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[ES] El potasio es un catión monovalente clave en múltiples aspectos del crecimiento y de la supervivencia celular, como la compensación de cargas negativas de las macromoléculas, el mantenimiento del volumen celular y la turgencia, la actividad enzimática, la síntesis de proteínas, el mantenimiento del potencial de membrana y el control de pH intracelular. En las plantas, además de las funciones fisiológicas básicas a nivel celular mencionadas, este catión está implicado en un importante proceso fisiológico, el control de la apertura estomática. A través del estoma la planta controla la transpiración y el intercambio de gases, además de ser una vía de entrada para patógenos. Los canales de entrada de potasio (Kin) regulan la entrada de este ion en las células oclusivas y participan en el control de la apertura estomática. KAT1 y su ortólogo KAT2 son los principales canales de entrada de potasio localizados en la membrana plasmática de las células oclusivas, las cuales forman el poro estomático. La identificación y caracterización funcional de reguladores de canales de potasio es una aproximación prometedora de cara a mejorar la tolerancia a sequía, así como la susceptibilidad a patógenos. En el presente proyecto caracterizamos la función de MEE31 y la interacción entre MEE31 y KAT1. MEE31 es una proteína que surgió como posible interactor de KAT1 en un rastreo Split-Ubiquitin realizado en nuestro laboratorio. Para ello se realizaron estudios de complementación funcional en distintos fondos mutantes de S. cerevisiae. Adicionalmente, se realizaron ensayos de interacción proteína-proteína y estudios de localización celular en plantas modelo. Además se presenta un análisis de los estudios previos de la función de MEE31 con el objetivo de desarrollar hipótesis contrastables sobre los posibles roles de MEE31 como regulador de KAT1., [EN] Potassium is a key monovalent cation in multiple aspects of cell growth and survival, such as the compensation of negatives charges of macromolecules, maintenance of cell volume and turgor, enzymatic activity, protein synthesis, maintenance of membrane potential and intracellular pH control. In plants, in addition to the basic physiological functions mentioned at the cellular level, this cation is involved in an important physiological process, the control of stomatal opening. Through the stomata the plant controls transpiration and gas exchange, in addition to being a path of entry for pathogens. The inward rectifying potassium channels (Kin) regulate the entry of this ion into the guard cells thus participate in the control of stomatal opening. KAT1, and its orthologue KAT2, are the main inward rectifying channels located in the plasma membrane of the guard cells that form the stomatal pore, where they form homo- or heterotetrameric type channels. The identification and functional characterization of potassium channel regulators is a promising approach to improve drought tolerance, as well as susceptibility to pathogens. In the present project, we functionally characterized the function and interaction between MEE31 and KAT1. MEE31 is a protein that emerged as a possible KAT1 interactor in a Split-Ubiquitin screen carried out in our laboratory. For this, functional complementation studies were carried out in different S. cerevisiae mutant backgrounds. In addition, we performed protein-protein interaction assays and cell localization studies in a plant model. We also present an analysis of the prior studies of MEE31 function in order to develop testable hypotheses about the possible roles of MEE31 as a KAT1 regulator.

[ES] La leche humana es un fluido biológico complejo que contiene glicanos bien como oligosacáridos libres (OLH) o bien formando parte de glicoproteínas y glicolípidos. Todos ellos atraviesan el tracto gastrointestinal y llegan intactos al colon, donde son utilizados por bacterias beneficiosas para la salud del bebé. Entre estas bacterias, es de especial relevancia el género Lactobacillus, que se encuentra comúnmente en el tracto gastrointestinal de los lactantes e incluye varias cepas con propiedades probióticas. La N,N’-diacetilquitobiosa (ChbNAc) es un disacárido que forma parte del núcleo de la Nglicosilación de las glicoproteínas presentes en la leche humana y en la mucosa intestinal. Ha sido demostrado con anterioridad que la ChbNAc es utilizada como fuente de carbono por Lactobacillus casei cepa BL23 y que el operón chb está implicado en su metabolismo. Los genes chbRCDE codifican para un hipotético regulador transcripcional, un dominio IIC del sistema de transporte de la fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS) y dos proteínas hipotéticas D y E, respectivamente, mientras que el cluster de genes chbBAF codifica para los dominios IIB y IIA del PTS, y para una hipotética N-acetiltransferasa. En este trabajo se ha construido un vector para inactivar el gen chbR y se ha obtenido una cepa mutante de L. casei BL23 deficiente en este gen. Se ha observado que este mutante es capaz de utilizar tanto la ChbNAc como el trisacárido N,N’,N’’-diacetilquitotriosa como fuentes de carbono en el medio de cultivo, sugiriendo que el regulador