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[ES] QQS es un gen huérfano que tiene un papel relevante en el metabolismo del almidón incrementando el ratio nitrógeno/carbono, un rasgo agronómicamente muy interesante que se puede conseguir sobreexpresando QQS en arroz, soja y maíz (Li et al., 2009 y 2015). Además, QQS está relacionado con la protón ATPasa de la membrana plasmática (en Arabidopsis, AHA) responsable del crecimiento celular y la toma de nutrientes. Micromatrices de pérdida de función de las dos principales isoformas, aha1-6 y aha2-4, muestran niveles bajos de mRNA de QQS (Haruta et al., 2012). Este mismo fenómeno ocurre cuando se le añade al medio externo ácido acético a pH 5.5. Al mismo pH, la planta transgénica promQQS::QQS-GFP muestra una expresión baja, mientras que al subir el pH del medio a 7,5 la proteína QQS-GFP se induce. Una posterior publicación asigna a QQS la tarea de acompañar al interior del núcleo el factor de transcripción NF-YC4. Este pertenece a la familia NF-YCs, que se comporta como inhibidores transcripcionales de la bomba de protones. Posteriormente, analizando las secuencias de zonas promotoras de los AHAs se pone de manifiesto que AHA2 tiene 5 cajas CCAAT típicas de los NF-Ys, mientras que AHA1 tiene solo un par de ellas. El análisis de expresión mediante QRT-PCR de líneas de ganancia de función de QQS y NF-YC4 (NF-YC4 OE) muestran inhibición específica de la expresión del gen AHA2. En las mismas condiciones, la pérdida de función de QQS y el triple mutante nf-yc3,4,9 tienen aumentadas su expresión. El Western blot de la línea promQQS::QQS-GFP con anticuerpo contra GFP revela que QQS sube de expresión a lo largo del periodo de luz, y con la oscuridad desaparece. Las mismas muestras con anticuerpo contra las principales isoformas de AHAs muestran que ellas tienen una expresión constante y solo al final de la noche hay un pico de expresión. En pgm1 (enzima del cloroplasto que sintetiza glucosa-6-fosfato) tanto QQS como los AHAs a lo largo del día tienen una expresión que difiere de la de los controles. Otro mutante que afecta a los niveles de la glucosa-6-fosfato es hxk/gin2, con el cual se realiza un tratamiento con sacarosa tras pasar por una fase de ayuno, observándose que este azúcar induce la expresión de AHA2, aunque inhibe en los mutantes NF-YC4 OE y hxk1. En este caso pgm1 no parece ser limitante. Al analizar el promotor de AHA2, se observa una caja similar a la del gen FLC (FLOWERING LOCUS C). El factor de activación clave de ese gen se llama ptm, que procede de la pared del cloroplasto y reconoce una región de 63 pares de bases. El análisis de expresión del mutante ptm muestra una expresión reducida de AHA2, mientras que en líneas constitutivas con una versión truncada muestran sobreexpresión de la misma. Todo esto, nos ha llevado a comprobar si ptm reconoce la caja del promotor AHA2 mediante un ensayo de One Hybrid en levadura., [EN] QQS is a gene that has a relevant role in the starch metabolism by increasing the nitrogen / carbon ratio, an agronomically interesting feature that can be reached by overexpressing QQS in rice, soybeans and corn (Li et al., 2009, Li et al., 2015) . In addition, QQS is related to the proton ATPase of the plasma membrane (in Arabidopsis, AHA), responsible for cell growth and nutrient intake. Microarrays of loss of function of the two main isoforms of AHA, aha1-6 and aha2-4, show low levels of QQS mRNA (Haruta et al., 2012). A subsequent publication assigns to QQS the task of facilitating the entry into the core of the transcription factor NF-YC4. This is a member of the NF-YCs family, which behave as transcriptional inhibitors of the proton pump. Subsequently, analyzing the sequences of the AHAs promoters, it is revealed that AHA2 has 5 CCAAT boxes typical of the NF-Ys, while AHA1 has only a couple of them. qRT-PCR expression analysis of QQS and NF-YC4 function gain lines (NF-YC4 OE) indicates specific inhibition of AHA2 gene expression. Under the same conditions, the loss of the QQS function and the triple mutant nf-yc3,4,9 have increased expression. The activation factor of that gene is called PTM, which is derived from the reduction of chloroplast and a region of 63 base pairs is recognized. The analysis of the expression of the mutant ptm2 (At5g22760), a gene of the family of the already described PTM, shows a reduced expression of AHA2, while in the constitutive lines with a truncated version show the overexpression of AHA2. Because of that, we are checking if PTM2 recognizes the AHA2 promoter box by means of a One Hybrid test in yeast.

