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El Potato yellow vein virus (PYVV) es uno de los virus más limitantes en cultivos de papa de la región andina. Es transmitido por moscas blancas y por tubérculos-semilla, por lo que la disponibilidad de métodos de detección resulta fundamental para su manejo. En este estudio se secuenció completamente el genoma de un aislamiento de PYVV de Solanum phureja en La Unión (Antioquia, Colombia), utilizando la secuenciación de nueva generación (NGS) y con base en dicha secuencia se diseñaron tres pares de cebadores para la detección del virus mediante RT-PCR convencional y RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR). Estas pruebas fueron evaluadas en 12 muestras asintomáticas y en cuatro sintomáticas. El genoma del virus consistió en tres segmentos de ARN con tamaños de 8032, 5330 y 3891 nt y 10 marcos abiertos de lectura (ORF). Al comparar los niveles de identidad de los tres segmentos con aquellos del único genoma disponible en GenBank (PRJNA14924), se encontraron niveles superiores al 99,2 %. Los cebadores para la cápside (CP) permitieron la detección del PYVV por RT-qPCR en cinco de las muestras foliares asintomáticas (Ct=16,55-29,34; Tm=77,3-77,8 °C) y en las cuatro muestras con amarillamiento de venas. Los cebadores para RT-PCR convencional amplificaron los productos esperados de CP (496 pb) y de la cápside menor (793 pb) en las muestras sintomáticas, pero no en aquellas asintomáticas. Se sugiere el uso de RT-qPCR en programas de certificación de tubérculo-semilla de papa y de RT-PCR convencional para apoyar los análisis filogenéticos y de variabilidad molecular del virus. Potato yellow vein virus (PYVV) is one of the most limiting viruses of potato crops in the Andean region. This virus is transmitted by whiteflies and infected tuber-seeds making the availability of adequate detection tools a very important need for management of the disease. In this study, the genome sequence of a PYVV isolate was obtained using the next generation sequencing (NGS) of infected leaves from a Solanum phureja plant in La Unión (Antioquia, Colombia) and, based on the genome data, three primer pairs for PYVV detection by RT-PCR and RT-qPCR were designed and tested in asymptomatic (12) and symptomatic (4) samples. The PYVV genome comprised three RNA segments of 8032, 5330 and 3891 nt containing a total of ten open reading frames. Comparison with the only PYVV genome sequence (PRJNA14924) available revealed an identity above 99.2 %. Primers targeting the coat (CP) sequence detected PYVV by RT-qPCR in five asymptomatic leaf samples (Ct=16.55-29.34; Tm=77.3-77.8 °C) and in the four samples showing vein-yellowing symptoms. Detection by RT-PCR resulted in fragments of the expected size for both the CP (496 bp) and the minor coat (793 bp) in symptomatic leaves. No amplification products were observed in asymptomatic material using these primers. We propose the use of RT-qPCR in tuber-seed certification programs and RT-PCR in phylogenetic and molecular variability studies of PYVV.

El Potato virus Y (PVY) es uno de los virus más limitantes en cultivos de solanáceas. En la región andina es frecuente encontrar cultivos mixtos de estas especies vegetales, lo cual facilita la inoculación cruzada con este virus. Estudios recientes en el departamento de Antioquia, Colombia, han detectado altos niveles de incidencia y variación genética de PVY en papa y tomate de árbol. Con el fin de evaluar si esta situación también ocurre en los cultivos de tomate de esta región, se realizó una secuenciación de nueva generación (NGS) del transcriptoma de tejido foliar de tomate, como base para la caracterización molecular del PVY en este hospedero. Se determinó, además, su incidencia en tres lotes de cultivo con TAS-ELISA y se confirmó su presencia por RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR). El PVY fue detectado en el 13,3% de las 45 muestras foliares analizadas mediante TAS-ELISA y se confirmó por RT-qPCR con valores de ciclo umbral (Ct) de 14,31 a 33,8 y temperaturas de fusión (Tm) de 77,5 ± 1,5 °C. Los análisis bioinformáticos identificaron la ocurrencia de dos variantes de PVY en proporciones de 3:2. Sus genomas tienen un tamaño de 9726 nt y comparten 97,5 % de identidad; codifican para una poliproteína de 3061 aminoácidos, con regiones no traducidas (UTR) 5’ y 3’ de 218 y 325 nt, respectivamente. Los análisis filogenéticos, tanto de la poliproteína como de la cápside de ambas variantes, indican su afinidad con genotipos de PVY NTN, y constituyen el primer reporte en América del genoma completo de este virus en el cultivo de tomate. PVY is one of the most limiting viruses in solanaceous plants. These crops are frequently planted together facilitating their cross-inoculation with this virus. Recent studies in Antioquia, Colombia, detected high levels of incidence and genetic variability of PVY infecting potato and tamarillo. In this study, Next-Generation Sequencing (NGS) transcriptome analysis of tomato leaves was used to confirm the presence of PVY in tomato crops in that region; virus incidence was evaluated in three plots using TAS-ELISA and further confirmed by real-time RT-PCR (RT-qPCR). TAS-ELISA of 45 leaf samples detected PVY in 13.3 % of them; RT-qPCR confirmed the serological results with threshold cycle values in the 14.31 and 33.8 range and a Tm of 77.5 ± 1.5 °C. Bioinformatic analysis confirmed the presence of two PVY variants (proportion 3:2), sharing 97.5 % of sequence identity. Both genomes are 9726 nt in size and code for 3061 amino acids polyprotein flanked by 5´and 3´ untranslated regions (UTR) of 218 and 325 nt. Phylogenetic analysis of both the sequences coding for the coat protein and the complete polyprotein suggest phylogenetic affinity with PVY NTN. To our knowledge, this is the first American report of a complete PVY genome naturally infecting tomato.