ChbR es un represor transcripcional., [EN] Human milk is a complex biological fluid that contains glycans such as free human milk oligosaccharides (HMO) or forming part of glycoproteins and glycolipids. All of them transit through the gastrointestinal tract and arrive intact to the colon where they are used by beneficial bacteria in order to improve babys’ health. Among these bacteria, especial relevance is according to Lactobacillus genus, which is commonly found at the gastrointestinal tract of infants and includes various strains with probiotic properties. The N,N'-diacetylchitobiose (ChbNAc) is a disaccharide forming part of the N-glycosylation core of the glycoproteins present in human milk and intestinal mucosae. It has been previously shown that the ChbNAc is used as a carbon source by Lactobacillus casei BL23 strain and that the chb operon is involved in its metabolism. The chbRCDE genes encode a hypothetical transcriptional regulator, a IIC domain of the phosphotransferase system (PTS) and two hypothetical proteins, D and E, respectively, whereas the chbBAF gene cluster encodes IIB and IIA PTS domains, and a hypothetical N-acetyltransferase. In this work, a vector has been constructed to inactivate the chbR gene and a mutant strain of L. casei BL23 deficient in this gene has been obtained. It has been observed that this mutant is able to use both ChbNAc and the trisaccharide N,N’,N’’-diacetylchitotriose as carbon sources in the culture medium, suggesting that the chbR regulator is a transcriptional repressor.

Los desórdenes congénitos de glicosilación (CDG) son un grupo de enfermedades hereditarias humanas debidas a defectos en la glicosilación en las células. De ellas, más de 50 son debidas a defectos en la N-glicosilación. La N-glicosilación de proteínas en el retículo endoplásmico (RE) consiste en la transferencia en bloque de un glicano Glc3Man9GlcNAc2 desde un derivado lipídico (Dol-PP-glicano) a las proteínas nacientes y es catalizada por la oligosacariltransferasa (OST). Los glicanos unidos a las proteínas (N-glicanos) facilitan su plegamiento ya que aportan grupos voluminosos hidrofílicos que mantienen en solución a los intermediarios de plegamiento. Posteriormente, los N-glicanos son modificados por glucosidasas, dando inicio al “control de calidad de plegamiento de glicoproteínas del RE” (QC). Las CDG pueden ser de tipo I y II. Las CDG de tipo I son causadas por defectos antes y durante la transferencia del glicano a las proteínas, donde la transferencia ineficiente por parte de la OST resulta en proteínas hipoglicosiladas. Las CDG de tipo II son debidas a defectos después de la transferencia del glicano, durante su remodelación, produciendo estructuras aberrantes. Para estudiar la influencia de la estructura del glicano en la eficiencia de la transferencia a proteínas por la OST, en este trabajo se determinó el grado de hipoglicosilación de un conjunto de 16 levaduras de fisión Schizosaccharomyces pombe mutantes que sintetizan todas las combinaciones de Dol-PP-glicanos posibles en la membrana del RE, simulando los defectos que se producen en las CDG de tipo I. Mediante un biosensor que consiste en una GFP que pierde la fluorescencia cuando se glicosila, se determinó que la ausencia de los residuos de glucosa es mas crítica que la de residuos de manosa en la estructura del glicano para su reconocimiento y transferencia por parte de la OST. La mutante que presentó el mayor grado de hipoglicosilación fue la que sintetiza Man9GlcNAc2. Estos resultados fueron validados por un estudio glicoproteómico donde se analizaron proteínas endógenas de la pared de S. pombe. Además, se determinó que la estructura final de un glicano que se transfiere truncado permanece incompleta. Estos resultados brindan un marco para predecir la severidad de las CDG de tipo I. Por otro lado, se reprodujeron en S. pombe los defectos genéticos de la CDG-IIb (también conocida como MOGS-CDG) debidos a mutaciones en la glucosidasa I (GI). Se observó que esta mutante crece muy lentamente y tiene un metabolismo y una capacidad replicativa muy bajos. Este fenotipo se suprimió mediante una mutación adicional en el gen alg10 (no se agrega la glucosa más externa y se sintetiza Glc2Man9GlcNAc2). Estos resultados indicarían que la acumulación de proteínas con N-glicanos triglucosilados, el sustrato de GI, sería la responsable del severo defecto observado en la CDG-IIb, si bien dicha acumulación no inhibió la actividad de la OST por producto. Por otro lado, el fenotipo observado en las mutantes no se debería tampoco a la imposibilidad de las glicoproteínas de ingresar al QC ni a una posible degradación limitada de sus glicoproteínas mal plegadas. Nuestro trabajo aporta nueva información para la comprensión de las bases moleculares de las CDG humanas de tipo I y IIb. The congenital disorders of glycosylation (CDG) are a group of inherited human diseases produced by defects in glycosylation process within the cell. Among them, more than 50 are produced by defects in N-glycosylation. Protein N-glycosylation in the endoplasmatic reticulum (ER) starts with the transfer en block of a glycan Glc3Man9GlcNAc from a dolicol derivative (Dol-PP) (Dol-PP-glycan) to nascent