhos, sendo as atividades antibacteriana e anticâncer as principais descritas,porém pouco se conhece sobre a atividade antiviral deste grupo de micro-organimos. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade de actinomicetos associados ao ambiente marinho, utilizando uma abordagem polifásica, associada à avaliação das atividades antimicrobiana e antiviral destas bactérias. No total, foram obtidos 579 isolados de bactérias oriundos de macro-organismos marinhos coletados no litoral norte do Estado de São Paulo, Brasil. Desses, 72 foram identificados por análise de sequência do gene RNA ribossomal 16S, como actinomicetos, e nove isolados foram descritos como novas espécies de actinobactérias pertencentes aos gêneros Gordonia (B204), Marmoricola (B374), Williamsia (B138, B375 e B452), Serinicoccus (B736), Kineococcus (B366), Knoellia (B175) e Janibacter (B742). A caracterização polifásica dessas novas espécies de actinobactérias foi realizada pela técnica de hibridação DNA-DNA, Multilocus Sequence Analysis (MLSA) utilizando genes conservados (rpoB, rpoA, gyrB, recA e trpB), análise de perfil de ácidos graxos e microscopia eletrônica. A caracterização dos isolados foi complementada por testes fisiológicos e quimiotaxonômicos, tais como a determinação do conteúdo de GC, lipídios polares, menaquinonas, testes de utilização de fontes de carbono, atividade enzimática, degradação de compostos e tolerância a antibióticos, pH e temperatura. Quanto ao potencial biotecnológico dos 72 isolados de actinobactérias avaliados, 16 isolados apresentaram potencial antimicrobiano e 13 potencial antiviral. Os extratos dos isolados B175 (CIM = 1 mg/mL), B375 (CIM = 2 mg/mL), B138 (CIM = 1 mg/mL) e B366 (CIM = 2 mg/mL) apresentaram atividade antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus ATCC 6538. O extrato do isolado B374 apresentou atividade antiviral frente ao vírus Metapneumovírus aviário (aMPV), os isolados B366 e B742, frente ao herpes vírus simplex do tipo 1 (HSV-1), os isolados B138 e B452 frente ao vírus Calicivírus Felino (FCV) e o isolado B204 frente ao vírus da diarréia viral bovina (BVDV). A partir deste trabalho, pode-se concluir que existe grande diversidade de micro-organismos marinhos a ser descoberta e explorada, como fonte de novas espécies e compostos com potencial biotecnológico Abstract: O ambiente marinho representa uma importante fonte de diversidade biológica com grande potencial para descoberta de novos metabólitos secundários biologicamente ativos. Dentro desse ambiente, pode-se destacar os actinomicetos marinhos, cujos estudos podem contribuir para a melhor compreensão de suas funções ecológicas e para seu uso como uma fonte importante de novos metabólitos. A taxonomia dos actinomicetos é bastante complexa e a metodologia de MLSA, ferramenta alternativa em estudos de sistemática microbiana, pode ser uma técnica importante na caracterização de actinomicetos. Novos metabólitos secundários tem sido isolados de actinomicetos marinhos, sendo as atividades antibacteriana e anticâncer as principais descritas,porém pouco se conhece sobre a atividade antiviral deste grupo de micro-organimos. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade de actinomicetos associados ao ambiente marinho, utilizando uma abordagem polifásica, associada à avaliação das atividades antimicrobiana e antiviral destas bactérias. No total, foram obtidos 579 isolados de bactérias oriundos de macro-organismos marinhos coletados no litoral norte do Estado de São Paulo, Brasil. Desses, 72 foram identificados por análise de sequência do gene RNA ribossomal 16S, como actinomicetos, e nove isolados foram descritos como novas espécies de actinobactérias pertencentes aos gêneros Gordonia (B204), Marmoricola (B374), Williamsia (B138, B375 e B452), Serinicoccus (B736), Kineococcus (B366), Knoellia (B175) e Janibacter (B742). A caracterização polifásica dessas novas espécies de actinobactérias foi realizada pela técnica de hibridação DNA-DNA, Multilocus Sequence Analysis (MLSA) utilizando genes conservados (rpoB, rpoA, gyrB, recA e trpB), análise de perfil de ácidos graxos e microscopia eletrônica. A caracterização dos isolados foi complementada por testes fisiológicos e quimiotaxonômicos, tais como a determinação do conteúdo de GC, lipídios polares, menaquinonas, testes de utilização de fontes de carbono, atividade enzimática, degradação de compostos e tolerância a antibióticos, pH e temperatura. Quanto ao potencial biotecnológico dos 72 isolados de actinobactérias avaliados, 16 isolados apresentaram potencial antimicrobiano e 13 potencial antiviral. Os extratos dos isolados B175 (CIM = 1 mg/mL), B375 (CIM = 2 mg/mL), B138 (CIM = 1 mg/mL) e B366 (CIM = 2 mg/mL) apresentaram atividade antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus ATCC 6538. O extrato do isolado B374 apresentou atividade antiviral frente ao vírus Metapneumovírus aviário (aMPV), os isolados B366 e B742, frente ao herpes vírus simplex do tipo 1 (HSV-1), os isolados B138 e B452 frente ao vírus Calicivírus Felino (FCV) e o isolado B204 frente ao vírus da diarréia viral bovina (BVDV). A partir deste trabalho, pode-se concluir que existe grande diversidade de micro-organismos marinhos a ser descoberta e explorada, como fonte de novas espécies e compostos com potencial biotecnológico Doutorado Microbiologia Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2009/13778-4

Orientador: Wanderley Dias da Silveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A bactéria Escherichia coli coloniza o trato intestinal de aves e humanos, de maneira comensal sem causar processos infecciosos. No entanto alguns clones adquiriram fatores de virulência específicos, permitindo o desenvolvimento de diferentes doenças como infecção do trato urinário, diarréia e meningite em humanos e colibacilose em aves. As linhagens que causam doença em aves são tipicamente denominadas APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli). Neste trabalho foram sequenciados e anotados os genomas de quatro linhagens APECs (SCI-07, SEPT362, S17 e O8)que, juntamente com mais nove genomas referentes a linhagens de Escherichia coli patogênicas para aves e patogênicas para humanos foram utilizados para a busca de genes sob seleção positiva. Os genes homólogos foram agrupados,e posteriormente submetidos ao alinhamento de códons e das sequencias protéicas correspondentes. Uma árvore filogenética foi gerada para cada grupo de proteínas homólogas. Testes estatísticos determinaram qual entre os modelos de seleção neutra ou seleção positiva melhor explicou os dados existentes (alinhamentos de códons e árvores filogenéticas). Essas análises detectaram duzentas e cinquenta e quatro grupos de genes homólogos com evidência de seleção positiva. Para cada grupo foi realizado um teste de recombinação para verificar se o aumento na variação das sequencias não era devido à conversão gênica, resultando em cento e dezesseis grupos de genes homólogos sob seleção positiva. A proteína correspondente a um gene de cada grupo de genes homólogos foi identificada, por meio da ferramenta Blast. Diversos fatores de virulência, já conhecidos, e proteínas regulatórias puderem ser detectados. Os genes sob seleção positiva, também foram submetidos à anotação considerando o termo GO (Gene Ontology),apenas da categoria processo biológico. Dos cento e dezesseis genes apenas cinquenta e sete puderam ser identificados por meio dessa metodologia. O resultado da classificação dos genes dentro da classe GO, considerando o terceiro nível hierárquico,mostrou que a maioria dos genes anotados (31) tinha relação com o metabolismo primário.As proteínas cuja identificação, por meio do blast, não foi possível (proteínas hipotéticas)foram submetidas à análise de predição de localização subcelular e de peptídeo sinal. Essas análises revelaram que três proteínas desconhecidas (hypothetical proteinECIAI39_1028, hypothetical proteinZ0639e hypothetical proteinEC042_3791) são potenciais alvos para estudos que visam à busca de novos fatores de virulência de Escherichia coli patogênicas Abstract: The bacterium Escherichia coli colonizesthe intestinal tract of birds and humans, in a commensal relationship without causing infection. However, some clones have acquired specific virulence factors allowing the development of various diseases such as urinary tract infection, diarrhea and meningitis in humans and colibacillosis in poultry. The strains that cause disease in birds are typically named APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli). In this study we sequenced and annotated the genomes of four APECs strains (SCI-07, SEPT362, S17 and O8). These genomes and nine others avian pathogenic Escherichia coli and humans pathogenic strains genomes were used for studying genes under positive selection. The homologous genes were grouped and then subjected to codons and corresponding protein sequences alignment. A phylogenetic tree was generated for each group of homologous proteins. Statistical tests determined which among neutral or positive selection models best explains the existing data (codon alignments and phylogenetic trees). This analyzes detected two hundred fifty-four groups of homologous genes with positive selection evidence. For each group a recombination test was conducted to verify if the variation increase in the sequences was not due to gene conversion, resulting in one hundred and sixteen groups of homologous genes under positive selection. The protein corresponding to a gene of each group of homologous genes under positive selection was identified through Blast tool. Genes under positive selection were annotated considering the GO term (Gene Ontology), just for the biological process category. Only fifty-seven genes could be identified using this methodology. The gene classification within the GO classes, considering only the third hierarchical level showed that most of the annotated genes (31) were related with the primary metabolism. Proteins which blast identification was not possible (hypothetical proteins) were subjected to sub cellular localization and signal peptide prediction analyzes. These analyzes revealed that three unknown proteins (hypothetical protein ECIAI39_1028, hypothetical protein Z0639e hypothetical protein EC042_3791) are potential targets for studies, in order to search for new virulence factors of pathogenic Escherichia coli Doutorado Microbiologia Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Marta Cristina Teixeira Duarte, Priscilla Efraim Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Durante o processamento primário, amêndoas de cacau passam por uma série de etapas de manipulação que possibilitam a contaminação por micro-organismos transmissores de doenças de origem alimentar, gerando risco à saúde dos consumidores. A irradiação gama por Cobalto-60 é uma forma eficaz de eliminar a carga bacteriana em alimentos. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da irradiação gama sobre as características microbiológicas, no que diz respeito à presença de fungos e Salmonella spp., e sobre as propriedades físico-químicas de amostras de amêndoas de cacau. Amostras de cacau (N=31) foram tratadas com três doses de irradiação gama, ou seja, 2, 3 e 5 kGy, e analisadas quanto à porcentagem de contaminação fúngica por plaqueamento direto, enquanto a presença de Salmonella spp foi determinada pelo método de PCR. Os resultados mostraram uma diminuição significativa (p

