Search

Giriş ve Amaç: Kan yoluyla bulaşan infeksiyon etkenlerinin geçişi sağlıklı görünen kan vericilerinden yapılan infekte transfüzyonlar sonucunda olmaktadır. Kan ve kan ürünlerinde güvenlik, sağlıklı kan verici seçimi ile başlar. Uygun kan verici seçiminden sonra kan yoluyla bulaşan infeksiyon etkenlerini aramaya yönelik testler uygulanır. Kan yoluyla bulaşan infeksiyon etkenleri arasında görülme sıklığı ve neden olduğu hastalıklar hepatit B virüsünü (HBV) önemli kılmaktadır. Hepatit B virüsü yüzey antijeni (HBsAg) prevalansı kan vericilerinde %0,1 ile %25 arasında değişmektedir. Kan merkezlerinde kullanılan serolojik testlerin duyarlılığının arttırılmasına rağmen ?güvenli kan? için 2006 yılından sonra transfüze edilecek kana HBV'yi saptayan nükleik asit testi (NAT) uygulamaları gündeme gelmiştir. Pencere dönemi dışında HBsAg negatif ve kronik HBV tanısı almayan gizli HBV infeksiyonunun tanısını HBV nükleik asit testi (NAT) sağlamaktadır. Ayrıca NAT ile yapılan çalışmalarda küçük havuzlarda NAT (MP-NAT)'ların duyarlılığının düşük olması nedeniyle tek tek örneklere uygulanan NAT (ID-NAT) uygulamaları ön plana gelmiştir.Bu çalışmada MP-NAT'a göre duyarlılığı daha yüksek olan ID-NAT ile HBsAg negatif kan vericilerinin araştırması planlanmıştır. Ayrıca ülkemizde uygulanmakta olan kan vericisi tarama testlerinin yeterli olup olmadığı, ülkemiz koşullarını da dikkate alarak yeni bir düzenleme getirilip getirilemeyeceğini irdelemek ve olası yeni bir algoritma oluşturulmasına katkıda bulunabilmek amaçlanmıştır.Gereç ve Yöntem: Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi (EÜTF) ve Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi (MÜTF) Sağlık Araştırma Uygulama Hastanesi Kan Merkezi'ne Nisan 2010 ile Ocak 2011 tarihleri arasında başvuran 18-65 yaş arası (ortalama: 35,6 yıl), toplam 4352 HBsAg negatif gönüllü kan vericisi çalışmaya alındı. Kan vericilerinin 1971'i EÜTF Kan Merkezi'nden, 2381'i MÜTF Sağlık Araştırma Uygulama Hastanesi Kan Merkezi'nden toplandı. Kan vericilerinin örneklerinde HBV-DNA'yı saptamak amacıyla gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) testi uygulandı. Çalışmada QCMD kalite kontrol örnekleri aynı test ve farklı test ile çalışıldı.Bulgular: 4352 kan vericisinin plazmalarına gerçek zamanlı PCR yöntemi ile HBV-DNA araştırılması sonucunda iki pozitif sonuç bulundu. İki pozitif sonuç aynı yöntemle iki kez ve farklı alternatif yöntemlerle doğrulamak amacıyla tekrarlandı. Tekrarlanan örneklerin negatif bulunması sonucunda örneklerin tümünde HBV-DNA negatif olarak değerlendirildi.Tartışma: Bu çalışmada HBsAg negatif bulunan 4352 kan vericisinde başlangıçta iki adet pozitiflik saptanmış ancak aynı yöntemle ve alternatif diğer yöntemlerle pozitiflikleri doğrulanamamıştır. Bu yüzden örneklerin tümü negatif olarak kabul edilmiştir. Ancak gizli HBV olgularının çoğunluğunda, örneklerde DNA pozitiflikleri düşük düzeyde bulunmaktadır. Bu çalışmada pozitif bulunan örneklerde de düzeyler düşüktür. Bu örneklerin tekrar pozitif bulunması olasılığı da bu nedenle düşüktür. Günümüz verileri değerlendirildiğinde HBV ülkemiz kan merkezlerinde öncelikli sağlık sorunudur. Ülkemizde NAT uygulamalarına geçmeden önce transfüzyon biliminin güvenliği açısından Ulusal Sağlık politikalarında önceliklerin belirlenmesi önemlidir. Introduction and aim: Transfusion transmitted infection agents are caused by infected transfusions from apparently healthy blood donors. Safety on blood and blood products starts with the determination of a healthy blood donor. The basic and most important key to attain a safe blood is the careful selection of blood donors. Following the selection of an appropriate donor, tests are conducted to look for blood transmitted infection factors. Diseases and the frequency it is spotted among