proteins by the oligosaccharyltransferase (OST). Glycans linked to proteins (N-glycans) facilitates its folding as it provides bulky hydrophilic groups that keep folding intermediates in solution. Then, N-glycans are modified by glucosidases, allowing glycoproteins entrance to the “ER quality control of glycoprotein folding” (QC). CDG can be of type I and type II. Type I CDG are caused by defects before and during glycan transfer to proteins: inefficient transfer by OST results in hypoglycosylated proteins. Type II CDG are due to defects after glycan transfer and during its remodeling, producing aberrant N-glycan structures. To study the influence of glycan structure on the efficiency of its transfer to proteins by the OST, we determined the degree of hypoglycosylation produced in a set of 16 fission yeast Schizosaccharomyces pombe mutants that synthesize all possible combinations of Dol-PP-glycan structures in the ER membrane, mimicking type I CDG defects. Using as a biosensor a mutated GFP that loses fluorescence when it is N-glycosylated, we determined that the absence of glucose residues is more critical than that of mannose residues in the glycan structure for its efficient transfer by OST. The mutant that showed the highest degree of hypoglycosylation was the one that synthesizes Man9GlcNAc2. These results were validated by a glycoproteomic analysis in which we analyzed the hypoglycosylation of endogenous cell wall glycoproteins of all S. pombe mutants. In addition, we determined that the final structure in the cell wall of a glycan that is transferred truncated remains incomplete. These results provide a framework to predict the severity of type I CDG. On the other hand, we reproduced in S. pombe the genetic defects produced in CDG-IIb (also known as MOGS-CDG) due to mutations in glucosidase I (GI). The mutant grows very slowly and has a very low metabolism and replicative capacity. This phenotype was suppressed by an additional mutation in the alg10 gene (this mutant lacks the glucosyltransferase that adds the outermost glucose and synthesizes Glc2Man9GlcNAc2). These results would indicate that the accumulation of the substrate of GI, i.e. proteins bearing triglucosylated N-glycans, would be responsible of the severe defect observed in the CDG-IIb, although this accumulation did not inhibit the activity of OST by product. Moreover, the observed phenotype in the mutants would not be due either to hindrance of glycoproteins to enter the QC, nor to a possible limited degradation of misfolded glycoproteins. Our work provides new information in the understanding of the molecular bases of human CDG type I and IIb. Fil: Gallo, Giovanna Lucrecia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT) es el sensor de la conformación de las glicoproteínas en el “Control de Calidad de Plegamiento de Glicoproteínas” ya que sólo presenta actividad sobre glicoproteínas que no se encuentran en su conformación nativa. Las glicoproteínas que presentan oligosacáridos monoglucosilados interaccionan con lectinas-chaperonas presentes en el Retículo endoplásmico (RE) como Calnexina y Calreticulina lo cual previene que los intermediarios de plegamiento inmaduros continúen su camino hacia el Aparato de Golgi. En C. elegans existen dos genes, uggt-1 y uggt-2, homólogos a los que codifican para las UGGT en diferentes organismos. La expresión de las proteínas UGGT-1 y UGGT-2 en S. pombe alg6 gpt1-, que carece de actividad de UGGT, permitió demostrar que uggt-1 codifica para una UGGT activa (CeUGGT-1), mientras que la proteína codificada por uggt-2 carece de actividad de UGGT (CeUGGT-2). Mediante la construcción de proteínas quiméricas, se determinó que el dominio C-terminal de CeUGGT-2 es incapaz de transferir glucosa a proteínas mal plegadas. El estudio del gusano mutante de uggt-2 (VC1961) reveló que CeUGGT-2 es esencial para la viablidad del nematodo ya que los gusanos uggt-2 -/- se arrestan en estadíos embrionarios y en L1 mostrando un tamaño menor y posibles defectos en la cutícula. Mediante Real Time PCR observamos que ambos genes se expresan durante todo el ciclo de vida de C. elegans. Mediante la construcción de gusanos transgénicos pudimos detectar expresión de CeUGGT-1 en todas las células y tejidos del nematodo. uggt-1 se induce en condiciones de estrés de RE a través de la vía de señalización de ire-1 en la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), mientras que uggt-2 no lo hace. El silenciamiento de la expresión de la proteína UGGT-1 y UGGT-2 por ensayos de RNAi produjeron un retraso en el desarrollo en gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) y resultaron en una disminución de la sobrevida de gusanos uggt-1(RNAi). CeUGGT-1 y CeUGGT-2 juegan un rol protector ante condiciones de estrés de RE ya que con 10 μg/ml de Tunicamicina (TN) se arrestó el crecimiento de gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) en L2/L3 pero no el de gusanos control. Además ensayos de RNAi a bajas concentraciones de TN en ausencia de ire-1, sugirieron que CeUGGT-2 es importante para aliviar los bajos niveles de estrés de RE en ausencia de esta vía de la UPR. Estos resultados indicarían que ambos homólogos de UGGT de C. elegans