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El sistema vomeronasal (SVN) es un sistema olfatorio accesorio presente en la mayoría de los tetrápodos. Clásicamente se lo ha asociado con el paso de los vertebrados al ambiente terrestre; sin embargo las evidencias surgidas en los últimos años indican que el SVN apareció tempranamente en la evolución de los tetrápodos y sería funcional en ambientes acuáticos. Este sistema sensorial ha sido descripto en etapas larvales de anuros. Pero ¿es funcional el SVN en renacuajos? No existen experimentos en donde se evalúe la participación del SVN en la quimiodetección en renacuajos. Sin embargo, un número considerable de evidencias indican que este sistema sensorial podría ser funcional en larvas de anuros: 1) El órgano vomeronasal (OVN) aparece durante el desarrollo embrionario y está presente durante toda la etapa larval. 2) El OVN contiene neuronas bipolares cuyos axones proyectan al bulbo olfatorio accesorio (BOA) donde establecen conexiones sinápticas con neuronas telencefálicas. 3) Las neuronas del OVN expresan los receptores de membrana descriptos en tetrápodos, así como la proteína G involucrada en la señalización intracelular. 4) Los análisis de microscopía electrónica demuestran que el OVN posee neuronas con microvellosidades apicales como se describe para otros grupos y sus características ultraestructurales no se modifican durante la metamorfosis. Más aún, no hay diferencias en la ultraestructura de las conexiones sinápticas entre larvas y adultos a nivel del BOA. Los renacuajos presentan una gran cantidad de comportamientos mediados por quimiodetección. Conocer si el SVN participa en la detección de alguno/s de estos estímulos ayudaría no sólo a dilucidar aspectos relacionados con la comunicación química y el comportamiento en renacuajos sino también a comprender aspectos evolutivos de los sistemas quimiosensoriales en vertebrados., The vomeronasal system (VNS) is an accessory olfactory system present in most tetrapods. Classically, the VNS has been associated with terrestriality in vertebrates; however, evidence emerged in recent years suggest that this sensory system appears earlier in tetrapods evolution and may play a role in chemosensory detection in aquatic environments. This sensory system has been described in anuran larvae. But, is the VNS functional in tadpoles? There are no experiments that evaluate the involvement of the VNS in chemodetection in tadpoles. However, a growing body of evidence suggests that the VNS could be a functional sensory system in anuran larvae: 1) The vomeronasal organ (VNO) appears during embryonic development and it is present throughout the larval phase. 2) The VNO contains bipolar neurons whose axons project to the accessory olfactory bulb (AOB) where they establish synaptic contact with telencephalic neurons. 3) The vomeronasal neurons express specific membrane receptors described in the VNO of tetrapods, and the G protein involved in intracellular signaling. 4) Electron microscopy analysis demonstrates that the vomeronasal neurons have apical microvilli as described in other groups and their ultrastructural features do not change during metamorphosis. Moreover, there are no differences in the ultrastructure of the synaptic connections in the AOB between tadpoles and adults. Tadpoles exhibit a large number of chemodetection mediated behaviors. Knowing whether the VNS is functional in tadpoles will contribute to elucidating aspects of chemical communication and tadpole behavior, and would allow us to better understand evolutionary aspects of chemosensory systems in vertebrates., Asociación Herpetológica Argentina

La presente tesis describe los estudios realizados sobre la actividad de la enzima 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa (3βHSD/I), así como su participación en la regulación de la espermiación inducida por hCG en testículos de Bufo arenarum. La enzima 3βHSD/I se localiza en las fracciones mitocondrial y microsomal. Ambas localizaciones muestran diferente especificidad de sustrato, dehidroepiandrosterona (DHE) es el sustrato preferido de la enzima microsomal en tanto que la mitocondrial utiliza solamente pregnenolona. Esta doble localización establecería una compartimentalización de las dos vías de síntesis de esteroides previamente descriptas en B. arenarum: la via Δ4 en las mitocondrias y la via Δ5 en los microsomas. La actividad de ambas fracciones subcelulares es mayor en el período reproductivo que en el no reproductivo. Cuando se incluye DHE en el análisis cinético de la transformación de pregnenolona, se observa una importante modificación de la Vmax, en tanto que el Km permanece constante. Estos resultados indican que DHE se comporta como un inhibidor no competitivo de la conversión de pregnenolona. Los valores de Km y Ki sugieren la presencia de dos sitios de unión. Por otra parte, cuando se utiliza pregnenolona como inhibidor de la transformación de DHE, solo se modifica ligeramente el valor de Km, en tanto que la Vmáx se mantiene constante. Esto indica que pregnenolona se comporta como un inhibidor competitivo. Los valores del coeficiente de Hill para la transformación de