Orientadores: Fabiana Fantinatti Garboggini, Suzan Pantaroto de Vasconcellos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Bactérias e fungos têm sido largamente explorados devido às suas habilidades em produzir uma grande variedade de enzimas, entre elas, as celulases que se destacam devido ao seu potencial em degradar materiais lignocelulósicos em açúcares fermentáveis, que podem então ser convertidos, por exemplo, em biocombustíveis. O presente trabalho visou a bioprospecção de bactérias isoladas a partir do processo de compostagem realizado pela Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP), quanto à produção de enzimas celulolíticas, além da caracterização taxonômica das linhagens de interesse. Para tanto, os micro-organismos oriundos do processo de compostagem da FPZSP foram isolados, preservados e caracterizados macroscopicamente. Dentre as linhagens isoladas, 168 foram testadas numa triagem qualitativa para a produção de celulases, obtendo-se 135 micro-organismos com potencial celulolítico evidenciado pela formação de halos de hidrólise em meio de cultura contendo carboximetilcelulose. Destes, 10 linhagens apresentaram halos translúcidos com diâmetros entre 1,3 cm e 1,9 cm, as quais foram avaliadas quanto a atividade celulotíca em ensaios quantitativos monitorados durante 7 dias, em duas condições de pH distintas: 4,8 e 7,4. Os melhores tempos de incubação verificados foram de sete e cinco dias para os valores de pH 4,8 e 7,4, respectivamente. Em seguida, foram selecionados linhagens para os ensaios de delineamento experimental e otimização das atividades enzimáticas. No planejamento P&B, a melhor atividade celulolítica verificada foi de 3,6392 FPU/mL obtida a partir da linhagem FPZSP 143, no pH 4,8. Esta linhagem foi então selecionada e o planejamento do tipo Delineamento Composto Central Rotacional ¿ DCCR aplicado, promovendo dessa maneira, um aumento 0,4574 FPU/mL em relação ao experimento do planejamento anterior. Posteriormente, o experimento foi validado e o resultado máximo alcançado para atividade celulolítica da linhagem FPZSP 143 foi de 4,6435 FPU/mL. Cinco linhagens selecionadas com atividade celulolítica foram identificadas por análise de sequências do gene RNA ribossomal 16S como membros do gênero Bacillus, bactérias frequentemente encontradas em ambientes da compostagem e que tem sido largamente reportada como produtoras de enzimas celulolíticas. O processo de compostagem demonstrou ser um ambiente em potencial para a produção de celulases de interesse para diversos ramos da indústria, sendo os representantes do gênero Bacillus os melhores produtores de enzimas celulolíticas. Embora as bactérias tenham sido isoladas de um ambiente com pH em torno de 7,4, há um potencial para a produção de celulases em pH mais ácidos, evidenciando sua aplicabilidade em diferentes condições. Essa característica torna-se relevante quando se leva em consideração os processos industriais, onde uma condição diferente e específica é exigida em cada processo, tornando as enzimas celulolíticas oriundas de processo de compostagem grandes aliadas no desenvolvimento e otimização de processos industriais Abstract: Bacteria and fungi have been extensively explored due to their ability to produce a variety of enzymes, including the cellulases that stand out because of their potential to degrade lignocellulosic materials to fermentable sugars, which can then be converted, for example, in biofuels. The present work aimed bioprospecting of bacteria isolated from the composting process conducted by Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP), for the production of cellulolytic enzymes and the taxonomic characterization of strains of interest. For both, the microorganisms derived from the composting process of FPZSP were isolated, preserved and characterized macroscopically. Among the isolates, 168 were tested for production in a qualitative screening of cellulases, obtaining 135 cellulolytic microorganisms with potential evidenced by the formation of halos of hydrolysis in culture medium containing carboxymethylcellulose. These, 10 strains showed translucent halos with diameters between 1.3 cm and 1.9 cm, which were evaluated for activity in cellulolytic quantitative assays monitored for 7 days under two different pH conditions: 4.8 and 7.4. The best times of incubation recorded were seven and five days to pH 4.8 and 7.4, respectively. Then, strains for testing experimental design and optimization of enzymatic activities were selected. In Planning P&B, the best cellulolytic activity verified was 3.6392 FPU/mL obtained from FPZSP 143, at pH 4.8. This strain was selected and the DCCR applied, thus promoting an increase of 0.4574 FPU/mL compared to the previous experiment planning. Subsequently, the experiment was validated and the maximum score achieved for cellulolytic activity FPZSP 143 strain was 4.6435 FPU/mL. Five strains with cellulolytic activity were identified by sequence analysis of the 16S ribosomal RNA gene as members of the genus Bacillus, bacteria frequently encountered in composting environments and has been widely reported as producing cellulolytic enzymes. The composting process proved to be a potential environment for the production of cellulases of interest for various branches of industry, being the representatives of the genus Bacillus the best producers of cellulolytic enzymes. Although bacteria have been isolated from an environment with a pH around 7.4, there is a potential for the production of cellulases in more acidic pH, indicating their applicability in different conditions. This feature becomes important when one takes into account the industrial processes, where a different and specific condition is required in each case, making the cellulolytic enzymes derived from composting process a good allied in developing and industrial process optimization Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Marcelo Lancellotti Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia Resumo: Neisseria meningitdis, ou meningococo, é uma bactéria comensal da nasofaringe humana. Contudo, algumas linhagens meningocócicas ocasionalmente ultrapassam a mucosa respiratória e a barreira hematoencefálica e causam enfermidades como meningite e septicemia. Como a espécie humana é o único hospedeiro natural para esse patógeno, estudos in vitro com modelos celulares são uma ferramenta importante para a análise da interação entre o meningococo e seu hospedeiro. Este trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes linhagens de N. meningitidis na adesão celular, morfologia e expressão de quimiocinas inflamatórias em culturas in vitro de células humanas. Tais parâmetros também foram avaliados em um sistema in vitro de co-cultura celular entre células de origem nervosa e endotelial a fim de mimetizar a barrreira hematoencefálica humana. Os resultados obtidos indicam que a adesão de diferentes linhagens bacterianas em células humanas de sítios específicos do processo infeccioso do meningococo, como Hep-2 (laringe), NCIH460 (pulmão), Hec1b (endotelial) e NG97 (neuroglia) foi capaz de mimetizar o processo fisiopatológico deste microrganismo. Em condições in vitro, células de origem nervosa mostraram-se mais suscetíveis à infecção nos parâmetros avaliados como uma elevada expressão de TNF-?, quimiocina característica em infecções meningocócicas. A linhagem B4 destacou-se entre as linhagens meningocócicas estudadas, apresentando elevados percentuais de adesão em células humanas com valor máximo de adesão em NG97. Células HEp-2 apresentaram poucas alterações morfológicas significativas frente à infecção por N. meningitidis. Tais resultados podem estar associados ao fato do trato respiratório superior ser o habitat natural do meningococo, no qual a interação entre este patógeno e as células hospedeiras seja comensal e não-invasiva. O modelo mimético de barreira hematoencefálica, realizado em transwell, indicou comunicação entre as células que o compõem e uma maior expressão dos níveis de quimiocinas inflamatórias quando comparada à infecção desta bactéria por cada uma das células estudadas isoladamente. Tal modelo foi capaz de mimetizar a barreira hematoencefálica, fato o que torna possível sua aplicação em estudos da passagem de fármacos e outros patógenos por essa barreira. Abstract: Neisseria meningitidis,or meningococci, is a commensal bacterium of the human nasopharynx. However, occasionally some meningococcal strains can cross the respiratory mucosa and the blood-brain barrier and cause life-threatening diseases such as meningitis and septicaemia. Since the human species is the only natural host for this pathogen, in vitro studies with cellular models are an important tool for the analysis of the meningococci and its host. The aim of this present work was to value the influence of several strains of N. meningitidis in cellular adhesion, morphology and inflammatory chemokines expression in human cells cultivated in vitro. These parameters were also evaluated in a co-cultivated cellular system with glial and endothelial cells aiming mimicking the human blood brain barrier. The results indicate that the adhesion of different bacterial strains from specific sites of infectious process of meningococci as Hep-2 (larynges), NCIH460 (lung), Hec1b (endothelial) and NG97 (glial cells) was capable of mimicking, partially, the pathophysiology of this microorganism. In in vitro conditions, cells from nervous origin showed more susceptibility to infection then others in this evaluated parameters such as a high TNF-? expression, a common chemokine in meningococcals diseases. The B4 strain distinguished from the others by presenting high rates of adhesion in human cells with maximum value on NG97. HEp-2 cells showed few expressives morphologic alterations after meningococcal infection. These results may be associated with the fact that the upper human respiratory tract is the meningoccci natural habitat, in which the interaction between this pathogen and host cells are commensal and not-invasive.The mimicking blood-brain barrier model, performed in transweel, has demonstrated some communication between the cells and greater expression of inflammatory chemokines when compared to the infection in isolated cells. This model was capable of mimicing the blood-brain barrier, which makes its application possible in studies of drugs and others pathogens who might crossover though this barrier. Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Fabiana Fantinatti-Garboggini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Nas últimas décadas um grande número de compostos de interesse biotecnológico, como por exemplo, citotoxinas, agentes antifúngicos, antimicrobianos, antivirais e anticancerígenos têm sido isolados de esponjas marinhas. Entretanto, estudos comprovam que, em muitos casos, os compostos ativos desses animais são oriundos de micro-organismos associados, que podem compor até 60% do volume tecidual das esponjas. A presente proposta teve por objetivo a caracterização taxonômica da diversidade de bactérias cultiváveis associadas às esponjas coletadas no litoral norte do estado de São Paulo, Brasil, e a avaliação da atividade antimicrobiana a partir de extratos orgânicos brutos dessas bactérias. Um total de 86 bactérias foi recuperado das esponjas Axinella corrugata, Dragmacidon reticulata, Chelonaplysilla erecta e Petromica citrina utilizando diferentes meios de cultivo. A diversidade das bactérias foi caracterizada utilizando dados de morfologia, ARDRA (Amplified Ribossomal Restriction Analysis) e sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S, cuja análise permitiu a identificação de membros pertencentes aos filos Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes e Firmicutes num total de 15 gêneros distintos. O gênero Pseudovibrio foi o único presente em todas as esponjas amostradas, e os gêneros Bacillus, Ruegeria, Vibrio, Staphylococcus e Erythrobacter estavam presentes em mais de uma esponja. A esponja Dragmacidon reticulata apresentou a maior diversidade bacteriana, englobando oito diferentes gêneros, dentre eles, um representate do gênero Cyclobacterium, o qual até onde se sabe, foi isolado pela primeira vez de uma esponja marinha. O gênero Bacillus esteve presente em três esponjas, mas na Petromica citrina, endêmica do Brasil, o gênero ficou representado em 74% dos isolados obtidos. Este estudo foi o primerio relato sobre a diversidade de bactérias cultiváveis da esponja Petromica critrina. Todos os isolados foram avaliados quanto à presença ou ausência dos fragmentos dos genes PKS (Polyketide Synthases) e NRPS (Non Ribossomal Peptide Synthetases), visando à investigação do potencial biotecnológico das bactérias, e mais da metade delas apresentaram pelo menos um dos genes estudados. Uma triagem da atividade antimicrobiana utilizando o método da difusão em bloco de ágar demonstrou que 21 isolados foram promissores para produção de antimicrobianos. Destes isolados foram obtidos os extratos orgâncios brutos, os quais foram testados quanto à determinação da concentração inibitória mínima contra oito micro-organismos indicadores. Um total de 13 extratos orgânicos brutos, em sua maioria respresentantes do gênero Bacillus, demonstraram ação contra o micro-organismo Bacillus subtilis ATCC 6051 e um deles demonstrou ação contra o micro-organismo Escherichia coli ATCC 11775. A numerosa inibição de estirpes de Bacillus por outros Bacillus sugere que a atividade possa ser gerada por bacteriocinas, polipeptídeos produzidos pela via ribossomal que atuam na inibição de crescimento de grupos próximos de micro-organismos. Sua possível função no meio ambiente é prover vantagem seletiva através da eliminação de um competidor relativamente próximo. Ainda, um representante do gênero Exiguobacterium apresentou atividade antimicrobiana contra B. subtilis, resultado este não descrito até o presente na literatura Abstract: In recent decades a large number of compounds of biotechnological interest, such as cytotoxins, antifungal, antimicrobial, antiviral and anticancer substances have been isolated from marine sponges, however, studies show that, in many cases, the active compounds are actually produced by associated microorganisms, which can comprise up to 60% of the volume of sponge tissue. This proposal aimed to characterize the taxonomic diversity of culturable bacteria associated with sponges collected in the northern coast of São Paulo, Brazil, and to evaluate the antimicrobial activity from crude organic extracts of these bacteria. A total of 86 bacteria were recovered from sponges the Axinella corrugata, Dragmacidon reticulata, Petromica citrina and Chelonaplysilla erecta using different culture media. The diversity of bacteria was characterized using data from morphology, ARDRA (Amplified Ribossomal Restriction Analysis) and sequencing of 16S ribosomal RNA gene, whose analysis allowed the identification of members belonging to the phyla Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes, in a total of 15 distinct genera. The genus Pseudovibrio was the only one present in all sponges sampled, and the genera Bacillus, Ruegeria, Vibrio, Staphylococcus and Erythrobacter were present in more than one sponge sampled. The sponge Dragmacidon reticulata showed the highest bacterial diversity, encompassing eight different genera, among which the genus Cyclobacterium, which, as far as is known, was first isolated from a marine sponge. The genus Bacillus was present in three sponges, but in Petromica citrina, endemic to Brazil, the genus accounted for 74% of the isolates. This study was the first report on the diversity of culturable bacteria from the sponge Petromica critrina. All isolates were evaluated for the presence or absence of NRPS (non ribossomal peptide synthetases) and PKS (polyketide synthase) genes in order to investigate the biotechnological potential of bacteria, and over half of the isolates had at least one of these genes. A screening of antimicrobial activity using the diffusion agar disk method showed that 21 isolates were promising for the production of antibiotics. Crude organic extracts from these isolates were produced and tested against eight indicator microorganisms to determine the minimum inhibitory concentration (MIC). A total of 13 crude organic extracts, most of the genus Bacillus, showed inhibitory activity against the microorganism Bacillus subtilis ATCC 6051, and one of them showed activity against the microorganism Escherichia coli ATCC 11775. The large inhibition of Bacillus strains to other Bacillus strains suggests that the activity can be generated by bacteriocins produced through ribosomal polypeptides that inhibit close groups of microorganisms. Its possible role in the environment is to provide a selective advantage by eliminating a relatively close competitor. Still, a representative of the genus Exiguobacterium showed antimicrobial activity against B. subtilis, which was not described in the literature up to date Mestrado Microbiologia Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Valeria Maia Merzel Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A contaminação por bactérias produtoras de ácido lático (LAB, do inglês Lactic Acid Bacteria) é um dos principais problemas enfrentados no processo de fermentação alcóolica em usinas de bioetanol, uma vez que reduz o rendimento do processo e traz perdas econômicas significativas. As LAB, além de competirem com as leveduras (Saccharomyces sensu stricto), responsáveis pela produção do bioetanol, também secretam metabólitos inibitórios prejudiciais às leveduras. O uso de antibióticos para o controle de LAB na fermentação alcoólica tem sido uma prática constante na indústria de bioetanol, apesar de gerar resíduos potencialmente nocivos, que resultam na disseminação de linhagens de bactérias resistentes que acarretam problemas ambientais e a saúde humana. Assim, no intuito de estabelecer processos ecologicamente mais amigáveis e sustentáveis, é indispensável a substituição dos antibióticos utilizados na indústria de bioetanol. Para tanto, é preciso substâncias eficazes que não se tornem resíduos nocivos, o que faz dos produtos naturais uma alternativa promissora para este tipo de substituição. No Brasil, a biodiversidade é considerada uma fonte de substâncias biologicamente ativas, onde muitas plantas vêm sendo amplamente reconhecidas por suas propriedades antimicrobianas ao longo dos séculos. Princípios ativos sintetizados pelo metabolismo secundário das plantas com aplicações biotecnológicas podem ser obtidos a partir de diferentes partes das plantas. Este fato motiva a investigação de produtos naturais provenientes de plantas, como óleos essenciais (OE), que possam ser utilizados no controle da contaminação por LAB no processo de fermentação alcóolica. Os OE possuem um alto potencial biotecnológico para esta substituição pois muitos apresentam atividade antimicrobiana para diversas bactérias. Em adição, são substâncias consideradas seguras, uma vez que são utilizados na indústria de alimentos e não produzem resíduos nocivos ao ambiente e à saúde humana. Desta forma, propomos neste trabalho, a triagem, caracterização e avaliação do efeito antimicrobiano de OE obtidos preferencialmente a partir de plantas da flora brasileira, que tenham atividade biológica seletiva, ou seja, inibitórios e/ou microbicidas para LAB e inertes para leveduras do gênero Saccharomyces sensu stricto, com potencial para substituir os antibióticos no controle de contaminação da fermentação de bioetanol Abstract: The use of antibiotics to control bacterial contamination in alcoholic fermentation process has been a common practice in the industry. Lactic acid bacteria (LAB), the main group of contaminating bacteria in the bioethanol fermentation process, are considered a huge problem to the process, since they are capable to thrive under the conditions found in fermentation tanks, competing with yeasts (Saccharomyces sensu stricto) for the sugar to be fermented (sugarcane juice or molasses). Furthermore, they secrete substances that may inhibit the development of yeasts in the process, compromising fermentation yield. In order to prevent LAB and limit production losses, the ethanol industry makes continuous use of the same antibiotics consumed by humans, such as, penicillin, erythromycin and virginiamycin. This practice can lead to the selection of resistant bacteria and contributes to the growing concern about the effects of the indiscriminate use of antibiotics in human health. In addition, traces of these antibiotics may be found in ethanol byproducts, such as dry yeast, which is sold as source of protein for animal feed preparation. Antibiotic traces in Brazilian dry yeast have caused frequent rejection of this product by the European Community. Hence, the replacement of antibiotics in fermentation process for bioethanol production is of paramount importance and should entail the use of substances that do not turn into harmful residues to the environment and, consequently, a hazard to human health. Essential oils (EO) are considered an important source of substances with antimicrobial activity. Thus, these oils may become a promising alternative to replace antibiotics in the control of lactic acid bacteria (LAB). In this context, the aim of this study was to screen and characterize EO obtained preferentially from Brazilian plants and showing selective activity, exhibiting inhibitory and/or biocidal activity against LAB and being inert to yeasts of the genus Saccharomyces sensu stricto, with potential to replace antibiotics in the contamination control of bioethanol fermentation Doutorado Microbiologia Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES 001

