Search

Amaç: AML12 hepatosit hücre hattında kolesterol ile indüklenen lipit birikiminde Seipin proteinin ER stres ve lipofaji üzerine etkisinin detaylı araştırılmasıdır. Kolesterol ile indüklediğimiz yağlı karaciğer hastalığı in vivo modelinde lipit birikimi, inflammasyon ve Seipin protein düzeylerinin belirlenmesidir.Gereç ve Yöntem: In vivo deneylerde 2-4 aylık erkek albino tavşanlar kontrol (normal yem ile beslenen) ve kolesterol (%2 kolesterol içeren yem ile beslenen) olmak üzere iki gruba ayrıldı. Elde edilen gruplardan sekiz haftanın sonunda kan örnekleri ile karaciğer dokuları toplandı ve dokular makroskopik olarak incelenirken TGF-β, IL1β mRNA ekspresyonları qPCR tekniği ile Seipin protein düzeyleri ise immunblotlama tekniği ile belirlendi. Çalışmamızın ikinci aşamasında hepatosit hücrelerine Seipin siRNA transfeksiyonu takiben Lipozom-Kolesterol uygulanması gerçekleştirildi ve qPCR tekniği ile ER stres ile ilişkili GRP78, GRP94 ve ATF4 belirteçlerinin mRNA seviyeleri, Bodipy boyama ile LD sayı/boyut farklılıkları ve immünfloresans yöntemi ile LD-LAMP1 kolokalizasyonu belirlendiBulgular: Kolesterol ile beslenen tavşanların karaciğer dokularında nodüler yapılar gözlenirken lipit birikiminin, IL1 β mRNA ve Seipin protein seviyelerinin arttığı TGF-β mRNA seviyelerinin azaldığı ise tespit edildi. Bununla birlikte, AML12 hücrelerine 8 saat boyunca Lipozom-Kolesterol uygulamasının kolestrol brikimi, Seipin protein aktivasyonu ve büyük LD sayısını arttırdığı gözlendi. Seipin siRNA uygulamasının hem taşıyıcı hemde Lipozom-Kolesterol grubunda büyük LD saysını ve GRP78 mRNA seviyelerini azalttığı tespit edildi.Sonuç: In vivo da yüksek kolesterolün lipit birikimine bağlı olarak inflammasyonu ve Seipin düzeylerini arttırdığı bulundu. In vitro çalışmalarımız ise hem normal koşullarda hemde yüksek kolesterol ile Seipin proteinin hepatositlerde ER strese karşı verilen ilk cevapta rolü olan GRP78 şaperon proteinin düzenlenmesinde rolü olduğunu belirledi. Objective: A detailed investigation of the effect of Seipin protein on ER stress and lipophagy in cholesterol-induced lipid accumulation in AML12 hepatocyte cell line. Determination of lipid accumulation, inflammation and Seipin protein levels in an in vivo model of cholesterol-induced fatty liver disease.Material and Methods: In the in vivo experiments, 2-4 months old male albino rabbits were divided into two groups as control (fed chow diet) and cholesterol (fed 2% cholesterol containing diet). Eight weeks later, liver tissues and blood samples were collected. The results of the effect of hypercholestrolemic diet in liver tissues were investigated macroscopically and also defined by western blotting (Seipin protein levels) and qPCR methods. (TGF-β, IL1β mRNA levels). In the second part of our study, Liposome-Cholesterol application was performed to hepatocyte cells following Seipin siRNA transfection and mRNA levels of ER stress-related GRP78, GRP94 and ATF4 markers were determined by qPCR, while LD number/size differences by Bodipy staining and LD-LAMP1 colocalization by immunofluorescence method.Results: Lipid accumulation and nodular structures were observed in the liver tissues of the rabbits fed with cholesterol, while seipin protein levels and IL1 β mRNA levels were increased and TGF- β mRNA levels were decreased. However it was observed that Lipzoom-Cholesterol application to AML12 cells for 8 h increased cholesterol accumulation, Seipin protein activation and large LD number. It was determined that Seipin siRNA application decreased the large LD number and GRP78 mRNA levels in both the vector and Liposome-Cholesterol groups.Conclusion : According to in vivo findings, high cholesterol was found to increase inflammation and Seipin levels due to lipid accumulation. However, in vitro studies were determined that both under both normal and with high cholesterol conditions, Seipin protein has the ability to regulate GRP78 chaperone protein, which has a role in the first response to ER stress in hepatocytes.

Endoplazmik Retikulum stresi, nörodejeneratif hastalıklar, metabolik hastalıklar, diyabet ve obezite, kanser ve farklı hastalıklar ile ilişkilendirilmiştir. ER stresinin uyaran ve bu hastalıkların ortaya çıkmasını sağlayan birçok etken bulunmaktadır. Hipoksi, reperfüzyon, oksidatif stres, metabolik değişiklikler, hücre içi kalsiyum iyonu konsantrasyon değişiklikleri, protein sentezinin artısı, protein glukozilasyonunun veya disülfid bağı oluşumunun bozulması ER stresini uyaran etkenler arasındadır. Tüm bu etkenlerin haricinde deneysel etkileri olduğu kanıtlanan Tunikamisin ve Thapsigargin gibi çeşitli kimyasal antibiyotiklerde ER stresini uyaran ve deneysel veriler elde edilmesinin sağlandığı etkenler arasındadır. Stres döneminde ER, hatalı protein katlanmasına karşın katlanmamış protein yanıtını (UPR) başlatır. UPR, üç transmembran ER proteinin aktivasyonu gerçekleşir. Bu proteinler; Endoplazmik retikulum kinaz benzeri protein (PERK), ER-çekirdeğe sinyal kinaz 1 (IRE-1) ile etkileşen inositol ve transkripsiyon faktörü 6 (ATF6)’dır. ATF6, miyoblast farklılaşması sırasında apoptotik miyoblastlarda spesifik olarak aktive edilir. Aktif IRE1a ve eIF2-a apoptoza aracılık eden proteinlerdir. Apoptoz CHOP, Jun N-terminal kinaz (JNK) ve kaspaz 12 aktivasyonuyla indüklenir ve kaspaz kaskadı aktive hale gelmiş olur. Tunikamisin, proteinlerdeki asparagin gruplarının n-glikozilasyonunu inhibe eden bir çeşit antibiyotik olup etkisini fosfat üzerinden gösterir ve gliokoprotein sentezini bozar. Tunikamisin, in vitro ve in vivo deneysel düzeylerde sık bir şekilde tercih edilmektedir. Deney hayvanlarına uygulanan Tunikamisin ile oluşturulan ER stresi modellemesi bugüne kadar böbrek ve karaciğer gibi fonksiyonel organlar üzerinde oldukça etkili bir mekanizmaya sahiptir. Bunun birlikte ovaryumda folikülogenezin fizyolojik sürecinde primordiyal, primer, sekonder, tertier ve corpus luteumda etkileri olduğu bilinmekte ancak ilişkili moleküler mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır. Oosit ve erken dönem embriyo gelişiminde ER stresine ilişkin çeşitli in vitro çalışmalar bildirilmektedir. Ancak doğrudan geliştirilen bir ER stres modeli üzerinden gonodal etkileri ovaryumdaki foliküler gelişime ilişkin bir çalışma bulunmamaktadır. ER stres aktivatörü olan Tunikamisin ile deneysel olarak akut ER stres modeli oluşturulan yetişkin farelerin ovaryumlarında folikülogenez temelinde ovaryumdaki histolojik değişiklikler ve ER stresine bağlı olarak UPR’ye bağlı yolaklardan GRP78, EIF2a ve IRE1 yolağı üzerinden apoptoz ilişkili Caspase-3 ve otofaji ilişkili Beclin-1’in immünohistokimyasal olarak araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda Balb-c türü fareler n=7 olacak biçimde; SF kontrol, DMSO kontrol ve TM deney grubu olmak üzere 3 grup şeklinde belirlendi. TM aracılığı ile ER stresi oluşturulan gruba intraperitoneal olarak 1 μg/g oranında Tunikamisin uygulaması yapılıp 24 saat sonra deneklerin sakrifikasyonu gerçekleştirildi. Ovaryum dokusunda, Tunikamisin etken maddesi aracılığıyla ER stres sebebi ile gelişmiş olan UPR mekanizmasının aracılık ettiği apoptotik yolaklar ve otofaji yolağını incelemek amacı ile histokimyasal olarak Hematoksilen-Eozin ve Masson Trikrom boyamaları ve immünohistokimyasal olarak GRP78, eIF2-a, IRE1-a, Caspase-3 ve Beclin-1 boyamaları yapıldı. Sonuç olarak çalışmamızda, protein katlanması için önemli N-glikosilasyonu inhibe ederek ER stresi oluşturmak için kullanılan kimyasal bir reaktif olan Tunikamisin ile bir ER stres modeli oluşturulmuştur. Ovaryumda ileri foliküler yapılarında ve Corpus luteumunda GRP78 aktivasyonuna yol açan Tunikamisinin ER stresini tetikleyerek GRP78’in sekonder, tertier foliküllerde ve corpus luteumunda anlamlı artışı ile ortaya konulmuştur. ER stresinde otofaji mekanizmasına ilişkin Beclin-1 primordiyal foliküler yapılarda değiştiği ancak anlamlı bulunmamıştır. Sekonder foliküllerde ise SF kontrol grubunda daha yüksektir deney grubunda azalması otofaji regülasyonunun Beclin-1 yönünde değişebileceği şeklinde açıklanabilir. Tunikamisin uygulamasına bağlı olarak apoptoz yolağına ilişkin Caspase-3 artışı corpus luteumda anlamlı bulunmuştur., Endoplasmic Reticulum stress has been associated with neurodegenerative diseases, metabolic diseases, diabetes and obesity, cancer and different diseases. There are many factors that stimulate ER stress and cause these diseases to occur. Hypoxia, reperfusion, oxidative stress, metabolic changes, intracellular calcium ion concentration changes, increased protein synthesis, disruption of protein glucosylation or disulfide bond formation are among the factors that stimulate ER stress. Apart from all these factors, various chemical antibiotics such as Tunikamycin and Thapsigargin, which have proven to have experimental effects, are among the factors that stimulate ER stress and provide experimental data. During the stress period, the ER initiates the protein misfold versus unfolded protein response (UPR). Activation of the UPR, three trans-membrane ER proteins occurs. These proteins are; Endoplasmic reticulum kinase-like protein (PERK) is inositol and transcription factor 6 (ATF6) that interact with ER-core signal kinase 1 (IRE-1). ATF6 is specifically activated in apoptotic myoblasts during myoblast differentiation. Active IRE1a and eIF2-a are proteins that mediate apoptosis. Apoptosis is induced by activation of CHOP, Jun N-terminal kinase (JNK) and caspase 12, and the caspase cascade is activated. Tunicamycin is a kind of antibiotic that inhibits the N-glycosylation of asparagine groups in proteins and shows its effect through phosphate and impairs glycoprotein synthesis. Tunicamycin is frequently preferred at in vitro and in vivo experiments. ER stress modeling created with Tunicamycin applied to experimental animals has a very effective mechanism on functional organs such as kidney and liver to date. However, it is known that it has effects on primordial, primary, secondary, tertiary and corpus luteum in the physiological process of folliculogenesis in the ovary, but its related molecular mechanisms have not been fully elucidated. Various in vitro studies on ER stress in oocyte and early embryo development have been reported. However, there is no study on the gonadal effects of follicular development in the ovary through a directly developed ER stress model. It was aimed to investigate histological changes immunohistochemically on the basis of folliculogenesis in the ovaries of adult mice experimentally created an acute ER stress model with tunicamycin, an ER stress activator, by apoptosis-associated Caspase-3 and autophagy-related Beclin-1 via GRP78, EIF2a and IRE1 pathways due to unfolded protein response (UPR) due to ER stress. In our study, Balb-c mice were n=7; they were determined as 3 groups as SF control, DMSO control and TM experimental group. Tunicamycin at the rate of 1 μg/g was administered intraperitoneally to the group in which ER stress was created through TM, and the mice were sacrificed after 24 hours. Hematoxylin-Eosin and Masson Trichrome stainings were histochemically and immunohistochemically GRP78, eIF2- a, IRE1-a, Caspase-3 and Beclin-1 in ovarian tissue to examine the autophagy pathway and apoptotic pathways mediated by the UPR mechanism developed due to ER stress through the active substance Tunicamycin. In conclusion, in our study, an ER stress model was created with Tunicamycin, a chemical reagent used to create ER stress by inhibiting N-glycosylation, which is important for protein folding. Tunicamycin, which causes GRP78 activation in the advanced follicular structures of the ovary and Corpus luteum, has been demonstrated by the significant increase of GRP78 in secondary, tertiary follicles and corpus luteum by triggering ER stress. Beclin-1 related to autophagy mechanism in ER stress was changed in primordial follicular structures, but it was not found significant. In secondary follicles, SF is higher in the control group, and its decrease in the experimental group can be explained as the regulation of autophagy may change in the direction of Beclin-1. Caspase-3 increase related to apoptosis pathway was found significant in corpus luteum due to tunicamycin administration.

Bu çalışmanın amacı, akrilamid uygulanan HepG2 hücrelerinde 3-metil adenin ve rapamisinin hücre canlılığına, mikrotübül-ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3-II ve aktif kaspaz-3 düzeylerine etkisini araştırmaktır. HepG2 hücrelerine tek başına uygulanan akrilamid, 3-metil adenin, rapamisin ve akrilamid ile birlikte uygulanan 3-metil adenin ve rapamisinin; hücre canlılığına etkisi 3-(4,5- dimetil-2-tiyazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromür testi ile, mikrotübül-ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3-II, prokaspaz-3 ve aktif kaspaz-3 protein düzeyleri western blot yöntemiyle ölçüldü. HepG2 hücrelerine 24 saat süreyle uygulanan 2.5 mM, 5 mM ve 10 mM 3-metil adenin ve 100 nM ve 250 nM rapamisin hücre canlılığını anlamlı olarak azalttı. 10 mM akrilamid ve 10 mM akrilamid ile birlikte uygulanan 1 mM 3-metil adenin ve 50 nM rapamisin hücre canlılığını anlamlı olarak azalttı. 10 mM akrilamid ile birlikte uygulanan 50 nM rapamisin hücre canlılığını 10 mM akrilamid ve 10 mM akrilamid ile birlikte 3-metil adenin uygulanan hücrelere göre anlamlı olarak azalttı. 10 mM akrilamid mikrotübül-ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3-II ve aktif kaspaz-3 düzeylerini anlamlı olarak arttırırken prokaspaz-3 düzeylerini anlamlı olarak azalttı. 1 mM 3-metil adenin ve 50 nM rapamisin 10 mM akrilamid uygulanan hücrelerde mikrotübül-ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3-II ve prokaspaz-3 düzeylerini anlamlı olarak değiştirmezken aktif kaspaz-3 düzeylerini anlamı olarak azalttı. Sonuç olarak çalışmamız, akrilamid uygulanan HepG2 hücrelerinde 1 mM 3-metil adeninin hücre canlılığında ve mikrotübül-ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3-II düzeylerinde anlamlı bir değişikliğe yol açmazken, aktif kaspaz-3 düzeylerinde ise azalmaya yol açtığını; 50 nM rapamisinin ise hücre canlılığını ve aktif kaspaz-3 düzeylerini anlamlı olarak azaltırken, mikrotübül-ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3-II düzeylerinde anlamlı bir değişikliğe yol açmadığını gösterdi. This study aims to investigate the effect of 3-methyl adenine and rapamycin on cell death, microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3-II, and active caspase-3 protein levels in acrylamide toxicity in acrylamide-treated HepG2 cells. The effects of 3-methyl adenine and rapamycin alone or together with acrylamide on cell viability were measured by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide test, and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3-II, active caspase-3 and procaspase -3 protein levels were measured by western blot method. 2.5 mM, 5 mM, and 10 mM 3-methyl adenine and 100 nM and 250 nM rapamycin applied to HepG2 cells for 24 hours significantly reduced cell viability. 1 mM 3-methyl adenine and 50 nM rapamycin co-administered with 10 mM acrylamide and 10 mM acrylamide significantly reduced cell viability. 50 nM rapamycin co-administered with 10 mM acrylamide significantly decreased cell viability compared to cells treated with 10 mM acrylamide and 10 mM acrylamide with 3-methyl adenine. 10 mM acrylamide significantly increased the levels of microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3-II and active caspase-3, while it significantly decreased the levels of procaspase-3. While 1 mM 3-methyl adenine and 50 nM rapamycin did not significantly change the levels of microtubuleassociated protein 1A/1B-light chain 3-II and procaspase-3 in cells treated with 10 mM acrylamide, it significantly decreased the levels of active caspase-3. Our study showed that while 1 mM 3-methyl adenine did not cause a significant change in cell viability and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3-II levels in acrylamide-treated HepG2 cells, it caused a decrease in active caspase-3 levels; 50 nM rapamycin significantly decreased cell viability and active caspase-3 levels, while it did not cause a significant change in microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3-II levels.