DHE y pregnenolona son, respectivamente, 1.04 and 1.01. Estos estudios sugieren que en esta especie la biosíntesis de andrógenos y progesterona es catalizada por sitios activos diferentes. En esta tesis también se ha utilizado un sistema de espermiación in vitro, con el objeto de identificar, en el sapo, los posibles mediadores esteroideos de la espermiación. La espemiación fue inducida con hCG, utilizándose además distintos inhibidores de la esteroidogénesis. Cianocetona, inhibidor de la síntesis de 3-oxo-4-ene esteroides, no afectó la espermiación inducida por hCG aún cuando la síntesis de aquellos esteroides y sus derivados reducidos disminuyó en más de un 95%. Aminoglutetimida, usada en una concentración que bloqueó la síntesis de esteroides, tampoco afectó la espermiación estimulada por la gonadotrofina. Resultados similares se obtuvieron con spironolactona, inhibidor de la enzima 17α-hidroxilasa/17-20 liasa. Como conclusión, puede decirse que en B. arenarum, la espermiación inducida por hCG no está mediada por la síntesis de esteroides. Cuando el ensayo de espermiación se realizó utilizando FSH Humana recombinante (FSHrh), se observó tanto inducción de la espermiación como aumento en la síntesis de esteroides. La capacidad esteroidogénica de las células de Leydig ha sido establecida desde hace tiempo, sin embargo, la potencialidad esteroidogénica de las células de Sertoli es aún controversial. En este trabajo se informa, también, la separación de dos poblaciones celulares que responden diferencialmente a las gonadotrofinas humanas. Las fracciones con una densidad de 1.05 g/ml respondieron a hCG con un aumento en la producción de testosterona (T). Sin embargo no respondieron a FSHrh con un aumento de andrógenos ni de cAMP. La formación de cAMP fue estimulada en las fracciones con una densidad de 1.038 g/ml. Estas también respondieron a FSHrh con un aumento en la síntesis de T. Cuando FSHrh se ensayó sobre fragmentos de testículo, se observó también un aumento dosis-dependiente de la secreción de T. El método utilizado permitió la separación de dos poblaciones de células con características similares a las células de Leydig y Sertoli de cerdo y trucha. Sin embargo, la fracción con una densidad semejante a las células de Sertoli, respondió a FSHrh no solo con un aumento en la formación de cAMP, sino también con un incremento en T. Se podría concluir que el testículo de B. arenarum tendría células de Sertoli con capacidad esteroidogénica, como fuera descripto para otras especies, y que la espermiación podría ser inducida por las gonadotrofinas directamente sobre las células de Sertoli. This thesis describes studies on the activity of the enzyme 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase (3βHSD/I), as well as its participation in the regulation of hCG-induced spermiation in the testes of Bufo arenarum. 3βHSD/I localises in mitochondria and microsomes. Both locations have different substrate-specificity: microsomal enzyme prefers dehydroepiandrosterone (DHE) while mitochondria1 enzyme converts only pregnenolone. As a consequence of this dual localisation, a compartmentalisation of theΔ4 and Δ5 pathway previously described in 5. arenarum, can be proposed: the Δ4 pathway in mitochondria and the Δ5 pathway in microsomes. The activity of both fractions is higher during the reproductive season than during the nonreproductive period. The inclusion of DHE in the kinetic analysis of pregnenolone conversion affected Vmax while Km was not modified, suggesting a non-competitive inhibition of the conversion of pregnenolone. The Km and Ki values suggest the presence of two different binding sites. However, when pregnenolone was added in the assays with DHEA as substrate, no effect was observed on the Vmax while Km values slightly increased with pregnenolone concentration. Consequently, pregnenolone inhibited the transformation of DHEA in a competitive fashion. The Hill coefficient for the conversion of DHE and pregnenolone are 1.04 and 1.01, respectively. These studies suggest that, in this species, the microsomal biosyntheses of androgens and progesterone are catalysed by different active sites. This thesis also employs an in vitro system to identify potential steroidal mediators of spermiation in the toad. Spermiation was induced by hCG and the effect of different inhibitors of steroid-biosynthesis was analysed. Cyanoketone, an inhibitor of 3-oxo-4-ene steroid biosynthesis, do not block hCG-inducing activity even though biosynthesis of 3-oxo-4-ene is inhibited by 95%. Aminogluthetimide, at a concentration that inhibited testosterone (T) biosynthesis, do not alter hCG actions. Similar results were obtained with spironolactone, an inhibitor of 17α-hydroxylase/17-20 lyase activity. It is possible to conclude that in B. arenarum, hCC-induced spermiation is not mediated by steroid biosynthesis. The inclusion of Human recombinant FSH (rhFSH) in the spermiation-assay not only induces spermiation but also an increase of testosterone biosynthesis. The steroidogenic capability of Leydig cell has been largely established, however, the steroidogenic potentially of Sertoli cell is still controversial. in this work