Orientadores: Valéria Maia Merzel, Fabiana Fantinatti-Garaboginni Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O continente Antártico é considerado uma região com condições climáticas extremas, com baixas temperaturas, alta incidência de radiação UV e déficit hídrico. Possui um bioma muito singular, o que significa que grande parte do seu patrimônio biológico não pode ser encontrada em outro lugar do planeta. Nestas condições espera-se encontrar micro-organismos adaptados (extremófilos) que possam ser explorados para a identificação de arsenais metabólicos únicos e versáteis com possíveis aplicações biotecnológicas em diversas áreas. O desenvolvimento de pesquisas recentes em nosso laboratório com bactérias e fungos da Antártica permitiu o isolamento de um grande número (em torno de 1200) de micro-organismos daquela região, muitos deles possivelmente indígenas, ainda não catalogados e não estudados quanto à produção de compostos bioativos potenciais. Com base nesse repertório, este estudo visou identificar as bactérias isoladas e descobrir produtos naturais de interesse biotecnológico, com foco em antibióticos e pigmentos para aplicação na indústria farmacêutica ou cosmética. Assim, um total de 326 isolados bacterianos, distribuídos em 39 gêneros diferentes, foram identificados com base no seqüenciamento do gene RNAr 16S. A triagem para antimicrobianos revelou quinze isolados capazes de inibir o crescimento de pelo menos uma das linhagens indicadoras: Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Candida albicans. Uma bactéria psicrotolerante, Pseudomonas sp. isolado 99, apresentou amplo espectro antimicrobiano, além de atividade antiproliferativa e antiparasitária. Em relação aos pigmentos, foram selecionadas quatro bactérias que melhor resistiram à radiação UV e seus pigmentos foram extraídos e identificados. Todos os pigmentos selecionados foram identificados como carotenoides e apresentaram alta atividade antioxidante e boa estabilidade sob exposição à luz ultravioleta. Um pigmento em específico, identificado como all-trans-bacterioruberina, se mostrou seguro nos testes de fototoxicidade, abrindo perspectivas de uso na formulação de cosméticos Abstract: The Antarctic continent is considered a region with extreme climatic conditions, with low temperatures, high incidence of UV radiation and water deficit. It has a very unique biome, which means that much of its biological heritage can not be found elsewhere on the planet. Under these conditions it is expected to find adapted microorganisms (extremophiles) that can be exploited for the identification of unique and versatile metabolic arsenals with potential biotechnological applications in several areas. The development of recent research in our laboratory with bacteria and fungi in Antarctica allowed the isolation of a large number (around 1200) of microorganisms, many of them possibly indigenous, not yet cataloged or studied for the production of potential bioactive compounds. Based on this repertoire, this study aimed to identify bacterial isolates and discover natural products of biotechnological interest, focusing on antibiotics and pigments for application in the pharmaceutical or cosmetic industry. Thus, a total of 326 bacterial isolates, distributed in 39 different genera, were recovered and identified based on 16S rRNA gene sequencing. Antimicrobial screening revealed fifteen isolates capable of inhibiting the growth of at least one of the indicator strains Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Candida albicans. A psychrotolerant bacterium, Pseudomonas sp. isolate 99, showed broad antimicrobial spectrum, besides antiproliferative and antiparasitic activity. Regarding pigments, four bacteria were shown to better withstand UV radiation and their pigments were extracted and chemically identified. All selected pigments were identified as carotenoids and exhibited high antioxidant activity and good stability under ultraviolet light exposure. A specific pigment, identified as all-trans-bacterioruberina, proved to be safe in the phototoxicity tests, opening perspectives for further use in the formulation of cosmetics Doutorado Microbiologia Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/17936-1

Orientadores: Laura Maria Mariscal Ottoboni, Renato Vicentini dos Santos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A cana-de-açúcar tem grande importância econômica para o Brasil, principalmente para o Estado de São Paulo, onde se concentra a maior produção dessa cultura. No entanto, a emissão crescente de gás carbônico na atmosfera está ocasionando aumento na temperatura média e diminuição da quantidade de chuvas nas regiões produtoras de cana-de-açúcar. Na rizosfera, as bactérias do solo estão intimamente relacionadas com as plantas e podem promover o crescimento vegetal. Dessa forma, o estudo do efeito das mudanças ambientais na rizosfera de cana-de-açúcar poderá proporcionar novas informações a respeito da interação planta-microbiota e como os micro-organismos poderiam ajudar as plantas a sobreviverem em condições adversas. Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do estresse hídrico na microbiota associada a rizosfera de duas variedades (CTC9001 e RB855536) de cana-de-açúcar por sequenciamento do metatranscriptoma. Além disso, a microbiota cultivável da rizosfera da variedade CTC9001 foi isolada e avaliada quanto a capacidade de promover crescimento vegetal. O Capítulo 1 deste trabalho apresentou os resultados do metatranscriptoma da rizosfera associada a variedade de cana-de-açúcar resistente a seca (CTC9001). Os resultados indicaram que a microbiota associada a rizosfera da variedade resistente é dominada principalmente por Proteobacteria, Actinobacteria e Bacteroidetes e que o estresse hídrico provocou alterações nessas comunidades. Uma diminuição na expressão de genes relacionados ao crescimento e ao metabolismo energético ocorreu principalmente nas amostras submetidas a oito dias de estresse hídrico e foram relacionadas com os gêneros Sorangium e Rhodanobacter. Por outro lado, genes associados a funções celulares como mobilidade por flagelo, adesão celular e degradação de proteínas aumentaram sua expressão em oito dias de estresse hídrico e foram relacionadas ao gênero Aequorivita. Esse gênero também apresentou correlação positiva com os ácidos orgânicos exsudados pela planta. O mesmo experimento de estresse hídrico foi conduzido para a microbiota associada a rizosfera da variedade de cana-de-açúcar sensível a seca (RB855536). Assim sendo, o Capítulo 2 apresentou os resultados obtidos da comparação entre a microbiota da rizosfera associada às duas variedades de cana-de-açúcar (resistente x sensível). Esses resultados mostraram que a microbiota da variedade sensível de cana-de-açúcar apresentou respostas diferentes em comparação aos dados obtidos para a variedade resistente. Essa diferença na resposta da microbiota entre as duas variedades de cana-de-açúcar foi observada mesmo em tempos mais curtos de estresse hídrico (dois dias). A variedade sensível apresentou modificações na expressão de genes associados a proteínas de ligação ao DNA e ao ribossomo, ao longo de todo o período de estresse hídrico avaliado. Nessa variedade, o gênero Streptomyces e a família Polyangiaceae apresentaram os maiores valores de expressão gênica aos 12 dias de estresse hídrico, provavelmente devido a capacidade de formarem esporos ou responderem mais rápido as mudanças ambientais. Streptomyces também apresentou vários transcritos correlacionados de forma negativa com os ácidos orgânicos exsudados pela planta, os quais podem ter atuado como sinalizadores para mudanças na expressão de alguns de seus genes. Finalmente, os resultados do isolamento de bactérias da rizosfera de cana-de-açúcar CTC9001 foi apresentado no Capítulo 3. As análises revelaram uma grande abundância de bactérias do gênero Arthrobacter, Pseudomonas, Microbacterium e Bacillus. Muitos isolados apresentaram resultados positivos para a capacidade de crescimento vegetal e crescimento sob estresse hídrico (na presença de PEG), sugerindo que os isolados poderiam ser utilizados como componentes de biofertilizantes comerciais para a agricultura. Testes de crescimento vegetal em plantas de tomate revelaram que o isolado Pseudomonas sp. WS02-30 aumentou o comprimento das raízes das plantas, provavelmente devido à sua capacidade de produzir ácido indol acético (IAA) e 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) deaminase Abstract: Sugarcane is a very important crop for the Brazilian economy, especially for the State of São Paulo, where the largest production of this crop is concentrated. However, the emission of carbon dioxide in the atmosphere is promoting an increase in the average temperature and a decrease in the rainfall in the sugarcane producing regions. In the rhizosphere, soil bacteria are closely related to plants and they can promote plant growth. Thus, the study of the effect of environmental changes on sugarcane rhizosphere could provide new informations about plant-microbiota interaction and how the microorganisms could help plants to survive in adverse conditions. Therefore, the aim of the present work was to evaluate the effect of water stress on the associated-rhizosphere microbiota of two sugarcane varieties (CTC9001 and RB855536) by metatranscriptome sequencing. In addition, the cultivable rhizosphere microbiota of CTC9001 variety was isolated and evaluated for the ability to promote plant growth. Chapter 1 of this work presented the results of rhizosphere metatranscriptome of the dry-resistant sugarcane variety (CTC9001). The results indicated that Proteobacteria, Actinobacteria and Bacteroidetes dominated the bacterial community associated with rhizosphere of the dry-resistant sugarcane variety and that water stress caused changes in these communities. A decrease in the expression of genes related to growth and energy metabolism occurred mainly in the samples submitted to eight days of water stress and were related to the Sorangium and Rhodanobacter genera. On the other hand, genes associated with functions such as flagella mobility, cell adhesion and protein degradation increased their expression in eight days of water stress and were related to the genus Aequorivita. This genus also showed a positive correlation with the organic acids exuded by the plant. The same water stress experiment was performed for the rhizosphere-associated microbiota of the dry-sensitive sugarcane RB855536. Thus, Chapter 2 presented the results obtained from the comparison between the rhizosphere-associated microbiota to the two sugarcane varieties (resistant x sensitive). These results showed that the microbiota of dry-sensitive sugarcane variety presented different responses compared to the data obtained for the resistant one. This difference in microbial response between the two sugarcane varieties was observed even in short times of water stress (two days). The dry-sensitive variety showed changes in the expression of genes associated with DNA and ribosome binding proteins, throughout the entire period of drought stress evaluated. In this variety, the genus Streptomyces and the family Polyangiaceae showed the highest values of gene expression at 12 days of water stress, probably due to the ability to form spores or respond faster to environmental changes. Streptomyces also presented several negatively correlated transcripts with organic acids exuded by the plant, which may have acted as signals for changes in the expression of some of its genes. Finally, the results of the isolation of bacteria from CTC9001 sugarcane rhizosphere were presented in Chapter 3. The analyzes revealed a high abundance of Arthrobacter, Pseudomonas, Microbacterium and Bacillus genera. Many isolates showed positive results for plant growth capacity and growth under water stress (in the presence of PEG), suggesting that the isolates could be used as components of commercial biofertilizers for agriculture. Plant growth tests on tomato plants revealed that the isolate Pseudomonas sp. WS02-30 increased the root length of plants, probably due to its ability to produce indole acetic acid (IAA) and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/05929-0 CAPES