poseerían distintas funciones biológicas. The UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (UGGT) is the sensor of glycoprotein conformations in the glycoprotein folding quality control as it exclusively glucosylates glycoproteins not displaying their native conformations. Monoglucosylated glycoproteins thus formed may interact with the lectin-chaperones calnexin and calreticulin. This interaction prevents premature exit of folding intermediates to the Golgi. Bioinformatic analysis showed that in C. elegans there are two genes, uggt-1 and uggt-2, coding for UGGT homologues. Expression of both genes in S. pombe mutants devoid of UGGT activity showed that uggt-1 codes for an active UGGT protein (CeUGGT-1). On the other hand, uggt-2 coded for a protein (CeUGGT-2) apparently not displaying a canonical UGGT activity and conversely to what happens in humans, the C-terminal domain of CeUGGT-2 is inactive. However, uggt-2 is not a pseudogene as we can detect its expression along the entire development. The study of the mutant worm VC1961 revealed that CeUGGT-2 is essential for viability. Worms uggt-2 -/- were arrested in embryonic and L1 stages and they showed smaller size and possible defects in the cuticle. Furthermore, Real-time PCR analysis showed that both uggt-1 and uggt-2 genes are expressed during the entire C. elegans life cycle. Moreover, transgenic worms constructed by fosmid recombineering technique carrying the gfp under the control of uggt-1 promoter indicated that that CeUGGT-1 is expressed in all cells and tissues of the nematode. uggt-1, but not uggt-2, is upregulated under ER stress through the ire-1 arm of the unfolded protein response (UPR). RNAi-mediated depletion of CeUGGT-1 but not of CeUGGT-2 resulted in a reduced lifespan and that of CeUGGT-1 and CeUGGT-2 in a developmental delay. We found that both CeUGGT1 and CeUGGT2 play a protective role under ER stress conditions, since 10 μg/ml tunicamycin (TN) arrested development at the L2/L3 stage of both uggt-1(RNAi) and uggt-2(RNAi) but not of control worms. Furthermore, we found that the role of CeUGGT-2 but not CeUGGT-1 is significant in relieving low ER stress levels simulated with TN in the absence of the ire-1 unfolding protein response signaling pathway. Our results indicate that both C. elegans UGGT homologues may have distinct biological functions. Fil: Buzzi, Lucila Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La Glucosidasa II (GII) cumple un rol fundamental en la biogénesis de glicoproteínas en el retículo endoplásmico (RE). Es responsable por la remoción secuencial de los dos residuos de glucosa (Glc) más internos del glicano (Glc3Man9GlcNAc2) transferido a los residuos de Asn en las glicoproteínas nacientes en la vía secretoria. GII participa en los ciclos de Calnexina (CNX)/Calreticulina (CRT) ya que remueve el residuo de Glc agregado a intermediarios de plegamiento por la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT). La GII un es un heterodímero soluble del RE cuya subunidad α (GIIα) posee el sitio catalítico mientras que el rol de la subunidad β (GIIβ) es controvertido, si bien ha sido involucrada en la retención en el RE de GII y en el plegamiento de GIIα. En esta tesis demostramos que en ausencia de GIIβ, la subunidad catalítica GIIα de la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe (un organismo que posee un mecanismo de control de calidad de plegamiento de proteínas similar al presente en células de mamíferos) adopta una conformación activa y es capaz de hidrolizar el análogo de sustrato p-nitrofenil-α-D-glucopiranósido. Sin embargo GIIβ es necesaria para la correcta localización de GII en el RE y para la deglucosilación eficiente de los sustratos fisiológicos Glc2Man9GlcNAc2 y Glc1Man9GlcNAc2. El dominio homólogo al dominio lectina del receptor de Manosa 6-fosfato presente en el C-terminal de GIIβ interacciona con manosas en las ramas B y/o C de los N-glicanos mediando la hidrólisis del sustrato por GIIα. Demostramos, también, que el dominio G2B del N-terminal de GIIβ es necesario para la interacción GIIα-GIIβ. Por último, demostramos que una reducción en el contenido de manosas de los N-glicanos disminuyó significativamente la deglucosilación in vivo mediada por GII pero no afectó la glucosilación in vivo mediada por UGGT, favoreciendo la formación de derivados monoglucosilados. Esto sugiere que GII funcionaría como un regulador de la permanencia en los ciclos de CNX/CRT de las glicoproteínas que se pliegan muy lentamente, y por lo tanto han sido demanosiladas, otorgando más oportunidades de plegamiento a las proteínas antes de enviarlas a degradación. Glucosidase II (GII) plays a key role in glycoprotein biogenesis in the endoplasmic reticulum (ER). It is responsible for the sequential removal of the two innermost glucose residues from the glycan (Glc3Man9GlcNAc2) transferred to Asn residues in proteins. GII participates in the Calnexin (CNX)/Calreticulin (CRT) cycle as it also removes the single glucose unit added to folding intermediates and misfolded glycoproteins by the UDPGlc: glycoprotein glucosyltransferase (UGGT). GII is a heterodimer whose α subunit (GIIα) bears the glycosyl hydrolase active site, whereas its β