it is also reported the separation of two population cells with different responsiveness to human gonadotropins. T production was stimulated by hCG in fraction with a density of 1.05 g/ml. However, this fraction did not respond to rhFSH either with an increase in cAMP production or with T synthesis. rhFSH induced cAMP production in fraction corresponding to 1.038 g/ml. This fraction also responded to rhFSH with an increase in T production. The effect of rhFSH on testosterone production by testis fragment was also assayed. The gonadotropin evoked a dose-dependent increase in T secretion. The method employed in the present work has permitted the separation of two population cells resembling pig and trout Leydig and Sertoli cells. However, the fraction with a density similar to Sertoli cells responded to rhFSH not only with an increase in cAMP production but also with an important augment in androgen synthesis. We can conclude that the testes of B. arenarum have Sertoli cells with steroidogenic capability and that spermiation could be elicited by the action of gonadotropins on Sertoli cells. Fil: Pozzi, Andrea Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El comercio de peces ornamentales es una actividad que ha crecido en los últimos años. Aunque en algunos países ya se ha establecido el cultivo de varias especies de peces ornamentales de interés económico, uno de los problemas más frecuentes alrededor de esta actividad es el desequilibrio generado por la presión constante sobre las poblaciones naturales, ya que muchas de las especies siguen siendo capturadas de su hábitat natural para su comercialización. Esto genera la necesidad de estandarizar las técnicas de producción de dichas especies, desarrollando modelos de manejo reproductivo, estudio del comportamiento, larvicultura, crecimiento, manejo nutricional, entre otros. El tetra cola roja (Aphyocharax anisitsi) y el neón cardenal (Paracheirodon axelrodi) son dos especies de Charácidos, uno de los órdenes de mayor interés de exportación en Argentina, de las cuales se conoce muy poco de su biología básica y su cría en cautiverio aún no ha sido exitosa. El presente trabajo, tuvo como objetivo principal generar conocimiento acerca de la biología reproductiva de estas dos especies, como base para estandarizar su cría. Para esto en primer lugar se realizó la descripción topológica y morfológica del cerebro de A. anisitsi, en la cual se observó que su organización interna presenta características similares a las descriptas en otros grupos de teleósteos. A través del análisis morfométrico se encontraron diferencias significativas entre los distintos lóbulos del cerebro, siendo los lóbulos ópticos las estructuras de mayor tamaño en esta especie. Se realizó además la descripción morfológica del complejo pineal de ambas especies, y se encontró que ambos complejos tienen características histológicas e inmunohistoquímicas muy similares, lo cual se podría atribuir a las adaptaciones de cada especie a la incidencia de la luz en su ambiente natural. También se realizó la caracterización inmunohistoquímica del eje endócrino asociado a la reproducción incluyendo el sistema GnRHérgicos y a las hormonas hipofisarias de ambas especies. Los resultados mostraron la presencia de tres poblaciones de neuronas GnRH, y un patrón de distribución de células hipofisarias similar a otras especies de teleósteos con ligeras diferencias en la distribución de βFSH. Finalmente, como estrategia para estandarizar la reproducción de P. axelrodi en condiciones de cautiverio, se implementaron varias metodologías para la inducción del desove; desde la modificación de la fisicoquímica de agua, partiendo de las condiciones reproductivas que se presentan en ambiente natural para esta especie, hasta el uso de Ovaprim, una droga que combina un análogo de GnRH y domperidona, un inhibidor de dopamina, para estimular el eje reproductivo e inducir la ovulación y la espermiación. Las variaciones fisicoquímicas en las condiciones del agua ensayadas no estimularon per se el desove en P. axelrodi, así como tampoco el uso de Ovaprim. Sin embargo, podemos decir a partir de los resultados obtenidos que, aunque las condiciones fisicoquímicas evaluadas en los experimentos no fueron suficiente estímulo para el desove, sí son esenciales para proporcionarle a los peces buenas condiciones para el crecimiento y la preparación de las gónadas para la reproducción. The ornamental fish trade has become an activity of growing interest during recent years. The breeding of several species of ornamental fish of economic interest has already been established in some countries. However, one of the most frequent problems around this activity is the imbalance generated by the constant pressure on natural populations, since many of the species are still being captured from its natural habitat for commercialization. Consequently, it is necessary to standardize the production techniques of these species and to develop models of reproductive management, behavioral studies, larviculture, growth, nutritional management, among others. The red-tailed tetra (Aphyocharax anisitsi) and the cardinal neon (Paracheirodon axelrodi) are