Orientador: Valéria Maia Merzel Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O manguezal é um dos biomas mais importantes para a manutenção da vida nos mares e o equilíbrio da biosfera. O sedimento do mangue é uma grande fonte de novos recursos genéticos para pesquisa. Estes ambientes têm sofrido impacto antropogênico por muito tempo, principalmente a poluição causada por derramamento de petróleo. Diversos estudos estão sendo conduzidos para explorar o potencial genético destas comunidades com a finalidade de desenvolver novos processos biotecnológicos para o tratamento de ambientes contaminados. Dentro deste contexto, este trabalho visou identificar e caracterizar genes que codificam dioxigenases, proteínas envolvidas na degradação de hidrocarbonetos aromáticos, a partir de clones fosmidiais de uma biblioteca metagenômica construída de sedimento de mangue impactado por petróleo do município de Bertioga-SP. A coleta e processamento das amostras ambientais, juntamente com a construção da biblioteca metagenômica fosmidial, foi realizada previamente no âmbito do projeto FAPESP "Prospecção de metagenoma microbiano de sedimentos de manguezais na busca por novos compostos bioativos" (Processo no. 2011/50809-5). O DNA metagenômico das amostras de sedimento, coletadas em triplicata, foi extraído e usado em reações de PCR para a construção de bibliotecas dos genes de dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos (ARHDs) e análise de seus padrões de distribuição biogeográfico. O DNA total da biblioteca fosmidial foi isolado e sequenciado em plataforma Illumina para prospecção in silico de genes envolvidos no metabolismo de compostos aromáticos. Ainda, os clones fosmidiais foram submetidos a uma triagem preliminar por colorimetria, baseada no uso do composto MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2 H-tetrazolium bromide] (Merck) e, posteriormente, ensaios de degradação de hidrocarbonetos por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) para confirmar e quantificar a atividade de degradação de hidrocarbonetos aromáticos (fenol, naftaleno, fenantreno, pireno e benzopireno) dos clones. O DNA fosmidial dos clones com melhor potencial de degradação foi sequenciado e processado para montagem de grandes fragmentos metagenômicos. Caracterização estrutural e funcional dos insertos metagenômicos foram feitos nas plataformas RAST e IMG, para elucidação de clusters gênicos envolvidos na degradação de hidrocarbonetos aromáticos. Alvos gênicos foram isolados, ligados em vetor de expressão pET28a(+) e transformados em cepas de E. coli BL21(DE3) e Rosetta. A análise da diversidade dos genes ?-ARHD revelou que Pseudomonas, Streptomyces, Variovorax, Bordetella e Rhodococcus foram os cinco gêneros mais abundantes entre os 15 sítios analisados. A análise de distribuição biogeográfica revelou forte endemismo de algumas Operational Protein Families (OPF) de alfa-ARHD em cada região geográfica e uma considerável proximidade evolutiva entre OPFs encontradas em sítios da Antártica e da América do Sul. O sequenciamento da biblioteca fosmidial permitiu identificar um total de 71.729 sequências metagenômicas parciais na categoria SEED para metabolismo de compostos aromáticos (1% do total). Estas foram classificadas nas subcategorias Anaerobic degradation of aromatic compounds (20,34%), Metabolism of central aromatic intermediates (35,40%), e Peripheral pathways for catabolism of aromatic compounds (22,56%). Além disso, foi evidenciado o predomínio das dioxigenases de Catecol, Protocatecuato e Homogentisato, envolvidas no metabolismo central, e das dioxigenases de Fenilpropionato, Lignostilbeno, Bifenil e Benzoato envolvidas nas vias periféricas de degradação de aromáticos. As análises de bioinformática dos dados de sequenciamento dos clones fosmidiais potencialmente degradadores revelaram uma interessante diversidade de genes envolvidos direta e indiretamente no metabolismo de compostos aromáticos. Os ensaios de cromatografia mostraram a eficiência de 3 clones na degradação de fenol (98%), pireno (75%) e naftaleno (71%). Os clones contendo os genes alvos para dioxigenases apresentaram sinais positivos nos testes de expressão. Os resultados deste trabalho permitiram elucidar a riqueza, distribuição e relação genética entre os genes ARHD de diferentes sítios ao redor do mundo. Além disso, a avaliação da biblioteca metagenômica pelas diferentes técnicas empregadas, revelou seu extenso potencial genético para o metabolismo de compostos aromáticos Abstract: Mangrove is one of the most important biomes for the maintenance of life in the seas and the balance of the biosphere. Mangrove sediment is a major source of new genetic resources for research. These environments have long been suffering anthropogenic impacts, especially pollution caused by oil spills. Many microbial species are able to degrade petroleum compounds, and several studies are being conducted to explore the genetic potential of these communities with the purpose of developing new biotechnological processes for the treatment of contaminated environments. In this context, this work aimed to identify and characterize genes encoding dioxygenases, proteins involved in the degradation of aromatic hydrocarbons, from fosmid clones of a metagenomic library constructed from oil-impacted mangrove sediments located in the city of Bertioga-SP. Sampling and further processing of environmental samples, together with the metagenomic fosmid library construction, were performed previously under the project "Bioprospecting microbial metagenome from mangrove sediments in the search for novel bioactive compounds" (FAPESP Process no. 2011/50809-5). Metagenomic DNA from sediment samples, collected in triplicate, was extracted and used in PCR reactions for the assembly of Aromatic Ring-Hydroxylating Dioxygenases (ARHDs) gene library and analysis of their biogeographic distribution patterns. Total fosmid DNA was isolated and sequenced on the Illumina platform for in silico prospecting of genes involved in the metabolism of aromatic compounds. Further, fosmid clones were subjected to a preliminary colorimetric screening, based on the use of the compound 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2 H-tetrazolium bromide (MTT, Merck) and, subsequently, to hydrocarbon degradation assays by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) to confirm and quantify the aromatic hydrocarbon degradation activity (phenol, naphthalene, phenanthrene, pyrene and benzopyrene) of the clones. Fosmid DNA from clones with the best degradation potential was sequenced and processed for the assembly of large metagenomic fragments. Further structural and functional characterization of the metagenomic inserts was performed in the RAST and IMG platforms, to elucidate gene clusters involved in the aromatic hydrocarbon degradation. Gene targets were isolated, ligated into pET28a (+) expression vector and transformed into E. coli strains BL21 (DE3) and Rosetta. Diversity analysis of the ?-ARHD genes revealed that Pseudomonas, Streptomyces, Variovorax, Bordetella and Rhodococcus were the five most abundant genera harboring dioxygenases among the 15 sites analyzed. The biogeographic distribution analysis revealed strong endemism of some Operational Protein Families (OPF) of alpha-ARHD in each geographic region and a significant evolutionary relatedness between OPFs found in sites of Antarctica and South America. Sequencing of the fosmid library allowed the identification of a total of 71,729 partial metagenomic sequences in the SEED category for the metabolism of aromatic compounds (1% of the total). These were classified in the categories of Anaerobic degradation of aromatic compounds (20.34%), Metabolism of central aromatic intermediates (35.40%), and Peripheral pathways for catabolism of aromatic compounds (22.56%). In addition, we have demonstrated the predominance of Catechol, Protocatechuate and Homogentisate dioxygenases involved in central metabolism, and the dioxygenases of Phenylpropionate, Lignostilbene, Biphenyl and Benzoate involved in the peripheral pathways of aromatics degradation. Bioinformatics analyzes of sequencing data from potentially degrading fosmid clones revealed an interesting diversity of genes involved directly or indirectly in the aromatic compounds metabolism. Chromatography assays showed the efficiency of three clones in the degradation of phenol (98%), pyrene (75%) and naphthalene (71%). Clones containing the target genes for dioxygenase showed positive signals in expression tests. The results of this work allowed to elucidate the richness, distribution and genetic relationships among ARHD genes from different sites around the world. In addition, the evaluation of the metagenomic library by the different techniques employed revealed its extensive genetic potential for the aromatic compounds metabolism Doutorado Genética de Microorganismos Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/22555-4

Orientadores: Fabiana Fantinatti Garboggini, Luciana Konecny Kohn Dissertação (mestrado) Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O ambiente marinho é uma preciosa fonte de diversidade biológica e genética, especialmente de micro-organismos. Embora a diversidade da comunidade microbiana nos ambientes marinhos seja muito ampla, especialmente nos ambientes extremos como o continente Antártica, pouco se conhece sobre essa diversidade. Muitos desses micro-organismos, são produtores de metabólitos secundários, podendo produzir compostos naturais com aplicações na indústria farmacêutica, entre outras aplicações de bioprospecção. Esse trabalho identificou por sequenciamento 16SrRNA, 145 isolados de sedimentos marinhos e macro-organismos como Salpa, Ascídia, Líquens e Algas oriundos da Baía do Almirantado, Ilha de Rei George, Antártica. Esses 145 isolados foram pertencentes a 4 filos; Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes e Bacteroidetes e identificados em 28 gêneros distintos. Dentre esses 145 isolados observou-se a possibilidade de ter isolado possíveis espécies novas. Além disso, foram produzidos 22 extratos microbianos oriundos do genero Pseudoalteromonas ( 2 extratos), Psychrobacter (4 extratos), Planococcus (3 extratos), Bacillus ( 2 extratos), Brevibacterium ( 2 extratos), Kocuria ( 1 extrato), Arthrobacter (1 extrato), Pseudomonas (2 extratos), Saccharopolyspora (1 extrato), Salinibacterium (3 extratos) e Rhodococcus (1 extrato). Posteriormente esses extratos foram submetidos a extração líquido-líquido com a utilização do solvente acetato de etila para a obtenção da fração orgânica, essas foram submetidas a ensaios antivirais. Os ensaios avaliaram o potencial antiviral contra o Herpes vírus simplex tipo 1 (HSV-1) e contra o Bovine