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La periodontitis es una de las enfermedades bucales de mayor prevalencia, el estudio de su patogénesis ha avanzado mucho en los últimos años, sin embargo, los detalles de los mecanismos involucrados en la reabsorción ósea no están aún esclarecidos. RANK, RANKL y OPG son proteínas que tienen un rol conocido en otras enfermedades del tejido óseo, en este trabajo se revisó la evidencia sobre su posible participación en la patogenia de la enfermedad periodontal. Es necesaria más evidencia para conocer la relación entre RANK, RANKL, OPG y la reabsorción ósea vinculada a la periodontitis.

Osteoarthritis (OA) is a disease of great impact that produces functional disability at an early age in racehorses where its diagnosis is usually carried out in advanced stages of the disease. The aim of this study was to demonstrate the presence of the activating receptor ligand of nuclear factor kappa-β (RANKL) in synovial fluid of equines in training. Three healthy horses of two years and four horses of 3-4 years of age with signs of joint inflammation were evaluated clinically and radiographically. Synovial fluid was extracted to quantify the expression of RANKL in different pathological states of the carpus by an ELISA test. The average value of RANKL in healthy horses was 33.13 ± 8.30 pg/ml and in horses with OA signs of 49.03 ± 5.95 pg/ml (p, Osteoartritis (OA) es una enfermedad de gran impacto que produce invalidez funcional a temprana edad en los caballos de carrera donde su diagnóstico generalmente se lleva a cabo en los estados avanzados de la enfermedad. El objetivo de esta investigación fue demostrar la presencia del ligando del receptor activador del factor nuclear kappa-β (RANKL) en líquido sinovial de equinos en training. Se evaluó clínica y radiográficamente a tres caballos sanos de dos años y cuatro caballos de 3-4 años con signos de inflamación articular. Se les extrajo líquido sinovial para cuantificar la expresión de RANKL en diferentes estados patológicos del carpo mediante una prueba de ELISA. El valor promedio de RANKL en los caballos sanos fue de 33.13 ± 8.30 pg/ml y en los caballos con signos de OA de 49.03 ± 5.95 pg/ml (p

A partir de la teoría de que la fusión celular es esencial para la función del Osteoclasto y su rol en el mantenimiento del control de la masa ósea y osteoclástica, se desarrolló un modelo para la obtención de células similares a osteoclastos que son capaces de realizar resorción utilizando polietilenglicol (PEG). Se demostró que su aplicación en monocitos (línea celular U937) genera fusión, y que este evento es suficiente para la expresión de genes específicos del Osteoclasto, y resorción ósea. El propósito de este trabajo fue investigar los cambios en la actividad resortiva al aplicar distintos agentes oxidantes y reductores sobre este modelo. Método: Se indujo fusión de células U937, para obtener células similares a osteoclastos, con 0.5μl PEG mw:1450 por cada 50.000 células que fueron sembradas sobre láminas de hueso, o un grupo control no tratado con PEG; las células fueron resuspendidas en DMEM con SFB al 10%, y mantenidas bajo una atmosfera humidificada al 5% de CO2 a 37°C durante 2 horas; aplicándolos directamente en el medio y en diferentes tiempos, se realizó inducción oxidativa con DMNQ 0.15μM, homocisteína 100μM, peróxido de hidrógeno 50μM o tratamiento con agentes reductores TROLOX 500μM, TEMPOL100μM, ácido ascórbico 50μg/ml, NAC 30mM, GSH 32mM + BME 25μM . Se evaluó presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS), tinción para TRAP (fosfatasa ácida tartrato resistente), actividad resortiva y expresión de marcadores osteoclásticos. Resultados: La fusión con PEG induce la generación de ROS, el aumento en el porcentaje de células TRAP +, la formación de anillos de actina y el área resorbida con respecto a las células no fusionadas. El tratamiento con agentes oxidantes en los días 0 y 1 después de fusionar con PEG genera un aumento en ROS consecuente con un aumento de TRAP, anillos de actina y resorción ósea, de manera contraria se produjo una disminución de estos con el tratamiento con agentes reductores en estas etapas; el pretratamiento con agentes oxidantes y reductores generó una disminución en la resorción para ambos casos, sin embargo, la aplicación de ambos tipos de tratamiento en los días 2 y 3 después de la fusión con PEG no generó