subunit (GIIβ) role is controversial and has been reported to be involved in GIIα ER retention and folding. Here, we report that in the absence of GIIβ, the catalytic subunit GIIα of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (an organism displaying a glycoprotein folding quality control mechanism similar to that occurring in mammalian cells) folds to an active conformation able to hydrolyze p-nitrophenyl- α-D-glucopyranoside. However, GIIβ is required for correct GII ER retention and for efficient deglucosylation of the physiological substrates Glc2Man9GlcNAc2 and Glc1Man9GlcNAc2. The interaction of the mannose 6-phosphate receptor homologous domain present in the Cterminal of GIIβ and mannoses in the B and/or C arms of the glycans mediates N-glycan hydrolysis enhancement. We also found that the N-terminal GIIβ G2B domain is essential for GIIα-GIIβ interaction. Finally, we show that a decrease in the N-glycan mannose content significantly diminished in vivo GII-mediated deglucosylation but did not affect in vivo UGGT activity. This suggests that GII may be an in vivo regulator of misfolded and slow-folding glycoprotein permanence in the ER as these glycoproteins are characterized by a detectable ER mannosidase(s)-catalyzed N-glycan demannosylation and therefore, an increased possibility of displaying monoglucosylated structures able to interact with CNX or CRT for longer time periods is likely to occur. Fil: Stigliano, Ivan Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El virus del dengue produce en humanos la enfermedad viral más frecuentementetransmitida por artrópodos y no existe hasta el momento terapia antiviral ni vacunaalguna. En este trabajo se desarrollaron diferentes herramientas genéticas con el fin de estudiarlas distintas etapas de la replicación viral y la interacción del virus con la célula huésped. Así, se obtuvo el primer clon infeccioso del virus del dengue de un aislamiento argentino ydistintas generaciones de virus con proteínas reporteras. Empleando estos sistemasgenéticos se pudieron disecar las distintas etapas de la replicación viral. La manipulacióndel genoma viral permitió caracterizar mutantes de N-glicosilación de las proteínas deenvoltura y pre-membrana, y estudiar su importancia en las distintas etapas del ciclo viral. El ensayo del virus reportero, el cual permite evaluar la actividad de luciferasa como unmarcador de replicación viral, fue miniaturizado para realizar una búsqueda de quinasasde la célula huésped involucradas en la replicación. Para esto se utilizó la tecnología del RNA de interferencia a gran escala. Mediante este ensayo se identificaron distintasquinasas claves en la replicación del virus y se estudió su importancia en la replicaciónviral. Por último, se aportó nueva infomación sobre el mecanismo celular por el cual laproteína de cápside se dirige a las organelas celulares lipid droplets, y su relación con laproteína celular ADRP. Este trabajo provee nuevas herramientas genéticas y nuevainformación sobre los requerimientos del virus del dengue para replicar en la célulainfectada. Además, realiza un aporte que podría llevar al desarrollo de nuevas estrategiasantivirales. Dengue is the most prevalent viral disease transmitted by arthropods. At present, neitherantiviral therapies or licensed vaccine exist. In this work, we developed new genetic toolsto study different steps of viral replication and host-viral interactions. We obtained thefirst infectious clone from an Argentinean clinical isolate, and several dengue virusreporter systems. Using these tools, we dissected each step of the viral replication processthrough a luciferase activity assay. Genetically manipulating the viral genome, wecharacterized N-glycosylation mutants of envelope and pre-membrane proteins, and theirrole during the viral life cycle. The reporter virus assay was miniaturized to perform an RNA interference screen to search for host kinases involved in viral replication. Weidentified several kinases important for different steps of viral replication. Finally, weprovided new information about the cellular mechanism by which the capsid protein istargeted to cellular organelles known as lipid droplets, and investigated the relationship ofcapsid with the cellular protein ADRP. This thesis provides new genetic tools and newinformation on the cellular requirements for dengue virus replication, which could lead tothe development of new antiviral strategies. Fil: Mondotte, Juan Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil: Ceaglio, Natalia Analía. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. El interferón alfa humano comprende una familia de proteínas que bloquean la infección viral e inhiben la proliferación celular. La citoquina producida en bacterias se encuentra aprobada para su uso clínico en el tratamiento de diversas patologías, siendo el principal problema su rápida eliminación del torrente sanguíneo. En el presente trabajo de Tesis se desarrolló exitosamente una estrategia de glicoingeniería mediante la introducción de sitios potenciales de N-glicosilación en la secuencia aminoacídica del rhIFNalfa2b, lo que permitió incrementar su vida media plasmática y, en consecuencia, su actividad biológica in vivo. Inicialmente, se seleccionaron las mutaciones más adecuadas para construir derivados del rhIFNalfa2b con un número variable de sitios de N-glicosilación. Conforme al aumento del número de sitios incorporados, se observó un incremento progresivo de la masa molecular de las muteínas. Por otra parte, la actividad biológica específica antiviral y antiproliferativa de las mismas disminuyó gradualmente en forma concomitante con la adición de sitios consenso. La farmacocinética de todas las variantes del rhIFNalfa2b en ratas demostró un incremento del tiempo de vida media y una disminución del clearance plasmático en forma concomitante con el agregado de sitios de N-glicosilación. De esta manera, el IFN con cuatro sitios de glicosilación (IFN4N) exhibió una vida media 25 veces superior y un clearance 20 veces inferior con respecto a la molécula no modificada. Además, a pesar de su menor actividad biológica in vitro, el IFN4N demostró un marcado incremento de su actividad antitumoral in vivo, determinada como su capacidad de inhibir el crecimiento de tumores en ratones inmunocomprometidos. Human alpha interferons comprise a family of closely related proteins that block viral infection and inhibit cell proliferation. Bacterially produced hIFNalpha2b has been approved for the treatment of a great variety of human diseases, but the clinical use of this cytokine has been restricted due to its short circulating half life. In the present Thesis work a successful glycoengineering strategy was developed through the introduction of potential N-glycosylation sites in the rhIFNalpha2b amino acid sequence, which allowed us to increase the cytokine´s plasma half-life and, in turn, its in vivo biological activity. Taking into account the carbohydrate content and the preservation of the biological activity, five amino acid mutations were chosen to construct rhIFNalpha2b derivatives with a variable number of N-glycosylation sites. Successive increases in size were observed after each addition of a functional consensus sequence. On the other hand, antiviral biological activity of rhIFNalpha2b was gradually reduced with the incorporation of new glycosylation sites. Pharmacokinetic experiments showed a 25-fold increase in the elimination half life and a 20-fold decrease in the systemic clearance rate of the IFN variant with four N-glycosylation sites (4N-IFN) compared to the non-glycosylated rhIFNalpha2b following subcutaneous administration to rats. Moreover, in spite of its lower in vitro activity, 4N-IFN showed a markedly enhanced in vivo antitumor activity in human prostate carcinoma implanted in nude mice. Universidad Nacional del Litoral Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

El retículo endoplásmico (RE) es el compartimiento celular donde las proteínas que son secretadas o las que residen a lo largo de las vías endo y exocíticas o en la membrana plasmática se pliegan y sufren diversas modificaciones postraduccionales. Para evitar que las proteínas viajen por el camino secretorio sin haber adquirido su conformación nativa, el RE cuenta con sistemas de control de calidad de plegamiento (QC) capaces de distinguir los polipéptidos mal plegados y retenerlos en el RE para que eventualmente se plieguen o terminen siendo degradados. Uno de los principales sistema de QC depende de la presencia de un Nglicano unido a la proteína que se está plegando. El glicano que se transfiere cotraduccionalmente al polipéptido naciente en la mayoría de las células eucariotas tiene la estructura Glc3Man9GlcNAc2. Los dos primeros residuos de glucosa son escindidos por acción de las glucosidasas I y II (GI y GII). El glicano monoglucosilado resultante (G1M9N2) es reconocido por dos lectinas residentes del RE, la calnexina (CNX) y la calreticulina (CRT). Esta interacción se interrumpe cuando la GII remueve la glucosa restante pero puede restituirse gracias a la acción de otra enzima residente del RE, la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). La GT vuelve a glucosilar sólo a aquellas glicoproteínas que no adquirieron su conformación nativa permitiendo su unión con las lectinas y así aumentando sus posibilidades de plegarse correctamente. En Trypanosoma cruzi se han identificado los tres componentes que forman el sistema de QC de glicoproteínas, GT, GII y CRT (este organismo no posee CNX). En este parásito, a diferencia de lo que ocurre en células de mamíferos, G1M9N2 sólo se forma por acción de la GT, puesto que el glicano transferido a las proteínas nascientes no contiene residuos de glucosa. Dada la gran importancia que diversas glicoproteínas poseen para el ciclo de vida de este parásito, se decidió estudiar si el facilitamiento del plegamiento mediado por CRT de la cruzipaína (CZ), uno de los factores de virulencia de T. cruzi, era esencial para la viabilidad, diferenciación y capacidad infectiva del parásito. Para ello, se identificó y secuenció el gen que codifica para la GT y se obtuvieron T. cruzi mutantes nulos para este gen. Así, se comprobó que la eliminación del sistema de QC de glicoproteínas no afectó el crecimiento de la forma epimastigote del parásito, aunque redujo la capacidad infectiva de la forma trypomastigote. El