Mitokondriyal-türevli peptid (MOTS-c), mitokondriyal DNA tarafından kodlanan bir hormondur. MOTS-c'nin de novo purin biyosentezini ve hücrede folat siklusunu inhibe ettiği bildirilmektedir. MOTS-c'nin çekirdeğe yerleştiği ve metabolik stresin ardından 5'-adenosin monofosfatla aktifleştirilmiş protein kinaza (AMPK) bağımlı bir şekilde nükleer gen ekspresyonunu düzenlediğini gösterilmiştir. AMPK'nın, başta kanser dahil olmak üzere metabolik hastalıklar için potansiyel bir terapötik hedef olduğu bildirilmektedir. Bu çalışmada MOTS-c'nin kolorektal kanser hücre serisi üzerine sitotoksik ve genotoksik etkilerini araştırmayı amaçladık. Çalışmada MOTS-c ve 5-Fluorourasil (5-FU)'in farklı konsantrasyonları insan kolon kanseri hücre serisi (Caco-2) ve sağlıklı kolon epitel hücre serisine (FHC) değişik zaman periyotlarında uygulandı. Uygulamalar sonrası hücrelerde canlılık düzeyindeki değişimler MTT analizi ile belirlendi. Bileşiklerin genotoksik etkisi tek hücre jel elektroforez (Comet) analizleriyle ortaya kondu. Apoptotik hücre ölümü düzeyi TUNEL boyama sonucu belirlendi. Ayrıca çalışmada bileşiklerin apoptoz ve otofaji süreçlerinde görev alan proteinler üzerine etkileri Western blot analizleriyle belirlendi. MOTS-c uygulaması Caco-2 hücrelerinde canlılığı 24. saatte önemli düzeyde azalttı (p

Purpose: Breast cancer is a common cancer that occurs due to different epigenetic changes and genetic mutations. Naturally occurring Quercetin is a flavonoid that exhibits antioxidant, anti-inflammatory and anti-cancer properties and manages multiple intracellular targets. In this study, it was aimed to investigate the possible effect of Quercetin on apoptosis/autophagy processes in MCF-7 breast cancer cell line.Materials and Methods: Quercetin was applied to MCF-7 breast cancer cell line at different concentrations and times (24, 48 and 72 hours) to determine the IC50 value of quercetin by 3-4.5-dimetil-tiyazolil–2.5-difeniletrazolyum bromid (MTT) analysis, and groups were formed. Control group; no treatment group, Quercetin 1; IC50 dose of quercetin administered group, Quercetin 2; group in which half the IC50 dose of quercetin was administered, D 1; In the quercetin 1 group, the DMSO ratio used in the preparation of the quercetin was applied, and D 2; In the quercetin 2 group, the DMSO ratio used in the preparation of the quer-cetin was applied, While TUNEL staining method was used to evaluate the apoptotic effect of quercetin, LC3/2 and Beclin-1 immunofluorescence staining method was applied to reveal its autophagic effect.Results: When the effect of quercetin on cells was examined, it was observed that cell viability was inhibited depending on dose and time. In addition, it was observed that the autophagy markers Beclin-1and LC3/2 immunoreactivity increased, too.Conclusion: In conclusion, it was observed that quercetin led to death of MCF-7 breast cancer cells through apoptosis and autophagy pathways., Amaç: Meme kanseri, farklı epigenetik değişiklikler ve genetik mutasyonlar nedeniyle ortaya çıkan yaygın bir kanserdir. Doğal olarak oluşan Kuersetin, antioksidan, anti-inflamatuar ve anti-kanser özellikler sergileyen ve çok sayıda hücre içi hedefi yöneten bir flavonoid’dir. Bu çalışma da, MCF-7 meme kanseri hücre hattında Kuersetinin apopitoz /otofaji süreçleri üzerine olası etkisi-nin incelenmesi amaçlandı.Araçlar ve Yöntem: Kuersetinin IC50 değerini 3-4.5-dimetil-tiyazolil–2.5-difeniletrazolyum bromid (MTT) analiz ile belirlemek için MCF-7 meme kanseri hücre hattına farklı konsantrasyonlar da ve sürelerde (24, 48 ve 72. saatte) kuersetin uygulandı ve gruplar oluşturuldu. Kontrol grubu; hiç bir uygulama yapılmayan grup, Kuersetin 1; kuersetinin IC50 dozunun uygulandığı grup, Kuersetin 2; kuersetin’in IC50 dozunun yarısının uygulandığı grup, D 1; kuersetin 1 grubunda kuersetin hazırlanmasında kullanı-lan DMSO oranının uygulandığı grup ve D 2; kuersetin 2 grubun da kuersetin hazırlanmasında kullanılan DMSO oranının uygu-landığı grup. Kuersetinin apopitotik etkisini değerlendirmek için TUNEL boyama yöntemi kullanılırken, otofajik etkisini ortaya çıkarmak için LC3/2 ve Beklin-1 immünofloresan boyama yöntemi uygulandı.Bulgular: Kuersetinin hücreler üzerine etkisine bakıldığında, hücre canlılığının doz ve zamana bağlı olarak inhibe olduğu görüldü. Bunun yanında otofaji belirteçleri olan Beklin-1 ve LC3/2 immunre aktivitesinin de arttığı gözlendi.Sonuç: Sonuç olarak, kuersetinin apopitoz ve otofaji yolakları ile MCF-7 meme kanseri hücrelerini ölüme götürdüğü gözlendi.

Saccharomyces cerevisiae, haploid veya diploid olarak bulunabilen tek hücreli ökaryotik bir organizmadır. Tek hücreli olmasına rağmen, bazı çevresel koşulların etkisi ile farklı gelişim süreçleri göstermektedir. Bu süreçler sporülasyon ve psödohifsel gelişmelerdir. Diploid mayalarda azot açlığının Ras2 membran proteini tarafından kontrol edildiği bilinmektedir. Azot açlığı durumunda aktif hale gelen Ras2 proteini, protein kinaz A yolu aracılığıyla, enzimleri ve transkripsiyon faktörlerini kodlayan çok sayıda genin aktivitesini değiştirmektedir. Sonuç olarak, diploid mayalar üreme şeklini değiştirmekte ve psödohifsel üremeye geçmektedir. Ras2 ve diğer bazı mutasyonlara sahip sigma suşu, haploid olsa dahi, pseudohif oluşturmaktadır. Trehaloz, S. cerevisiae için önemli bir disakkarittir ve depo karbonhidrattır. Stres koruma faktörü olmakla birlikte hücreye glikoz girişini kontrol etmektedir. TPS1 ve − genleri de trehaloz metabolizmasında biyosentez ve katabolizmada işlev gören enzimleri kodlamaktadır. Bu tez çalışmasında, S. cerevisiae'de görülen apoptoz, otofaji, pseudohifsel gelişim gibi farklı hücresel süreçlerinin TPS1 ve NTH1 genlerinin transkripsiyonu üzerine etkileri araştırıldı. Farklı genetik özelliklere sahip suşlara transforme edilen TPS1-LacZ ve NTH1-LacZ gen füzyonlarının transkripsiyon seviyeleri β-galaktozidaz enzim tayin methoduyla belirlendi. Apoptoz koşulları aktive edildiğinde TPS1 ve NTH1 gen ekspresyonunun 2 kat baskıladığı görüldü. Ancak, otofaji koşullarının aktive edilmesi ile hem TPS1 ve hem de NTH1 geni trasnkripsiyonunda farklı seviyelerde aktivasyon olduğu bulundu. Diploid maya hücresinde sporulasyon aktivasyonunda NTH1 geni transkripsiyonunda önemli bir azalma olduğu tayin edildi. NTH1 ve TPS1 gen transkripsiyonlarının S. cerevisiae’nın farklı hücresel gelişim veya farklılaşma süreçlerinden farklı şekillerde etkilendiği görülmektedir. Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryotic organism that can be found as haploid or diploid. Although it has a single cell, it shows different developmental processes under the influence of some environmental conditions. These processes are sporulation and pseudohyphal developments. It is known that nitrogen starvation in diploid yeasts is controlled by the Ras2 membrane protein. The Ras2 protein, which is activated in nitrogen starvation, changes the activity of many genes encoding enzymes and transcription factors through the protein kinase A pathway. As a result, diploid yeasts change their growth pattern and pass on to pseudohyphal reproduction. Sigma strain with ras2 and some other mutations produces pseudohyphae even though it is haploid. Trehalose is an important disaccharide and storage carbohydrate for S.cerevisiae. Although it is a stress protection factor, it controls the entry of glucose into the cell. TPS1 and NTH1 genes also encode enzymes that function in biosynthesis and catabolism in trehalose metabolism. In this thesis study, the effects of different cellular processes such as apoptosis, autophagy, pseudohyphal development seen in S. cerevisiae on the transcription of TPS1 and NTH1 genes were investigated. The transcription levels of TPS1-LacZ and NTH1-LacZ gene fusions transformed into strains with different genetic characteristics were determined by the β-galactosidase enzyme assay method. When the apoptosis conditions were activated, it was observed that TPS1 and NTH1 gene expression was suppressed 2-fold. However, different levels of activation were found in both TPS1 and NTH1 gene transcription by activating autophagy conditions. A significant decrease in NTH1 gene transcription in sporulation activation in diploid yeast cell was determined. It is seen that NTH1 and TPS1 gene transcriptions are affected differently by different cellular development or differentiation processes of S. cerevisiae.

Sweetgum Oil (SO), Liquidambar orientalis'in yaralı gövdesinden elde edilen "Sığla Yağı" adıyla yerel olarak isimlendirilen reçineli bir eksüdattır. SO'nun antibakteriyel, antioksidan, antiseptik ve antienflamatuar özellikleri birçok çalışmada bildirilmiştir. Bu çalışmada dirençli K562R ve duyarlı K562S kronik myeloid lösemi hücre hatlarında ROS oluşumu üzerine farklılıkların belirlenmesi ve ROS'un otofaji üzerindeki etkilerinin gözlenmesi amacıyla sitotoksik dozda Tirozin Kinaz İnhibitörleri (TKİ) ile sığla yağı kombinasyonu hücre hatlarına uygulanmıştır. K562R ve K562S hücre hatlarında sitotoksisite, ROS oluşumu, DNA hasarı, otofaji ve otofaji ile ilişkili proteinlerden otofagozom oluşumunda rol oynayan LC3α/β proteini ile ROS oluşumuna bağlı olarak inaktif hale gelen Atg4A proteininin ekspresyon seviyelerine etkileri incelenmiştir. Sitotoksisite çalışmalarında sığla yağının K562R hücrelerinde IC50 değeri 250 μg/ml, K562S hücrelerinde IC50 değeri 150 μg/ml olarak belirlenmiştir. H2DCFDA boyama ile sığla yağı kullanımında oluşan ROS'un K562R hücrelerinde ponatinibe kıyasla %28,8 oranında, K562S hücrelerinde ise imatinibe göre %23,8 oranında daha az olduğu görülmüştür. Kombine uygulamalarında ise sığla yağının tekli uygulamalarına göre ROS'un K562R hücrelerinde %67,56 oranında, K562S hücrelerinde ise %60,9 oranında azaldığı görülmüştür. K562R hücrelerinde, K562S hücrelerine göre %21,9 daha fazla ROS gözlenmiştir. Oluşan ROS'a bağlı olarak tirozin kinaz inhibitörleri ile tedavi edilen hücrelerde sığla yağı ile tedavi edilen hücrelere göre daha fazla DNA hasarı meydana gelmiştir. K562R hücrelerinde sığla yağının otofaji aktivasyonunda azalmaya neden olduğu K562S hücrelerinde ise otofaji aktivasyonunda artış sağladığı floresan mikroskop ile gözlenmiştir. Western blot deneyinde sığla yağı uygulanmış hücrelerde Atg4A ekspresyonunun daha fazla olduğu ve ROS'un fazla olduğu diğer gruplarda ise Atg4A ekspresyonunun azaldığı görülmüştür. LC3-I ekspresyonu ise sığla yağı uygulandığında K562R hücrelerinde azalmış, K562S hücrelerinde ise artış göstermiştir. Sweetgum Oil (SO) is a resinous exudate locally named " Sığla Yağı " obtained from the injured body of Liquidambar orientalis. Antibacterial, antioxidant, antiseptic and anti-inflammatory properties of SO have been reported in many studies. In this study, cytotoxic dose Tyrosine Kinase Inhibitors (TKI) and Sweetgum Oil combination was applied to cell lines in order to determine the differences on ROS formation in resistant K562R and sensitive K562S chronic myeloid leukemia cell lines and to observe the effects of ROS on autophagy. In K562R and K562S cell lines, the effects of the LC3α/β protein, which plays a role in the formation of autophagosomes, which are related to cytotoxicity, ROS formation, DNA damage, autophagy and autophagy, and the Atg4A protein, which becomes inactive due to ROS formation, on expression levels were examined. In cytotoxicity studies, the IC50 value of sweetgum oil in K562R cells was determined as 250 μg / ml and in K562S cells as 150 μg / ml. It was observed that the ROS formed by the use of sweetgum oil with H2DCFDA staining was 28.8% less in K562R cells compared to ponatinib and 23.8% less in K562S cells than imatinib. In combined applications, according to the single applications of sweetgum oil, it was observed that ROS decreased by 67.56% in K562R cells and 60.9% in K562S cells. 21.9% more ROS were observed in K562R cells than in K562S cells. Due to the ROS generated, more DNA damage occurred in cells treated with tyrosine kinase inhibitors than cells treated with sweetgum oil. It was observed by fluorescent microscope that sweetgum oil caused a decrease in autophagy activation in K562R cells and increased autophagy activation in K562S cells. In the Western blot experiment, it was observed that Atg4A expression was higher in cells treated with sweetgum oil, and Atg4A expression was decreased in other groups with high ROS. LC3-I expression decreased in K562R cells and increased in K562S cells when sweetgum oil was applied. Bilecik Şeyh Edebali Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesi – BAP - 2019-01.BŞEÜ.04-01. Bilecik Seyh Edebali University Scientific Research Project - BAP - 2019-01.BŞEÜ.04-01.

