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Autism spectrum disorder is a neurodevelopmental disorder characterised by an atypical brain structure from the first months of gestation. These structural differences may be the consequence of heterochrony in the divisions of the periventricular germ cells. Whether due to a too rapid growth of developing cells (proliferation), a defect in neuronal migration, or a failure to eliminate leftover neurons (apoptosis), the result is an increase in short-range neuronal connections and an decrease in the long-range. The functional anomalies that this entails could explain most of the cognitive and behavioural manifestations of the people who suffer from it. The aim of this work is to integrate and synthesise the latest advances in the study of neuronal connections that could be involved in these manifestations. El trastorno del espectro autista es un trastorno del neurodesarrollo caracterizado por una estructura cerebral atípica desde los primeros meses de gestación. Estas diferencias estructurales pueden ser la consecuencia de una heterocronía en las divisiones de las células germinales periventriculares. Ya sea debido a un crecimiento demasiado rápido de las células en desarrollo (proliferación), a un defecto en la migración neuronal, o a un fallo en la eliminación de neuronas sobrantes (apoptosis), el resultado es un aumento de las conexiones neuronales de corto alcance y un decremento de las de largo alcance. Las anomalías funcionales que esto conlleva podrían explicar la mayor parte de las manifestaciones cognitivas y conductuales de las personas que lo padecen. El objetivo de este trabajo es integrar y sintetizar los últimos avances en el estudio de las conexiones neuronales que podrían estar implicadas en dichas manifestaciones.

La presente tesis doctoral presenta varios resultados fundamentales para la ampliación del conocimiento actual de procesos importantes en la generación de los circuitos neuronales, como son la migración y la ramificación de células neurales. En primer lugar, se ha determinado la expresión de la semaforina transmembranal 4F en cerebro de ratón en desarrollo y adulto. Así, se ha visto que se expresa en diversas áreas del cerebro, y se ha encontrado expresión de esta proteína en precursores neuronales y en neuronas maduras, principalmente en dendritas, y en células del linaje oligodendroglial. Para profundizar más en este aspecto se llevaron a cabo varios marcajes dobles de Sema4F con proteínas marcadoras de oligodendrocitos, observándose marca en el nervio óptico y otras regiones cerebrales, incluídas la materia blanca y vías de migración de oligodendrocitos. La localización de esta semaforina en el nervio óptico a edades embrionarias y su expresión en células precursoras de oligodendrocitos (OPCs), comprobada in vitro, nos llevó a sugerir que Sema4F funciona controlando la migración de OPCs. Una serie de experimentos con explantes de nervio óptico tratados con medio control o medio condicionado 4F nos permitió determinar que Sema4F actúa inhibiendo la migración de OPCs, sin afectar a su proliferación. Además, Sema4F induce la diferenciación de OPCs a oligodendrocitos maduros. Todos estos datos sugieren un posible papel de Sema4F en procesos de remielinización. Los efectos negativos de Sema4F sobre la migración de OPCs deben cursar con cambios en el citoesqueleto celular. La kinasa de adhesión focal (FAK) es un importante mediador de señales extracelulares (como factores tróficos, interacción de integrinas con proteínas de matriz extracelular, etc…) y el interior de las células. Actúa sobre el citoesqueleto de actina y de tubulina, influyendo en la generación de filopodios, lamelipodios y fibras de estrés. Tiene un papel crucial en migración, de modo que dedicimos estudiar si Sema4F ejerce sus efectos en OPCs a través FAK. Hemos visto que Sema4F es capaz de inducir