Search

İmplantasyon başarısızlığı patogenezi nedenlerinden olabileceği düşünülen ER stresinin implantasyondaki rolü henüz tam olarak ortaya konmamıştır. İmplantasyon penceresinin bileşenlerindeki moleküler mekanizmalar ve buradan yola çıkarak öncelikle embriyonun trofoektoderm hücrelerinin ER stresindeki moleküler değişikliklerinin aydınlatılması gerekmektedir. Bu tez çalışmasında insan trofoektoderm hücre hattı 2 boyutlu ve 3 boyutlu sferoid hücrelerinde endoplazmik retikulum ve kalsiyum üzerinden oluşturulan ER stresinin, hücre içi dinamiklerine ilişkin olarak ER stres, apoptoz, otofaji, hücre iskeleti, hipoksi, adezyon molekülleri mekanizmaları özelinde oluşturulan panellerde gen ekspresyon analizleri RT-qPCR ve aktif genlerle ilişkilendirilecek proteinlerin analizleri için immunfloresan boyama yöntemlerinden yararlanılarak araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada insan trofoektoderm hücreleri HTR-8/SVneo hücre hattı ile temsil edilerek 2 boyutlu ve insan embriyosundaki trofoektoderm tabakasındaki yapıyı taklit etmek amacıyla hücreler sferoid halinde kültür edilerek 3 boyutlu sferoid hücre kültürlerinde kontrol ve ilaç deney grupları oluşturuldu. Deney gruplarına ER stresi oluşturmak amacıyla Thapsigargin uygulama dozunu belirlemek için farklı doz ve saatlerde MTT, Tripan mavisi, Muse hücre canlılık analizleri yapıldı. 2 ve 3 boyutlu kontrol ve deney gruplarında gen ekspresyon analizleri için belirlenen 6 panelde 21 gen ifadelenmelerindeki değişim gerçek zamanlı RT-qPCR yöntemi gerçekleştirildi. Aktif genlere ilişkin protein analizleri için belirlenen 8 antikor immunfloresan boyama yöntemi ile boyanarak 2 ve 3 boyutlu örneklerin floresan mikroskop görüntüleri Image J programı ile değerlendirildi. Sonuç olarak, Thapsigargin’in HTR-8/SVNeo hücrelerinde endoplazmik retikulum kalsiyum homeostazını etkileyerek ER stres oluşumuna yol açtığı; oluşan ER stresin 2 ve 3 boyutlu hücrelerde davranış farklılıkları ortaya çıkararak apoptoz ve otofaji gibi sağkalım mekanizmalarında değişiklikler meydana getirdiği, hipoksi mekanizmasını etkilediği, hücre iskeleti ve hücre adezyon moleküllerinde hücre-hücre etkileşimlerinde değişikliklere yol açtığı saptanmıştır. Bu çıktılar doğrultusunda Thapsigargin ile hücre içi kalsiyum homeostazındaki değişikliklere bağlı olarak oluşan ER stresi insan trofoektoderm hücrelerindeki hücre içi dinamikler aydınlatılmış olup terapötik hedef moleküllerin implantasyon başarısını arttırabileceği düşünülmektedir., Endoplasmic reticulum stress is thought to be one of the causes of implantation failure pathogenesis and its role in implantation has not yet been fully lighted up. Molecular mechanisms in all components of the implantation window, based on this especially the molecular changes in ER stress of the trophectoderm cells of the embryo, should be clarified. In this thesis study, human trophectoderm cell line gene expression analyzes in panels created specifically for the mechanisms of ER stress, apoptosis, autophagy, cytoskeleton, hypoxia, adhesion molecules related to the intracellular dynamics of ER stress generated through endoplasmic reticulum and calcium channels in 2-dimensional and 3-dimensional spheroid cells RT-qPCR and proteins to be associated with active genes by using immunfluorescent staining methods. In this study, control and drug experimental groups were formed in 2-dimensional in the HTR-8/SVneo cell line representing human trophoectoderm cells and in 3-dimensional spheroid cell cultures that cultured as spheroids to mimic the structure in the trophectoderm layer of the human embryo. MTT, Trypan blue, Muse cell viability analyzes were performed at different doses and times to determine the application dose of Thapsigargin, which was administered to experimental groups to create ER stress. Real time RT-qPCR method was performed to change 21 gene expressions in 6 panels determined for gene expression analysis in 2 and 3-dimensional control and experimental groups. Eight antibodies determined for protein analysis for active genes were stained by immunofluorescent staining method. Fluorescence microscope images of 2 and 3- dimensional samples were evaluated with Image J program. As a result, it was found that Thapsigargin caused ER stress creation by affecting endoplasmic reticulum calcium homeostasis in human trophectoderm HTR-8/SVneo cells; the resulting ER stress caused changes in the survival mechanisms such as apoptosis and autophagy by revealing behavioral differences in 2 and 3-dimensional cells, affected the mechanism of hypoxia, and caused changes in the cell-cell interactions in the cytoskeleton and cell adhesion molecules. In line with the outcomes of this thesis project, the intracellular dynamics in ER stress human trophectoderm cells caused by changes in intracellular calcium homeostasis with Thapsigargin, and it is thought that therapeutic target molecules can increase the success of implantation.

Günümüzde canlı doğum, gebelik şansı ve implantasyon oranını belirleyici blastosist morfolojik parametreleri halen tartışmalıdır. Embriyo morfolojik parametreleri ile transferi sonrası klinik sonuçlar arasındaki ilişki henüz tam olarak anlaşılamamış ve fikir birliği oluşmamıştır. Bu amaçla iyi kalite embriyo seçiminde objektif olarak kullanılabilecek kantitatif bazı morfolojik parametrelerin implantasyon ve klinik sonuçları belirlemedeki etkinliğini değerlendirebilmek amacı ile; bu çalışmada blastosist ve blastosöl çevre ve alan hesaplamaları, trofoektoderm (TE) hücre sayısı ve iç hücre kitlesi (ICM) alanının implantasyon üzerine etkileri değerlendirilmiştir. Çalışmanın temel bulgusu blastosist transferi ardından, implantasyon ve sonrasında devam eden klinik gebelik oranının; embriyo kalite skoru, blastosist alan ve çevresi, blastosöl alanı, çevresi ve TE hücre sayısı ile ilişkili olduğudur. Embriyo ICM alan ve çevresi, dairesellik indeksi ve ZP kalınlığının, klinik gebelik oranları üzerinde etkin olmadığı sonucuna varılmıştır. Today, morphological parameters of blastocyst that determine live birth, chances of pregnancy and implantation are still controversial. The relationship between morphological parameters of embryo and clinical outcomes after embryo transfer is not yet fully understood and there is no consensus. In our study, we aimed to evaluate the effectiveness of some quantitative morphologic parameters (blastocyst and blastocyte diameter and area, trophectoderm cell number and inner cell mass area) that could be utilized objectively in selecting good quality embryos for implantation and clinical outcome. The main finding of our study was that the rate of ongoing implantation and clinical pregnancy was associated with embryo quality score; blastocyst area/diameter; blastosol area/diameter and the number of TE cells. The results showed that the ICM area/diameter, ICM roundness index and ZP thickness were not effective on clinical pregnancy rates.