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The biological properties of mesenchymal stem cells (MSCs) from synovial fluid from horse limb joints were analysed. The samples were characterized by their peculiarity of adhering to the plastic of the culture flasks. The electromagnetic field technique (MACS) and the surface biomarker STRO-1 were used to optimize their isolation by enriching mesenchymal precursor cells (MSC-LS). To determine the expression of multipotency genes, total RNA was extracted and M-MLV reverse transcriptase was used for the cDNA, which served as a template for qPCR (quantitative PCR). qPCR was performed using the BioRad system with Sybr Green quantification. The multipotency genes quantified were OCT4 and NANOG. The cells selected using MACS with the surface biomarker STRO-1 (CMM-LS STRO-1) proliferate more rapidly than the CMM-LS obtained without purification. In addition, they showed a greater predisposition to differentiate into chondrocytes and osteocytes compared to non-purified LS-MSCs, and a lower predisposition to differentiate into adipocytes. Likewise, the expression of OCT-4 was significantly higher in the CMM-LS STRO-1 compared to the non-purified CMM-LS. NANOG expression was slightly higher in STRO-1 CMM-LS, but without significant differences. The results suggest that the co-expression of OCT-4 and Nanog could increase the physiological functions of MSC-LS STRO-1 related to better proliferation, self-renewal, and the predisposition to differentiate in osteochondral lineages; however, the functional role of these pluripotency markers in adult stem cells needs to be clarified., Se analizaron las propiedades biológicas de las células madre mesenquimales (CMM) provenientes del líquido sinovial de las articulaciones de las extremidades de caballo. Las muestras fueron caracterizadas por su peculiaridad de adherirse al plástico de los frascos de cultivos. Se utilizó la técnica de campos electromagnéticos (MACS) y el biomarcador de superficie STRO-1 con la finalidad de optimizar su aislamiento mediante el enriquecimiento de células precursoras mesenquimales (CMM-LS). Para determinar la expresión de los genes multipotencia, se extrajo el ARN total y se usó la transcriptasa reversa M-MLV para el ADNc, el que sirvió como molde para la qPCR (PCR cuantitativa). El qPCR se realizó utilizando el sistema BioRad con cuantificación mediante Sybr Green. Los genes de multipotencia cuantificados fueron OCT4 y NANOG. Las células seleccionadas utilizando MACS con el biomarcador de superficie STRO-1 (CMM-LS STRO-1), proliferan más rápidamente que las CMM-LS obtenidas sin purificar. Además, manifestaron una mayor predisposición a diferenciarse en condrocitos y osteocitos en comparación a las CMM-LS sin purificar, y una menor predisposición a diferenciarse en adipocitos. Así mismo, la expresión de OCT-4 fue significativamente superior en la CMM-LS STRO-1 en comparación con las CMM-LS sin purificar. La expresión de NANOG fue ligeramente superior en las CMM-LS STRO-1, pero sin diferencia significativa. Los resultados hacen suponer que la coexpresión de OCT-4 y Nanog podrían incrementar las funciones fisiológicas de las CMM-LS STRO-1 relacionadas con una mejor proliferación, autorrenovación y la predisposición a diferenciarse en los linajes osteocondrales; sin embargo, se necesita aclarar el papel funcional de estos marcadores de pluripotencia en células madre adultas.