viral diarrhea virus (BVDV). O HSV-1 é um vírus que afeta principalmente a região orofacial dos seres humanos e BVDV é um dos principais patógenos bovinos, ambos os vírus apresentam distribuição mundial. Dos 22 extratos avaliados apenas 1, identificado como Pseudomonas sp. apresentou 99% de proteção contra o vírus HSV-1 e índice de seletividade de 8,88%. Nenhum extrato apresentou inibição igual ou superior a 97% de proteção contra o vírus BVDV. Esse trabalho evidenciou a possibilidade de revelar espécies novas de bactérias e de compostos biologicamente ativos com potencial anti-herpético oriundo do genero Pseudomonas Abstract: The marine environment is a precious source of biological and genetic diversity, especially of micro-organisms. While the diversity of the microbial community in marine environments is very wide, especially in extreme environments such as the Antarctic continent, little is known about this diversity. Many of these micro-organisms are producers of secondary metabolites and can produce natural compounds with applications in the pharmaceutical industry, among other bioprospecting applications. This work identified by 16S rRNA sequencing, 145 isolated from marine sediments and macro-organisms as Salpa, Squirt, Lichens and Algae coming from Admiralty Bay, King George Island, Antarctica. These 145 isolates were belonging to 4 phyla ; Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes and were identified in 28 distinct genera. Beteween these 145 isolates it is possible had isolated new speciesof bacterias. In addition, we produced 22 microbial extracts derived from Pseudoalteromonas (2 extracts), Psychrobacter (4 extracts), Planococcus (3 extracts), Bacillus (2 extracts), Brevibacterium (2 extracts), Kocuria (1 extract), Arthrobacter (1 extract), Pseudomonas (2 extracts), Saccharopolyspora (1 extract), Salinibacterium (3 extracts) and Rhodococcus (1 extract). Subsequently, these extracts were undergoing liquid-liquid extraction with the use of ethyl acetate solvent to obtain the organic fraction, these were subjected to antiviral assays. The assays evaluated the antiviral potential against Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and against Bovine viral diarrhea virus (BVDV). HSV-1 is a virus that mainly affects the orofacial region of human and BVDV is a major cattle pathogens, both viruses have worldwide distribution. Of this 22 extracts only one, identified as Pseudomonas sp. showed 99% protection against HSV-1 and 8.88% selectivity index. No extract showed inhibition less than 97% protection against BVDV virus. This work highlighted the possibility to reveal new species of bacteria and biologically active compounds with anti-herpetic potential derived from the genus Pseudomonas Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CAPES 2013/05113-8 FAPESP 2013/05961-9

Orientador: Suzete Aparecida Lanza Destéfano Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Burkholderia andropogonis, inicialmente descrita por Smith (1911) como Bacterium andropogonis, agente causal de doença em sorgo (Sorghum bicolor), causa sintomas como manchas e listras foliares em uma ampla gama de hospedeiros com extensa distribuição geográfica. Essa espécie bacteriana possui características únicas ausentes na maioria dos patógenos de planta, como a presença de um único flagelo polar do tipo embainhado e produção de metabólitos secundários do tipo rizobiotoxina. O objetivo desse estudo foi caracterizar a diversidade bioquímica, genética e patogênica de 42 linhagens de B. andropogonis e reavaliar a relação filogenética dessa espécie bacteriana dentro do gênero Burkholderia. Características bioquímicas e fisiológicas diferenciais não foram observadas entre as linhagens isoladas de diferentes hospedeiros e regiões geográficas, assim como não foi verificada especialização patogênica nos testes de patogenicidade em diferentes plantas hospedeiras. Na caracterização molecular, a técnica de rep-PCR mostrou-se um método sensível para medir a variação genética dentro desta espécie bacteriana, uma vez que a análise combinada utilizando REP-, ERIC- e BOX-PCR permitiu a separação das linhagens em grupos de acordo com seus hospedeiros específicos e/ou localização geográfica. Nas análises filogenéticas do gene RNA ribossomal 16S e de multilocus (MLSA) utilizando cinco genes housekeeping (gyrB, recA, lepA, atpD e gltB), B. andropogonis ficou separada das demais espécies do gênero, com baixas porcentagens de similaridade entre as sequências dos genes. O sequenciamento do genoma da linhagem Tipo de B. andropogonis também foi realizado nesse estudo e uma análise de multilocus utilizando 30 diferentes genes conservados mais uma vez mostrou que B. andropogonis permaneceu separada das demais espécies do gênero Burkholderia. Além disso, a identidade média de nucleotídeos (ANI), a frequência de tetranucleotídeos (TETRA) e o porcentual de proteínas conservadas (POCP) foram calculados e B. andropogonis apresentou valores mais baixos nas comparações aos pares com 12 diferentes espécies do gênero Burkholderia, reforçando a distância observada nas análises filogenéticas. Nossos resultados claramente colocaram B. andropogonis em um grupo distinto que pode representar um novo gênero Abstract: Burkholderia andropogonis initially described by Smith (1911) as the causal agent of leaf stripe disease on sorghum (Sorghum bicolor), affects a wide range of host plants economically important with an extensive geographical distribution. This bacterial species has unique features absent in most plant pathogens such as a single polar sheathed flagellum and rhizobitoxine production. The aim of this study was to assess the genetic, biochemical and pathogenic diversity among Burkholderia andropogonis strains and to establish the phylogenetic relationship of this bacterial species within Burkholderia genus. Differential biochemical and physiological features were not observed among strains isolated from different host and different geographical origins, as well as host specialization was not observed in the pathogenicity tests on distinct plant species. In the molecular characterization the rep-PCR technique was a sensitive method to measure the genetic variation within this bacterial species once the combined analysis using REP, ERIC and BOX-PCR allowed separation of strains into clusters according to specific hosts and/or geographical location. . The phylogenetic analysis using 16S rRNA gene and multilocus sequence analysis (MLSA) using five housekeeping genes (gyrB, recA, lepA, atpD e gltB) allowed clear separation of B. andropogonis from the other species of the genus, with low percentages of similarity among the genes sequences. After the genome sequencing of B. andropogonis type strain a multilocus analysis using 30 different conserved genes was also performed and again, B. andropogonis remained separated from the species of the Burkholderia genus. In addition, the average nucleotide identity (ANI), tetranucleotide frequency signature (TETRA), and percentage of conserved proteins (POCP) analyses were also carried out, and B. andropogonis species showed lower values when compared to the other Burkholderia species, reinforcing the distance observed in the molecular analyses. Our findings clearly indicates that B. andropogonis belongs to a distinct group and may represent a new genus Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2011/12222-2

Orientadores: Fabiana Fantinatti Garboggini, Marta Cristina Teixeira Duarte Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os micro-organismos associados ao continente Antártico apresentam populações diversas e metabolicamente ativas, porém o potencial farmacológico dos compostos obtidos pelos micro-organismos é pouco conhecido. As bactérias são importante fonte de compostos utilizados atualmente como antimicrobianos, e as principais vias de biossíntese de muitos antibióticos são catalisadas pelos genes PKS (Polyketide Synthases) e NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetases). O presente estudo teve como objetivo a avaliação genética e funcional da produção de compostos antimicrobianos obtidos de bactérias isoladas na Baía do Almirantado, Antártica, a identificação taxonômica das bactérias que apresentaram tal potencial e a identificação do perfil químico dos compostos antimicrobianos. O total de 153 bactérias foi isolado do ambiente antártico, 127 isolados apresentaram pelo menos um dos genes PKSI, PKSII e NRPS. Estes foram identificados através do sequenciamento parcial do gene RNA ribossomal 16S e pertencem a 28 gêneros distintos, sendo representantes dos Filos Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria e Bacteroidetes. A avaliação funcional da produção de antimicrobianos foi realizada com o total de 76 isolados dos quais 30 isolados formaram halos de inibição frente a micro-organismos testes. Os extratos brutos obtidos foram avaliados quanto à concentração inibitória mínima (MIC) frente a oito micro-organismos não virulentos, e 18 extratos brutos apresentaram atividade inibitória, onde se destaca o extrato denominado E131, obtido da bactéria do gênero Streptomyces, que apresentou atividade bacteriostática frente S. aureus e M. luteus, e atividade bactericida frente a C. albicans e B. subtilis. Frente a micro-organismos isolados de amostras clínicas, 11 extratos brutos apresentaram atividade inibitória frente a quatro cepas de Neisseria meningitides, com MIC dos extratos brutos variando de 0,0313 mg.mL-1 até 2,0 mg.mL-1. O extrato E46, obtido da bactéria Pseudoalteromonas sp., destacou-se quanto à atividade inibitória observada frente às quatro cepas avaliadas. Frente à cepa B4, destacam-se a atividade antimicrobiana dos extratos brutos obtido das bactérias Pseudoalteromonas sp. e Pseudomonas azotoformans CUG12536. Frente à cepa YUSA, destaca-se a atividade antimicrobiana observada pelo extrato bruto obtido da bactéria Marinilactibacillus sp., cuja atividade antimicrobiana foi relatada pela primeira vez neste gênero de bactéria. Os extratos brutos possuem em sua composição, compostos cuja atividade antimicrobiana é conhecida, como ácidos graxos e compostos cuja atividade antimicrobiana não está descrita na literatura. Os testes de fracionamento dos extratos frente a solventes de diferentes polaridades indicou que os extratos brutos são solúveis, em sua maioria, a solvente polar. Portanto, as bactérias isoladas da Antártica produzem compostos de interesse farmacológico e podem ser utilizadas como fonte de novos compostos. Tais resultados enfatizam a necessidade de mais estudos de bactérias associadas a ambientes extremos, como a Antártica Abstract: Microorganisms associated with the Antarctic continent have various and metabolically active populations, but the pharmacological potential of compounds obtained by micro-organisms is poorly understood. Bacterias are an important source of compounds currently used as antimicrobial, major biosynthetic pathways of many antibiotics are catalyzed by the PKS genes (Polyketide Synthases) and NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetases). This study had the objective to genetic and functional evaluation of the antimicrobial activity of bacteria isolated in Admiralty Bay, Antarctica, and