Apoptoz hücrenin fizyolojik ve patalojik şartlarda kendini ortadan kaldırmasını sağlayan, bir programlanmış hücre ölüm mekanizmasıdır. Otofaji ise hücrede açlık durumlarında veya farklı uyaranların etkisi ile hasarlı organellerin ve bazı proteinlerin otofagosom denilen bir çift katlı membran yapısı içinde biriktirilerek geri dönüştürülmesidir. Retrograd kontrol ise mitakondriden nükleusa sinyal iletim mekanizması olup mitokondriyel hasarlar veya Krebs döngüsü bozuklukları ile aktive edilebilir. Bu sinyallere bağlı olarak aktive edilen transkripsiyon faktörleri nükleusa girerler ve hedef genleri ekspres ederek mitakondriyel hasarların onarılmasını sağlarlar. S. cerevisiae’da GPD1, CYC1 ve SUC2 genleri sırasıyla gliserol-3-fosfat dehidrojenaz enzimini, sitokrom-c, izoform-1 proteinini ve invertaz enzimini kodlarlar. Bu araştırmada S. cerevisiae’da apoptoz, otofaji ve retrograd kontrolün, GPD1, CYC1 ve SUC2 genlerinin transkripsiyonuna etkileri incelendi. Apoptoz koşullarının aktivasyonu ile GPD1, CYC1 ve SUC2 genleri transkripsiyonlarının baskıladığı görüldü. Otofaji koşullarında ise yaban tip maya suşunda GPD1 geni transkripsiyonunda düşük seviyelerde azalma görülürken, CYC1 geni transkripsiyonu etkilenmedi. SUC2 geni ekspresyonunun ise 3-kat baskılandığı görüldü. Apoptoz ve otofaji koşullarında Hog1p ve Tor1p kinazlarının bu genlerin transkripsiyonlarına farklı etkileri olduğu görüldü. İnvertaz aktivitesi ölçüldüğünde apoptozun invertaz sekresyonunu tamamen önlediği otofaji aktivasyonunun ise invertaz sekresyonuna önemli etkisi olmadığı bulundu. Retrograd kontrol mekanizmasının transkripsiyon faktörleri olan Rtg1/3p kompleksi retrograd hedef genlerinin promotorlarında R kutusu denilen sekansa bağlanmaktadır. GPD1, CYC1 ve SUC2 genlerinin promotorları R-kutusu sekansları için biyoinformatik araçlar ile analiz edildi. GPD1, CYC1 ve SUC2 genlerinin promotor bölgelerinde çok sayıda R-kutusu sekansı olduğu bulundu. Bu sonuçlar hücrede önemli metabolik işlevleri olan GPD1, CYC1 ve SUC2 genlerinin transkripsiyonlarının apoptoz, otofaji ve retrograd sinyal mekanizmalarına bağlı olarak belirli derecelerde kontrol edildiğini göstermektedir. Apoptosis is a programmed cell death mechanism that allows the cell to eliminate itself in physiological and pathological conditions. Autophagy, which can be triggered by starvation or other stimuli, is the recycling of damaged organelles and misfolded proteins in a double membrane structure called an autophagosome. Retrograde control is the signaling pathway from the mitochondrion to the nucleus that is activated by mitochondrial damages and Krebs cycle disturbances. Upon activation by retrograde signaling, certain transcription factors enter the nucleus and activate the transcription of mitochondrial genes resulting in the repair of mitochondrial damages. In S. cerevisiae, GPD1, CYC1, and SUC2 genes encode glycerol-3-phosphate dehydrogenase enzyme, cytochrome-c isoform-1 protein, and invertase enzyme, respectively. In this study, the effects of apoptosis, autophagy and retrograde control on the transcription of GPD1, CYC1, and SUC2 genes were investigated. Activation of apoptosis conditions resulted in the transcriptional repression of GPD1, CYC1, and SUC2 genes. In autophagy conditions, while GPD1 gene transcription decreased at low levels in wild yeast strain, CYC1 gene transcription was not affected. Transcription of SUC2 repressed by 3-fold in autophagy induced conditions. It was observed that Hog1p and Tor1p kinases had different effects on the transcription of these genes under apoptosis and autophagy conditions. Our results also indicated that apoptosis conditions completely prevent invertase secretion. However, autophagy activation did not have severe effects on invertase secretion the yeast cells. The Rtg1/3p complex, which is the transcription factor of the retrograde control mechanism, binds to the sequence called R box in the promoters of the retrograde targeted genes. The promoter regions of the GPD1, CYC1, and SUC2 genes were analyzed for R box sequences using bioinformatics tools, and multiple R-boxes were identified within the promoter regions of those genes. Altogether, these results indicate that transcription of GPD1, CYC1, and SUC2 genes, which have significant metabolic functions in cells, are controlled at certain levels depending on autophagy, apoptosis, and retrograde signaling.

Sacchoromyces cerevisiae retrotranspozonları incelemek için kullanılan GRAS bir mikroorganizmadır. S. cerevisiae genomunda Ty1-Ty5 olarak adlandırılan 5 çeşit retrotranspozon bulunur. Bu retrotranspozonlar retrovirüslere genomik açıdan benzedikleri için pseudovirüs olarak da bilinirler. Genomda sayıları sabittir ve TYA ve TYB olarak adlandırılan iki adet açık okuma çerçevesini sahiptir. TYA; VLP oluşumunu sağlarken, TYB; reverse transkriptaz, integraz ve proteaz enzimini oluşturmaktadır. TYB'nin translasyonu TYA:TYB füzyon proteini olarak yapılır ve bu translasyon işlemi ribozomal çerçeve kayması ile gerçekleşir. Ty genomlarından hiçbir translasyon ve transkripsiyon faktörü kodlanmaz. Transkripsiyon ve translasyonları için tüm faktörleri virüslere benzer şekilde konak hücresi olan S. cerevisiae'nın faktörlerini kullanırlar. Bu nedenle mayayı etkileyen sinyallerin Ty elementlerini de etkilediği düşünülmektedir. Apoptoz programlı bir hücre ölüm mekanizmasıdır. Otofaji ise protein bozunmasını indükleyen ve hücre dengesini sağlayan bir süreçtir. Üreme ortamında asetik asitle yaratılan apoptoz sinyali ve kafeinle yaratılan otofaji sinyallerinin S. cerevisiae'da çeşitli genlere olan etkisi bilinmektedir. Bu araştırmada; mayada deneysel olarak oluşturulan apoptoz ve otofaji sinyallerinin Ty1 ve Ty2'nin transkripsiyon ve ribozomal çerçeve kayması üzerindeki etkisi incelendi. Yapılan çalışmada; apoptoz ve otofaji sinyallerinin mutant suşlardaki Ty1 ve Ty2 elementlerinin transkripsiyonunu farklı oranlarda etkilendiği görüldü. Ty1 ve Ty2 elementlerinin transkripsiyonunun; apoptoz ve otofaji sinyali ile azaldığı belirlendi. Ty elementlerinde programlı ribozomal çerçeve kaymasının da selektif otofaji türleriyle %50 oranda azaldığı belirlendi. Sacchoromyces cerevisiae is a GRAS microorganisms used to study retrotranspozons. S. cerevisiae contains 5 different types of retrotransposon, known as Ty1-Ty5, in its genome. These retrotranspozons are also known as pseudoviruses because they are genomically similar to retroviruses. Their numbers are constant in the genome and have two open reading frames, called TYA and TYB. While TYA provides VLP formation, TYB forms reverse transcriptase, integrase and protease enzyme. The translation of TYB is done as TYA:TYB fusion protein, and this translational process occurs by ribosomal frameshift. There is no translation and transcription factors encoded from Ty genomes. All factors for transcription and translation use factors of S. cerevisiae, the host cell, similar to viruses. Therefore, the signals affecting yeast are thought to affect Ty elements as well. Apoptosis is a programmed cell death mechanism. Autophagy is a process that induces protein degradation and ensures cell balance. Apoptosis can be activated by acetic acid in yeast. Moreover, autophagy pathway can be activated by caffeine. Apoptosis and autophagy signals affects many different genes in S. cerevisiae. In this study, the effect of experimentally generated apoptosis and autophagy signals on transcription and ribosomal frameshift of Ty1 and Ty2 was studied in yeast. The study showed that apoptosis and autophagy signals affect the transcription of Ty1 and Ty2 pseudoviruses in mutant strains at different rates. Transcription of the Ty1 and Ty2 was determined to decrease with apoptosis and autophagy signaling. It was determined that ribosomal frameshift in Ty elements decreased by 50% with selective autophagy types.

Glioblastoma Multiforme (GBM), erken tanısı yapıldığı takdirde dahi agresif etkisini gösteren biyolojik olarak heterojen bir tümördür ve bu heterojen kitlenin içerisinde, kendini yenileme ve farklılaşma özelliğine sahip, CD133, CD44 gibi tipik kök hücre yüzey belirteçlerini ifade edebilen, kanser progresyonunu uyaran ve kanser hücrelerinin tedavi direnci kazanmasına sebep olan kanser kök hücreleri de yer almaktadır. Hücre büyümesi, hayatta kalma, migrasyon ve karsinogenez gibi hücresel olayların gelişiminden sorumlu PI3K/AKT/mTOR sinyal yolunun GBM ve Glioblastoma multiforme kanser kök hücrelerinde (GBMKH/CD133+ kanser kök hücreleri) aktif olduğu, tümörojeniteye katkı sağladığı bildirilmiştir. Hücre sağ kalım mekanizması otofaji ile epitelyal mezenşimal geçiş (EMT) esnasında kanser hücrelerinin hareketlilik kazanarak metastazına neden olan hücre iskelet elemanı F-aktin, PI3K/AKT/mTOR sinyal yolu üzerinden düzenlenmektedir. Bu sinyal yolunun dual inhibitörü olan Voxtalisib (XL765, SAR245409)’in GBM’li hastalarda sitotoksisiteyi artırarak tümör gelişimini azalttığı ve buna bağlı sağ kalım oranını artırdığı görülmüştür. Mekanik enerjinin non-invaziv bir formu olan düşük yoğunluklu darbeli ultrason (low intensity pulsed ultrasound, LIPUS), diğer mekanik uyarıcılara kıyasla derin yerleşimli dokulara etki edebilme yeteneğine sahip bir ultrason tipidir. LIPUS’un düşük toksisitesi, derin penetrasyonu ve yüksek etkinliği nedeniyle anti-tümör tedavisi için kullanılabileceğini gösteren güncel çalışmalar bulunmaktadır. İlaçla kombine edilen LIPUS tedavisinin mekano-akustik etkisi ile karsinogenezi uyaran sinyal proteinlerinin down-regülasyonunu sağladığı, kanser hücrelerinde apoptoz ve otofajiyi indüklediği bildirilmiştir. Ancak LIPUS’un, Voxtalisib ile meydana gelen kemodinamik etkisi henüz incelenmemiş olup, GBMKH’de Voxtalisib/LIPUS inhibisyonu sonucu F-aktin ve hücre sağ kalım mekanizmalarının ortaya konduğu yeterli bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada, dual inhibitör Voxtalisib ile PI3K/AKT/mTOR inhibisyonu ve LIPUS kombine uygulamasının, F-aktin hücre iskeleti ve hücre ölüm mekanizması olan otofaji üzerindeki olası etkilerinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Bu amaçlar doğrultusunda floresanla aktive hücre ayırma (FACS) metodu kullanılarak glioblastoma multiforme kanser kök hücrelerinin izolasyonu gerçekleştirilmiştir. GBM ve GBM kanser kök hücrelerine Voxtalisib, LIPUS ve ikili kombinasyonları uygulanarak otofaji ve F-aktin üzerinde meydana gelen değişimler incelenmiştir. Bu değişimlerin incelenmesi sırasında uygun ilaç dozu belirlenmiş, hücre sayımları yapılmıştır. İmmünofloresan yöntemleri kullanılarak F-aktin ve sinyal yolu inhibisyonunun yorumlanması gerçekleştirilmiştir. Hücre migrasyonları standart wound healing deneyi ile gösterilmiş, deney ve kontrol gruplarında sırasıyla incelenen tüm parametreler ImageJ programı ile skorlanmış ve değerlendirilmiştir. Sonuçta, Voxtalisib’in artan dozlara bağlara bağlı LIPUS uygulamasının mTOR’u inhibe ederek, her iki hücrede de canlılığı azalttığı gösterilmiştir. Yanı sıra, mTOR inhibisyonuna bağlı olarak otofaji aktive olmuştur ve bunun sonucunda LIPUS’un GBM hücrelerinde otofajiyi artırdığı, GBMKH’lerde ise hücrelerin 5 ve 10 μM ilaç dozlarında otofajiye direnç geliştirdikleri gözlenmiştir. Hücre invazyonu, phalloidin boyaması ve migrasyon deneyleri ile gösterilmiş, sonuçta LIPUS’un artan dozlara bağlı olarak hücre invazyonunu negatif yönde etkilediği sonucuna varılmıştır. Yapılan çalışmalar, LIPUS ve Voxtalisib birlikte uygulamasının, kanser ve kanser kök hücrelerini hedef almada etkili olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine, LIPUS’un klinik kullanımının yaygınlaşmasına yardımcı olabilir., Glioblastoma Multiforme (GBM) is a biologically heterogeneous tumor that shows its aggressive effect despite early diagnosis. In this heterogeneous tumor, there are also cancer stem cells which has capability of self-reneweal and differantiation, can express typical stem cell surface markers such as CD133, CD44, stimulate cancer progression and cause cancer cells to gain treatment resistance. PI3K/AKT/mTOR signaling pathway what is responsible for the development of cellular events such as cell growth, survival, migration and carcinogenesis has been reported to be active in GBM and Glioblastoma Multiforme cancer stem cells (GBMKH/CD133 + cancer stem cells) and contribute to tumorigenicity. The cell survival mechanism autophagy and the cellular skeleton element F-actin which causes metastasis of cancer cells by mobilizing during epithelial mesenchymal transition (EMT) are regulated on PI3K/AKT/mTOR pathway. Voxtalisib (XL765, SAR245409), the dual inhibitor of this signaling pathway has been shown to reducing tumor development by increasing tumor cytotoxicity in patients with GBM, consequently, increased the survival rate associated with it. Low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS), a non-invasive form of mechanical energy, is an ultrasound type that capable of affecting deep-lying tissues when compared to other mechanical stimulants. Due to low toxicity, deep penetration and high efficacy of LIPUS, there have been current studies that show LIPUS can be used for anti-tumor treatments. It has been reported that LIPUS therapy combined with the drug provides down-regulation of signal proteins that stimulate carcinogenesis and induces apoptosis and autophagy in cancer cells with its mechano-acoustic effect. However, the chemodynamic effect of LIPUS with Voxtalisib has not yet been studied, and there is no adequate study demonstrating F-actin and cell survival mechanisms in GBMKH as a result of Voxtalisib/LIPUS inhibition. In this study, it is aimed to reveal the possible effects of PI3K/AKT/mTOR inhibition with dual inhibitor Voxtalisib and LIPUS combination on F-actin cytoskeleton and cell survival mechanism autophagy. For these purposes, it is realized to isolation of glioblastoma multiforme cancer stem cells using fluorescent activated cell sorting (FACS) method. It has been examined the changes that were occured on F-actin and autophagy in GBM and GBMKH applying Voxtalisib, LIPUS and their dual effects. During the examination of these changes, the appropriate drug dose was determined and cell counts were made. Interpretation of F-actin and signal path inhibition was performed using immunofluorescence methods. Cell migrations were demonstrated with the standard wound healing assay, all parameters that examined in the experimental and control groups were scored and evaluated with the ImageJ programme. As a result, the application of Voxtalisib's increased doses of ligated LIPUS has been shown to inhibit mTOR and decrease viability in both cells. In addition, autophagy has been activated with mTOR inhibition, and in the event of this, it has been observed that LIPUS increases autophagy in GBM cells and GBM cancer stem cells advanced resistance for autophagy at 5 and 10 μM drug doses. Cell invasion has been demonstrated by phalloidin staining and wound healing stratching experiments, eventually it has been resulted that LIPUS negatively affects cell invasion depend on increasing doses. Our studies have shown that co-administration of LIPUS and Voxtalisib co-administration is effective in targeting cancer and cancer stem cells. This study can help development for new methods of treatment and expand the clinical use of LIPUS.