two species of Characiphorms, one of the orders of greatest export interest in Argentina. Despite of its economic relevance, unfortunately very little of their basic biology is known and captive breeding has not been successful yet. The main objective of this work was to describe the reproductive biology of these two species to generate knowledge that can be used as a basis to standardize their breeding conditions in captivity. To achieve this goal, the topological and morphological description of the brain of A. anisitsi was carried out. Results suggest that its internal organization presents characteristics like those described in other teleost groups. Through the morphometric analysis, significant differences were found between the different lobes of the brain, the optical lobes being the largest structures in this species. The description of the morphology of the pineal complex of both species was also analyzed and both complexes have very similar histological and immunohistochemical characteristics, which could be attributed to the adaptations of each species to the incidence of light in its natural environment. The immunohistochemical characterization of the endocrine axis associated with reproduction was also performed, including the GnRHergic system and the pituitary hormones of both species. The results showed the presence of three populations of GnRH neurons, and a distribution pattern of pituitary cells like other teleost species with slight differences in the distribution of βFSH. Finally, several methodologies for the induction of spawning were implemented to standardize the reproduction of P. axelrodi in captivity conditions. Two strategies were taken into consideration: the modification of the water physicochemistry, starting from the reproductive conditions that occur in natural environment for these species, and the use of Ovaprim, a drug that combines a GnRH analog and domperidone, a dopamine inhibitor, to stimulate the axis reproductive and induce ovulation and spermiation. The physicochemical variations in the water conditions tested and the use of Ovaprim did not stimulate per se spawning in P. axelrodi. However, we can say from the results obtained that, although physicochemical conditions evaluated in the experiments were not sufficient stimulus for the spawning, they are essential to provide fish with good conditions for the growth and preparation of the gonads for the reproduction. Fil: Rincón Camacho, Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada; Argentina

La posibilidad de supervivencia de una población está dada, en parte, por la capacidad de sus individuos para detectar y responder a las situaciones de amenaza. Anteriormente, en nuestro laboratorio se comprobó que las larvas de Rhinella arenarum (Amphibia, Anura) producen una señal de alarma especie-específica que es liberada al medio cuando se produce daño tisular. Esta señal es detectada por conespecíficos desencadenando una serie de comportamientos antipredatorios. En la mayoría de las especies de anfibios, la respuesta antipredatoria más evidente consiste en una reducción en la actividad exploratoria. Sin embargo, en algunas especies las respuestas incluyen otras estrategias como: evitación de zonas, utilización de refugio, e incluso aumento en los niveles de actividad. Por otro lado, reducir la actividad se contrapone con otras actividades relacionadas con la explotación de recursos, como la búsqueda e ingesta de alimento, lo que conllevaría un alto costo para el individuo provocando menores tasas de crecimiento y/o desarrollo. En base a esto, distintos autores han propuesto la existencia de un compromiso entre la respuesta antipredatoria adoptada y otras actividades fundamentales para la supervivencia del animal. En esta tesis, se realizó una caracterización del comportamiento antipredatorio desencadenado por señales de alarma en las larvas de R. arenarum. Se demostró que este comportamiento presenta dos componentes: uno activo, dónde las larvas muestran eventos de escape y evitación de la zona donde el estímulo está presente, o es más intenso; y uno pasivo que consiste en la reducción completa de la actividad locomotora. Estos componentes se van alternando hasta que la larva logra detectar que el nivel de riesgo disminuye en intensidad, permitiendo que se retome la actividad exploratoria. Los resultados muestran la complejidad de la respuesta comportamental antipredatoria donde se tiende a maximizar el compromiso entre reducir los riesgos de predación y mantener otras actividades esenciales para la sobrevida del animal. Por otra parte, muchos autores han planteado que las condiciones en las que las larvas crecen y se desarrollan constituye un efecto modulador de las respuestas antipredatorias. En el caso de las larvas de R. arenarum, el desarrollo en condiciones de hacinamiento provoca la aparición de un comportamiento atípico como es el canibalismo. En esta tesis se demuestra que larvas criadas en estas condiciones dejan de responder con comportamientos antipredatorias ante señales asociadas a riesgo de predación. Mas aún, estas señales desencadenan comportamientos predatorios (exploración y ramoneo) en