cambios significativos en la resorción. Conclusión: La fusión per se implica la generación de ROS, aumentando la expresión de marcadores osteoclastogénicos y actividad resortiva, dichas características se acentúan al aplicar reactivos oxidantes, sugiriendo que el estado oxido reductor de la célula es crítico para la supervivencia, estabilidad de la fusión y para el inicio de la actividad osteoclastogénica Palabras Abstract: Based on the theory regarding nuclear fusion is essen tial for the osteoclast function and its role in maintaining control of both the bone mass and osteoclastic resorption, a model was developed in order to obtain osteoclasts like cells that are able to bone resorption using p olyethylene glycol (PEG). It was demonstrated that its application in monocytes (cell line U 937) generates fusion, and this event is enough for the expression of osteoclast specific genes, and bone resorption. The purpose behind this work was to investigate the changes in the resorptive activity when applying different oxidant and reducing agents using this model. Method: Fu sion of U937 cells were induced to obtain osteoclast like cells with 0.5 μ l PEG mw:1450 per 50.000 cells that were seeded in bone slices, or a control group that were not treated with PEG; cells were resuspended in DMEM with SFB at 10%, and kept under a humidified atmosphere with 5% of CO 2 at 37°C during 2 hours; Applying direc tly in the culture media and at different times ; oxidant induction was achieved with DMNQ 0.15 μ M, Homocysteine 100 μ M, Hydrogen peroxide 50 μ M , besides treatment with reducer agents TROLOX 500 Μ m, TEMPOL 100 Μ m, Ascorbic Acid 50 μ g/ml, NAC 30Mm, GSH 32Mm + BME 25 Μ m. The presence of reactive species of oxygen (ROS) was evaluated, osteoclast differentiation was determined by Tartrate - resistant acid phosphatase (TRAP) staining, resorptive activity and expression of osteoclastic markers. Results: PEG fusion r esults in ROS generation, increase in the TRAP + cells percentage, actin ring formation and resorbed area compared with non - treated cells. Treatment with oxidants on days 0 and 1 after PEG fusion results in increased levels of ROS, TRAP+ cells percentage, actin rings and bone resorption, treatment with reducers had an opposite effect decreasing these aspects; pretreatment with oxidants and reducers showed a decrease in bone resorption in both cases; otherwise oxidant and reducers applied on days 2 and 3 aft er PEG fusion did not show significative changes in bone resorption. Conclusion: Fusion itself implies ROS generation in turn increasing the expression of osteoclastogenic markers and resorptive activity, these characteristics are accentuated when applyin g oxidizing reagents, suggesting that the redox state of the cell is critical for survival, fusion stability and the beginning of the osteoclastogenic activity . Maestría

La osteoporosis se define como un trastorno esquelético sistémico. El individuo presenta una masa ósea baja con deterioro de la microarquitectura del tejido óseo, tanto trabecular como cortical, derivando en fragilidad ósea susceptible de fracturas. A nivel del metabolismo óseo, presenta una actividad osteoblástica y osteoclástica alterada. Esta patología se ve influenciada por factores como la edad, el tabaco, la alimentación, alteraciones hormonales, el uso de ciertos medicamentos, o exceso de ejercicio físico. Se estima que una de cada tres mujeres y uno de cada cinco hombres de más de 50 años padecerá una fractura por osteoporosis. Según estudios publicados, el 95% de los pacientes que presentan una fractura por fragilidad, no había sido diagnosticado previamente de osteoporosis, demostrando que la enfermedad no presenta signos de alerta previos a la aparición de fracturas. La prevalencia de la enfermedad aumenta un 15% entre edades comprendidas entre los 50 y 59 años y hasta un 80% en edades superiores a los 80 años. Objetivo: El objetivo del estudio es relacionar las unidades de densidad radiológica obtenidas a partir de la tomografía computerizada de haz cónico (CBCT) de los maxilares y el metabolismo óseo mediante la cuantificación de factores del metabolismo óseo obtenidos de dichos maxilares. Material y método: Se analizó en un total de 28 mujeres postmenopausicas la densidad en maxilar posterior según CBCT, y los valores del metabolismo óseo (RANKL, OPG, Ca2+ y ALP). Los grupo de estudio fueron: Grupo 1: grupo control (pacientes con ausencia de osteoporosis), Grupo 2: grupo test 1 (pacientes con osteoporosis sin tratamiento), Grupo 3: grupo test 2 (pacientes con osteoporosis bajo tratamiento farmacológico). Resultados: Según los resultados obtenidos, no hemos encontrado relación entre los indicadores del metabolismo óseo y la densidad ósea del maxilar determinada a partir del CBCT en pacientes sin o con osteoporosis. Los pacientes con osteoporosis presentan una densidad ósea maxilar significativamente más baja a nivel de la tuberosidad que el grupo de pacientes sin osteoporosis y una marcada tendencia a menor densidad en la zona perimplantaria analizada. En relación a los valores del metabolismo óseo, el grupo sin osteoporosis presentó valores mayores de ion calcio, no habiendo diferencias para el resto de valores. Sin embargo si hubieron diferencias entre el grupo con osteoporosis tratado del no tratado, presentando mayor concentración de RANKL, y menor concentración de ALP el grupo tratado. El grupo sin osteoporosis presentó concentraciones mayores de Ca2+ y ALP que el grupo con osteoporosis. Conclusión: Se han determinado diferencias entre el grupo sano y el grupo con osteoporosis tanto a nivel de densidad de maxilar evaluado con el CBCT como a nivel de ciertos valores del metabolismo óseo como el Ca2+ y la ALP. Sin embargo no se ha podido establecer ninguna correlación entre la densidad ósea de los maxilares y los valores del metabolismo óseo., L'osteoporosi es defineix com un trastorn esquelètic sistèmic, per el que l 'individu presenta una massa òssia baixa amb deteriorament de la microarquitectura del teixit ossi, tant trabecular com cortical, derivant en fragilitat òssia susceptible de fractures. A nivell del metabolisme ossi, presenta una activitat osteoblàstica i osteoclàstica alterada. Aquesta patologia es veu influenciada per factors com l'edat, el tabac, l'alimentació, alteracions hormonals, l'ús de certs medicaments, o excés d'exercici físic. S'estima que una de cada tres dones i un de cada cinc homes de més de 50 anys patirà una fractura per osteoporosi. Segons estudis publicats, el 95% dels pacients que presenten una fractura per fragilitat, no havia estat diagnosticat prèviament d'osteoporosi, demostrant que la malaltia no presenta signes d'alerta previs a l'aparició de fractures. La prevalença de la malaltia augmenta un 15% entre edats compreses entre els 50 i 59 anys i fins a un 80% en edats superiors als 80 anys. Objectiu: L'objectiu de l'estudi és relacionar les unitats de densitat radiològica obtingudes a partir de la tomografia computeritzada de feix cònic (CBCT) dels maxil·lars i el metabolisme ossi mitjançant la quantificació de factors del metabolisme ossi obtinguts d'aquests maxil·lars. Material i mètode: Es va analitzar en un total de 28 dones postmenopàusiques la densitat en maxil·lar posterior segons CBCT, i els valors del metabolisme ossi (RANKL, OPG, Ca2 + i ALP). Els grup d'estudi van ser: Grup 1: grup control (pacients amb absència d'osteoporosi), Grup 2: grup test 1 (pacients amb osteoporosi sense tractament), Grup 3: grup test 2 (pacients amb osteoporosi sota tractament farmacològic). Resultats: Segons els resultats obtinguts, no hem trobat relació entre els indicadors del metabolisme ossi i la densitat òssia del maxil·lar determinada a partir de l'CBCT en pacients sense o amb osteoporosi. Els pacients amb osteoporosi presenten una densitat òssia maxil·lar significativament més baixa a nivell de la tuberositat que el grup de pacients sense osteoporosi i una marcada tendència a menor densitat a la zona perimplantaria analitzada. En relació als valors del metabolisme ossi, el grup sense osteoporosi presentar valors més grans de ió calci, no hi ha diferències per a la resta de valors. No obstant això si van haver diferències entre el grup amb osteoporosi tractat del no tractat, presentant major concentració de RANKL, i menor concentració d'ALP el grup tractat. El grup sense osteoporosi presentar concentracions més grans de Ca2 + i ALP que el grup amb osteoporosi. Conclusió: S'han determinat diferències entre el grup sa i el grup amb osteoporosi tant a nivell de densitat de maxil·lar avaluat amb el CBCT com a nivell de certs valors del metabolisme ossi com el Ca2 + i la ALP. No obstant això no s'ha pogut establir cap correlació entre la densitat òssia dels maxil·lars i els valors del metabolisme ossi.