Doktora Tezi., Küçük hücreli-dışı akciğer kanseri (KHDAK) ve küçük hücreli akciğer kanseri (KHAK) olmak üzere histolojik olarak iki sınıfa ayrılan akciğer kanseri, tüm dünyada kansere bağlı ölümlerin en yaygın sebeplerinden biridir. KHAK; kemoterapötik ajanlara karşı direncin gözlendiği en agresif akciğer kanseri türüdür. İlaç direnci, temel mekanizmaların yanı sıra kodlamayan RNA profili, hipoksi ve otofaji gibi faktörlerle de ilişkilendirilen bir süreçtir. Bu tez çalışmasında hipoksi ile indüklendiği bilinen bir lncRNA olan HIF1A-AS2'nin KHAK hücrelerinde otofaji üzerinden kemoterapötik dirençteki olası etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Doksorubisine duyarlı H69 ve doksorubisine dirençli H69AR KHAK hücrelerinde HIF1AAS2 ifadesi siRNA yöntemi ile susturulmuştur. Ardından, normoksik ve CoCl2 ile indüklenen hipoksik ortamdaki hücrelerde doksorubisin duyarlılığını belirlemeye yönelik sitotoksisite ve apoptoz analizleri gerçekleştirilmiştir. HIF1A-AS2'nin susturulmasının doksorubisin varlığında ve yokluğunda otofaji üzerine etkisi otofaji analizi ile değerlendirilmiştir. HIF1A-AS2'nin susturulmasının normoksik ve hipoksik ortamda ilaç direnci ve otofaji ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyeleri üzerine etkisi qPZR analizi ile belirlenmiş; MRP1, HIF-1α ve Beclin-1 proteinlerinin seviyeleri western blot yöntemi ile analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre; kontrol grupları ile karşılaştırıldığında H69 ve H69AR hücrelerinde HIF1A-AS2'nin susturulması, normoksik ve hipoksik ortamda doksorubisinin IC50 değerlerini azaltmış, doksorubisine bağlı apoptozu artırmıştır. Ayrıca, doksorubisin varlığında ve yokluğunda HIF1A-AS2'nin susturulması normoksik ve hipoksik ortamda otofajinin azalması ile sonuçlanmıştır. qPZR analizi sonuçlarına göre; HIF1A-AS2'nin susturulması, normoksik ve hipoksik ortamda her iki hücre hattında da ilaç duyarlılığını artıracak ve otofajiyi inhibe edecek şekilde çok sayıda genin ekspresyonunu etkilemiştir. Western blot analizi sonuçlarına göre, HIF1A-AS2'nin susturulması ile normoksik ve hipoksik ortamda her iki hücre hattında da HIF-1α ve Beclin-1 proteinlerinin seviyeleri azalmıştır. H69AR hücrelerinde MRP1 protein seviyesinde de azalma tespit edilmiştir. Ayrıca, hipoksik ortam H69 hücrelerinin ilaç duyarlılığını azaltmıştır, HIF1A-AS2'nin susturulması ile hipoksinin bu etkisi baskılanmıştır. H69AR hücrelerinde ise hipoksinin ilaç direncini daha da artırıcı bir etkisi tespit edilmemiştir. Sonuç olarak, KHAK hücrelerinde HIF-1α'yı pozitif yönde düzenlediği ve hipoksi ile indüklendiği belirlenen HIF1A-AS2 lncRNA'nın susturulması, KHAK hücrelerinin ilaç duyarlılığını otofaji ile ilişkili olarak artırmıştır. Dolayısıyla, bu hücrelerde ilaç duyarlılığında hipoksi-HIF1AAS2- otofaji etkileşiminin belirleyici olduğu düşünülmektedir., Lung cancer, which is histologically divided into two classes as non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC), is one of the most common causes of cancer-related deaths in worldwide. SCLC, where resistance against chemotherapeutic agents is observed, is the most aggressive type of lung cancer. Drug resistance is a process associated with factors such as noncoding RNA profile, hypoxia and autophagy as well as basic mechanisms. In this thesis, it is aimed to investigate the possible effect of HIF1A-AS2, a lncRNA known to be induced by hypoxia, on drug resistance associated with autophagy in SCLC cells. The expression of HIF1A-AS2 was silenced by siRNA method in doxorubicin sensitive H69 and doxorubicin resistant H69AR cells. Then, cytotoxicity and apoptosis analyzes were carried out to determine the doxorubicin sensitivity of the cells in the normoxic and CoCl2-induced hypoxic environment. The effect of silencing of HIF1A-AS2 on autophagy in the presence and absence of doxorubicin was evaluated by autophagy analysis. The effect of silencing of HIF1A-AS2 on the expression levels of genes, which are associated with drug resistance and autophagy, in the normoxic and hypoxic environment was determinated by qPCR analysis, the levels of MRP1, HIF-1α and Beclin-1 proteins were analysed by western blot method. According to the results; when compared to control groups, the silencing of HIF1A-AS2 in H69 and H69AR cells decreased IC50 values of doxorubicin and increased doxorubicin-related apoptosis in normoxic and hypoxic environment. In addition, the silencing of HIF1A-AS2 in the presence and absence of doxorubicin resulted in the reduction of autophagy in the normoxic and hypoxic environment. According to the results of qPCR analysis, the silencing of HIF1A-AS2 in normoxic and hypoxic environment has affected the expression of many genes that will increase drug sensitivity and inhibit autophagy in both cell lines. According to results of western blot analysis, the levels of HIF-1α and Beclin-1 proteins decreased in both cell lines in the normoxic and hypoxic environment by silencing of HIF1A-AS2. And, a decrease was also detected in level of MRP1 protein in H69AR cells. In addition, the hypoxic environment reduced drug sensitivity of H69 cells, this effect of hypoxia was suppressed by silencing of HIF1A-AS2. In the H69AR cells, hypoxia did not increase the drug resistance. As a result, the silencing of HIF1A-AS2, which was determined to positively regulate HIF- 1α and was induced by hypoxia in SCLC cells, increased drug sensitivity of cancer cells in relation to autophagy. Therefore, hypoxia-HIF1A-AS2-autophagy interaction is thought to be determinative in drug sensitivity of these cells.

Otofaji, tüm ökaryotlarda yüksek oranda korunmuş hücre içi degradasyon ve geri dönüşüm prosesidir. Otofaji mekanizmasında meydana gelen aksaklıklar kanser de dahil birçok hastalığın progresyonunda yer alır. Otofaji, kanserin doğasına bağlı olarak tümör baskılayıcı bir mekanizma olarak davranabildiği gibi onkogenik bir mekanizma olarak da davranabilir. Otofaji mekanizmasının düzenlenmesinde birçok hücre içi molekül, selüler proses ve yolaklar rol oynayabilir. Bu yolaklardan biri de NFB yolağıdır. Bir transkripsiyon faktörü olan NFB, önemli hücresel proseslerde rol oynayan çok fazla sayıda genin ekspresyonunu regüle eder. NFB’nin otofajiyi indükleyici ya da otofajiyi inhibe edici olarak davrandığı bilinmektedir. Kullanımda olan birçok anti-kanser terapisinin hem otofajiyi hem de NFB yolağını etkilediği bilinmektedir. NFB yolağı ve otofaji arasındaki fonksiyonel ilişkiyi aydınlatmak kombine terapiler kullanılarak kanser tedavilerinin etkinliğinin arttırılmasına ve yeni stratejiler geliştirilmesine katkı sağlayabilecektir. Ancak literatürde, Küçük Hücre Dışı Akciğer Kanserlerinde (KHDAK) NFB yolağının otofajiyi nasıl düzenlediği ve bu düzenlemenin ayrıntılı mekanizmasına ilişkin bilgi bulunmamaktadır. Bu nedenle tez çalışmamızda Küçük Hücre Dışı Akciğer Kanserlerinde NFB’nin otofaji mekanizması üzerindeki olası regüle edici etkisini ve NFB-aracılı otofaji regülasyonunda rol oynayan olası genleri saptamayı amaçladık. Öncelikle KHDAK hücre hattında NFB baskılanan ve overeksprese edilen gruplar oluşturduk ve bu gruplarda otofajiyi indüklediğimiz ve indüklemediğimiz alt gruplar oluşturduk. Bu örnek gruplarında otofaji düzeylerini western blot analizi ile belirledik. Bunun sonucunda Küçük Hücre Dışı Akciğer Kanserinde NFB’nin otofajiyi pozitif regüle ettiğini ortaya koyduk. Sonrasında bu örnek gruplarında RNA sekans analizi ile gruplar arasında farklı ekspresyon profili sergileyen genleri saptadık. NFB overeksprese edilen otofaji indüklü gruplarda ekspresyonu artarken NFB baskılandığında ekspresyonu düşüş gösteren genleri NFB-aracılı otofaji regülasyonunda rol oynayan aday genler olarak belirledik. RNA sekanslama sonuçlarını qRT-PCR analizi ile teyit ederek NFB-aracılı pozitif otofaji regülasyonunda rol oynayan genleri saptadık. Çalışmamızın ‘NFB Küçük Hücre Dışı Akciğer Kanserlerinde otofajiyi nasıl regüle eder ve bu regülasyonda rol oynayan genler nelerdir?’ sorusuna cevap bulabilmek adına literatüre katkı sunacağını düşünmekteyiz. Autophagy, is an intracellular degradation and recycling process which has been highly conserved in eukaryotes. Dysfunctions in autophagy process take place in progression of various diseases including cancer. Depend on nature of cancer, autophagy may behave as an oncogenic mechanism as well as a tumor suppressor mechanism. Many intracellular molecules, cellular processes and pathways may play role in regulation of autophagy mechanism. One of them is NFB pathway. NFB, a transcription factor, regulates the expression of a large number of genes involved in important cellular processes. It is known that NFB behaves an autophagy inducer or inhibitor. Many anti-cancer therapies in use effect both autophagy and NFB pathway. Illuminating the functional relationship between the NFB pathway and autophagy can contribute to increase of the effectiveness of cancer treatments by using combined therapies and to development of new strategies. However in the literature, there is no information about how NFB pathway regulates autophagy in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) and detailed mechanism of this regulation. Therefore, in our thesis, we aimed to determine the possible regulatory effect of NFB on autophagy mechanism and possible genes involved in NFB-mediated autophagy regulation in NSCLC. Firstly, we constitued NFB-suppressed and -overexpressed groups in NSCLC cells and subgroups which we induced and not induced autophagy. We determined autophagy levels in these groups by western blotting. As result, we revealed that NFB positively regulates autophagy in NSCLC. After that, in these groups, we detected genes that display different expression profiles between the groups by RNA sequence analysis. We determined the genes that showed decreased expression when NFB was suppressed while their expressions increased in NFB overexpressed autophagy-induced groups as candidate genes which play role in NFB-mediated autophagy regulation. We detected genes which play role in NFB-mediated positive autophagy regulation by confirming RNA sequencing results by qRT-PCR. We think that our study will contribute to the literature in order to find the answer to the question of "How does NFB regulate autophagy in NSCLC and what are the genes involved in this regulation?" Bu çalışma, Öğretim Üyesi Yetiştirme Programı ve PAÜ Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir (Proje No: 2018SABE024).

Recent studies with natural and synthetic boron compounds suggest that these compounds may be effective in the prevention and treatment of cancer. In this context, a synthetic boron compound, Borax pentahydrate (BPH), is aimed to be tested for cytotoxic effect on the glioblastoma multiforme (GBM) model U-87MG cell line representing fourth stage brain cancer in terms of induction of apoptosis and autophagy. Changes in apoptosis and autophagy rates of the research group treated with the specified IC50 dose of BPH were determined by fluorescence-based microcapillary cytometry kit (Muse® Annexin V & Cell Death and Muse® Autophagy LC3-antibody based kit). The data obtained were evaluated using GraphPad Prism 5 statistical program. The IC50 value of BPH in the U-87MG cell line was determined to be 2454μM for cytotoxicity. On the other hand, apoptosis rate was determined as increased 12.79 folds in the BPH treated group compared to the control group, while elevation of autophagy rate is determined as 1.2 folds. In the light of these data, while the cytotoxic effect of BPH on U-87MG cells, which is a model for GBM, is designated, it is understood that cell death pattern occurs through apoptosis instead of autophagy. In addition to these, it is thought that with the support of other new studies BPH may be an alternative agent that can be used in the treatment of GBM., Doğal ve sentetik bor bileşikleri ile yapılan son dönemdeki araştırmalar bu bileşiklerin kanserden korunma ve tedavisinde etkin olabileceğini işaret etmektedir. Bu bağlamda, sentetik bir bor bileşiği olan Boraks pentahidrat (BPH)’ın dördüncü evre beyin kanserini temsil eden glioblastoma multiforme (GBM) modeli U-87MG hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkisi ile apoptoz ve otofaji indüksiyonu yönünden sınanması amaçlanmıştır. BPH’ın belirlenmiş IC50 dozu ile muamele edilmiş çalışma grubunun apoptoz ve otofaji oranlarındaki değişimler floresan temelli mikrokapiller sitometri cihazına uygun kitler (Muse® Annexin V & Hücre Ölümü ve Muse® Otofaji LC3-antikor temelli) aracılığı ile belirlenmiştir. Elde edilen veriler, GraphPad Prism 5 istatistik programı kullanılarak değerlendirilmiştir. Sitotosisite yönünden BPH’ın U-87 MG hücre hattındaki IC50 değeri 2454 μM olarak belirlenmiştir. Diğer taraftan kontrol grubuna oranla BPH ile muamele edilmiş grupta apoptoz oranı 12,79 kat iken otofaji oranının ise 1,2 kat arttığı saptanmıştır. Bu veriler ışığında, BPH’ın GBM’ye model oluşturan U-87 MG hücrelerine sitotoksik etkisi bilenirken, hücre ölümü biçiminin otofaji yerine apoptoz üzerinden gerçekleştiği anlaşılmaktadır. Bütün bunlarla birlikte, BPH’ın yeni araştırmalarla desteklenerek GBM tedavisinde kullanılabilecek alternatif bir ajan olabileceği düşünülmektedir.

