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El virus dengue (DENV) es un grave problema para la salud pública por su reemergencia en las últimas décadas, ya que en la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección. A pesar de la creciente incidencia de DENV en el mundo, y en América en particular, al presente no hay quimioterapia específica para el tratamiento de la enfermedad. Las etapas iniciales que conducen a la entrada del virus a la célula son una alternativa atractiva como estrategia antiviral para bloquear el comienzo de la infección. Sin embargo, se ha demostrado que la entrada de DENV es un proceso muy complejo que depende de distintos factores virales y celulares, que a su vez afectan la susceptibilidad antiviral frente a agentes que interfieren con la interacción inicial virus-célula. El presente trabajo de tesis se propuso estudiar la entrada del virus dengue 3 (DENV-3) a células de mamífero y sus posibles implicancias en la terapia antiviral, analizando la acción inhibitoria de carragenanos. Mediante la utilización de inhibidores farmacológicos y moleculares de las diferentes vías endocíticas celulares se demostró que la entrada infecciosa de DENV-3 cepa H87 a células Vero y A549 ocurre por una vía endocítica no clásica, independiente de clatrina, dependiente de pH ácido y dinamina, con una participación parcial de caveolas. Asimismo, se demostró por primera vez en estos sistemas celulares la coexistencia de vías infectivas y no infectivas para la entrada de DENV, situación que podría disminuir la eficiencia de la infección. El tráfico intracelular luego de la entrada de DENV-3 presentó características propias de los virus de penetración tardía hasta completar el proceso de fusión y desnudamiento viral. La evaluación de la dependencia con clatrina para la entrada de DENV-3 a otras líneas celulares humanas, tales como células HepG2, U937 y K562, mostró una respuesta variable según la línea celular. También los resultados fueron variables en la infección a células U937 en presencia o ausencia de anticuerpos contra DENV. Respecto de la actividad antiviral, los carragenanos λ e ι fueron potentes inhibidores de DENV-3, con valores de índice de selectividad (relación citotoxicidad / actividad antiviral) mayores a 1000, excepto en la infección mediada por anticuerpos. El blanco de ambos compuestos fue la entrada del virus a la célula, interfiriendo con la adsorción viral y la internalización de la nucleocápside a partir de los endosomas. La caracterización de la vía de entrada de DENV-3 y de la actividad antiviral de compuestos que bloquean eventos tempranos en la multiplicación del virus aporta conocimientos para dilucidar los mecanismos que regulan la infección viral así como optimizar el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales que sean protectoras ante los cuatro serotipos de DENV, de modo de evitar la progresión a las formas severas y letales de la enfermedad. The reemergence of dengue virus (DENV) in the last decades is a serious threat for public health, since at present almost half the world population is at risk of infection. Instead of the increasing DENV incidence worldwide, and particularly in America, there is no specific chemotherapy for treatment of the disease. The initial stages leading to virus entry into the host cell represent an attractive antiviral strategy for chemotherapy to suppress the beginning of infection. However, DENV entry appears to be a very complex process regulated by several celland virus-dependent factors that may also affect antiviral susceptibility to agents blocking the initial virus-cell interaction. The aim of the present study was to study the entry of dengue 3 (DENV-3) into mammalian cells and the possible relationship with antiviral susceptibility, analyzing the inhibitory action of carrageenans. By using chemical and molecular inhibitors of different endocytic pathways, it was demonstrated that the infectious entry of DENV-3 strain H87 into Vero and A549 cells occurs by a non-classical clathrin-independent endocytosis pathway, which depends on the acid endosomal pH and dynamin, and is partially-mediated by caveolae. Results show for the first time in these cell systems the simultaneous coexistence of infective and non-infective routes for DENV entry into the cell, a phenomenon that may reduce the efficiency of infection. The intracellular trafficking of DENV-3 after uptake was typical of a late-penetrating virus to achieve fusion and viral uncoating. The influence of the clathrin pathway in DENV-3 infective entry in other mammalian cell lines of human origin, such as HepG2, U937 and K562 cells, was also evaluated demonstrating that variable entry pathways are employed depending on the host cell. Furthermore, the entry into U937 cells also when infection occurred in the presence of non neutralizing antibodies. Next, the antiviral susceptibility of DENV-3 to entry inhibitors was evaluated. Both λ and ι carrageenans were potent inhibitors of DENV-3, with selective index values (ratio cytotoxicity / antiviral activity) higher than 1000. However, no inhibition was detected in antibody-mediated infection. The target of these compounds was virus entry by dual blockade of virus adsorption and internalization of the nucleocapsid from the endosomes. The characterization of the entry pathway of DENV-3 and the antiviral activity of compounds that block early events in virus multiplication cycle provides information to elucidate the mechanisms responsible of virus infection as well as to optimize the design of new antiviral therapies protective against the four DENV serotypes, in order to prevent progression to severe and lethal forms of disease. Fil: Piccini, Luana Erica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Background: Dengue virus (DENV), a member of the family Flaviviridae, is at present the most widespread causative agent of a human viral disease transmitted by mosquitoes. Despite the increasing incidence of this pathogen, there are no antiviral drugs or vaccines currently available for treatment or prevention. In a previous screening assay, we identified a group of N-allyl acridones as effective virus inhibitors. Here, the antiviral activity and mode of action targeted to viral RNA replication of one of the most active DENV-2 inhibitors was further characterized. Results: The compound 10-allyl-7-chloro-9(10H)-acridone, designated 3b, was active to inhibit the in vitro infection of Vero cells with the four DENV serotypes, with effective concentration 50% (EC50) values in the range 12.5-27.1 mu M, as determined by virus yield inhibition assays. The compound was also effective in human HeLa cells. No cytotoxicity was detected at 3b concentrations up to 1000 mu M. Mechanistic studies demonstrated that virus entry into the host cell was not affected, whereas viral RNA synthesis was strongly inhibited, as quantified by real time RT-PCR. The addition of exogenous guanosine together with 3b rescued only partially the infectivity of DENV-2. Conclusions: The acridone derivative 3b selectively inhibits the infection of Vero cells with the four DENV serotypes without a direct interaction with the host cell or the virion but interfering specifically with the intracellular virus multiplication. The mode of antiviral action for this acridone apparently involves the cellular enzyme inosine-monophospahe dehydrogenase together with another still unidentified target related to DENV RNA synthesis., Agencia Nacional de Promocion Cientifica y Tecnologica; Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas (CONICET); Universidad de Buenos Aires (UBA), Argentina

Fil: Carro, Ana C. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fil: Carro, Ana C. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina At present, a high proportion of world population is at risk of infection with dengue virus (DENV), a pathogen causing either a mild febrile illness or more severe forms of disease, with 2.5 % mortality. Although DENV represents a serious health problem worldwide, no specific chemotherapy or vaccine is currently available. Virus entry is an attractive antiviral strategy to block initiation of infection. For DENV, the mode of entry into the host cell has been studied only in fibroblastic or epithelial cell lines, derived from mammals or mosquitoes, with controversial results. In the present study, the entry of DENV into human myeloid cell lines, a model more representative of the natural infection, was analyzed as well as the relationship between mode of entry and antiviral susceptibility to sulfated polysaccharides. By using biochemical inhibitors of endocytic routes, infectivity titrations by plaque formation, viral RNA determinations by quantitative RT/PCR, fluorescence and electron microscopy, a clathrin, and dynamin, mediated endocytosis was demonstrated for entry of both serotypes DENV 2 strain NGC and DENV 1 strain Hawaii into human myelomonocytic U937 and erithroleukaemic K562 cell lines. When both cells were infected with DENV 2 in the presence of nonneutralizing anti DENV antibodies, conditions which allow an enhancement of infection in vitro and lead to severe forms of disease in vivo, the route of entry was clathrin mediated or not, according to the receptor FcR involved in the infective process. Furthermore, the antiviral activity in both cell systems of carrageenan, a sulfated polysaccharide known to inhibit DENV 2 adsorption and uncoating in Vero cells, was also evaluated. A relationship between antiviral susceptibility to carrageenan and the type of receptor employed for antibody-mediated entry was observed. Finally, studies about the cholesterol dependence for DENV infection have shown that the envelope cholesterol is a critical factor in the fusion process for DENV entry whereas cell membrane cholesterol is not involved. The characterization of the mode of entry in myeloid cells and the role of viral cholesterol contributes to the knowledge of factors involved in DENV infection and the design and usage of new and more effective antiviral therapies. Actualmente, casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de contraer virusdengue (DENV), agente patógeno que puede causar una infección aguda febril autolimitada o progresara formas más severas de enfermedad, con una tasa de mortalidad de 2,5 %. A pesar de representar ungrave problema para la salud pública, no existen vacunas ni quimioterapias disponibles para DENV. Laentrada del virus a la célula huésped es una interesante estrategia antiviral ya que permite bloquear elcomienzo de la infección viral. En el caso de DENV, sólo se ha estudiado hasta el presente el modo deentrada en líneas celulares epiteliales o fibroblásticas de mamíferos y de mosquito, con resultadoscontroversiales. El presente trabajo de tesis se enfocó en el estudio del mecanismo de entrada de estepatógeno a células mieloides humanas, más representativas de la infección natural, y la implicancia quepudiese tener en la quimioterapia antiviral. Mediante la utilización de inhibidores químicos de lasdistintas vías endocíticas, medida de infectividad por formación de placas, determinaciones de RNAviral por RT PCR en tiempo real y técnicas de microscopía de fluorescencia y electrónica, se demostróque los dos serotipos DENV 1 cepa Hawaii y DENV 2 cepa NGC utilizan una vía clásica de endocitosisdependiente de clatrina y dinamina para entrar en células humanas U937, de origen monocítico, yK562, de origen ertitroleucémico. En la infección de ambas células en presencia de anticuerpos noneutralizantes anti DENV, condiciones en que hay incremento de la infección in Vitro y puedenexplicarse las formas más severas de la enfermedad in vivo, se observó que DENV 2 utiliza diferentesvías de entrada, mediadas o no por clatrina, según el receptor Fc R involucrado en el proceso. Tambiénse evaluó en los mismos sistemas la actividad antiviral del carragenano , polisacárido sulfatado queinhibe la adsorción e internalización de DENV 2 en células Vero, encontrándose también una relaciónentre la susceptibilidad antiviral y el tipo de receptor empleado para la entrada mediada poranticuerpos. Finalmente, se realizó un estudio de la dependencia de colesterol para la infección conDENV, concluyendo que el contenido adecuado de colesterol en la envoltura viral, no así en lamembrana celular, sería determinante para lograr la fusión de ambas membranas y alcanzar unainfección productiva. La caracterización de la vía de entrada en células mieloides y el rol del colesterolviral aporta nueva información para comprender los factores involucrados en la infección de DENV yfavorecer el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales más efectivas.