Osteonecrosis of the jaw is a particular form of chronic osteomyelitis caused by bisphosphonates (BF) or by other pharmacological or anti-angiogenic drugs. The BF are potent drugs inhibitors of osteoclasts by exerting a strong interaction with these cells, producing a sharp decrease of bone resorption. Objectives: To analyse clinical and radiologic characteristics as well as differences in the plasma levels of the Activation Nuclear Kappa receptor ligand (RANKL) and of osteoprotegerin (OPG) in a group of patients with osteonecrosis and compared to healthy controls. In addition, within the Group of patients with osteonecrosis maxillary study if there is relationship between plasma levels of OPG and RANKL and clinical data. Material and methods: a clinical study in 183 cases of Osteonecrosis of the jaw by bisphosphonates intravenous and oral bisphosphonates in patients with osteoporosis and oncologic patients. Analyze a study x-ray in three groups: Group 1 consisting of 30 cases selected from the 183 of the clinical study, group 2 comprised 30 patients without pathology in the jaws and group 3, 30 cases of Group 1, but of the healthy contralateral areas. Finally, the determination of plasma levels using an assay enzyme-linked immunosorbent enzymes or ELISA, to measure the plasma levels of OPG and RANKL in three groups of patients

El osteoclasto ha sido considerado clásicamente como una célula con una función exclusivamente remodeladora del hueso, de comportamiento gregario. Sin embargo, los avances que se han ido produciendo en los últimos años han ido cambiando drásticamente este concepto y, en el momento actual, sabemos que esta célula multinucleada está sometida a una compleja regulación biológica, necesaria para ejercer un papel multifuncional de dimensiones desconocidas. Además de su participación como la única célula capaz de reabsorber la matriz ósea calcificada, el osteoclasto forma parte de los elementos celulares efectores del sistema inmunitario, una función aún poco conocida pero esperable dada su pertenencia a la estirpe monocito-macrofágica. También comienza a ser conocido su papel en otros procesos, tanto locales, como elemento colaborador en la osteoformación y mantenimiento del nicho de células madre hematopoyéticas, como sistémicos. En la presente revisión se analizan los hallazgos más destacados que se han producido en el conocimiento de la biología del osteoclasto, con un contenido eminentemente práctico y un enfoque dirigido a conocer las posibles dianas moleculares que van a permitir mejorar el abordaje terapéutico de enfermedades tan relevantes como la osteoporosis, la artritis o el cáncer. The osteoclast has been considered classically as a cell with the exclusive function of bone remodelling, with a gregarious behaviour. However, advances which have been made in recent years have changed this concept drastically, and we now know that this multinuclear cell is subject to complex biological regulation, necessary for it to exert a multifunctional role of unknown dimensions. In addition to its participation as the only cell capable of reabsorbing the calcified bone matrix, the osteoclast is one of the cellular elements effective in the immune system, a function still little-known but expected, given its belonging to the monocyte-macrophage lineage. Its role in other processes, both local, such as as a collaborative element in osteoformation and hematopoietic stem cell niche maintenance, and systemic, is also beginning to be understood. In this review the most significant findings contributing to our understanding of the biology of the osteoclast are analysed, with an eminently practical content and an approach aimed at understanding the possible molecular targets which will allow a better therapeutic treatment of such important diseases as osteoporosis, arthritis or cancer.