la fosforilación en varios residuos tirosina de FAK en pocos minutos, y que ambas proteínas por separado ejercen efectos opuestos en la migración de oligodendrocitos. La vía de señalización de 4F, de la que se desconoce incluso el receptor, podría cursar mediante la modulación del estado de activación de FAK, aunque faltan experimentos definitivos. FAK presenta varias isoformas específicas del sistema nervioso central, originadas mediante procesos de splicing alternativo. En la presente tesis hemos determinado con gran especificidad la forma mayoritaria expresada en varias áreas cerebrales y en el desarrollo embrionario o el adulto, tanto en neuronas como en células de la glía. FAK responde a neurotrofinas y participa en procesos de ramificación neuronal, si bien su efecto final es controvertido. Otra proteína que responde a neurotrofinas, y actúa promoviendo la ramificación axonal, es la kinasa dependiente de cdc-42 activada 1 (Ack1). En esta tesis hemos determinado que ambas proteínas interaccionan en cerebro específicamente, de manera independiente de la isoforma de FAK presente. Mediante el uso de inhibidores hemos visto que la activación de FAK es necesaria para la fosforilación de Ack1 y viceversa. FAK es la responsable de la atracción ejercida por netrina-1, y hemos determinado que la ausencia de Ack1 elimina el efecto de esta molécula de señalización. Con técnicas de Espetrometría de Masas hemos identificado algunos posibles interactores de ambas proteínas. Además, hemos observado cambios en el estado de fosforilación de varios residuos de FAK y Ack1 en función del estado de desarrollo (ratones P5 Vs. Adultos) y del estado general de activación del cerebro (ratones inyectados con la droga epileptogénica PTZ Vs. Control)., This thesis presents several results related to important processes regarding neural circuit formation, i.e. migration and ramification of Central Nervous System (CNS) cells. First, we have determined the expression of transmembrane semaphorin 4F (Sema4F) in developing and adult mice brain. Expression of this protein is high in neuronal and oligodendrocyte precursor cells (OPCs), and in different areas including optic nerve (ON) and different migratory pathways. In vitro experiments confirmed Sema4F expression in OPCs. We investigated the role of this protein in functions important for OPC physiology, and found that Sema4F inhibits OPC migration from ON explants and induces their differentiation into mature progenitors. Negative effects of Sema4F in migration must involve cytoskeleton changes. Focal adhesion kinase (FAK) is an important integrator of different extracellular signals and modulates cytoskeleton dynamics to control generation of lamellipodia, fillopodia and stress fibers. In the present project we found that Sema4F is able to phosphorylate FAK, and that FAK enhances OPC migration. The exact implications of Sema4F-FAK relationship remain to be elucidated. FAK exists in different spliced isoforms, expressed preferentially in brain. In this project, we characterised the exact isoform expressed in different areas of the brain and by different cell types. Finally, FAK response to neurotrophins is well characterised. FAK also participates in ramification processes, with controversial final effects in neurons. Ack1 is a crucial transducer of neurotrophin-induced ramification. In this thesis we show that both proteins interact specifically in neurons. We have also found that the activation of FAK is necessary for Ack1 phosphorylation upon stimulation, and viceversa. FAK mediates netrin-1 attraction, and here we have determined that knocking-down Ack1 avoids netrin-1 effects in hippocampal explants. By Mass Spectrometry (MS) techniques, we have observed changes in the phosphorylation state of both proteins depending on the developmental stage of the brain (P5 mice) or its activation state (epileptic mice).