las larvas criadas en condiciones de hacinamiento. Estos cambios de comportamiento frente a la señal de alarma son reversibles, ya que luego de una semana en condiciones de no hacinamiento las larvas vuelven a responder de manera antipredatoria. En cuanto a la naturaleza de las señales de alarma en larvas de anfibios, hasta el momento es muy escasa la información con la que se dispone. En esta tesis se describen las características químicas, posible origen tisular y mecanismo de liberación de la señal de alarma en las larvas de R. arenarum. Se confirma que la/s molécula/s relacionadas con el riesgo de predación serían de origen peptídico de un tamaño cercano a 5 kDa. La liberación de esta señal se produce en forma pasiva por ruptura de las células que la contienen, probablemente durante los eventos de predación. Los resultados permiten también especular que estas señales provienen de las células “giant cells” presentes en el tegumento de las larvas de esta especie. Además se ha logrado establecer una co-ocurrencia entre la aparición de estas células durante el desarrollo ontogenético y el momento donde comienzan a sintetizarse las señales que desencadenen la respuesta comportamental antipredatoria. También se demostró una coincidencia entre la presencia de las giant cells en la epidermis de otra especie de bufonido (R. fernandezae), con la capacidad de generar respuestas antipredatorias en R. arenarum. The possibility a population survival is given, in part, by the ability of their individuals to detect and respond to threatening situations. Previously, in our laboratory it was proved that Rhinella arenarum (Amphibia, Anura) tadpoles produce a species-specific alarm signal that is released to the environment after tissue damage. This signal is detected by conspecifics triggering antipredatory behaviours. In most amphibian species, the most evident antipredatory response consists in a reduction in the activity. However, in some species these responses include other strategies such as: area avoidance, use of refuge, and even increase in activity levels. On the other hand, reducing activity is contrasted with other activities related to the exploitation of resources, like search and food intake, which would entail a high cost for the individual, causing lower grow rates of and development. Based on this, different authors have proposed the existence of a compromise between the antipredatory response and other activities essential for the animal survival. In this thesis, it was made a characterization of the antipredatory behaviour triggered by alarm signals in the larvae of R. arenarum. It was demonstrated that this behaviour has two components: an active one, where the tadpoles show escape events and avoidance of the area where the stimulus is present, or is more intense; and a passive one that consists in a complete reduction of the activity. These components alternate until the larva manages to detect that the level of risk decreases in intensity, allowing the exploration activity to resume. These results demonstrate that the antipredatory behavioural response in anuran larvae is complex, and tends to maximize the compromise between reducing the predation risks and continue with other activities essential for the animal survival. On the other hand, many authors have suggested that the conditions in which tadpoles grow and develop can modulate the antipredatory responses. This thesis shows that tadpoles raised in overcrowding, a condition that triggers cannibalism events, the antipredatory response to the alarm signal disappears. And moreover, the same homogenates that produce an antipredatory response in control larvae, trigger predatory behaviours (exploration and browse) in larvae reared in cannibalistic conditions. This surprising behavioural change is reversible: after a week in conditions of no overcrowding, tadpoles respond to alarm signals in an antipredatory manner. Regarding the nature of alarm signals in amphibian larvae, so far, there is only one chemical characterization for a signal involved in intra-specific communication made in Lithobates clamitans. In this case, the alarm signal is a mixture of small peptides stored in vesicles of epidermal cells. In the present work I describe the chemical characteristics, tissue origin and release mechanism of the alarm signal in R. arenarum tadpoles. It is confirmed that the molecule that act as an alarm signal would be one or more peptides of a size less than 5 kDa. Its release occurs by breaking the cells that contain them, probably when the tadpole is captured by a predator. The results allow speculating that these signals come from the cells "giant cells" present in the tegument of the larvae of this species. In addition, I establish a co-occurrence between the appearance of these cells during ontogenetic development and the behavioural response that triggers them. A coincidence was also demonstrated between the presences of giant cells in the epidermis of another species of bufonido (R. fernandezae), with the capacity to generate antipredatory responses in R. arenarum. Fil: Raices, Marilina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.