[spa] Este proyecto de tesis doctoral se ha centrado en tres objetivos principales: el primero es el estudio de la función de la vía de señalización de RANK-RANKL-OPG en el desarrollo y progresión del cáncer de mama en humanos. El segundo es el análisis de la expresión de RANK en muestras de tumores humanos y análisis modificaciones en el gen que afecten en la incidencia de cáncer de mama en humanos. El tercero es la generación de modelos ortotópicos de ratón de cáncer de mama humano que sirvan como herramienta para la caracterización de nuevas dianas terapéuticas así como para testar la eficacia de nuevas drogas dirigidas a pacientes de cáncer de mama resistente a los tratamientos ya existentes. Respecto al primero objetivo, los resultados obtenidos indican que la sobre-expresión de RANK en células epiteliales de mama humanas no transformadas MCF10A induce la adquisición de un fenotipo asociado al proceso de transición epitelio-mesenquina (EMT) así como la adquisición de un fenotipo característico de células madre. El mecanismo por el cual la sobre-expresión de RANK induce EMT está relacionado con el aumento de la producción del factor de crecimiento transformate beta (TGF-beta) mediante la activación de las vías de señalización del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-κB) y la proteína quinasa activada por mitógenos p38. La inducción del fenotipo de célula madre está asociado a la activación de vía de señalización de las quinasas reguladas por señales extracelulares 1 y 2 (ERK 1/2). Los resultados referentes al segundo objetivo indican que en muestras de pacientes humanos, los niveles de expresión de RANK son más elevados en tumores con un peor pronóstico clínico (fenotipo triple negativo, alto índice de proliferación y algo grado histológico) y mediante la expresión de los niveles de mARN de RANK y RANKL se puede diferenciar entre tumores metastáticos y no metastáticos a nódulo linfático. Además, se ha descrito la existencia de un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) presente en la región 5´del gen de RANK que está asociado con una menor probabilidad de padecer cáncer de mama en pacientes que poseen mutaciones en el gen BRCA2 (“breast cancer 2”). Finalmente, en este trabajo se describe la generación de cinco modelos ortotópicos de cáncer de mama a partir de muestras clínicas de pacientes. Estos modelos mantienen las características histológicas de los tumores humanos de origen así como los patrones de metástasis de los pacientes de los que proceden. De los cinco modelos generados, dos tienen unas características histológicas relativas a tumores triples negativos (TNBC), dos a tumores luminales (positivos para la expresión del receptor de estrógenos y progesterona) y uno a tumor Her2+. Los tumores Luminales y Her2+ manifiestan diferentes comportamientos de crecimiento en respuesta a hormonal, siendo un reflejo de los distintos tipos de comportamientos que existen en clínica. Por último, se ha testado la sensibilidad de estos modelos a taxanos (Docetaxel), una de las drogas quimioterapéuticas mas empleadas en la actualidad. Los dos modelos TNBC muestran más sensibilidad a la droga mientras que los modelos hormono-dependientes son resistentes. A partir de un modelo sensible TNBC se ha desarrollado un segundo modelo de ratones resistente a Docetaxel mediante la administración continuada del fármaco. Lo que se pretende en futuros proyectos es emplear estos modelos generados en el estudio de nuevas dianas terapéuticas en cáncer de mama así como testar nuevos fármacos en su fase pre-clínica de desarrollo., [eng] This study has been focused in three main goals: study of RANK and RANKL pathway in the development and progression of human breast cancer; analysis of RANK expression in clinical human samples and analysis in RANK gene modifications implicated in human breast cancer; generation of orthoxenopatients of human breast cancer. The results of first objective showed RANK over-expression in human mammary cells MCF10A induces epithelial-mesenchymal transition (EMT) and Stemness phenotype. The molecular mechanism though RANK induces these effects implicates the increment of transforming growth factor beta (TGF-beta) ligands expression thorugh activation of nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) and mitogen activated kinase protein p38. On the other hand, the induction of Stemnes phenotype implicates the activation of Extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK 1/2). The analysis of RANK expression in clinical human samples showed that tumor with a poor prognosis (such as triple negative tumors, tumors with high proliferative index and high histological grade) has higher levels of RANK expression. Moreover, through analysis of RANK and RANKL expression is able discriminate metastatic and non