Search

The objective of the present study was to transfer sheep embryos produced in vitro to recipient ewes. Ovaries were taken from slaughtered Kıvırcık ewes and transferred to the laboratory in phosphate buffered saline (PBS) at 30-35 ºC. The cumulus-oocyte complexes were obtained by slicing and washing 1-6 mm diameter follicles and matured for 24 h in medium 199 supplemented with sodium pyruvate, follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and 10% fetal calf serum (FCS) at 38.5 ºC under 5% CO2 in humidified atmosphere. Fresh semen was collected from three Kıvırcık rams, pooled and prepared for in vitro fertilization by the percoll-gradient method. Matured oocytes were transferred into synthetic oviduct fluid (SOF) based fertilization medium supplemented with 2% sheep oestrous serum (SES) and co-incubated with semen (0.8 x 106 spermatozoon/ml) for 20-21 h. After fertilization, presumptive zygotes were transferred into SOF medium and incubated for 8 days under an atmosphere of 5% CO2, 5% O2 and 90% N2 at 38.5 ºC. Glucose (1.5 mM) was added to the culture medium on day 4. In culture, embryos were checked for cleavage and embryo development on days 4 and 8, respectively. A total of 534 oocytes were inseminated in vitro, 407 (76.2%) cleaved, and 119 (29.2%) and 69 (16.9%) reached the morula and blastocyst stages, respectively. Forty days after the transfer of 40 blastocysts into the uteri of 17 recipient ewes, pregnancy was detected in 10 ewes (58.8%) by ultrasonography and 7 ewes gave birth to 8 live lambs. The other 3 ewes, which had 7 fetuses, could not have live offspring. According to the transferred embryos, the implantation rate was 37.5% and the live lamb rate was 20.0%.

8. Özet Çalışmada, ilk aşama olarak mezbaha materyali koyun ovaryumlarından kazanılan oositlerin in vitro oyunlaştırılması ve in vitro fertilizasyonu ile elde edilen embriyoların blastosist dönemine kadar in vitro kültüründe ko-kültürün; ikinci aşama olarak ise bu in vitro üretilen embriyoların vitrifikasyon yöntemi ile dondurulmasında iki farklı dehidrasyon sisteminin etkilerini ortaya koymak amaç edinilmiştir. Araştırmanın ilk bölümünde mezbahada kesilen koyunların ovaryumlarından elde edilen oositler (n= 3705) olgunlaştırma medyumu içerisinde (Hepes tamponlu, Na piruvat, LH, FSH ve FCS ilaveli TCM-199), 38.5°C ısı ve atmosfer havasında %5 CC^'in sağlandığı ortamda 24 saat inkübe edildi. Olgunlaştırmayı takiben %2 SES ilaveli, bikarbonat tamponlu SOF içerisine alınan oositler (n=3159) üzerine, percoll-gradient yöntemi ile hazırlanan taze koç sperması (0,8-1x1 06 spermatozoon/ml) ilave edilerek aynı şartlarda 20 saat inkübe edildi. Koyun embriyolarının in vitro üretilmesinde ko-kültürün etkilerini araştırmak amacıyla fertilizasyonu takiben oositler iki gruba ayrıldı ve SOF medyumu içerisinde ko-kültüre (n=1485) ve kültüre (n=1535) (38.5°C ısı ve %5 CO2, %5 O2, %90 N2'in sağlandığı ortamda) edildi. Ko-kültür grubunda kültür ortamına koyun ovidukt epitel hücreleri ilave edildi. Ko-kültür ve kültür gruplarına göre sırasıyla %74,20 (1102/1485) ve %75,17 (1154/1535) yarıklanma, %17,05 (188/1102) ve %14,38 (166/1154) blastosist oranları elde edildi. Gruplar arasındaki farklar istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0.05). Çalışmanın vitrifikasyon bölümünde, in vitro ko-kültür ve kültür ile elde edilen blastosistler tekrar ikişer alt gruba ayrıldı ve 1. ekilibrasyon solüsyonu olarak 1. alt gruplarda (n=157; ko-kültür=87, kültür=70) %20 etilen glikol, 2. alt gruplarda ise (n=159; ko-kültür=87, kültür=72) %10 gliserol içerisinde 5 dakika ve daha sonra 2. ekilibrasyon solüsyonu (alt grupların tümünde %20 EG + %10G) içerisinde 5 dakika bekletildikten sonra vitrifikasyon solüsyonuna (grupların tümünde %25 EG + %25 G) alındı ve en fazla 30 saniye tutulduktan sonra payetlere yerleştirilerek sıvı nitrojene daldırıldı. Vitrifikasyon ve ekilibrasyon medyumlarında temel solüsyon olarak, %15 FCS, 0,3 mM Na piruvat ve 5,5 mM glikoz içeren PBS solüsyonu kullanıldı ve tüm işlemler oda ısısında gerçekleştirildi. Dondurulan embriyolar 2-10 ay süre ile sıvı azotta saklandıktan sonra çözündürülüp in vitro kültüre edilerek, kullanılan prosedürlerin embriyo yaşama kabiliyeti üzerindeki etkisi incelendi. Eritme işlemi, payetler 20°C'lik su banyosunda 15-20 saniye tutulduktan sonra payetin içeriği boş bir petriye boşaltılıp 5 dk. beklenerek yapıldı ve embriyolar 0,25 M sukrozda 5 dk. daha bekletildikten sonra iki kez HSOF medyumu ile yıkandı ve SOF medyumu içerinde kültüre alındı. Dondurma-eritme sonrası 24 saatlik kültürü takiben, ko- kültür grubunda (1. ve 2. dondurma gruplarına göre) sırasıyla %38,35 ve %39,28 (p>0,05); kültür grubunda (1. ve 2. dondurma gruplarına göre) ise sırasıyla %62,12 ve %30,15 oranında (p0.05). At the vitrification stage of the study, blastocysts produced by in vitro co- culture and culture were again divided into two subgroups and placed for 5 minutes in 20% ethylene glycol in the first subgroups (n=157, co-culture=87, culture=70) and in 10% glycerol in the second subgroups (n=157, co-culture=87, culture=72) as the first equilibration solution. In all the subgroups, blastocysts were then kept for 5 minutes in 20% EG + 10% G as the second equilibration solution and after 30 sec in vitrification solution (25% EG + 25% G), they were placed into plastic straws and immersed into liquid nitrogen. PBS solution containing 15% FCS, 0.3 mM Na pyruvate and 5.5 mM glucose was used as the basic solution in the vitrification and equilibration media and all procedures were done at room temperature. Frozen embryos were kept in liquid nitrogen for 2-10 months, then thawed and in vitro cultured to observe the effects of the vitrification procedures on the embryos survival. For thawing, the straws were immersed into a water bath at 20°C for 15-20 seconds, and then the content of the straw was emptied into a petri dish. After 5 minutes, the embryos were transferred to 0.25 M sucrose for another 5 minutes and washed twice with HSOF medium. Frozen-thawed embryos were cultured in SOF medium for 24 hours and in the co-culture group (according to 1. and 2. freezing subgroups) 38.35% and 39.28% (p>0.05); and in the culture group (according to 1. and 2. freezing subgroups) 62.12% and 30.15% viability rates (pO.001) were observed, respectively and the difference among the groups was statistically significant. In the first vitrification group, the difference between the viability rates (co-culture: 38.35%; culture: 62.12%) was also significant statistically (p