Türkiye İstatistik Kurumu 2014 verileri Türkiye'de 2. ölüm nedeni erkeklerde %24,8 kadınlarda %16 oranında kanser varlığı göstermiştir. Otofaji, hücre içerisinde uzun ömürlü protein ve hasar görmüş organellerin, lizozom tarafından uzaklaştırılmasında görevli fizyolojik yolaktır. Otofajide görev alan ATG olarak adlandırılan genlerde oluşan mutasyonların çeşitli kanser ve hastalıkların oluşmasına etkisi olduğu gösterilmiştir. Kanser tedavisinde sıklıkla uygulanan tedavi yöntemi olan radyoterapinin (RT) uygulama sonrası genetik dizi değişikliklerine ve yan etkilere neden olduğu bulunmuştur. Bu epidemiyolojik ve moleküler bilgiler ışığında, bu çalışmada gastrointestinal sistem tümörü (Özefagus, Mide, Rektum) olan ve neoadjuvan RT uygulanan hastalarda, ATG5, ATG12 ve ATG9B genlerinde oluşan ekzon farklılıkları dizi analizi yöntemiyle incelenmiştir. ATG5 ve ATG12 geni için hastaların RT öncesi (RTÖ) ve RT ortası - RT bitiminde (RTS) genomları karşılaştırılmış ve hiçbir fark bulunamamıştır. ATG9B geni incelendiğinde, 4 hastada (%17,4) tüm evrelerde frameshift mutasyon (FS) oluşurken, 2 hastada (%8,7) RTÖ'de ATG9B geninde 8G tekrar içeren bölgede GGG (valin) delesyonu oluşmuş ancak RTS'de bu durum gözlenmemiştir. Bu mutasyonun DNA tamir enzimleri tarafından giderildiği düşünülmüştür. FS görülen hastalarda aminoasit kaybı protein karakterini pozitif non-polardan negatif polara dönüştürürken erken stop kodonu oluşarak 183 aminoasit içeren proteini 146'ya indirerek 37 aminoasit kaybına yol açar. Hastalar RTÖ ve RTS olarak gruplandırıldıklarında, RTÖ CA 19-9 değerleri, ATG9B mutasyon (ATG9BMut) olmuş hastalarda RTÖ'de ATG9B wild-tipi (ATG9BWT) taşıyan hastalara kıyasla yaklaşık 2 kat yüksektir. CEA bakımından RTÖ ve RTS ATG9BWT ayrışması anlamlıdır (Mann-Whitney, p=0,0175). RTS CA19-9'un ATG9BMut ve ATG9BWT olan hastalarda ayrışması anlamlıdır (t-test, p=0,0245). Hastalar FS ve 3G delesyonu olarak gruplandırıldığında, RTÖ'de 3G delesyonu RTS'de ATG9BWT hastaların CA19-9 değerleri anlamlı düşüş gösterirken (t-test, p=0,0165), ATG9B-FS mutasyon hastaların RTS CA19-9 değerleri yükseliş göstermiştir. İncelenen genler kıyas edildiğinde, tandem G mononükleotit tekrarlarının hotspot bölgeler olduğu bulunmuştur. ATG9BMut olan hastalara klinik olarak RT önermemek daha uygun olabilir.Anahtar kelimeler: GIS neoplazmlar, Otofaji, Radyoterapi, Dizileme,Radyogenomik According to data retrieved from Turkish Statistics Institute (TUIK), the second major mortality cause in Turkey is cancer with the rate of 24.8% in men and 16% in women. Autophagy is one of the physiologic cell pathway that is continuously recycling old proteins and renewing damaged organelles by using lysosome. Genes responsible for autophagy pathway is called Autophagy Related Genes (ATG) family and some studies show that; mutations occurring in ATG family genes evoke to various cancer and some pathologic conditions. Radiotheraphy (RT) which is commonly preferred treatment option for cancer patients shows a strong correlation between genetic variation in genome of patients and serious side effects. This epidemiological and molecular information diverted us to conduct exon mutation analysis for ATG5, ATG12 and ATG9B genes of patients who diagnosed with gastrointestinal tumors (esophagus, stomach or rectum) after treatment with neoadjuvant RT. There is no exon variations detected for ATG5 and ATG12 genes before RT and middle-after radiothreaphy (after RT). However for ATG9B gene, exon variation analysis of 4 patients (17.4%) resulted frameshift mutation for before RT and after RT. Exon variation analysis of 2 (8.7%) patients resulted GGG deletion in 8G mononucleotide tandem repeat region but that mutation was eliminated after RT. One can speculate that, this mutation was removed by DNA repair enzymes. FS mutation results in truncated protein (146 aa) which is 37 aa less than WT (183 aa) homolog due to formation of nonsense codon in genetic code. Protein characteristic changed from positive non-polar to negative polar. When patiens assigned to groups as before RT and after RT, CA19-9 levels in ATG9BMut patients is two times more compared to ATG9BWT patients. Differentiation between CEA serum levels in before RT and after RT of ATG9BWT patients is significant (Mann-Whitney, p=0,0175). Differentiation between CA19-9 levels in after RT of ATG9BMut and ATG9BWT patients is significant (t-test, p=0,0245). When patients assigned to groups as FS and deletion mutation; 3G deletion carriers at before RT responded better to RT by resulting decline in CA19-9 levels (t-test, p=0,0165) whereas FS mutation carriers showed rise in CA19-9 levels after RT. When ATG genes are compared, monoguanine repeat regions are most likely to be hotspot for mutations. It may clinically be advised that, patients who carry ATG9BMut allel are not suitable candidate for ameliorating cancer with RT.Key Words: GIS neoplasm, Autophagy, Radiotherapy, Sequencing,Radiogenomics 145

Kronik miyeloid lösemi (KML) 9. ve 22. kromozomların resiprokal translokasyonu sonucu oluşan BCR-ABL füzyon geni nedeniyle oluşan bir hematopoetik neoplazidir. KML tedavisinde kullanılan Tirozin Kinaz İnhibitörlerine karşı gelişen direnç, tedavinin başarısız olmasına neden olmaktadır. Bu proje kapsamında K562 KML hücre serilerine İmatinib uygulanarak İmatinib dirençli hücre serileri elde edilmiş ve bu hücrelerde İmatinib'e karşı gelişen direnç mekanizması kök hücrelilik, tutunma, metabolizma, ER stres ve otofaji yönünden araştırılmıştır. Dirençli hücre serileri K562R-adh (dirençli-yapışan) ve K562R(dirençli-süspanse) olarak iki farklı populasyon temelinde analiz edilmiştir. KML'de İmatinib'e karşı gelişen direnç mekanizmasını tanımlamak amacıyla K562S (duyarlı), K562R ve K562R-adh hücrelerinin integrin ve kök hücre paneli PCR array analiz sonuçları değerlendirilmiştir. İntegrin panelinde dirençten sorumlu olarak her iki hücre serisinde THSB1, VCAN, SELP, ITGB3, ITGB6, COL15A1, ITGA9, ITGA10 gen ifadelerinin anlamlı olarak arttığı belirlenmiştir. Kök hücre panelinde ise dirençli hücrelerimizde DATCH1, ALCAM1, JAG1, CD44, KITLG, ITGA2, GATA3, ABCG2, PTPRC genlerinin yüksek ifade edildiği saptanmıştır. KML'de İmatinib'e karşı gelişen dirençten sorumlu olarak VCAN, SELP, COL15A1, ITGB6 ve ITGA9 genlerinin ifadelerinin arttığı ilk kez bu tez projesinde belirlenmiştir. Özellikle, K562R-adh hücrelerimizde integrin panelinde COL4A2, FN1, ITGA5, ITGA4, LTNNA1, ECM1, LAMC1 ve CNTN1; kök hücre panelinde ise SOX2, KLF4, ALDHA1 ve CD24 kök hücre belirteçlerinin anlamlı bir şekilde yüksek ifade edildiği saptanmıştır. Bu tez projesinin ikinci aşamasında ise, KML'de gelişen İmatinib direncinin yok edilmesinde, mitokondri şaperon (HSP90) inhibitörü olan Gamitrinib'in alternatif ajan olabileceği düşünülerek İmatinib, Gamatrinib ve İmatinib+Gamatrinib ilaç kombinasyonları üç farklı hücre grubuna uygulanmıştır. K562S hücre serisine Gamitrinib uygulandığında İmatinib'den daha yüksek hücre ölümü gözlenmiş olması IM'e alternatif bir tedavi ajanı olabileceğini göstermiştir. Annexin V, kaspaz ve ATP miktar tayini sonuçlarımıza göre, İmatinib'e dirençli hücre serilerinden K562R-adh hücrelerimizde Gamitrinib+İmatinib ile kombine uygulandığında bu hücreleri yüksek oranda apoptoza götürürken, K562R hücrelerimizde ise tek başına Gamitrinib uygulanması ve İmatinib ile kombine uygulanması durumunda yüksek miktarda apoptoza yola açmıştır. Bu sonuç, KML'de gelişen İmatinib direncinde İmatinib+Gamitrinib kombine tedavisinin ilaç direncini gidermek için alternatif bir tedavi protokolü olarak önerilebileceğini göstermektedir. Gamitrinib uygulanan hücrelerde bunlara ilaveten otofaji ve ER stres belirteçleri analiz edilmiş, ancak ilaç uygulanması ile bu yolaklar arasında direkt bir ilişki gözlenmemiştir. Gamitrinib aerobik glikolizi inhibe eden bir ajan olduğu için bazı metabolik genler de araştırılmış ve K562R hücrelerimizde Gamitrinib'in HK2, PKM1 ve LDHA genlerinin ifadesini düşürdüğü ve bu hücrelerin normalde aerobik glikoliz yaparak hücre canlılığını arttırdığı şeklinde yorumlanmıştır. Chronic myeloid leukemia (CML) is a hematopoietic neoplasm (9, 22) (q34, q11) caused by the BCR-ABL fusion gene which is produced as a result of the reciprocal translocation between 9. and 22. chromosomes. Resistance to tyrosine kinase inhibitors used in the treatment of CML causes treatment failure. In this project, Imatinib resistant cell line which was obtained by incubating cells with increasing concentrations of Imatinib was used to analyze resistance mechanisms in terms of stemness, adhesion, metabolism, ER stress and autophagy. Resistant cell lines were analyzed on the basis of two different populations, Radh (adheren) and R (suspension). In order to define the mechanism of resistance against Imatinib in CML; integrin and stem cell signaling PCR array results were analyzed in K562S (susceptible), K562R (resistant-suspension) and K562R-adh (resistant-adherent) cells. THSB1, VCAN, SELP, ITGB3, ITGB6, COL15A1, ITGA9, ITGA10 gene expressions significantly increased in both K562R and K562R-adh cells. In the stem cell panel, DATCH1, ALCAM1, JAG1, CD44, KITLG, ITGA2, GATA3, ABCG2, PTPRC genes were found to be highly expressed in our resistant cells. Increased expression of VCAN, SELP, COL15A1, ITGB6 and ITGA9 genes, which are responsible for resistance to Imatinib in CML, has been identified for the first time in this thesis project. In the stem cell panel, DATCH1, ALCAM1, JAG1, CD44, KITLG, ITGA2, GATA3, ABCG2, PTPRC genes were found to be highly expressed in our resistant cells. The expression of VCAN, SELF, COL15A1, ITGB6, ITGA9, and KITLG genes, which are responsible for resistance to Imatinib in CML, was first identified in this thesis project. In particular, our Radh cells exhibited significantly increased expressions of COL4A2, FN1, ITGA5, ITGA4, LTNNA1, ECM1, LAMC1, CNTN1 and SOX2, KLF4, ALDHA1 and CD24 as integrin and stem cell panel genes respectively. In the second phase of this thesis project, we investigated the effects of Imatinib, Gamatrinib and Imatinib + Gamatrinib drug combinations on three different cell groups considering that mitochondria chaperone (HSP90) inhibitor Gamatrinib might be an alternative agent to Imatinib to eliminate Imatinib resistance in CML. Cell death in K562s cells achieved with Gamitrinib treatment was higher than Imatinib treatment which suggested Gamitrinib as an alternative treatment agent to Imatinib. According to Annexin V staining, caspase activity and ATP quantification results, Gamitrinib induces a high rate of apoptosis when combined with Imatinib in K562R-adh cells. On the other hand, Gamitrinib induces a high rate of apoptosis in K562R cells when applied as a single agent or in combination with Imatinib. This result shows that Imatinib + Gamitrinib combination therapy may be recommended as an alternative treatment protocol to eliminate Imatinib resistance in CML. In addition, autophagy and ER stress markers were analyzed in Gamitrinib-treated cells, but no direct correlation was observed between drug administration and these pathways. Since Gamitrinib is an agent that inhibits aerobic glycolysis, some metabolic genes have also been investigated and it was interpreted that in our K562R cells Gamitrinib reduces the expression of HK2, PKM1 and LDHA genes, and these cells normally do aerobic glycolysis to increase cell viability 232

Ülseratif kolit ve Crohn hastalığını kapsayan inflamatuvar bağırsak hastalıkları (İBH); son yıllarda dünya çapında insidansı gittikçe artan, kronik ve tekrarlayan inflamatuvar bir bozukluktur. Bu çalışmada, 2,4,6 trinitrobenzen sülfonik asit (TNBS) ile kolit oluşturulmuş şıçanların kolon dokusunda, quercetin kullanımının otofajik süreç üzerindeki etkisi ile kolon dokusunda meydana gelen histopatolojik hasarları önleyici/azaltıcı rolü araştırıldı. Bu amaçla 24 adet Wistar Albino sıçandan rastgele 3 grup (Kontrol, kolit ve kolit+quercetin) oluşturuldu. Kolit indüksiyonu; 24 saat öncesinde aç bırakılmış kolit ve kolit+quercetin grubu deneklere, 0,25 ml %30 luk etanol içerisinde hazırlanmış, 25 mg TNBS’in intrarektal yoldan verilmesiyle gerçekleştirildi. Kolit indüksiyonundan hemen sonra başlayarak 7 gün boyunca, kolit+quercetin grubu deneklerine, intragastrik yoldan 100 mg/kg/gün quercetin verildi. Deneklerin günlük olarak vücut ağırlığı ve dışkı takibi yapıldı. Işık mikroskobik incelemeler (mikroskobik skor, Goblet hücre sayısı, mast hücre sayısı, morfometrik ölçümler) ile kolon histopatolojisinin yanı sıra, mukozal Beclin-1 ve p62 immünoreaktivitesi ile de otofaji değerlendirildi. Deneklere TNBS’in rektal yoldan uygulanması; şiddetli diyare ile birlikte belirgin kilo kaybı ile kendini gösteren kolit gelişimine neden oldu. Histopatolojik olarak kolon dokusunda gözlenen; yaygın inflamatuvar hücre infiltrasyonu ile birlikte transmural inflamasyon, yer yer kanama alanları, yüzey epitelinde kayıp ve bozulmalar, Goblet hücre sayısında azalma, kriptlerde yapısal değişiklikler ve kript kaybı ile birlikte atlamalı olarak seyreden mukozal ülserasyon ve erozyon nedeniyle, kolit grubunda yüksek mikroskobik hasar skoru tespit edildi. Ayrıca, baskılanmış otofaji nedeni ile mukozal Beclin-1 immünoreaktivitesinde azalma, p62 immünoreaktivitesinde artış gözlendi. Quercetin tedavisi, kolon dokusunda ortaya çıkan histopatolojik ve otofajik değişiklikleri önemli ölçüde önledi. Bu çalışmanın bulguları; quercetinin, TNBS ile indüklenen kolite bağlı olarak ortaya çıkan otofajik ve inflamatuvar değişiklikleri düzenlemek suretiyle, İBH gelişimini önlemede faydalı olabileceğini göstermektedir. Inflammatory bowel diseases (IBD) including ulcerative colitis and Crohn's disease, is a chronic and recurrent inflammatory disorder of the digestive tract and the incidence of IBD is increasing worldwide. In this study, the effect of quercetin on the autophagic process and its role in preventing / reducing histopathological damage in the colon tissue of rats treated with 2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) were investigated. Twenty-four Wistar albino rats divided from randomly 3 groups (control, colitis and colitis + quercetin). For the colitis induction, TNBS (25 mg) was prepared in 0.25 ml of 30% ethanol and then intrarectally was administered to fasted colitis and colitis + quercetin group of animals for 24 hours. Beginning immediately after the induction of colitis, intragastrically, 100 mg/kg per day quercetin was given for 7 days. Following colitis induction, all rats were monitored daily for body weight and stool consistency. At the end of the experiment, colon tissues were removed and evaluated the colon histopathology by light microscopic examination (microscopic score, Goblet cell count, mast cell count, morphometric measurements), and the autophagy by immunohistochemically mucosal Beclin-1 and p62. Rectal administration of TNBS to rats was caused severe diarrhea accompanied by marked weight loss. Histopathologically; transmural inflammation with diffuse inflammatory cell infiltration, occasional hemorrhagic areas, loss and deterioration of surface epithelium, decrease in number of Goblet cells, crypt distortion, crypt loss and patch-like ulceration were observed in colon of colitic rats. As a result, high microscopic damage score was determined in group. As indicator of suppressed autophagy, we also shown that a decrease in mucosal Beclin-1 immunoreactivity and an increase in p62 immunoreactivity. Quercetin treatment significantly prevented histopathological and autophagic changes in colon tissue of TNBSinduced colitic rats. The findings of this study suggested that quercetin may be useful in preventing and treatment of IBD by regulating autophagic and inflammatory changes in colon