metastatic tumors. In addition, a lower probability to undergo breast cancer in patients with mutations in BRCA2 gene has been correlated with a SNP in the 5´region of RANK gene. Finally, five models of ortothopic mouse models of human breast cancer have been generated. The models obtained were two triple negative, two luminal and one Her2+. These models resemble de histological characteristics of original tumors and the metastasis patterns of the patients. Also the growth rate, latency and dependence to hormones were evaluated in these models. The sensitivity of these tumors was tested to Docetaxel. The triple negative tumors were sensitive whereas Luminal and Her2+ tumors were resistant to Docetaxel. Moreover, resistant models to Docetaxel were generated from sensitive models by continued Docetaxel administration. Samples were collected during the process in order to investigate the mechanisms implicated in resistance acquisition to Decetaxel in the future.

Propósito: Las periodontitis representan un grupo heterogéneo de infecciones periodontales cuya etiología son las bacterias residentes en el biofilm subgingival. Aunque este biofilm está constituido por una amplia variedad de especies bacterianas, sólo un número limitado de especies, como Porphyromonas gingivalis, se ha asociado a la etiología de la enfermedad. P. gingivalis expresa diversos factores de virulencia que pueden causar daño directo a los tejidos del hospedero; sin embargo, su mayor patogenicidad involucra la inducción de una respuesta inmuno-inflamatoria, durante la cual se secretan una amplia variedad de citoquinas, quimioquinas y mediadores inflamatorios que pueden inducir la destrucción de los tejidos de soporte de los dientes y la pérdida de ellos. Método: En esta investigación, se evaluó si los distintos serotipos capsulares (K) de P. gingivalis pueden determinar los niveles de síntesis de RANKL, citoquina clave en la destrucción del hueso alveolar durante la periodontitis. Para ello, se cuantificaron los niveles de expresión de RANKL mediante PCR cuantitativa y los niveles de secreción mediante ELISA en linfocitos T activados en presencia de los serotipos capsulares K1-K6 de P. gingivalis, y estos se correlacionaron a los niveles de expresión de los factores de transcripción asociados a cada uno de los fenotipos de linfocitos efectores: Th1 (T-bet), Th2 (GATA-3), Th17 (RORC2) y Treg (Foxp3). Resultados: Mayores niveles de expresión y secreción de RANKL fueron detectados en linfocitos T activados en presencia de los serotipos K1 y K2 de P. gingivalis, en comparación a los detectados ante los otros serotipos. Además, estos mayores niveles de RANKL se correlacionaron positivamente con los niveles de expresión de RORC2. Conclusión: Estos datos demuestran que la síntesis de RANKL por linfocitos T se restringe a ciertos serotipos capsulares de P. gingivalis (K1 y K2) y permiten sugerir que los serotipos K1 y K2 de P. gingivalis podrían asociarse a la destrucción del hueso alveolar y a la pérdida de los dientes durante la periodontitis. Aim: Periodontitis represents a heterogenic group of periodontal infections elicited by bacteria residing at the subgingival biofilm. Although this biofilm is constituted by a broad variety of bacterial species, only a limited number has been associated with the periodontitis aetiology, among them Porphyromonas gingivalis. P. gingivalis express a number of virulence factors that contribute to direct tissue damage; however, their pathogenicity relies mainly on the induction of a host immuno-inflammatory response. This leads to the release of a broad array of cytokines, chemokines and inflammatory mediators, which cause destruction of the tooth-supporting alveolar bone and ultimately tooth loss. Method: In the present investigation, in order to determine whether different P. gingivalis serotypes might lead to a differential RANKL synthesis, a key cytokine involved in alveolar bone resorption, the mRNA expression and secretion of RANKL and the expression of transcription factors T-bet, GATA-3, RORC2 and Foxp3, the master-switch genes controlling the Th1, Th2, Th17, and Treg cell differentiation, respectively, were analyzed on human T cells activated with different P. gingivalis capsular (K) serotypes. Results: T lymphocytes responding to P. gingivalis serotypes K1 or K2, but not to the other serotypes, led to an increased expression and secretion of RANKL. In addition, these higher RANKL levels correlate with RORC2 expression upon activation with K1 or K2 serotypes. Conclusion: These data demonstrated that RANKL expression and secretion by T lymphocytes was restricted to particular P. gingivalis serotypes (namely K1 and K2), and allowed to suggest a link between these serotypes with alveolar bone destruction and teeth loosening during the periodontitis.