El consumo de etanol durante la gestación puede inducir una serie de alteraciones graves en el desarrollo del feto, la manifestación más extrema da lugar al Síndrome Alcohólico Fetal (SAF). La exposición prenatal al alcohol es la causa conocida y, además evitable, más importante de retraso mental en el mundo occidental. Además de déficits cognitivos, los niños con SAF presentan múltiples anomalías estructurales en el sistema nervioso central, como reducción de la masa cerebral, y a nivel celular, daños en la migración neuronal, en el proceso de formación de espinas dendríticas y establecimiento de sinapsis. En la actualidad, los mecanismos moleculares implicados en la teratogénesis inducida por el etanol siguen sin esclarecerse. En el presente estudio empleamos neuronas de hipocampo en cultivo primario que se expusieron crónicamente, durante 14 días in vitro, a una dosis moderada de etanol (30 mM). Se analizaron los efectos del etanol sobre el citoesqueleto, y se demostró que el tratamiento disminuía los niveles de actina y tubulina polimerizadas, así como el número y la distribución de los microtúbulos en las dendritas. Los efectos observados podían estar relacionados con la alteración de múltiples proteínas implicadas en las vías de señalización mediadas por las Rho GTPasas (Rac1, Cdc42 y RhoA), que son las principales moléculas reguladoras del citoesqueleto. El tratamiento reducía los niveles de las tres GTPasas, y afectaba la cantidad de las formas activas (unidas a GTP) de Rac1 y Cdc42, así como la de varias proteínas involucradas en dichas vías. La exposición crónica a niveles bajos de alcohol, alteraba la densidad de las espinas maduras y la proporción de los diferentes tipos morfológicos de espinas. Estos efectos, se producían entre la primera y segunda semana de cultivo, y podrían estar causados por la alteración en el equilibrio G-actina/F-actina, causado por los cambios en los niveles de diferentes factores que regulan la organización de la actina filamentosa, que desempeña un papel central en la formación, maduración, y plasticidad de las espinas dendríticas. Otra diana clave en la toxicidad del etanol en neuronas, y estrechamente ligada al citoesqueleto, podría ser el tráfico intracelular. Para evaluar esta posibilidad estudiamos el efecto del etanol sobre la endocitosis, y los elementos y moléculas que participan en el tráfico intracelular (aparato de Golgi, retículo endoplásmico y proteínas motoras). El tratamiento reducía la endocitosis de la albúmina, la cual es degradada en los lisosomas, y producía un desfase en la cinética de captura y reciclaje de la transferrina. Esto podría estar causado por las alteraciones observadas en los niveles de varias moléculas implicadas en las vías endocíticas (proteínas adaptadoras, estructurales y Rab GTPasas). Cabe destacar que el alcohol afectaba notablemente la estructura del aparato de Golgi El efecto tóxico del etanol sobre los orgánulos y las vías que regulan el tráfico intracelular y la dinámica del citoesqueleto, podrían afectar a procesos esenciales para el desarrollo del sistema nervioso, como neuritogénesis, elongación del axón, sinaptogénesis y migración neuronal, conduciendo finalmente a las graves enfermedades mentales descritas en niños expuestos prenatalmente al etanol.

El sistema endocannabinoide (eCB), compuesto por los receptores cannabinoides (rCB1 y rCB2), ligandos endógenos (endocannabinoides), y enzimas de síntesis y degradación, está presente en el cerebro desde etapas muy tempranas de su desarrollo. En este periodo, el sistema eCB está involucrado en la regulación de la proliferación de progenitores neuronales, en la especificación, la migración y la diferenciación de neuronas piramidales e interneuronas y también en la sinaptogénesis. El consumo de marihuana durante la gestación representa un gran riesgo para el desarrollo del sistema nervioso central de los fetos, dado que el Δ9‐ tetrahidrocannabinol, el principal compuesto activo del cannabis, atraviesa la placenta y la barrera hemato‐encefálica. Estudios realizados en niños y adolescentes cuyas madres consumieron marihuana durante el embarazo, documentaron anormalidades cognitivas y comportamentales. En este trabajo se demostró la expresión del rCB1 durante la corticogénesis en neuronas postmitóticas en migración, así como en diversas poblaciones neuronales. Además, el presente trabajo aporta evidencias sobre los efectos que produce la exposición materna a un agonista cannabinoide sobre las neuronas postmitóticas en migración y la diferenciación de neuronas del linaje glutamatérgico. Estos resultados contribuyen al conocimiento sobre los sustratos neurobiológicos que determinarían los cambios neuro‐comportamentales que persistentes en las funciones cerebrales durante la vida postnatal. Asimismo, se demostró que ratones CB1 knockout mostraron una disminución en el número de progenitores intermedios y un aumento en el número de neuronas postmitóticas glutamatérgicas. Durante la