Kadın hastalarda görülen erken ovaryum yetmezliği veya kanser tedavisi gibi fizyopatolojik durumlar fertilizasyonu olumsuz etkilemektedir. Fertiliteyi korumak için oosit, embriyo ve ovaryum dokusu kriyoprezervasyon yöntemleri kullanılmaktadır. Kriyoprezervasyon yöntemlerinin içinde vitrifikasyon yöntemi daha az toksik olması nedeniyle tercih edilir. Ancak bazı durumlarda en uygun yöntemler seçilmesine rağmen yine de hücre ölümü görülebilir. Otofaji, programlı hücre ölüm mekanizmalarından biridir. Otofajik aktivitenin kontrolünde belirteç olan mTOR hücrede protein sentezi ve hücresel büyümeyi kontrol eden bir kinazdır. Bu proteinin baskılanması, otofajiyi aktif hale getirir. Çalışmamızda ovaryum dokusunda vitrifikasyon işlemi öncesi ve sonrasında mTOR ve ve aktif hali olan PmTOR ekspresyonları immunohistokimyasal yöntemle incelenmesi amaçlandı Bu çalışmada 12 haftalık Wistar Albino cinsi sıçanlardan alınan ovaryumlar kontrol (n=6) ve vitrifikasyon (n=6) olmak üzere iki grup oluşturuldu. Kontrol grup için alınan ovaryumlar formalin içinde 48 saat tespit edildi. Vitrifikasyon grubu için alınan ovaryumlar, içinde vitrifikasyon solüsyonu bulunan kriyoviallere konularak -120C◦ de sıvı azot tankı içinde donduruldu. Bir hafta sonra dokular çözdürüldü. Her iki grup rutin parafin takibine alındı. Her bir dokudan 5μm kalınlığında kesitler alındı. Hematoksilen&Eozin boyama ve immünohistokimya işlemi uygulandı. Histolojik boyama yapılan doku örneklerinden tüm foliküller ışık mikroskopunda incelenerek sayımları yapıldı. Elde edilen veriler istatistiksel olarak değerlendirildi. Folikül sayıları kontrol grubu ve vitrifikasyon grubunda istatiksel olarak farklı değildi. Ovar yum dokusunda gelişimin her aşamasındaki foliküller izlenmekteydi. MTOR ekspresyonu her iki gruptaki bütün foliküllerin granülosa hücrelerinde ve oositlerinde kuvvetli pozitifti. PmTOR ekspresyonu ise kontrol grubundaki oositler ve granulosa hücrelerinde pozitif ekspresyon gösterirken vitrifikasyon işleminin uygulandığı gruptaki oositlerde ve granulosa hücrelerindeki negatif eksprese olmuştu.Sonuç olarak bulgularımıza göre vitrifikasyon işleminin ovaryum dokusunda otofajiyi indüklemediğini saptadık. Literatürde oosit kalitesiyle ilişkilendirilen pmTOR aktivitesinin vitrifiye edilen ovaryum dokularında olmaması vitrifikasyon yönteminin oosit kalitesini bozduğunu düşündürtmektedir.Key Words: Ovary, Vitrification, autophagy, mTOR, PmTOR Physiopathological conditions such as early ovarian failure and cancer treatment negatif affect fertilization in female patient. Cryopreservation method was used oocytes, embryos and ovarian tissues to protect fertility. The vitrification method is minimizing toxic due to vitrification is prefered method in cryopreservation methods. However, in some cases, although the most appropriate methods are selected, cell death can be seen. Autophagy is one of the mechanisms of programmed cell death. Mtor is a protein kinase that controls protein synthesis and cellular growth in the cells. Suppression of this protein activates autophagy. The aim of this study was to investigate the mTOR and active form PmTOR expressions before and after vitrification of the ovary tissue by immunohistochemical methodTwo groups were formed: control (n= 6) and vitrification (n= 6) of Ovaries from 12-week-old rats in this study. Control group fixed for 48 hours in buffered formalin. Vitrification group were placed in cryovials with vitrification solution and frozen in liquid nitrogen tank at -120 C. One week later the tissues were thawed. Both groups performed routine paraffin tracking. 5μm sections were taken with microtome from each sample. immunohistochemistry examination for mTOR and PmTOR expression and Hematoksilen&Eozin saining were performed. All foliküllicles in histologically stained tissues were counted and examined by light microscope. Data were evaluated by using statistical methods. Foliküllicle numbers were not statistically different in the control and vitrification groups. foliküllicles showing different developmental stages in ovarian tissue. Mtor ekspression were strongly positive in granulosa cells and oocytes in all foliküllicles in two groups. Although PmTOR has positive expression in oocytes and granulosa cells in control group, it is negative in oocytes and granulosa cells in the vitrification group.In concluiding, Based on our findings, we found that vitrification methods did not induce autophagy in ovarian tissue. The PmTOR activity associated with oocyte quality In the literature. However, the absence of PmTOR activity in frozen over tissues suggested that vitrification deteriorates the quality of oocyteKey Words: Ovary, Vitrification, autophagy, mTOR, PmTOR 57

Ergenlik dönemi ile ileri yaşlardaki bireyleri hedef alan ve sağkalım oranları günümüz teknolojisine rağmen %60-70 oranlarında seyreden osteosarkom yüksek dereceli primer kemik malignitelerinden biridir. Non-spesifik şikayetler ile başvuran hastaların %30'unda teşhis konulduğu anda metastatik lezyonlar izlenmesine ek olarak bu hastaların 5 yıllık sağkalım oranları %20 civarındadır. Farklı kanser türlerinde etkili olan ajanların metastaz potansiyeli yüksek osteosarkom vakalarında da faydalı olup olmayacağı sorusu araştırmacı ve klinisyenleri bu ilaçların farklı hücresel mekanizmalar üzerindeki etkilerini anlamaya yöneltmiştir. Bu etkiler açısından ele alınabilecek ilaçlar arasında statinler de yer almaktadır. Statinler birçok kanser türünde anti-metastatik ve anti-proliferatif etkiler göstermektedir. Benzer şekilde vitamin D'nin de anti-kanser etkiler gösterdiği bilinmektedir. Çalışmadaki amacımız bu iki ajanın MG-63 osteosarkom hücrelerinde TNF- varlığında/yokluğunda ölüm yolakları üzerindeki tek başına ve kombine etkilerini araştırmaktır. Çalışmamızda MG-63 hücreleri, farklı dozlarda atorvastatin (5, 10 ve 50 µM), TNF- (20 ng/mL) ve/veya vitamin D (10-6 M) varlığında 24 ve 48 saat süreyle kültüre edilmiştir. 24 saat kültürden sonra otofajik, apoptotik ve endoplazmikretikulum (ER) stres yolaklarında yer alan proteinlerin ekspresyon düzeyleri qPCR ve akım sitometre analizleri ile, kemik matriks proteini olanosteokalsin'inmRNA seviyeleriqPCR, osteokalsin ve kollajen-1'in protein düzeyleriimmunositokimyasal boyamalar ile değerlendirilmiştir. 24-48 saat sonunda hücre canlılığı ve laktatdehidrojenaz (LDH) düzeyleri ölçülmüş, tedavi süresi boyunca hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleri alınarak morfolojik değişiklikler incelenmiştir. Ayrıca, 48. saatte alkalenfosfataz (ALP) aktivitesi saptanmıştır. Çalışma sonuçlarımıza göre atorvastatin otofajik ve apoptotik yolakta yer alan proteinlerin ve ER stres belirteçlerinin ekpresyonlarınıuyararak MG-63 hücrelerinin canlılığını azaltmış ve matriks protein yıkımına yol açan enzimlerin ekspresyonunu arttırmıştır. Vitamin D MG-63 hücrelerinde ölüm yolakları üzerinde atorvastatin ile birlikte uygulandığında bu yolaklarda mevcut proteinlerin ekspresyonu üzerine atorvastatinin etkilerini zayıflatmıştır. Sonuç olarak, vitamin D'nin osteoblast-osteosit farklılaşmasına yönelik olası etkileri üzerindenatorvastatin ile antagonist etki oluşturabileceğini ve bu nedenle bu ajanların kombine halde verileceği tedavilerde dikkatli olunması gerektiğini düşünmekteyiz. Osteosarcoma is one of the high-grade primary bone malignancies that target adolescence and older individuals and have a survival rate of 60-70% despite current technology. In addition to the presence of metastatic lesions in 30% of patients with non-specific complaints at the time of diagnosis, the 5-year survival rate of these patients is around 20%.The question of whether agents that are effective in different types of cancers will also be useful in cases of osteosarcoma with high metastatic potential has led researchers and clinicians to understand the effects of these drugs on different cellular mechanisms.Statins are among these drugs with such various effects. They have anti-metastatic and anti-proliferative effects in many cancer types. Similarly, vitamin D is known to have anti-cancer effects.The aim of this study was to investigate the effects of these two agents on death pathways (alone and in combination) in the presence/absence of TNF- in MG-63 osteosarcoma cells.In our study, MG-63 cells were cultured in the presence of different doses of atorvastatin (5, 10 and 50 µM), TNF (20 ng/mL) and/or vitamin D (10-6 M)for 24 and 48 hours.After 24 hours of culture, expression levels of proteins in autophagic, apoptotic and endoplasmic reticulum (ER) stress pathways were evaluated by qPCR and flow cytometer analysis. Osteocalcin expressions of bone matrix protein was evaluated by qPCR in mRNA and by immunocytochemical staining in protein levels of osteocalcin and collagen-1. Cell viability and lactate dehydrogenase (LDH) levels were measured at the end of 24-48 hours. Real-time images and morphological changes of the cells were examined during treatment. In addition, alkaline phosphatase (ALP) activity was determined at 48 hours.According to our results, atorvastatin decreased the viability of MG-63 cells by stimulating the expression of autophagic and apoptotic pathway proteins and ER stress markers and increased expression of the enzymes leading to matrix protein degradation.When vitamin D was co-administered with atorvastatin, it weakened the effects of atorvastatin on expression of proteins present in death pathways in MG-63 cells.In conclusion, we think that vitamin D might be antagonizing atorvastatin over its possible effects on osteoblast-osteocyte differentiation and therefore, we suggest that caution should be exercised in the treatment of these agents in combination. 137

Balıkesir Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı, Kanser ülkemizde ve dünya çapında çok fazla rastlanan ciddi sorunlarla yaşamı tehdit eden bir hastalıktır. Kanserli hücrelerin yapısı değiştiğinde normal fonksiyonlarını yapamayıp başka fonksiyonlar kazanırlar. Buğdayın (Triticum aestivum) gelişmekte olan ülkelerde kullanımı gün geçtikçe artmaktadır. Buna bağlı olarak buğday çimeninin önemi de her geçen gün tartışmalara yol açmaktadır. Yapılan çalışmalar tahıl kökenli beslenmenin birçok hastalığa (kanser, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar) karşı koruyucu olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada, buğday çimi (Triticum aestivum L.) ekstresinin (BÇE) farklı konsantrasyonlarının farklı hücre hatları prostat kanser hücre hattı (PC3), insan kordon bağı ven endoteliyal hücre hattı (HUVEC), karaciğer kanser hücre hattı (HEP3B), pankreas kanser hücre hattı (PANC-1) üzerindeki 24, 48 ve 72 saatteki etkileri incelenmiştir. Yapılan canlılık testleri sonucunda en yüksek etkinin PC3 hücrelerinde olduğu belirlenmiştir. BÇE uygulaması PC3 ve HUVEC hücrelerinde morfolojik olarak da değişikliklere sebep olmuştur. PC3 hücrelerine BÇE uygulamasının pro apoptotik BAX ve otofaji ilişkili Beklin 1 gen ekspresyonuna etkileri mRNA seviyesinde Real Time PCR yöntemi kullanılarak ve protein seviyesinde ise Western Blot yöntemi kullanılarak aydınlatılmıştır. Çalışmalarımız sonucunda PC3 hücrelerinde BÇE uygulamasına bağlı olarak meydana gelen hücre ölümünde apoptotik hücre ölüm yolağının etkili olabileceği konusunda veriler elde edilmiştir. Bu çalışma sonucunda elde edilen verilerin kanser tedavisi alanında daha sonra yapılacak çalışmalara ışık tutacağı öngörülmektedir., Cancer is a life-threatening disease with serious problems in our country and worldwide. When the structure of cancerous cells change, they cannot perform their normal functions and gain of new other functions. The use of wheat (Triticum aestivum) in developing countries is increasing day by day. Accordingly, the importance of wheat grass leads to controversy. Studies have shown that cereal-based nutrition is protective against many diseases (cancer, diabetes, cardiovascular diseases). In this study, the effect of different concentrations of wheatgrass (Triticum aestivum L.) extract (WGE) on different cell lines prostate cancer cell line (PC3), human umbilical vein endothelial cell (HUVEC), HEP3B, pancreatic cancer cell line (PANC-1) at 24, 48 and 72 hours time intervals ) was investigated. As a result of vitality tests, the highest effect was observed in PC3 cells. WGE application also caused morphological changes in PC3 and HUVEC cells. The effects of WGE administration on PC3 cells on pro apoptotic BAX and autophagy-related Beclin 1 gene expression were elucidated by using Real Time PCR method at mRNA level and by using Western Blot method at protein level As a result of our studies, data have been obtained that apoptotic cell death pathway can be effective in cell death due to WGE application in PC3 cells. It is predicted that the data obtained as a result of this study will shed light on future studies in the field of cancer treatment., Bu tez çalışması Balıkesir Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP) tarafından 2018/181 nolu proje ile desteklenmiştir.

Açlık genel anlamda insanlarda 12 saat ile üç hafta periyotları arasında değişen hiç veya az miktarda yiyecek alınmasıdır. Besin kısıtlaması; tüm besin değerlerinin değiştirilmeden ad libitum diyetinin(günlük gıda alınımı) yüzdesel olarak azaltılması olarak tanımlanır. Otofaji, çeşitli stresli durumlara besin yoksunluğu, oksidatif stres ve DNA hasarı gibi cevaben hücresel homeostazı korumak için uyarıldığı bilinmektedir. Otofajinin düzenlenmesinde Sirt1 ve Sirt2 için çok yönlü rolleri tanımlamıştır. Sirt1, otofajiyi, otofaji genlerinin (Atg) 5, 7 ve 8 ürünleri gibi otofaji indüksiyon ağının temel bileşenlerinin deasetilasyonu yoluyla doğrudan etkilediği bilinmektedir. Bu çalışmada fareler kontrol, Oruç, S-24, S-48, 1W, 2W, 3W olmak üzere 7 gruba ayrıldı. Gebeliğin 18.5 gününde anneden fetüs ve plasenta alınarak ağırlıkları ve boyları değerlendirildi. Besin kısıtlaması ve açlık uygulanmış farelerin SİRT1, SİRT2, ATG5 ve LC3/AB gibi genlerin organ bazında ve plasenta bölgesel açısından immünohistokimyasal ekspresyon düzeylerine bakıldı. Morfolojik değerlendirme için fetüs ve plasentaların Hematoksilen- Eozin boyamaları yapıldı. Deney sonuçlarına göre besin kısıtlaması ve çeşitli açlık uygulamalarının maternal farelerin fetüs ve plasenta ağılık ve boy ölçümleri arasında anlamlı olarak düşük saptanmıştır. Besin kısıtlaması ve açlık gruplarında immünohistokimyasal sonuçlarına göre plasentada anlamlı bir farklılık görülmemiştir. Ancak fetüs için organ bazında SIRT-1 belirteci için kalp ve sol ekstremite, ATG-5 belirteci için bağırsak ve LC3/AB belirteci için ise karaciğer dokularında anlamlı bulgular bulunmuştur. Bu çalışmanın deney sonuçları doğrultusunda besin kısıtlaması ve çeşitli açlık grupları ve SIRT-1, ATG-5 ve LC3/AB belirteçleri etkili olmakta ve ekpresyon düzeylerini etkilemektedir. In general, fasting is the intake of little or no food in humans, ranging from 12 hours to three weeks. Food restriction; It is defined as the percentage reduction of the ad libitum diet (daily food intake) without changing all nutritional values. Autophagy is known to be stimulated to maintain cellular homeostasis in response to various stressful conditions such as food deprivation, oxidative stress and DNA damage. He described multiple roles for Sirt1 and Sirt2 in the regulation of autophagy.Sirt1 is known to directly affect autophagy by deacetylation of the essential components of the autophagy induction network, such as the products of autophagy genes (Atg) 5,7 and 8. In this study, mice were divided into 7 groups as control, fasting, S-24, S-48, 1W, 2W, 3W. The fetus and placenta were obtained from the mother on the 18.5 days of gestation and their weights and lengths were evaluated. Immunohistochemical expression levels of the genes such as SİRT1, SİRT2, ATG5 and LC3 / AB in organ-based and placental regions of the mice with food restriction and fasting were evaluated. Hematoxylin-eosin staining of fetuses and placentas was performed for morphological evaluation. According to the results of the experiment, it was found that nutrient restriction and various fasting applications were significantly lower between fetus and placenta weight and height measurements of maternal mice. There was no significant difference in the placenta according to immunohistochemical results in food restriction and fasting groups. However, significant findings were found in the organs of the heart and left extremity for SIRT-1 marker, intestine for ATG-5 marker and liver tissue for LC3 / AB marker. 138