Propósito: La periodontitis crónica es una enfermedad de naturaleza inflamatoria y etiología infecciosa, caracterizada por la destrucción del aparato de inserción del diente, cemento radicular, ligamento periodontal y hueso alveolar, y que causa la pérdida de los dientes. Durante su desarrollo se establece un denso infiltrado inflamatorio celular, constituido principalmente por linfocitos T, con la capacidad de secretar una serie de citoquinas que participan en los eventos patogénicos de la enfermedad, regulando la inflamación de los tejidos periodontales y la destrucción del hueso alveolar. En la artritis reumatoide, la citoquina recientemente identificada RANKL (Ligando del receptor activador del factor nuclear kB) es expresada por los linfocitos T CD4+, participando directamente en los procesos de estimulación de la diferenciación osteoclástica y en la activación de osteoclastos maduros, y por lo tanto, en la destrucción ósea articular. El objetivo del presente estudio es determinar si mayores niveles de RANKL se encuentran asociados a la periodontitis crónica y si estos son sintetizados por los linfocitos T CD4+ reclutados en los sitios con periodontitis crónica. Material y métodos: En 33 pacientes mayores de 35 años de edad afectados de periodontitis crónica y 20 individuos controles sanos, se determinaron los niveles de mensajero de ácido desoxiribonucleico (mARN) de RANKL en biopsias de encía mediante transcriptasa reversareacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en tiempo real. A partir de las mismas biopsias, células gingivales totales fueron aisladas para inmunotipificar y cuantificar los leucocitos infiltrantes gingivales e identificar las células responsables de la expresión de RANKL mediante doble tinción por citometría de flujo. Resultados: Los pacientes con periodontitis mostraron mayores niveles de mARN de RANKL en comparación a individuos sanos, observándose que la expresión de RANKL se incrementó en 238,3 veces con relación a los sujetos controles. Los individuos con periodontitis mostraron mayores porcentajes de linfocitos T CD4+ y CD8+. Además, una asociación entre RANKL y los linfocitos T CD4+ fue determinada mediante doble tinción por citometría de flujo. Conclusión: Estos datos demuestran que mayores niveles de RANKL se encuentran asociados a la periodontitis y que estos mayores niveles se pueden explicar en parte a la actividad de los linfocitos T CD4+ en el sitio de la infección. La determinación de la asociación entre la periodontitis crónica y la síntesis de RANKL constituye un interesante mecanismo molecular que contribuye a explicar en parte la destrucción tisular asociada y permite proyectar posibles nuevas estrategias inmunoterapéuticas que ayudarían a controlar la pérdida de tejido característica de la enfermedad periodontal. Background: Chronic periodontitis is an infectious disease, characterized by alveolar bone destruction and teeth loss. Receptor activator of nuclear factor kB- ligand (RANKL) is an osteoclastogenic cytokine, central regulatory factor in the osteoclasts life-span and physiological and pathological bone resorption. Gingival T cells synthesize RANKL contributing to molecular local unbalance that entail to the alveolar bone resorption seen in periodontitis. Our study was aimed at associating the levels of RANKL with the CD4+ T cell activity present in gingival tissues of chronic periodontitis patients. Methods: Gingival biopsies were obtained from 33 chronic periodontitis patients and 20 healthy controls. Specimens were either formalin fixed and paraffin embedded for real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RT-PCR) and histological analysis, or