contenido celular de CZ sólo disminuyó parcialmente (5-20%) a pesar de que en células salvajes más del 90% de estas moléculas interaccionan con CRT. En los T. cruzi carentes de GT no pudo detectarse interacción entre CRT y CZ aún en condiciones muy suaves de inmunoprecipitación sin embargo se verificó un retraso en la llegada de la proteinasa a los lisosomas. Este retraso se debió a la inducción del sistema alternativo de QC basado en BiP/Grp78, cuya interacción con CZ se prolongó. Estos resultados ponen de manifiesto la gran plasticidad de la maquinaria de plegamiento del RE, la cual le permite al párasito sobreponerse a la falta del sistema de QC específico para glicoproteínas. Por otra parte, además de su función como chaperona, CRT es la principal proteína de unión de calcio en el RE. Dado que el nivel de calcio del RE fluctúa de forma considerable se estudió la relación entre ambas funciones de la CRT. La afinidad de CRT por G1M9N2 determinada por equilibrio de diálisis y por anisotropía de fluorescencia no se afectó con modificación de la concentración de calcio presente en el medio. La unión de CRT a neoglicoproteínas que presentan una conformación nativa o de tipo glóbulo fundido también fue independiente de la concentración del ión. En este mismo sentido, se comprobó que el calcio y G1M9N2 estabilizan a CRT frente a la desnaturalización térmica o inducida por urea de manera independiente y aditiva. Además, la capacidad de CRT de inhibir la agregación de IgY desnaturalizada tampoco se modificó al variar los niveles de calcio. En una aproximación in vivo, se observó que al disminuir los niveles de calcio del RE de T. cruzi no se altera la unión entre CRT y CZ. Estas observaciones demuestran que las funciones de chaperona y de unión de calcio de CRT son mutuamente independientes. Por último, se observó que la variación de los niveles de calcio del RE afectaba la localización subcelular de CRT, provocando un aumento de la concentración de esta en el citosol. The endoplasmic reticulum (ER) is the site of folding for proteins destined for compartments of the secretory and endocytic pathways, the plasma membrane and secretion. Only native proteins are released from the ER. Folding intermediates, orphan subunits of oligomeric complexes, and misfolded polypeptides are retained in the ER and eventually forwarded to degradation in a complex series of events denominated Quality Control (QC). N-glycans are directly involved in QC. Nglycosylation occurs in most eukaryotic cells by addition of a preassembled core glycan (Glc3Man9GlcNAc2) to nascent polypeptides emerging into the ER lumen. Rapid trimming of the two outermost glucose residues by ER-resident enzymes glucosidases I (GI) and glucosidase II (GII) generates a monoglucosilated protein bound N-glycan (G1M9N2) which is recognized by the ER lectins calnexin (CNX) and calreticulin (CRT). Release from CNX/CRT is followed by GII cleavage of the innermost glucose residue. The folding sensor UDP-glucose:glycoprotein glycosyltransferase (GT) adds back a terminal glucose to promote re-association of non-native polypeptides with the lectins, thus prolonging their retention in the ER folding environment. The three components involved in QC of glycoprotein folding, i.e. GT, GII and CRT, have been described in Trypanosoma cruzi (this parasite lacks CNX). However, contrary to what happens in most eukaryotic cells, in trypanosomatid protozoa G1M9N2 is exclusively formed by GT action because unglucosylated Nglycans are transfered to nascent polypeptides. The gene coding for GT was identified and sequenced. Even though several of this parasite glycoproteins have been identified as essential components of differentiation and mammalian cell invasion processes, disruption of both GT-encoding alleles did not affect cell growth rate of epimastigote form parasites and partially affected differentiation and mammalian cell invasion of the trypomastigote form. The cellular content of one of the already identified T. cruzi glycoprotein virulence factors (cruzipain, CZ, a lysosomal proteinase) only showed a partial (5-20%) decrease in GT null mutants in spite of the fact that >90% of all CZ molecules interacted with CRT during their folding process in wild-type cells. Although extremely mild cell lysis and immunoprecipitation procedures were used, no CRT-CZ interaction was detected in GT-null mutants, but secretion of the proteinase was nevertheless delayed because of a lengthened interaction with BiP/Grp78 probably caused by the detected induction of this chaperone in GT null mutants. This result provides a rationale for the absence of a more drastic consequence of GT absence. It was concluded that T. cruzi ER folding machinery presents an exquisite plasticity that allows the parasite to surmount the absence of the glycoprotein-specific folding facilitation mechanism. Besides being a chaperone, CRT is one of the main calcium buffers in the cell. Here, we study the interplay between these roles of CRT. The affinity of CRT for G1M9N2 measured in solution by equilibrium dialysis or fluorescence anisotropy was not affected by the absence of calcium. Binding of CRT to monoglucosylated neoglycoproteins displaying either