Amaç: Kronik rezistans egzersiziyle indüklenen kas kütlesi artışında otofaji-lizozom mekanizmasının temel moleküler düzenlemesini yapan sinyal yolaklarını araştırmak.Gereç ve Yöntem: Sprague Dawley sıçanlar randomize olarak 3 gruba ayrılarak bir gruba rezistans egzersizi (EGZ) yaptırıldı, bir gruba rapamisin tedavisi uygulandı ve bir gruba da hem rezistans egzersizi hem de rapamisin tedavisi birlikte uygulandı. Rezistans egzersizi 8 hafta, haftada 3 gün, gün aşırı olacak şekilde ağırlıkla merdiven çıkma şeklinde yaptırıldı. mTOR inhibitörü rapamisin (1.5mg/kg) 8 hafta boyunca gün aşırı uygulandı. Haftalık kilo takipleri, kas dokusu ağırlığı ve kas kuvveti kaydedildi. Gastroknemius kasından alınan doku örneklerinde p-ULK1, p-Akt, p-p70S6K, Atg13, LC3AB protein ekspresyonları western blot analiziyle ölçüldü. LC3AB ve Atg13 immünfloresans boyamaları sonrası konfokal mikroskopta analiz edildi. Hematoksilen&Eosin boyamasıyla kasın enine kesit alanı hesaplandı. Bulgular: Vücut ağırlığı yalnızca EGZ grubunda başlangıç ağırlığına göre arttı (p

Maya Atg6'nın memeli ortoloğu olan Beclin 1, hücresel stres periyotları sırasında artan, programlı bir hücre sağkalım süreci olan otofajide merkezi role sahip bir proteindir. Açlık, ökaryotik organizmalarda hücresel homeostaziyi sağlamak için otofajiyi uyarmaktadır. Yapılan çalışmalar otofaji proteinlerinin bağırsak bağışıklığı, bariyer görevi ve bağırsak homeostazında temel bir role sahip olduğunu göstermektedir. Ancak açlık ile uyarılan otofajide sıçan ince bağırsak dokusunda Beclin 1'in immün ekspresyonuna dair bilgiye rastlanılmamıştır. Bu çalışma ile 12, 24, 36 ve 48 saat açlığa maruz bırakılan sıçanların ve ad libitum beslenen kontrol grubunun ince bağırsak dokularında Beclin 1 immün ekspresyonu araştırılmıştır. Çalışmada kontrol ve açlık gruplarındaki sıçanlardan immünohistokimya (IHC) analizleri için ince bağırsak doku örnekleri toplanmış, Beclin 1 immün lokalizasyonları belirlenmiş ve elde edilen sonuçlar semiquantitatif olarak değerlendirilmiştir. Çalışma sonucunda kontrol grubu ve açlık gruplarının hepsinin ince bağırsak dokularında Beclin 1 immün ekspresyonlarının pozitif olduğu ancak gruplar arası anlamlı ekspresyon farklarının olmadığı görülmüştür. Beclin 1, the mammalian ortholog of yeast Atg6, is a protein that plays a central rolein autophagy, a programmed cell survival process which increased upon periods ofcellular stress. Starvation stimulates autophagy to maintain cellular homeostasis ineucaryotic organisms. Studies have shown that autophagy related proteins have amajor role in intestinal immunity, barrier function and intestinal homeostasis.However, there was no information on the expression of Beclin 1 in rat small intestinetissue in starvation-induced autophagy. In this study, Beclin 1 immune expression wasinvestigated in small intestine tissues of rats which fasted for 12, 24, 36 and 48 hoursalong with an ad-libitum fed control group. In the study, small intestine tissue sampleshad collected for immunohistochemistry (IHC) analysis from control and fasting rats,Beclin 1 immune localizations were determined and the results were evaluatedsemiquantitatively. As a result of the study, it was found that all of the control andfasting groups had positive Beclin 1 immune expressions in the small intestine tissuesbut there were no significant expression differences between the groups. 73

Çeşitli mikroorganizmaların oluşturduğu infeksiyonların reaktif oksijen bileşikleri (ROS) ve reaktif azot bileşiklerinin (RNS) oluşumuna yol açtığı iyi bilinmektedir. Bu bileşiklerin de intrasellüler oksidan/antioksidan dengeyi değiştirip oksidatif strese neden olduğu birçok çalışmada gösterilmiştir. Oksidatif stres, birçok farklı mekanizma ile DNA hasarı oluşturabilmektedir. DNA hasarı, basit ve onarılabilir baz lezyonlarından, en tehlikeli DNA hasarı olan DNA çift sarmal kırıklarına (DSB) dek oldukça geniş bir yelpazede görülebilir. Radyasyon ve bazı bakteri toksinleri DSB'yi indükleyerek, karsinojeneze yol açabilir. Helicobacter pylori gastrik mukozada kronik infeksiyona neden olan bir Gram negatif bakteridir. Helicobacter pylori infeksiyonu Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı tarafından `Grup I karsinojen` olarak sınıflandırılmıştır. Helicobacter pylori'nin neden olduğu toksisite altında yatan mekanizmalar ve bu bakterinin yol açtığı gastrik karsinojenezin mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Çalışmalar Helicobacter pylori'nin hem doğrudan DNA hasarı yaparak, hem de epigenetik mekanizmalarla genetik instabiliteye neden olduğunu göstermektedir. Helicobacter pylori infeksiyonu konak DNA'sında oksidatif hasara neden olmaktadır. Literatürde, Helicobacter pylori infeksiyonunun oksidatif strese ve DSB'ye neden olduğu ve DSB onarım mekanizmalarını da etkileyebileceğini gösteren çalışmalar mevcuttur. Ancak, Helicobacter pylori infeksiyonu ile oksidatif stres arasındaki ilişkiyi inceleyen yeterli sayıda çalışma bulunmamaktadır. Bu verilerin ışığında gerçekleştirilen tez kapsamında, gastrik adenokarsinoma (AGS) hücrelerinin Helicobacter pylori'ye maruziyeti sonucu ortaya çıkabilecek olası sitotoksisite, intrasellüler ROS artışı ve oksidatif stres, DNA baz lezyonları, DNA onarım proteinlerindeki değişiklikler, apoptotik ve otofajik değişiklikler detaylı bir şekilde araştırılmıştır. Ayrıca, AGS hücrelerinin Helicobacter pylori'yle infekte olması sonucu, hücrelerde DSB'nin bir biyogöstergesi olan histon 2A ailesi üyesi X (H2AX) fosforilasyonunun (-H2AX) belirlenmiştir. Diğer taraftan, DSB onarım yolaklarıyla ile Helicobacter pylori maruziyeti sonucu ortaya çıkabilecek DSB'lerin onarılabileceği de düşünülerek çalışmaya bir DSB onarımında önemli rolü olan DNA-protein kinaz (DNA-PK) inhibitörü eklenmiş ve ilgili parametreler DNA-protein kinaz inhibitörü varlığında da ölçülmüştür. Bu şekilde, DSB onarımı bozulmuş bireylerde Helicobacter pylori infeksiyonunun neden olabileceği olası durumun öngörülmesi planlanmıştır. Elde edilen sonuçlar, Helicobacter pylori infeksiyonunun özellikle DNA-PK inhibitörü varlığında oksidatif streste önemli artışlara, DNA onarım proteinlerinde değişikliklere ve g-H2AX düzeylerinde belirgin artışlara yol açtığı ve apoptozu ve otofajiyi tetiklediği görülmüştür. Diğer taraftan, Helicobacter pylori ve DNA-PK inhibitörü birlikte maruz kalan grupta apoptoz ve otofajinin çok daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak, Helicobacter pylori infeksiyonunun özellikle DSB onarımında sorun olan hücrelerde ciddi sorunlara yol açabileceği belirlenmiştir. It is well-known that infections caused by various microorganisms lead to the formation of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS). Several studies have shown that these species can change the intracellular oxidant/antioxidant balance and cause oxidative stress. Oxidative stress can cause DNA damage by many different mechanisms. DNA damage can be observed in a wide range, from simple and repairable base lesions to DNA double-strand breaks (DSBs),which are the most dangerous DNA damage types. Radiation and some bacterial toxins can casue carcinogenesis by inducing DSBs. Helicobacter pylori is a gram negative bacterium that causes chronic infection in gastric mucosa. Approximately 50% of the world's population has been reported to be infected with chronic Helicobacter pylori infection which causes gastritis, peptic ulcer, stomach adenocarcinoma and gastric mucosal lymphoma. Helicobacter pylori infection is categorized as `Group I carcinogen` by the International Agency for Research on Cancer. The mechanisms underlying the toxicity of Helicobacter pylori infection and the mechanism of gastric carcinogenesis caused by this certain bacterium are not fully understood yet. Studies show that Helicobacter pylori infection can cause genetic instability both by direct DNA damage and by epigenetic mechanisms. Helicobacter pylori infection causes oxidative damage nuclear and mitochondrial DNA of the host. In addition, it can lead to chromosomal instability, microsatellite instability and mutations by affecting DNA methylation. There are studies in literature that show Helicobacter pylori infection can cause DSBs, oxidative stress and may also affect DSB repair mechanisms. However, there are not many studies that investigate the association between Helicobacter pylori infection and oxidative stress. Studies to date have generally been conducte on clinical specimens, and focused on the direct treatment of infection rather than focusing on the toxicity mechanisms of the bacterium. In the light of these data, the possible cytotoxicity, intracellular ROS elevations, and oxidative stress, DNA base lesions, changes in DNA repair proteins, apoptotic and autophagic changes caused by Helicobacter pylori in gastric adenocarcinoma (AGS) cell line were investigated in detail in this thesis. In addition, AGS cells which were infected with Helicobacter pylori were investigated for the presence of histone 2A family X (H2AX) phosphorilation (-H2AX), a biomarker of DSBs. On the other hand, by evaluating that DSBs caused by Helicobacter pylori can be repaired, a DNA-protein kinase (DNA-PK, an important DSB repair protein) inhibitor was also included to the study and the related parameters were measured. Thus, we planned to foresee the outcomes of Helicobacter pylori infection in people which disrupted DSB repairs. According to the results, Helicobacter pylori infection caused significant increases in oxidative stress, changes in DNA repair proteins and increases in g-H2AX levels, particularly in the presence of DNA-protein kinase inhibitor. Moreover, Helicobacter pylori infection triggered apoptosis and autophagy and cell death was significantly higher in both DNA-protein kinase inhibitor and Helicobacter pylori -exposed group. 231

Proteinlerin sentezinin, katlanmasının, taşınmasının ve yıkımlarının kontrolü proteostazın sürdürülmesi için şarttır. Hücre içi protein yıkımı ubikitin-proteazom sistemi ve otofaji sistemi tarafından gerçekleştirilmektedir. Mikrotübül-ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3B protein otofaji markırlarından biridir ve fosfatidiletanolamin ile konjuge olarak mikrotübül-ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3B-II olarak adlandırılan formda otofagazom yapısına girer. Isı şok proteini 70; proteinlerin katlanma, disagregasyonunda ve yıkımında rol oynayan önemli bir şaperondur. Literatürde karaciğerde akrilamidin ısı şok proteini 70 düzeylerine, ubiquitin-proteazom sistemine veya otofajiye etkisini araştıran bir çalışmaya rastlamadık. Bu çalışmada, insan kaynaklı hepatoma hücrelerinde akrilamidin protein yıkım yolları üzerine etkilerini araştırmayı amaçladık. Akrilamidin etkisinin araştırılması amacıyla HepG2 hücreleri 24 saat boyunca 10 1 , 10 2 , 10 3 ve 10 4 µM konsantrasyonlarda akrilamid ile inkübe edildi. Hücre canlılığı 3-(4,5Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolium bromür testi ile değerlendirildi. Isı şok proteini 70, ubikitinlenmiş protein ve mikrotübül-ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3B-II protein düzeyleri western blot yöntemiyle ölçüldü. Akrilamid, 10 2 , 10 3 ve 10 4 µM konsantrasyonlarda hücre canlılığını anlamlı olarak azalttı. 10 4 µM akrilamid; ısı şok proteini 70, ubikitinlenmiş protein ve mikrotübül-ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3B-II protein düzeylerinde anlamlı azalmaya yol açtı. Sonuç olarak, çalışmamız akrilamidin HepG2 hücrelerinde; hücre canlılığını azalttığını, ısı şok proteini 70, ubikitinlenmiş protein ve mikrotübül-ilişkili protein 1A/1Bhafif zincir 3B protein düzeylerini arttırdığını gösterdi. Bu çalışma ile insan kaynaklı hepatoma hücrelerinde akrilamidin özellikle yüksek konsantrasyonlarda protein yıkım yollarının çalışmasını bozduğu gösterilmiştir. The control of synthesis, folding, transporting and degradation of proteins is essential for maintaining proteostasis. The degradation of intracellular proteins are performed by ubiquitin-proteasome system and autophagy. Microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3B is an autophagy marker and enters to autophagasome structure by its conjugated form with phosphatidylethanolamine which is called as microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3-II. Heat shock protein 70 is an important chaperone which plays role on the folding, dissagregation and degradation of proteins. In literature, we did not encounter any study which investigates the effect of acrylamide on heat shock protein 70 levels, ubiquitinproteasome system or autophagy in liver. In present study, we aimed to investigate the effect of acrylamide on protein degradation pathways in human-derived hepatoma cells. In order to investigate the effects of acrylamide, HepG2 cells were incubated with acrylamide at 10 2 , 10 3 ve 10 4 µM concentrations for 24 hours. Cell viability was evaluated by 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay. Heat shock protein 70, ubiquitinated protein and microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3B protein levels were measured by western blotting. Acrylamide at 10 2 , 10 3 ve 10 4 µM concentrations significantly decreased cell viability. 10 4 µM acrylamide caused a significant increase on heat shock protein 70, ubiquitinated protein and microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3B-II protein levels. As a result, our study showed that acrylamide decreases cell viability and increases heat shock protein 70, ubiquitinated protein and microtubule-associated protein 1A/1B lightchain 3B-II protein levels in HepG2 cells. With the present study, it has been shown that acrylamide, especially at high concentrations, disrupts protein degradation pathways in human-derived hepatoma cells.