the agents for blood transmitted infections make hepatitis B virus (HBV) further important. Rates of HBV surface antigen (HBsAg) prevalence may greatly vary from %0,1 to %25 among blood donors. HBV-NAT enables detection of HBsAg negative occult HBV infections outside the window period. It is also apparent that the sensitivity of mini-pool NAT (MP-NAT) is insufficient, so individual NAT (ID-NAT) technics have come into prominence. It is important to acknowledge that HBsAg screening on donors with occult HBV infections do not suffice in terms of safe transfusionIn our study we aimed to explore HBsAg negative blood donors through individual NAT (ID-NAT), which has a higher sensitivity level with respect to MP-NAT. This study also aims to reveal whether donor screenings are sufficent, whether new regulations are viable considering the conditions of our country, and to make contributions for a possible new algorithm.Material and Method: Study was conducted with a total of 4352 HBsAg negative volunteer-donors between the ages of 18-65 (mean 35,6 years), admitted to the Blood Transfusion Center of Ege University Faculty of Medicine (EUTF) and Mersin University Faculty of Medicine (MUTF) Medical Research and Application Hospital between April 2010 and January 2011. 1971 of the donors were collected from Blood Transfusion Center of EUTF, while 2381 from the latter. Donors were tested with realtime polymerase chain reaction (RT-PCR). QCMD quality control samples were studied with the same test and different test.Results: Following HBV-DNA screening of the plasmas from 4352 donors through RT-PCR, two positive results were found. The test was repeated on the two positive samples with both the same method and with an alernative method. Repeated tests resulted negative, therefore all the samples were thought to be negative.Discussion: In this study, out of 4352 blood donors with HBsAg negative, an early detection of two positivity was achieved, however the repetition of the same test and alternative tests failed to verify positivity. As a result, we detected no positivity in our samples. However, DNA positivities in the majority of cases diagnosed as occult HBV infection have low levels of positivity. In this study, our positive samples also displayed low levels. Therefore, the probability of finding positivity again in these samples is very low.Recent data show that HBV stand out as a primary health issue in the blood transfusion centers in our country. It is imperative that priorities should be determined in the national health policies in terms of reliability of transfusion as a science before proceeding to NAT applications in our country. 72

ÖZET Yüksek Lisans Tezi SERİN ALKALİ PROTEAZ ENZİMİNİN HÜCREİÇİ ÜRETİMİNİ KONTROL EDEN ALANIN- VE SERİN-GRUBU AMİNO ASİTLERİN ENZİM ÜRETİMİNE ETKİSİ Arzu BAYRAM Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman : Prof.Dr. Tunçer H. ÖZDAMAR Eş-Danışman : Doç. Dr. Pınar ÇALİK Serin alkali proteaz (SAP) üretiminde subC içeren plasmid pHV1431 taşıyan rekombinant Bacillus licheniformis ile SAP sentezinin hücreiçi üretimini kontrol eden alanin grubu amino asitlerin.alanin (Ala), lözin (Leu), valin (Val)- ve serin grubu amino asitlerin -serin (Ser), glisin (Giy), sistein ( Cys)- SAP üretimine etkisinin belirlenmesi amacıyla farklı ekleme zamanlarında ve Caa-0-15 mM derişim aralığında etkileri incelenmiştir. Ala, Ser ve Leu SAP aktiviteyi artırmazken, üretim ortamına t=0 st'te eklenen Cvıi=7.5 mM valin, Coiy=7.5 mM glisin ve Ccy,=0.004 mM sistein SAP aktivitesini sırasıyla 1.24 kat, 1.14 kat ve 1.13 kat arttırmıştır. Optimum derişimleri bulunan Val, Giy ve Cys'in tekli, ikili ve üçlü kombinasyonlarının SAP verimine ve seçimliliğine, ürün ve yan-ürün dağılımlarına ve hücreiçi metabolit derişimlerine (amino asitler, organik asitler, toplam protein, RNA, DNA) etkileri programın ikinci evresinde araştırılmıştır. Hücreiçi metabolit derişimlerinin belirlenmesi amacıyla da yöntem geliştirilmiş ve belirtilen üretim ortamlarında proses süresince birim hücre basma hücreiçi metabolit derişimlerinin kalma süresiyle değişimleri incelenmiştir. 