Search

El objetivo principal de esta tesis fue estudiar la interacción entre las vías de MAP quinasas de Saccharomyces cerevisiae. Estas vías están representadas en humanos, donde su mal funcionamiento puedeconducir a patologías tales como cáncer o problemas en el desarrollo. La complejidad de los circuitos de señalización de MAP quinasas en células de mamíferos dificulta lacomprensión de como estas integran las señales que los activan. Para resolver este problema, una estrategiaes analizar sistemas biológicos más simples que comparten propiedades con los más complejos. En estesentido, nos propusimos caracterizar exhaustivamente sistemas de señalización de MAP quinasas en unsistema biológico simple, la levadura S. cerevisiae. En esta tesis decidimos determinar los puntos de flujo de información entre las vías de "Respuesta a Shock Hiperosmótico" (HOG) y de "Respuesta a Feromona" (PR) de levaduras, ya que estas vías compartencomponentes en sus vías de señalización y existe controversia sobre sus interacciones. A su vez, estudiamosestas vías en células individuales, estimulando las mismas controlando la dosis de los estímulos utilizados y enuna variada serie de condiciones experimentales. Finalmente, medimos las respuestas de estas vías de unmodo cuantitativo, estudiando su dinámica temporal y analizando el mayor número de respuestas posible encada célula. Resumiendo los resultados obtenidos, podemos decir, que la vía de HOG no presenta osmoadaptaciónperfecta como se había afirmado previamente y permanece activa en estado estacionario. Su activación esmayor cuanto mayor es la osmolaridad externa, y también depende del gradiente químico de glicerol. Además, vemos una alta variabilidad de la respuesta de HOG en células individuales. A nivel de las interacciones entre las vías de MAP quinasas, determinamos que la vía PR es capaz deactivar a la vía HOG en células adaptadas a alta osmolaridad. Esta compleja activación requiere de la MAPK dela vía de integridad de la pared celular (CWI) Slt2/Mpk1 y del polarisoma. La activación de HOG es pulsátil ypresenta una alta variabilidad en células individuales. Los picos de actividad de HOG coinciden con eventosmorfogenéticos inducidos por PR en los cuales se activa Slt2/Mpk1. La vía PR induce una salida de glicerol, queestaría mediada por Slt2/Mpk1, y este sería el mecanismo que llevaría a la activación de la vía HOG. Lainducción de HOG también puede lograrse a través de la activación de Slt2/Mpk1 mediante shock térmico. Ambos tipos de activaciones (por feromona o alta temperatura) son proporcionales a la osmolaridad externa ydependen del gradiente químico de glicerol. Una consecuencia fisiológica de esta activación de HOGpromovida por la vía PR es que las células en estas condiciones presentan una mejor capacidad deosmoadaptación. Finalmente, podemos agregar que los shocks hiperosmóticos inhiben a la vía PR durante la etapa derespuesta aguda, pero no hemos establecido aún los actores moleculares que median esta inhibición. Sin embargo, podemos descartar algunos componentes de la vía de HOG como Sho1, Ssk1 y Hog1. Para terminar,la alta osmolaridad, a largo plazo, en células ya adaptadas, cambia la dinámica de la respuesta de la vía PRreduciendo su sensibilidad a α factor. Esta reducción es proporcional a la osmolaridad externa. Esperamos que los resultados encontrados en este sistema biológico sean de utilidad, para pensar deuna manera más integrativa, como se comporta la dinámica de la respuesta en un dado sistema frente amúltiples señales externas, de acuerdo a como el mismo las integra globalmente. The main objective of this thesis was to study the interaction between MAPK signaling pathways in Saccharomyces cerevisiae. These pathways are represented in humans, were the malfunction of them canlead to pathologies such as cancer or developmental problems. The complexity of MAPK signaling circuits in mammalian cells difficult the understanding of how theyintegrate the signals activating them. As a means to solve this problem, one strategy is to analyze simplerbiological systems that share properties with the more complex ones. In these sense, we ought to characterizethoroughly MAPK signaling pathways in a simple biological system, the yeast S. cerevisiae. In this thesis we decided to determine the points of information flow between the yeast "High Osmolarity" (HOG) and the "Pheromone Response" (PR) pathways, because they share components in theirsignaling cascades and there is controversy in how they interact. In addition to these, we studied thesepathways in individual cells, stimulating them by controlling the stimulus doses and under a severalexperimental conditions. Finally, we measured the output of these pathways in a quantitative way, studyingtheir temporal dynamics and analyzing the most number of possible readouts. Summing up the results obtained, we can say that, the HOG pathway does not present perfectadaptation as it was previously stated and it remains active in steady state. Its activation is higher the higherthe external osmolarity and it also depends on the chemical gradient of glycerol. Besides, we see highvariability in the HOG output of individual cells. At the level of interactions between the MAPK pathways, we determined that the PR pathway canactivate the HOG pathway in cells adapted to high osmolarity. This complex activation requires the Cell Wall Integrity (CWI) MAPK Slt2/Mpk1 and the polarisome. This HOG activation occurs in pulses and presents highvariability in single cells. The peaks of HOG activity coincide with PR induced morphogenetical events where Slt2/Mpk1 is activated. The PR pathway induces a glycerol efflux, which would be controlled by Slt2/Mpk1,and that would be the mechanism leading to HOG pathway activation. HOG induction can also be achievedthrough Slt2/Mpk1 heat shock activation. Both kinds of activations (by pheromone or high temperature) areproportional to the external osmolarity and depend on the glycerol chemical gradient. One physiologicalconsequence of these PR promoted HOG activation is that the cells present a better osmoadaptation capacityin these conditions. Finally, we can add that hyperosmotic shocks inhibit PR pathway during the acute hyperosmoticphase, but we have not established yet the molecular actors that mediate this inhibition. However, we canrule out some of HOG pathway components like, Sho1, Ssk1 and Hog1. To finish, high osmolarity, at longertimes in cells already adapted, changes the dynamics of PR response reducing its sensitivity to α factor. Thisreduction is proportional to the external osmolarity. We hope the results found in this biological system are helpful, to think in a more integrative way,how the output dynamics of a system behaves, facing multiple external signals, depending on how itintegrates them globally. Fil: Baltanás, Rodrigo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.