Çelik, H. The Effect of Atorvastatin on Sestrin-2, Sirtuin-1, TPP1 and LC3B in Amyloid Beta Induced Alzheimer’s Disease Model in Human Neuroblastoma Cell Culture. Hacettepe University Graduate School of Health Sciences, M.Sc. Thesis in Pharmacology, Ankara, 2019. Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease characterized by the accumulation of amyloid-beta (Aβ) peptides and the formation of neurofibrillary tangles in the brain, accompanied by neuronal loss and inflammation, decreased cognitive functions and dementia. Disorders in lipid metabolism are thought to be associated with the development of AD. The fact that cholesterol affects the formation of Aβ from amyloid precursor protein (APP) reveals the need for investigating the pathogenesis of AH in terms of Aβ-cholesterol pathways. Recent studies have shown that there is a close relationship between the pathology of AH and autophagy pathways. Autophagy is a vital in the cleavage and removal of protein aggregates, such as Aβ, which is the reason of AD pathology, by lysosomal destruction. The aim of this study was to investigate the role of cholesterol-related pathways in sestrin-2 (SESN2), sirtuin-1 (SIRT1), a lysosomal enszyme tripeptidyl peptidase 1 (TPP1) ve microtubule associated protein light chain-3 (LC3B) proteins, which are thought to be responsible for antioxidant and autophagy-inducing mechanisms. Aβ (10 μM) applied to human neuroblastoma (SH-SY5Y) cell line and increased SESN2 expression, decreased SIRT1 expression. Co-administration of atorvastatin (1μM) has been shown to inhibit 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase enzyme and lipid peroxidation indicator malondialdehyde (MDA) in these cells. The autophagy marker LC3B increased with co-administration of Aβ (10 μM) and atorvastatin (1μM). No change has been shown in the levels of the lysosomal enzyme TPP1. In this thesis, we can conclude that atorvastatin has a pharmacological effect during Aβ damage by regulating the expression of SESN2, SIRT1 and LC3B proteins as well as HMG-CoA reductase enzyme inhibitor and antioxidant effect. HÜBAB (Proje Numarası: THD-2017-13478) ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xi TABLOLAR xv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Alzheimer hastalığı (AH) 4 2.2. Alzheimer hastalığı (AH) oluşumu ile ilgili hipotezler 4 2.2.1. Kolinerjik Hipotez: 4 2.2.2. Aβ Kaskad Hipotezi 5 2.2.3. Tau Hipotezi 6 2.2.4. Kolesterol Hipotezi 6 2.3. Alzheimer Hastalığı (AH) ve Oksidatif Stres 7 2.4. Lizozomlar ve Otofaji 8 2.5. Otofaji-lizozom yolağı (ALP) ve Alzheimer Hastalığı (AH) ile ilişkisi 12 2.6. Sestrinler (SESN’ler) 14 2.7. Sirtuinler (SIRT’ler) 18 2.8. Tripeptidil peptidaz 1 (TPP1) 23 2.9. Statinler 24 3. GEREÇ VE YÖNTEM 27 3.1. Hücre Kültürü 27 3.1.1. Hücrelerin Pasajlanması 27 3.1.2. Deneysel AH Hücre Kültürü Modeli için Aβ1-42 proteinin hazırlanması 27 x 3.1.3. Sitotoksisite Deneyleri 28 3.1.4. Deney Gruplarının Oluşturulması ve Tedavisi 29 3.1.5.Hücrelerden Total Protein Ekstrelerinin Elde Edilmesi 29 3.2. Western Blot 30 3.3. ELISA Lipid Peroksidasyon Testi 31 3.4. ELISA HMG-KoA Aktivite Tayini 32 3.5. Kullanılan Çözeltiler 32 3.6. Kimyasallar ve Malzemeler 33 3.7. Kullanılan Cihazlar 34 3.8. İstatistiksel Analiz 34 4. BULGULAR 35 4.1. Sitotoksisite Sonuçlarının Değerlendirilmesi 35 4.2. İn vitro Aβ1-42 ve Atorvastatin Uygulamasının Otofaji ile İlişkili Proteinlere Etkisinin Karşılaştırılması 37 4.3. İn vitro Aβ1-42 ve Atorvastatin Uygulamasının Lipid Peroksidasyon Göstergelerine Etkisi 45 4.4. İn vitro Aβ1-42 ve Atorvastatin Uygulamasının HMG-KoA Enzim Aktivitesine Etkisi 46 5. TARTIŞMA 47 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 55 7. KAYNAKLAR 56 8. EKLER Ek 1. Tez Çalışması ile İlgili Etik Kurul İzni Ek 2. Orijinallik Ekran Çıktısı Ek 3. Dijital Makbuz 9. ÖZGEÇMİŞ Çelik, H. İnsan Nöroblastoma Hücre Kültüründe Amiloid Beta ile Oluşturulan Alzheimer Hastalığı Modelinde Atorvastatinin Sestrin-2, Sirtuin-1, TPP1 ve LC3B Ekspresyonuna Etkisi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakoloji Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2019. Alzheimer hastalığı (AH), beyinde amiloid-beta (Aβ) peptidlerin birikimi ve nörofibriler yumakların oluşumu ile karakterize, bilişsel fonksiyonların azaldığı ve demansın gözlendiği nörodejeneratif bir hastalıktır. Lipid metabolizmasındaki bozuklukların AH gelişimi ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Kolesterolün amiloid prekürsör protein (APP)’den Aβ oluşumunu etkilediğinin gösterilmesi, AH patogenezinin Aβ-kolesterol yolakları açısından araştırılması ihtiyacını ortaya koymaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar AH patolojisi ile otofaji yolakları arasında da yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. Otofaji, AH’nın patolojisini oluşturan Aβ gibi protein agregatlarının lizozomal yıkımla parçalanmasında ve hücreden uzaklaştırılmasında yaşamsal öneme sahiptir. Nörodejeneratif hasara ve Aβ toksisitesine karşı koruyucu olarak değiştikleri gösterilen, bu etkilerinde antioksidan ve otofajiyi indükleyici mekanizmaların sorumlu olduğu düşünülen sestrin-2 (SESN2) ve sirtuin-1 (SIRT1) ile lizozomal bir enzim olan tripeptidil peptidaz 1 (TPP1) ve otofaji belirteci mikrotübülle ilişkili protein hafif zinciri (LC3B) proteinlerinin etki mekanizmalarında kolesterol düşürücü atorvastatinin rolünün araştırılması amaçlanmıştır. İnsan nöroblastoma (SH-SY5Y) hücre hattına uygulanan Aβ (10 μM)’nın SESN2 ekspresyonunda artış, SIRT1 ekspresyonunda azalma yaptığı, eşzamanlı atorvastatin (1μM) tedavisinin bu proteinlerdeki değişiklikleri kontrol seviyelerine geri döndürdüğü ayrıca hücrelerde 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A'yı (HMG-KoA) ve lipid peroksidasyonunun göstergesi malondialdehiti (MDA) inhibe ettiği gösterilmiştir. Otofaji belirteci LC3B, Aβ (10 μM) ile atorvastatinin (1μM) eşzamanlı uygulaması ile artmış, lizozomal bir enzim olan TPP1 seviyelerinde ise değişiklik olmamıştır. Bu tez çalışmasında, atorvastatinin Aβ hasarı sırasında farmakolojik etkisini, HMG-KoA redüktaz enzim inhibitörü ve antioksidan etkisinin yanı sıra, SESN2, SIRT1 ve LC3B proteinlerinin ekspresyonlarını değiştirerek gösterdiği sonucuna varabiliriz.

Tam başkalaşım geçiren Bombyx mori ipek böceğinin orta bağırsağı larval-pupal metamorfoz sırasında yeniden şekillenme sürecine girmektedir. Larval orta bağırsak epitelinin olgun hücreleri otofaji ve apoptoz mekanizmaları ile tamamen dejenere olmaktadır. Larval kök hücreler büyüme, çoğalma, ve farklılaşma geçirerek pupal epitelin oluşumunu sağlamaktadır. Otofaji hücre içi makro moleküllerin ve organellerin yanlış katlanma, eskimiş olma, kullanılmama ve hasar görmesi durumlarında parçalanması ve yapı taşlarının geri kazanılmasını sağlayan hücre içi geri dönüşüm mekanizmasıdır. Otofaji kök hücrelerin kendini yenilemesini, çoğalmasını ve farklılaşmasını sağlayan kritik bir mekanizma olduğu düşünülmektedir. Bu süreçlerde kök hücrelerdeki en önemli mekanizmanın otofaji olduğu düşünülmektedir. Hücrelere yeniden şekillenme sürecinde besin ve enerji kaynağı sağlamaktadır. Bu çalışmada Bombyx mori'de pupal orta bağırsağı oluşturan kök hücrelerde otofaji mekanizmasının rolü araştırılmıştır. Bu amaçla 5. larval evrenin farklı günlerinde ve dozlarda klorokuin uygulaması enjeksiyon yolu ile gerçekleştirilmiştir. Bu uygulamalar sonrası morfolojik ve biyokimyasal analizler gerçekleştirilmiştir. Otofaji mekanizmasının baskılanması larval-pupal deri değişimini engellemiş ve Bombyx mori'nin ölümüne neden olduğu gösterilmiştir. Ayrıca otofaji mekanizması klorokuin ile engellendiğinde kök hücrelerde çoğalma oranının azaldığı ve farklılaşmanın engellendiği gözlenmiştir. Otofajinin, kök hücrelerin hem çoğalma hem de farklılaşma süreçlerinin başlangıcında önemli rolleri olabileceğine ilişkin güçlü kanıtlar elde edilmiştir. Özellikle memeli ve böcek kök hücrelerinin benzerliklerinden dolayı, elde edilen sonuçlar sadece böcek fizyolojik çalışmalarında değil tür farkı gözetmeksizin farklı kök hücrelerinin biyolojilerinin anlaşılmasına da katkı sağlayacaktır. Anahtar kelimeler: Bombyx mori, orta bağırsak, kök hücre, otofaji, Midgut of silkworm Bombyx mori which passes complete metamorphosis, go into remodelling timing during larval-pupal metamorphosis. Mature cells of larval midgut epithelium is completely dejenerated with apoptosis and autophagy mechanisms. Larval stem cells lead to formation of pupal epithelium passing growing, proliferating and differentiation. Autophagy is intracellular recycling mechanism which leads in cases of false folding, being old, disused, damaged intracellular macro molecules and organels broken down and recovered of integral parts. It is thought that autophagy which provides self-renewal, proliferating and differentiation of stem cells, is a critical mechanism. It is supposed that, in these processes, autophagy is the most important mechanism in stem cells. This provides food and energy source during remodelling into cells. İn this study, autophagy mechanism's role was searched in stem cells which is formated pupal midgut in Bombyx mori. With this aim, it was realized in different days of 5. larval stage and different doses using chloroquine via injection. After these practices, it was performed morphological and biochemical analysis. Being inhibition of autophagy mechanism blocked larval-pupal molting and it was showed that causing death of Bombyx mori. Also, when Autophagy mechanism was blocked by chloroquine, proliferation ratio decreased in stem cells and seemed stopping of differentiation. It was obtained powerfull evidences of autophagy, stem cells in beginning of both proliferation and differentiation timing, may have important roles. Due to similarity of mammals and insect stem cells, it will contribute, obtained results not only in insect physiology studies but also not looking out for difference of species different stem cells'biologies understanding.

`ERKEK İNFERTİLİTESİ TANISI ALMIŞ BİREYLERİN SPERMLERİNDE OTOFAJİ BELİRTEÇLERİNİN ARAŞTIRILMASI`CAN K. N. Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Histoloji ve Embriyoloji Programı Doktora Tezi, Aydın, 2018.İnfertilite sadece fizyolojik olarak değil, psikolojik ve sosyolojik yönleri ile de ele alınması gereken önemli bir sağlık sorunudur. İnfertilite günümüzde üreme çağındaki çiftlerin % 10- 15' ini etkilemektedir. Erkek faktörüne bağlı infertilite ise bu oranın yaklaşık olarak %30-40'ını oluşturmaktadır. Normal erkek fertilitesinin korunması morfolojisi normal, yeterli ve hareketli sperm üretimine dayanır. İnsan spermatozoası, otofaji aktivasyonu için gerekli olan moleküler mekanizmaya sahiptir. Bu mekanizma, insan sperm fizyolojisinde canlılığı ve motiliteyi korumada görev almaktadır. Otofaji işlevselliğini yitirmiş olan proteinlerin, sitoplazmik yapıların ve organellerin parçalanmasından sorumlu fizyolojik bir süreçtir. Otofaji mekanizmasında meydana gelebilecek bir bozulma hücre canlılığını olumsuz yönde etkilemektedir. Bu bilgiler ışığı altında biz yapmış olduğumuz bu çalışmada 4 grup oluşturduk. Grup1: Kontrol Grubu: Hiçbir infertilite rahatsızlığı bulunmayan Dünya Sağlık Örgütü (WHO 2010) semen parametrelerine göre normal kabul edilen hastalar, Grup:2 Varikosel Grubu: Varikosel teşhisi almış ve diğer infertilite nedeni olan hastalıkları bulunmayan hastalar ve Grup:3 Enfeksiyon Grubu: Orşit-Epididimit teşhisi almış ve diğer infertilite nedeni olan hastalıkları bulunmayan hastalar Grup 4: Açıklanamayan İnfertilite Grubu: Açıklanamayan İnfertilite teşhisi almış ve diğer infertilite nedeni olan hastalıkları bulunmayan hastalar. Her bir gruba dahil edilen hastaların sperm parametreleri WHO 2010 kriterlerine göre değerlendirildi. Ayrıca her bir hasta grubundan alınan örneklere yayma preparat ile LC3A/B, Beclin-1, p62, ATG5, ATG12 ve ATG16 antikorları ile immunohistokimyasal olarak boyama yapıldı. Her bir hasta grubunadan alınan örneklere LC3A/B ve Beclin-1 antikorları ile western blot analizi yapıldı ve her bir hasta grubu Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) kullanılarak ultrasitrüktürel olarak incelendi.Elde ettiğimiz sonuçlar doğrultusunda normal insan spermatozoasında işlevsel olarak var olduğu bilinen otofaji belirteçlerinin hasta gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı derecede arttığını gözlemledik. Yapmış olduğumuz western blot analizi ve ultrastrüktürel incelemelerde bu elde ettiğimiz verileri destektemekteydi. Bu sonuçlarda bize varikosel, orşit-epididmit gibi rahatsızlıkların otofaji mekanizmasında bozulmaya neden olabileceğini göstermiştir. Bu mekanizmanın açığa çıkarılması yeni tedavi seçenekleri oluşturulmasının kapısını açacaktır. Ayrıca yapılan tüm araştırmalara rağmen açıklanamayan erkek infertilitesi teşhisi konmuş vakalarda da otofaji belirteçlerindeki bu artışın, yeni teşhis ve tedavi alternatiflerinin geliştirilmesi yönünden bilime katkı sağlayacağı kanaatindeyiz.Anahtar Kelimeler: İnfertilite, sperm, otofaji. `INVESTIGATION OF AUTOPHAGY MARKERS IN THE SPERMS OF MALE INFERTILITY DIAGNOSED INDIVIDUALS`CAN K. N. Adnan Menderes University Institute of Health Sciences Histology and Embryology Program PhD Thesis, Aydın, 2018.Infertility is an important health problem not only physiologically but also psychologically and sociologically. Infertility affects 10-15% of the reproductive couples today. Infertility due to male factor accounts for approximately 30-40% of this ratio. The preservation of normal male fertility is based on the production of morphologically normal, adequate and mobile sperm. Human spermatozoa has the molecular mechanism necessary for autophagy activation. This mechanism is responsible for maintaining vitality and motility in human sperm physiology. Autophagy is a physiological process responsible for the disruption of proteins, cytoplasmic structures and organelles that have lost their functionality. A disruption that may occur in the autophagy mechanism affects the cell viability negatively. In this study we have created 4 groups:Group 1: Control Group: Patients without any infertility disorders who are considered normal according to the World Health Organization (WHO 2010) semen parameters.Group 2: Varicocele Group: Patients diagnosed with varicocele but without other infertile diseases.Group 3: Infection Group: Patients diagnosed with Orchitis- epididymitis but without other infertile diseases.Group 4: Unexplained Infertility Group: The group in which the patients were diagnosed with an unexplained infertility diagnosis (without other infertile disease).The sperm parameters of patients included in each groups were assessed according to the WHO 2010 criteria. Immunohistochemical staining was also performed with LC3A/B, Beclin-1, p62, ATG5, ATG12 and ATG16 antibodies in the specimens obtained from each patient group. Samples from each patient groups were subjected to western blot with LC3A/B and Beclin-1 antibodies. In addition, each patient group was examined ultrastructurally using TEM microscopy. We observed that autophagic markers known to be functionally present in normal human spermatozoa increased significantly in patient groups compared to the control group. The western blot and ultrastructural studies that we have done have also supported the data we have obtained. These results have shown us that such disorders as varicocele, orchitis-epididitis may cause deterioration in autophagy mechanism. The discover of this mechanism will open the door to the creation of new treatment options. In addition, we believe that this increase in autophagic markers will shed new light on the development of new diagnostic and therapeutic alternatives for unexplained infertility cases.Key Words: Infertility, Sperm, Autophagy. 129