[ES] La longevidad de semillas es el tiempo durante el cual las semillas son capaces de germinar. Esta capacidad de germinación se reduce en el tiempo debido a las condiciones de almacenaje, y factores físicos externos como la temperatura y la humedad la reducen en gran medida. No obstante, son múltiples los mecanismos de protección de las semillas para paliar estos daños. Todos estos mecanismos están controlados transcripcionalmente durante el desarrollo de la semilla, y cada especie vegetal sigue su propio programa, causando una variación en la longevidad de las semillas de las diferentes especies. La planta Arabidopsis thaliana se usa mundialmente como especie modelo y dispone de colecciones de mutantes para hacer estudios de genética directa. En uno de estos estudios, realizado en el laboratorio de Ramón Serrano en el IBMCP (UPV-CSIC), se obtuvo un mutante de activation-tagging cuya longevidad de semilla era mayor. Dicho mutante sobreexpresa el gen que codifica el factor de transcripción COG1. El análisis de sus semillas revela una capa de suberina mucho mayor que la de las semillas de las plantas silvestres, y podría ser la explicación de esta mayor longevidad de las semillas debido a una mayor impermeablización ante el agua y el aire, previniendo así eventos oxidativos deletéreos para las semillas. (Bueso, et al., 2016) En este estudio se pretende conocer mejor el papel del factor de transcripción COG1. Concretamente se va a estudiar la regulación transcripcional del gen COG1. Un primer análisis consistirá en localizar la expresión de dicho gen durante el desarrollo de la semilla mediante plantas con el promotor de COG1 unido a la proteína reportera GFP. La segunda estrategia consistirá es buscar factores de transcripción que están implicados en el desarrollo de la cubierta de la semilla y/o en la longevidad de la semilla, que regulen directamente a la región promotora del gen COG1. Para dicha estrategia se usará la técnica yeast one-hybrid en el sistema heterólogo Saccharomyces cerevisiae., [EN] Seed longevity is defined as time during which seeds are able to germinate. This germination capacity decreases over time due to storage conditions. External physical factors such as high temperature and high humidity greatly reduce it. However, there are multiple mechanisms to protect seeds in order to mitigate these damages. All these mechanisms are controlled transcriptionally during seed development, and each plant species follows its own program, causing a variation in seed longevity between different species. Arabidopsis thaliana is used worldwide as a model species and there are different mutant collections to make reverse genetics studies. In one of these studies, conducted in Ramón Serrano’s laboratory at IBMCP (UPV-CSIC), an activating-tagging mutant was obtained whose seed longevity was greater and it overexpresses the transcription factor COG1. Seeds lypid polyester analysis reveals a thicker suberin layer compared to wild-type seeds. This could be the seed greater longevity explanation due to an increase in the impermeability to water and air, thus preventing oxidative events which are deleterious to seeds (Bueso, et al., 2016). In this study, it is intended to better understand the role of COG1 transcription factor. Specifically, COG1 gene transcriptional regulation will be studied. A first analysis will consist of locating the expression of said gene during seed development by plants with COG1 promoter bound to GFP reporter protein. Our second strategy will be to seek for transcription factors that are involved in seed coat development and / or in seed longevity, which directly regulate COG1 gene promoter region. For this strategy, yeast one-hybrid technique will be used in the heterologous Saccharomyces cerevisiae system.