vida postnatal, la deleción del rCB1 indujo una distribución de interneuronas anormal. En suma, los resultados obtenidos en este trabajo constituyen avances originales sobre el papel del sistema endocannabinoide en el desarrollo de la corteza cerebral. The endocannabinoid system (eCB), formed by the cannabinoid receptors (rCB1 and rCB2), endogenous ligands (endocannabinoids) and synthesis and degradation enzymes, is present since early stages of brain development. During this period, the eCB is involved in the regulation of proliferation of neural progenitors and in specification, migration and differentiation of pyramidal neurons and interneurons as well as in synaptogenesis. Marihuana consumption during pregnancy represents a serious risk for the proper development of the fetus´s brain since Δ9‐ tetrahidrocannabinol, main active compound of cannabis, can reach the fetus through placenta and hemato‐encephalic barrier. Cohort studies performed on children and adolescents of mothers who consumed marihuana during pregnancy, reported cognitive and comportamental abnormalities in these subjects. In the present study, we demonstrated the expression of the rCB1 during corticigenesis in migrating postmitotic neurons as well as in other neuronal populations. Moreover, this Thesis work provides evidence on the effects accounted by prenatal exposure to a cannabinois agonist on migrating post‐mitotic neurons and the differentiation of glutamatergic neurons. The present results contribute to the knowledge on neurobiologic substrates that determine neuro‐comportamental changes that will persist through post‐natal life. Finally, it was also proved that CB1 knockout mice showed a diminished number of intermediate progenitors and a higher number of glutamatergic post‐mitotic neurons. During post‐natal life, the deletion of rCB1 induced an abnormal distribution of interneurons. In summary, the results presented in this Thesis work represent an original advance in the understanding of the role played by the eCB system in the development of the cerebral cortex. Fil: Saez, Trinidad María de los Milagros. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La esquizencefalia es el trastorno más frecuente de la migración neuronal y ocurre entre el tercero y quinto meses de la gestación. Se describen en este artículo sus posibles causas genéticas (EMX2), vasculares e infecciosas, así como sus manifestaciones clínicas, radiológicas y electroencefalográficas. El tratamiento es sintomático y multidisciplinario. Schizencephaly is the most frequent neuronal migration disorder and it develops between the third and fifth gestational months. Genetic (EMX2), vascular and infectious etiologies have been described. Its clinical, radiological and electroencephalographic characteristics are described in this article. Treatment should be symptomatic and multidisciplinary.

El objetivo de esta Tesis ha sido profundizar en el estudio del desarrollo del complejo claustroamigdalino en ratón. Para ello hemos estudiado: 1) cuales de sus componentes derivan del palio lateral o ventral, en base a expresión diferencial de genes reguladores Dbx1, Lhx9, Lhx2, Lmo3, Lmo4, Cadherina 8 y Emx1 durante el desarrollo embrionario; 2) el desarrollo de las interneuronas del complejo claustroamigdalino que contienen proteínas ligadoras de calcio (incluyendo el desarrollo de sus circuitos locales); 3) el origen histogenético de dichas interneuronas, mediante cultivos organotípicos y el análisis del ratón transgénico Nkx2.1-Cre/Rosa26-GFP (Kessaris y col. 2006). Nuestros datos permiten distinguir los componentes paliales laterales o ventrales del complejo, que contienen múltiples subtipos de interneuronas con orígenes en distintas subdivisiones del subpalio. Esto abre las puertas a futuras investigaciones sobre la conectividad y función de cada subtipo de interneurona, y sobre su grado de implicación en los desórdenes neuropsiquiátricos., The objective of this Doctoral Thesis was to deepen in the study of the development of the claustroamygdaloid complex in mouse. For that, we pursued to study: 1) which components derive from either the lateral or ventral pallium based on differential expression of regulatory genes (Dbx1, Lhx9, Lhx2, Lmo3, Lmo4, Cadherina 8 y Emx1) during embryonic development; 2) the development of interneurons of the claustroamygdaloid complex that contain calcium binding proteins (including the development of its local circuits); 3) the histogenetic origin of these interneurons, by means of organotypic cultures and analysis of the transgenic mouse Nkx2.1-Cre/Rosa26-GFP (Kessaris and col. 2006). Our data allowed the distinction between lateral and ventral pallial components of the complex, which contain multiple subtypes of interneurons with origins in different subpallial subdivisions. This opens new venues for future investigations on the connectivity and function of each interneuron subtype, and on their involvement in neuropsychiatric disorders.