the taxonomic identification of bacteria that had such potential and identification of the chemical profile of antimicrobial compounds. The total of 153 bacteria was isolated from Antarctic environment, among the isolates, 127 isolates showed at least one of the genes PKSI, PKSII and NRPS. These were identified by partial sequencing of 16S ribosomal RNA gene and belong to 28 different genera, with representatives of the phyla Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Bacteroidetes. The functional evaluation of the production of antibiotic was conducted with a total of 76 isolates including 30 isolates that formed inhibition halos against test microorganisms. The crude extracts were evaluated as the minimum inhibitory concentration (MIC) against eight non-virulent microorganisms, and 18 crude extracts showed activity, highlighting the so-called E131 extract, obtained from bacteria of the genus Streptomyces, which showed bacteriostatic activity against S. aureus and M. luteus, and bactericidal activity against C. albicans and B. subtilis. Faced with microorganisms isolated from clinical samples, 11 crude extracts showed inhibitory activity against four strains of Neisseria meningitides, with MIC ranging from 0.0313 mg.mL-1 to 2.0 mg.mL-1. The E46 extract obtained from the bacterium Pseudoalteromonas sp., stood out as the inhibitory activity observed across the four evaluated strains. Faced with the strain B4, stand out the antimicrobial activity of crude extracts obtained from bacteria Pseudoalteromonas sp. and Pseudomonas azotoformans CUG12536. Against YUSA strain, Marinilactibacillus sp. crude extract showed antimicrobial activity, which was the first reported in this bacterial genus. The extracts have in their composition, antimicrobial compounds whose activity is known, such as fatty acids, and compounds whose antimicrobial activity is not described in the literature. Fractionation tests of extracts using solvents of different polarities, indicated that the crude extracts are soluble mostly the polar solvent. Therefore, the bacteria isolated from the Antarctic produce compounds of pharmacological interest and can be used as a source of novel compounds. These results highlight the need for more studies of bacteria associated with extreme environments, such as Antarctica Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Suzete Aparecida Lanza Destéfano Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A sarna da batata é uma doença de ocorrência generalizada nas regiões produtoras do Brasil, tornando-se um fator limitante no cultivo dessa cultura. Essa doença afeta a qualidade da batata por lesões na superfície do tubérculo, que diminuem seu valor comercial ou impedem a comercialização. Diferentes espécies do gênero Streptomyces são causadoras dessa doença e o levantamento das espécies patogênicas presentes em regiões produtoras do Brasil é um fator primordial para a realização de medidas de manejo. O presente trabalho teve por objetivo a caracterização de 57 linhagens de Streptomyces, consideradas possíveis novas espécies associadas à sarna da batata no Brasil, por meio de taxonomia polifásica. Foi realizada a caracterização morfológica, bioquímica, patogênica (genes nec1, tomA e txtAB e testes de patogenicidade in vitro em rabanete e batata) e molecular (primers específicos para S. acidiscabies, S. scabiei e S. turgidiscabies, PCR-RFLP do gene atpD, análises de multilocus - genes atpD, gyrB, recA, rpoB, trpB e do gene 16S RNAr) das linhagens. Utilizando-se as técnicas de PCR-RFLP do gene atpD e análise de sequências dos genes atpD e rpoB as linhagens foram, inicialmente, separadas em 20 grupos genéticos (G1 a G20). Esses grupos apresentaram alta heterogeneidade com relação à morfologia da cadeia de esporos, à produção de pigmentos e ao aspecto e coloração das colônias e dos esporos, bem como na utilização de diferentes fontes de carbono. Das 57 linhagens analisadas, 24 (35,3%) apresentaram amplificação dos três genes de patogenicidade avaliados, seis (8,8%) não apresentaram nenhum dos genes e 38 (55,9%) apresentaram diferentes combinações com ausência de um ou mais genes. Todas as linhagens mostraram-se patogênicas ao rabanete causando sintomas de necrose, inchaço radial e/ou nanismo da parte aérea e raiz, no entanto, apresentaram diferenças no grau de virulência. As linhagens mais virulentas também foram avaliadas em testes de patogenicidade em fatias de batata e a agressividade das mesmas, determinada pela extensão e profundidade da necrose, foi dependente da cultivar testada, sendo que todas as variedades avaliadas foram suscetíveis. A relação filogenética das linhagens foi estabelecida junto às principais espécies de Streptomyces fitopatogênicas e a maioria dos grupos genéticos ficou alocada em ramos distintos e/ou com baixos valores de similaridade de sequências. O grupo G11 ficou filogeneticamente próximo de S. scabiei e suas genomoespécies e o G7 próximo de S. turgidiscabies/S. reticuliscabiei, porém, esses grupos não apresentaram amplificação com primers espécie-específicos e apresentaram características morfológicas diferentes. Os dados moleculares, associados às características morfológicas, bioquímicas e patogênicas das linhagens, permitiram a confirmação de que os grupos genéticos representam pelo menos 34 novas espécies de Streptomyces fitopatogênicas no Brasil. Os polimorfismos nas sequências do gene atpD permitiram o desenvolvimento de primers específicos para as espécies S. caviscabies/S. setonii (Cavis1F/Cavis4R) e S. scabiei (ScADF2/ScADR1). A especificidade desses primers foi confirmada em experimentos de amplificação utilizando-se DNAs de outras espécies de Streptomyces causadoras da sarna da batata. O nível de sensibilidade da técnica de PCR utilizando-se os primers Cavis1F/Cavis4R foi de 0,1 pg. Ainda, nas análises de AFLP, a combinação de primers E21/M16 foi selecionada como marcador molecular para estudos taxonômicos dentro do grupo de espécies de Streptomyces fitopatogênicas Abstract: Potato scab is a widespread disease in growing areas in Brazil, becoming a limiting factor in potato production. This disease affects potato quality due to injuries on the tuber surface decreasing its market value or precluding its commercialization. Several species of the genus Streptomyces causing potato scab are known and the survey of pathogenic species present in the Brazilian producing areas is the most important factor for performing management measures. This study aimed to characterize 57 strains of Streptomyces, considered possible new species associated with potato scab in Brazil, through polyphasic taxonomy. The morphological, biochemical, pathogenic (nec1, tomA and txtAB genes and in vitro pathogenicity tests on radishes and potatoes) and molecular characterization (species-specific primers for S. acidiscabies, S. scabiei and S. turgidiscabies, PCR-RFLP of atpD gene, multilocus sequence analysis of atpD, gyrB, recA, rpoB and trpB genes and 16S rRNA gene sequence analysis) of the strains were performed. Using PCR-RFLP of atpD gene technique and sequence analysis of atpD and rpoB genes, the strains were initially separated into 20 genetic groups (G1 to G20). These groups showed high heterogeneity in their spore chains morphology, pigment production and the appearance and color of the colonies and spores, as well as the utilization of different carbon sources. From a total of 57 strains evaluated, 24 (35.3%) showed presence of the three pathogenicity genes, six (8.8%) showed no amplification of the genes and 38 (55.9%) showed absence of one or more genes. All strains were pathogenic on radish causing symptoms of necrosis, radial swelling and/or stunting of shoot and roots, however, they showed differences in virulence level. The most virulent strains were evaluated in pathogenicity test on potato tubers slices and the aggressiveness of the strains, determined by the extent and depth of necrosis, was dependent on the cultivar of potato used, and all evaluated varieties were susceptible. The phylogenetic relationship of the strains has been established with respect to the main species of plant pathogenic Streptomyces and most groups were allocated in different branches and/or with low sequence similarity values. G11 group was closely related to S. scabiei and its genomospecies and G7 was allocated with S. turgidiscabies/S. reticuliscabiei, but they showed no amplification in experiments using species-specific primers and different morphological features were observed. The molecular data, associated with morphological, biochemical and pathogenic characteristics of the strains, allowed confirmation that these genetic groups represent at least 34 new species of phytopathogenic Streptomyces in Brazil. The polymorphisms in the atpD gene sequences allowed the development of species-specific primers for S. caviscabies/S. setonii (Cavis1F/Cavis4R) and S. scabiei (ScADF2/ScADR1). The specificity of these primers was confirmed by amplification experiments using DNA from other Streptomyces species causing potato scab. Sensitivity level of the PCR technique using the Cavis1F/Cavis4R primers was 0.1 pg. Further, in AFLP analyzes, E21/M16 primers set was selected as molecular marker for taxonomic studies within the group of plant pathogenic species of Streptomyces Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2011/02994-8

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Alessandra Alves de Souza Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Interações planta-patógeno possuem uma ampla participação de mecanismos moleculares que dirigem todo o processo de manutenção e disseminação do patógeno em seu hospedeiro. X. fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica com grande repercussão em importantes culturas agronômicas no mundo, como, por exemplo, na citricultura brasileira. Estudos acerca da compreensão dos mecanismos de patogenicidade de X. fastidiosa puderam ser melhor desenvolvidos após o sequenciamento do seu genoma, gerando novas informações e questionamentos em relação ao seu comportamento biológico e molecular. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo caracterizar a função da proteína VapD, acrônimo em inglês designado para virulence-associated protein D, produto da ORF XFb0051. Para tanto, foram utilizadas técnicas de imunodetecção por western blot para avaliação da expressão da proteína nos diferentes estágios de desenvolvimento do biofilme de X. fastidiosa, além de testes funcionais por meio de dicroísmo circular com desenovelamento térmico e testes de atividade de ribonuclease. Nossos resultados mostraram que VapD é uma proteína termoestável com atividade de ribonuclease, com maior expressão nas fases de maturação do biofilme, e de dispersão. Adicionalmente, VapD mostrou alta homologia estrutural com VapD de Helicobacter pylori. Simultaneamente foi realizado um estudo detalhado do perfil de secreção in vitro de proteínas de X. fastidiosa em diferentes estágios de formação do biofilme, e, adicionalmente, o perfil de secreção após ser submetida a uma dosagem subletal de tetraciclina, e também em meio contendo dosagem suplementar de cálcio (II). Nossos resultados mostraram um aumento do número de proteínas secretadas concomitante ao desenvolvimento do biofilme, podendo ser identificadas 50 proteínas na estirpe virulenta 9a5c e 48 na avirulenta J1a12, totalizando 74 diferentes proteínas em ambas as estirpes analisadas. Não houve diferença quantitativa sob uma dosagem subletal de tetraciclina, enquanto que sob uma suplementação com cálcio (II), houve considerável aumento da formação de biofilme e redução drástica de proteínas secretadas. Os resultados obtidos neste trabalho agregam informações inéditas acerca do comportamento biológico e molecular de X. fastidiosa, gerando subsídios para uma maior investigação referente ao seu complexo mecanismo de patogenicidade Abstract: A broad range of molecular mechanisms contributes to plant-pathogen interaction, driving the maintenance and spread of the pathogen within the host. Xylella fastidiosa is a plant pathogen bacterium responsible for economic losses in many different crops worldwide, such as citrus in Brazil. Based on genome sequence of X. fastidiosa, new approaches may enable a better understand of its biological and molecular behavior. Therefore, this work aimed to characterize the function of VapD protein, acronym of virulence-associated protein D, ORF XFb0051. So, were used immunodetection assay by western blot for quantification of its relative expression levels in X. fastidiosa biofilm stages, and functional assays from circular dichroism unfold-refolding, and ribonuclease activity test. The results showed that VapD is a thermostable protein with ribonuclease activity, and higher expression in mature biofilm and dispersion stages. In addition, VapD showed high structural homology to VapD from Helicobacter pylori. At the same time a detailed study of the protein secretion profile in vitro of proteins of X. fastidiosa at different stages of biofilm formation was carried out. Additionally, a thorough analysis of the proteins secreted by X. fastidiosa was performed after treatment with a subinhibitory dosage of tetracycline and in media supplemented with calcium (II). The results showed an increase in secreted proteins concomitant with biofilm development, and identified 50 proteins from 9a5c virulent and 48 proteins from J1a12 avirulent strains, totaling 74 non-redundant proteins. There was no quantitative difference in response to subinhibitory concentrations of tetracycline, while the calcium (II) supplementation increase biofilm formation and decrease drastically the secreted proteins. The results of this study add new information about the biological and molecular behavior of X. fastidiosa, generating basis for the further research about its complex mechanism of pathogenicity Doutorado Genética de Microorganismos Doutor em Genética e Biologia Molecular CAPES

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Sindélia Freitas Azzoni Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Buscando contribuir com o desenvolvimento da tecnologia de produção do etanol de segunda geração, o presente estudo analisa o transcriptoma de T. harzianum IOC-3844 utilizando técnicas de sequenciamento high-thoughput. O principal objetivo dessas análises foi identificar, caracterizar e catalogar os transcritos expressos por T. harzianum relacionados com a degradação de substratos complexos, como o bagaço de cana de açúcar, revelando o conjunto de genes envolvidos na degradação da biomassa. A análise do transcriptoma do fungo Trichoderma harzianum sob condições que induzem a degradação da biomassa permitiu a identificação de sequências de genes potencialmente eficazes no processo de biodegradação, uma etapa essencial à compreensão do processo de hidrólise enzimática. O sequenciamento resultou em 246 milhões de sequências com 72 pb, o que corresponde a 14,7 GPB analisados. Após a montagem , 32.494 contigs foram gerados, submetidos à identificação e classificados de acordo com sua identidade. Todas as sequências de contigs foram comparados com o banco de dados do NCBI, Gene Ontology (GO terms), Enciclopédia de Genes Kyoto (KEGG), Carbohydrate Active-Enzymes (CAZYmes). Foram identificados 487 CAZymes no transcriptoma, inclusive aquelas ligadas as reações químicas de despolimerização de celulose e hemicelulose. As sequências classificadas como atividade catalítica (6.975) e atividade reguladora (143) podem estar envolvidas com esse tipo de reação.A análise permitiu definir o principal conjunto de genes envolvidos na degradação da celulose e de hemicelulose do T. harzianum , e genes acessórios relativos à despolimerização de biomassa. Uma análise dos níveis de expressão permitiu determinar os conjuntos de genes diferencialmente expressos em diferentes condições de cultivo. Os resultados obtidos acrescentam conhecimento sobre a constituição do genoma, as atividades de expressão gênica do fungo Trichoderma harzianum e fornece informações importantes a respeito dos mecanismos genéticos de degradação de biomassa que o fungo utiliza. As informações obtidas poderão ser utilizadas para outras espécies de fungos filamentosos com potencial para a biodegradação Abstract: In order to contribute to the development of second-generation ethanol technology, this study analyzes the transcriptome of T. harzianum IOC-3844 using high-thoughput sequencing techniques. The main objective of this analysis was to identify, characterize and catalog the transcripts expressed by T. harzianum related to the degradation of complex substrates such as sugar cane bagasse, revealing the set of genes involved in the degradation of biomass. The analysis of the transcriptome of the fungus Trichoderma harzianum under conditions that induce the degradation of biomass allowed the identification of genes potentially effective in the biodegradation process, an essential step for understanding the enzymatic process. Sequencing resulted in 246 million sequences with 72 bp, which corresponds to 14.7 GBP analyzed. After assembly, 32,494 contigs were generated, identified and classified according to their identity. All sequence contigs were compared with NCBI database, Gene Ontology (GO terms), Kyoto Encyclopedia of Genes (KEGG), Carbohydrate Active-Enzymes (CAZYmes). 487 CAZymes were identified in the transcriptome, including those related to reactions of cellulose and hemicellulose depolymerization. Sequences classified as catalytic activity (6,975) and regulatory activity (143) may be involved with this type of reaction. This analysis define the set of genes involved in the degradation of cellulose and hemicellulose of T. harzianum, and accessories genes related to depolymerization of the biomass. An analysis of expression levels was used to calculate the set of differentially expressed genes in different culture conditions. The results add to knowledge about the composition of the genome and gene expression activity of the fungus Trichoderma harzianum, and provides important information regarding the genetic mechanisms of biomass degradation that the fungus uses. The information obtained may be used for other species of filamentous fungi with potential for biodegradation Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Marta Cristina Teixeira Duarte Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A castanha do Brasil (Bertholletia excelsa H.B.K.) é a segunda mais importante fonte extrativista da floresta amazônica. Desta forma, não são utilizados defensivos químicos e a produção da castanha do Brasil é considerada orgânica tendo sua extração ambientalmente correta, porém este baixo nível tecnológico favorece o crescimento de fungos potencialmente produtores de micotoxinas como os do grupo Aspergillus section flavi. Visando reduzir esta contaminação, uma das possibilidades é a utilização de óleos essenciais, que apresentam propriedades antimicrobianas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antifúngica de 11 óleos essenciais de espécies medicinais e aromáticas sobre cepas aflatoxigênicas de A. flavus, A. nomius e A. arachidicola isoladas de castanha do Brasil. O ensaio de microdiluição mostrou que os óleos que apresentaram melhor atividade antifúngica contra estes os isolados foram Cinnamomum burmannii e Eugenia caryophyllata, com MIC de 250 'mu'g/mL e 500 'mu'g/mL, respectivamente. A inibição do crescimento micelial dos fungos foi melhor quando estes foram submetidos à ação por contato com os óleos essenciais, do que por ação de seus compostos voláteis, sendo as concentrações referentes às de MIC capazes de inibir totalmente o crescimento dos fungos. A produção de aflatoxina por A. flavus foi inibida somente pelo óleo essencial de E. caryophyllata, na concentração de 500 'mu'g/mL. Ensaios in vivo conduzidos com a casca da castanha do Brasil mostraram que o óleo essencial de C. burmannii inibiu o fungo a 500 'mu'g/mL e propiciou maior redução na porcentagem de infecção pelos isolados de A. flavus. Quanto aos isolados de A. nomius e A. arachidicola, a menor porcentagem de infecção foi obtida após tratamento com o óleo essencial de E. caryophyllata na concentração de 1000 'mu'g/mL. Os óleos de E. caryophyllata e C. burmanni mostraram ser alternativas naturais para controle do crescimento de A. flavus, A. nomius e A. arachidicola e da produção de aflatoxinas por A. flavus, através da ação na redução da contaminação fúngica das castanhas do Brasi Abstract: The Brazil nut (Bertholletia excelsa H.B.K.) is the second most important forest source of the Amazon rainforest. Thus, no chemical pesticides are used and the production of Brazil nuts is considered organic and an environmentally friendly extraction. However, this low technological level favors the growth of potentialy mycotoxin producing fungi such as Aspergillus section flavi. In order to reduce this contamination, one possibility is the use of essential oils that exhibit antimicrobial properties. The objective of this study was to evaluate the antifungal activity of 11 essential oils of medicinal and aromatic species on aflatoxigenics strains of Aspergillus flavus, A. nomius and A. arachidicola isolated from Brazil nuts. The microdilution assay showed that the oils from Cinnamomum burmannii and Eugenia caryophyllata presented the best antifungal activity against all isolates, with MIC of 250 'mu'g/mL and 500 'mu'g/mL, respectively. The inhibition of mycelial growth of the fungi was better when submitted to action by contact than by action of oils volatile compounds, with concentrations of MIC able to completely inhibit the growth of fungi. The aflatoxin production was inhibited only by E. caryophyllata essential oil at a concentration of 500 'mu'g/mL . In vivo assays conducted with shells of Brazil nut showed that the essential oil of C. burmannii at 500 'mu'g/mL provided greater reduction in the percentage of infection by A. flavus isolates. As the isolates of A. nomius and A. arachidicola, the infection rate was lower after the treatment with the essential oil of E. caryophyllata in the concentration of 1000 'mu'g/mL. The essential oils of E. caryophyllata and C. burmannii showed to be natural alternatives for controlling the growth of A. flavus, A. nomius and A. arachidicola and aflatoxin production by A. flavus, through the reduction of the fungal contamination of Brazil nuts Mestrado Ciência de Alimentos Mestra em Ciência de Alimentos