[ES] El tiempo durante el cual las semillas permanecen viables se denomina longevidad de semillas. Esta longevidad de semillas es una característica de alto interés agronómico tanto para la conservación de recursos genéticos en bancos de germoplasma como para la propagación de cultivares. El estudio de la longevidad de semilla es crucial para conocer cómo afectan los factores genéticos y ambientales al deterioro de las semillas y como combatir estos eventos deletéreos que hacen que la semilla no germine. En el laboratorio del profesor Ramón Serrano se han realizado diversos análisis de asociación del genoma completo (GWAS) a partir de más de doscientos ecotipos de la planta Arabidopsis thaliana sujetos a distintos tratamientos de envejecimiento de semilla acelerado. En varios de estos análisis, una región genómica que destaca y podría estar asociada con la longevidad de semilla es la que comprende al factor de transcripción MYB47. Se analizó la longevidad de semilla en líneas de inserción de t-DNA en el gen MYB47 y éstas mostraron tener una menor longevidad. Esto apunta a un importante papel de dicho factor de transcripción en la longevidad de la semilla. El objetivo de este TFG es intentar esclarecer el papel de MYB47 en la red transcripcional que participa en el desarrollo de la semilla. Para ello se han propuesto dos técnicas: analizar la expresión del factor MYB47 y buscar genes que regulan y que son regulados por MYB47. En la primera estrategia se usarán plantas transgénicas con el promotor de MYB47 unido a la proteína reportera GFP para visualizar donde se expresa este factor de transcripción durante el desarrollo de semilla. Para la segunda estrategia se utilizará la técnica yeast one-hybrid en el sistema heterólogo Saccharomices cerevisae, y se buscarán factores de transcripción implicados en el desarrollo de la cubierta de la semilla y/o en la longevidad de la semilla que interaccionen directamente con las regiones promotoras conservadas del gen MYB47. También se contempla clonar regiones promotoras de posibles dianas directas de MYB47 y realizar también este tipo de ensayo de interacción proteína-DNA., [EN] The time during which seeds remain viable is called seed longevity. Longevity of seeds is a characteristic of high agronomic interest both for the conservation of genetic resources in germplasm banks and for the propagation of cultivars. The study of seed longevity is crucial to know how genetic and environmental factors affect the deterioration of seeds and how to combat these deleterious events that cause the seed not to germinate. In the laboratory of Professor Ramón Serrano, several analysis of the complete genome association (GWAS) have been made from more than two hundred ecotypes of the Arabidopsis thaliana plant subject to different accelerated seed aging treatments. In several of these analysis, a genomic region that stands out and could be associated with seed longevity is that which comprises the transcription factor MYB47. The longevity of seed in lines of insertion of t-DNA in the MYB47 gene was analysed and these showed lower longevity. This points to an important role of MYB47 transcription factor in the longevity of the seed. The objective of this TFG is to try to clarify the role of MYB47 in the transcriptional network that participates in the development of the seed. For this, two techniques have been proposed: check the expression of the MYB47 factor during seed development and look for genes that regulate and that are regulated by MYB47. In the first strategy, transgenic plants with a t-DNA insert with the MYB47 promoter bound to the GFP reporter protein will be used to visualize where this transcription factor is expressed during seed development. For the second strategy, the Yeast One-Hybrid technique will be used in the heterologous Saccharomyces cerevisiae system to find transcription factors involved in the development of the seed coat and in the longevity of the seed that interact directly with the conserved promoter regions of the MYB47 gene. It is also contemplated to clone promoter regions of possible direct targets of MYB47 and perform this type of protein-DNA interaction assay.