[EN] Since the development of techniques for in vitro embryo production there is an important demand of methods to assess the quality of the generated embryos. One of the main criteria to assess the quality of produced blastocysts is the ratio between the number of inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE). Nanog and Cdx2 proteins are founded in the ICM cells and TE cells respectively in mouse embryos. The aim of this work was tune up, in our laboratory, the immunodetection analysis of Nanog protein in goat and sheep embryos produced by in vitro fertilization (IVF) and parthenogenesis. We have produced 640 ovine embryos by IVF and 1083 by parthenogenetic activation (PA). In caprine we produced 205 embryos by IVF and 66 by PA. All produced embryos are grouped in three different groups: 2 to 8 cells embryos, morulae, and blastocysts. We used the routine techniques of laboratory to carry out IVF and PA. For the Nanog protein analysis we used 286 embryos and different protocols were performed to optimize the suitable one for sheep and goats. By using the original immunodetection protocol (mouse), it was observed that Nanog protein needed an optimization by changing the primary antibody from the original (polyclonal rabbit anti-­‐Nanog) to the human one (rabbit anti-­‐Human Nanog). We found expression of Nanog protein in each cell in: 2-­‐8 cells embryos, morulae and blastocysts. It was contrary to our expectations considering that the mouse Nanog protein is localized, in blastocysts, only in the ICM cells and it is not found in the previous embryonic stages. Our produced blastocysts shows Nanog signal in 66’7% and 89’6% en sheep, and 83’6% and 60’5% in goat of total cells, which indicates that this signal was also localized in the TE cells and not only on the ICM, as it was expected. The Cdx2 was located in 68’97% of cells in the blastocyst stage, indicating that the labeling was correct only in the TE. In conclusion, our data do not show significant differences between sheep and goat embryos produced by IVF and PA., [ES] Desde que se desarrollaron las técnicas de producción de embriones in vitro existe una demanda de métodos que permiten evaluar la calidad de los embriones generados. Uno de los criterios de la calidad de los blastocistos producidos es la relación entre el número de células del Masa Celular Interna (MCI) y del Trofoectodermo (TE). La proteína Nanog y la Cdx2, son proteínas que se encuentras en la MCI y TE, respectivamente en embriones de ratón. El objetivo de este trabajo fue poner a punto en nuestro laboratorio en embriones caprinos y ovinos producidos por fecundación in vitro (FIV) y partenogénesis, el análisis de inmunodetección de la proteína Nanog. Producimos 640 embriones ovinos mediante FIV y 1083 embriones por activación partenogenética (AP). En caprino producimos 205 embriones por FIV y 66 por AP. Los embriones producidos son agrupados en tres grupos: embriones de 2 a 8 células, mórulas y blastocistos. Las técnicas utilizadas para la FIV y AP son las rutinarias del laboratorio. Para el análisis de la proteína Nanog utilizamos 286 embriones con diferentes protocolos hasta optimizar el adecuado para ovino y caprino. Utilizando el protocolo de inmunodetección original (de ratón), se observó que la proteína Nanog necesitó una optimización para los embriones de oveja y cabra, cambiando el anticuerpo primario original rabbit polyclonal anti-­‐Nanog por rabbit anti-­‐Human Nanog. Encontramos expresión de la proteína Nanog en cada célula de embriones de 2-­‐8 células, mórulas y blastocistos, contrariamente a lo esperado ya que la proteína Nanog de ratón solo se localiza en las células MCI y no en los anteriores estadios embrionarios. En nuestros blastocistos producidos se observa que el número de células con señal Nanog es del 66’7% y 89’6% en ovino, y 83’6% y 60’5% en caprino del total de células, lo que indica que esta señal estuvo localizada también en las células del TE y no solo en las del MCI, como era lo esperado. El Cdx2 se localizó en el 68’97% de las células del blastocisto, indicando que era correcto su marcaje solo en las TE. En conclusión nuestros datos no muestras diferencias significativas entre los embriones de ovino y caprino producidos mediante FIV y AP

Los organismos multicelulares se desarrollan a partir de una sola célula: el cigoto. A lo largo de su ontogenia, las células que derivan del cigoto despliegan distintos programas celulares, los cuales son estabilizados por mecanismos epigenéticos. Los programas de las células troncales son más inclusivos, siendo mayor el silenciamiento que la activación de genes durante el proceso de diferenciación celular. Experimentalmente, se ha logrado que células en estado de diferenciación terminal reactiven el programa de células troncales y recuperen su pluripotencialidad, proceso llamado reprogramación. Esto despierta esperanzas en el avance de una medicina regenerativa con nuevas capacidades para el tratamiento de enfermedades crónicas, sin las restricciones éticas del uso de células embrionarias.

Los organismos multicelulares se desarrollan a partir de una sola célula: el cigoto. A lo largo de su ontogenia, las células que derivan del cigoto despliegan distintos programas celulares, los cuales son estabilizados por mecanismos epigenéticos. Los programas de las células troncales son más inclusivos, siendo mayor el silenciamiento que la activación de genes durante el proceso de diferenciación celular. Experimentalmente, se ha logrado que células en estado de diferenciación terminal reactiven el programa de células troncales y recuperen su pluripotencialidad, proceso llamado reprogramación. Esto despierta esperanzas en el avance de una medicina regenerativa con nuevas capacidades para el tratamiento de enfermedades crónicas, sin las restricciones éticas del uso de células embrionarias. Multicellular organisms develop from one cell: the zygote. During ontogeny, cells derived from the zygote display different cellular programs that are stabilized through epigenetic mechanisms. The programs of stem cells seem more inclusive, and during the process of differentiation a larger number of genes are silenced than activated. The reactivation of pluripotency recovers of the stem cell program in terminally differentiated cells has been achieved experimentally. This process, called reprogramming, brings new hope for the development of a regenerative medicine with new capabilities for the treatment of chronic diseases, without the ethic restrains imposed by the use of embryonic cells.