La yuca es afectada por diversos patógenos que reducen su productividad. En América la principal enfermedad es el Cuero de Sapo de la Yuca (CFSD), relacionada con un reovirus y un fitoplasma. Los estudios de caracterización del reovirus han permitido identificar entre nueve y diez segmentos genómicos, viriones de forma cuasi-isométrica, similaridad con género Oryzavirus y la presencia de variantes. El presente estudio permitió confirmar la diversidad del Cassava frogskin associated virus a partir de la comparación de más de 80 secuencias del segmento 4 que contiene el gen de la Polimerasa; esta misma diversidad fue encontrada al comparar secuencias del segmento 3 y se plantea la hipótesis de la presencia de reorganización y se propone el nombre de las razas Amazonas, Quilcasé y América. El análisis de los fragmentos de restricción utilizando la enzima Eco RV permitió identificar la presencia aislamientos con los patrones NERV y ERV, siendo el primero restringido al Amazonas y al Cauca mientras que el segundo se distribuye en toda Colombia y en las muestras procedentes de Paraguay, Brasil, Ecuador Venezuela, Panamá y Costa Rica. La variante EV en la variedad resistente COL1468 (CMC40) no fue transmitida por semilla sexual (botánica). La expresión de síntomas en Secundina a partir de plantas con CFSD positivas o negativas al reovirus permitió discriminar un serie de síntomas como amarillamiento de nervaduras, manchas anulares, moteado, mosaico, deformación foliar y enchinamiento relacionados con la enfermedad pero no con el reovirus. Las observaciones de ultraestructura celular de Secundina evidenciaron la presencia de partículas similares al reovirus en células de haces vasculares, así como la presencia de otras partículas isométricas, inclusiones laminares y viroplasmas. A partir del secuenciamiento a gran escala se caracterizó parcialmente el genoma de la raza Quilcasé a partir del asilamiento FSD29. Se obtuvieron secuencias nuevas de los segmentos 1, 7 y 9, y se incrementaron las de los segmentos 3, 4, 5 y 10. El análisis filogenético de la familia Reoviridae al comparar secuencias de aminoácidos de la polimerasa permitió confirmar la mayor cercanía con el género Oryzavirus formando un clado con el RRSV, el RpLV y SFRV, aunque podría ser una género nuevo por su baja similaridad y el hospedero. //Abstract. Cassava is affected by different pathogens that reduce their productivity. In America Cassava Frog Skin Disease (CFSD) is the main disease, associated with a reovirus and a phytoplasma. Characterization studies of the reovirus have identified between nine and ten gene segments, quasi-Isometric shape of its particles, the similarity with Oryzavirus gender and the presence of variants. The present study confirmed the diversity of the Cassava Frogskin associated virus (CsFSaV) from a comparison of over 80 sequences of segment 4 which contains the polymerase gene. Identical diversity was found when comparing sequences of segment 3 and raises the reassortment hypothesis, which provides a criterion for discriminating races in the family Reoviridae. Amazon, Quilcasé and America races are rised. Analysis of restriction fragments using EcoRV enzyme allowed the identification of isolates with NERV and ERV patterns, the first one restricted to the Amazon and the Cauca region, the second one was distributed throughout Colombia and was found in samples from Paraguay, Brazil, Ecuador, Venezuela, Panama and Costa Rica. ERV variant COL1468 resistant variety (CMC40) was not transmitted by sexual seed (botanical). Symptom expression in Secundina grafted with CFSD infected rootstock positive or negative to reovirus allowed discrimination range of symptoms as vein yellowing; vein banding, ringspot, mottling, mosaic, leaf deformation and curling. All this symptoms related to the CFSD but not with the CsFSaV. Observations of Secundina ultrastructure in transmission electron microscope showed the presence of reovirus-like particles in vascular cells as well as the presence of other isometric particles, viroplasms and laminar inclusions. From deep sequencing primers were designed and partially characterized genome Quilcasé strain from FSD29 isolated. New sequences were obtained from segments 1, 7 and 9, and increased the sequences of the segments 3, 4, 5 and 10. Phylogenetic analysis of the family Reoviridae comparing amino acid sequences of the polymerase confirmed the gender-closer Oryzavirus of CFSaV forming a clade with RRSV, RpLV and SFRV, although it could be a new genus due to the percentage of similarity and host. Maestría