tissue digestion processed for cell culture and flow cytometry analysis. RANKL mRNA and protein levels were determined by quantitative RT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in gingival cells culture supernatants. Gingival leukocytes were quantified by flow cytometry. RANKL and CD4 immunoreactivity was analyzed by flow cytometry and confocal microscopy. Results: RANKL mRNA levels were higher in periodontitis than in healthy subjects and spontaneous and LPSand PHA-stimulated RANKL synthesis were higher also in patients than controls. CD4+ T lymphocytes were the predominant infiltrate cell subset present in gingival tissues of periodontitis patients. Furthermore, an association between RANKL and CD4+ T cells was determined by double-staining flow cytometry and confocal microscopy. Conclusion: Taken together, these data demonstrate that gingival CD4+ T cells are the main cells responsible for the higher levels of RANKL observed in chronic periodontitis human patients. But: La parodontite chronique est une maladie de nature inflammatoire et étiologie infectieuse, caractérisée par la destruction de l’appareil d’insertion de la dent, ciment radiculaire, ligaments parodontaux et os alvéolaire, et qui cause la perte des dents. Pendant son développement, un dense infiltré inflammatoire cellulaire est établie, constitué principalement par des lymphocytes T, avec la capacité de sécréter une série de cytokines impliquées dans les événements pathogéniques de la maladie, en régulant l’inflammation des tissus parodontaux et la destruction de l’os alvéolaire. La cytokine récemment identifiée dans l’arthrite rhumatoïde RANKL (ligand du récepteur activeur du facteur de transcription nucléaire kB) est exprimé par les lymphocytes T CD4+, et est directement impliqué dans les processus de stimulation de la différenciation des ostéoclastes, leur activation, et la destruction osseuse de l’articulation. L’objectif de la présente étude est de déterminer une possible association entre des niveaux élevés de RANKL et la parodontite chronique, et établir si les lymphocytes T CD4+ recrutés dans les emplacements avec parodontite chronique son les cellules qui sécrètent cette cytokine. Matériel et méthodes: Dans 33 patients ages de 35 années diagnostiqués de parodontite chronique et 20 individus contrôles sains, les niveaux de d’acide ribonucléique messager (ARNm) spécifique pour RANKL ont été déterminés sûr des biopsies de gencive par RT-PCR en temps réel. À partir de les mêmes biopsies, des cellules gingivales totales ont été isolées pour typifier et quantifier les leucocytes infiltrant de la gencive et identifier les cellules responsables de l’expression de RANKL par cytométrie de flux de double couleur. Résultats: Les patients diagnostiqués de parodontite ont des niveaux plus élevés de ARNm de RANKL en comparaison à des individus sains (238 fois), et des pourcentages de lymphocytes T CD4+ (7 fois) et CD8+ (5 fois) supérieurs à des individus sains. Une association entre les taux d’expression de RANKL et le pourcentage de lymphocytes T CD4+ a été déterminée par cytométrie de flux. Conclusion: Ces données démontrent que de plus grands niveaux de RANKL, que peuvent être expliqués en partie à l’activité des lymphocytes T CD4+ dans l’emplacement de l’infection, sont associés à la parodontite. La détermination de l’association entre la parodontite chronique et la synthèse de RANKL constitue un mécanisme moléculaire intéressant qui contribue à expliquer en partie la destruction tissulaire associée et permet de projeter de nouvelles stratégies immunotherapéutiques qui aideraient à contrôler la perte de tissu caractéristique de la parodontite chronique.