183 bileşiğin yeraldığı 236 tepkime ile tanımlanan hücreiçi tepkime sistemi için kütle-korunum temelli matematik model kurulmuş; referans ortam ile SAP üretimini kontrol eden Val, Giy, ve Cys eklenmiş hücreiçi ve biyoreaktör üretim ortam verileri kullanılarak denklem sistemi çözülmüştür. SAP üretimini kontrol eden üç amino asitin hücreiçi tepkime hızlarına etkisi bulunmuştur. Hücreiçi ölçümlerin başarılması sonucunda, metabolik yolizi analizinde yapılan hücreiçi bileşikler için yapılan yaklaşık yatışkın koşul varsayımının doğruluğu ve etkisi sulanmıştır. Genetik mühendisliği araştırma programı kapsamında ise B.subtilis 168 'e ve sistein üretme potansiyeli olmayan B.subtilis 31 (cys')'e ve B.subtilis 97(cys`) 'e pHV1431.:ı»6C geni transfer edilmiş ve geliştirilen recombinant mikroorganizmalar kullanılarak başlangıç sistein derişiminin SAP aktivitesine etkisi araştırılmış ve Ccy,=0.06 mM derişiminde sisteinin SAP aktivitesini 1.71 kat artırdığı belirlenmiştir. R-B.subtilis 168 'de kullanıldığında ise, üretim ortamına eklenen aynı derişimlerdeki sisteinin aktiviteyi azalttığı bulunmuştur. 2002: 241 sayfa ANAHTAR KELİMELER: Serin alkali proteaz üretimi, rekombinant Bacillus, kontrol eden amino asitler, hücreiçi metabolit derişimleri, amino asitler, organik asitler, metabolik yolizi mühendisliği. ABSTRACT Master Thesis EFFECTS OF CONTROLLING ALANINE AND SERINE GROUP AMtNO ACIDS ON SERINE ALKALINE PRODUCTION Arzu BAYRAM Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor Professor Tunçer H. ÖZDAMAR Co-Supervisor : Associate Professor Pınar ÇALIK The effects of concentration and addition time of alanine- and serine- group amino acids on serine alkaline protease (SAP) production in order to determine the controlling amino acids of SAP synthesis were investigated by using recombinant Bacillus licheniformis carrying subC gene encoding SAP enzyme. Although SAP activity of t-B. licheniformis did not change with the addition of alanine, serine and leucine; nevertheless, SAP activity was enhanced in each enriched bioprocess medium containing 7.5 mM valine, 7.5 raM glycine and 0.004 mM cysteine, which increased the SAP activity, respectively, 1.24-, 1.14- and 1.13-fold. The effects of valine, glycine, and cysteine concentrations on glucose consumption rate, microorganism concentration, SAP activity, SAP concentration, intracellular and extracellular amino acids, organic acids concentrations, RNA and DNA concentrations were investigated in batch bioreactors having working capacities of 1 10 cm3. Further, methods for intracellular metabolite concentrations were developed; and, the variations in the concentrations of the intracellular metabolites were determined with respect to cultivation time in enriched three bioprocess media and the reference medium. Thereafter, the mass-flux balance based stoichiometric model for the bioreaction network that includes 236 reactions and 183 metabolites were developed; and then solved using the intracellular concentration data together with the batch-bioreactor medium concentration measurements. The intracellular reaction fluxes for the three amino acid substituted bioreactor media were determined and compared. With the use of the concentrations of the intracellular components and their time derivatives, the relevance of the pseudo-steady state assumption in the metabolic pathway analysis without the intracellular data was also evaluated. On the other hand, pHV143 1 241