native or molten globule-like conformations was also independent of calcium concentrations. Moreover, calcium and G1M9N2 stabilized CRT structure in an apparent additive, independent manner when the protein was subjected to thermal or urea-induced denaturation. In addition, the ability of CRT to decrease the level of aggregation of a chemically denatured monoglycosylated and nonglycosylated IgY was also independent of calcium level. From an in vivo point of view, a decrease in ER calcium concentration in T. cruzi cells did not alter CRT-CZ binding. Thus, chaperone and calcium binding activities of CRT are independent. On the other hand, changes in ER calcium levels influenced CRT location, leading to an increase in CRT in the citosol of T. cruzi cells. Fil: Conte, Ianina Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La N-glicosilación de proteínas es una de las modificaciones postraduccionales más frecuentes en células eucariotas y consiste en la transferencia en bloc de un oligosacárido de un derivado lipídico, dolicol, a una cadena polipeptídica naciente, reacción que es catalizada por una enzima oligomérica, la oligosacariltransferasa (OST). Dependiendo de la glicoproteína esta modificación puede ser esencial para la adquisición de la estructura terciaria en el lumen del retículo endoplásmico (RE), para el control de calidad del plegamiento en esa organela, para la la correcta localización de las proteínas lisosomales o para los diversos roles que tienen las glicoproteínas en la membrana plasmática o en el medio extracelular. En la primera parte de esta tesis estudiamos el rol del N-glicano en la degradación de glicoproteínas mal plegadas asociada al RE. Se ha propuesto que la formación del isómero B de Man8GlcNAc2 (M8B) por la α-manosidasa I del RE constituye una señal para enviar a las glicoproteínas que se encuentran irremediablemente mal plegadas al proteasoma para su degradación. Contrariamente a lo informado en la literatura, pudimos detectar in vivo, pero no in vitro, una actividad muy débil de α-manosidasa en Schizosaccharomyces pombe. La enzima degrada a Man9GlcNAc2 dando M8B y es inhibida por kifunensina. Las células de S. pombe poseen una capacidad muy limitada de demanosilar el Man9GlcNAc2 presente en glicoproteínas mal plegadas, incluso luego de una larga estadía en el RE. A su vez, no se detectó una degradación preferencial de las glicoproteínas que contenían M8B. Sin embargo, la disrupción del gen que codifica a la α-manosidasa impidió casi por completo la degradación de una glicoproteína mal plegada. Este trabajo, junto con otros resultados cognitivos publicados anteriormente, pueden ser explicados asumiendo que el rol de la α-manosidasa del RE en la degradación de glicoproteínas es independiente de su actividad enzimática. De esta forma, la enzima se comportaría como una lectina que uniría oligosacáridos de polimanosa de diversas estructuras y pertenecería, junto con sus homólogos Htm1p/Mnl1p/EDEM, a una cadena de transporte responsable de enviar a las glicoproteínas irremediablemente mal plegadas a los proteasomas. La kifunensina y el 1-deoximanojirimicina, al ser análogos de manosa, se comportarían como inhibidores de la actividad de lectina de la manosidasa del RE y/o de Htm1p/Mnl1p/EDEM. En la segunda parte de esta tesis estudiamos la especificidad de la OST con respecto al oligosacárido dador. La mayoría de los eucariotas muestran una marcada preferencia para la transferencia tanto in vivo como in vitro del mayor oligosacárido unido a dolicol-P-P (Glc3Man9GlcNAc2) a las proteínas nacientes frente a los intermediarios biosintéticos que carecen de los tres residuos de glucosa. La OST es un complejo multimérico formado por ocho subunidades, una de las cuales, la Stt3p, es la subunidad catalítica. Los tripanosomátidos carecen del complejo multimérico de la OST y expresan en cambio solo esta última proteína. Contrariamente a la OST de la mayoría de las células eucariotas, la Stt3p de estos parásitos transere Man7−9GlcNAc2 y Glc1−3Man9GlcNAc2 a la misma velocidad en ensayos libres de células. Reemplazamos la Stt3p de Saccharomyces cerevisiae por su homólogo de Trypanosoma cruzi y encontramos que el complejo de la OST que se forma transfiere preferentemente el oligosacárido triglucosilado tanto in vitro como in vivo. Por lo tanto, la preferencia por Glc3Man9GlcNAc2 es una característica determinada por el complejo y no por la subunidad catalítica. Los resultados incluidos en la presente tesis dieron lugar a las siguientes publicaciones: Preferential transfer of the complete glycan is determined by the oligosaccharyltransferase complex and not by the catalytic subunit. Castro O., Movsicho F. and Parodi A.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(40): 14756-60, 2006. Characterization of Schizosaccharomyces pombe ERα -Mannosidase: A Reevaluation of the Role of the Enzyme on ER-associated Degradation. Movsicho F., Castro O.A. and Parodi A.J. Mol. Biol. Cell, 16(10): 4714-4724, 2005. Glycosylation of asparagine residues is one of the main posttranslational modifications in eukaryotic cells. It involves the en bloc transfer of a lipid linked oligosaccharide to a nascent polypeptide catalyzed by a multimeric enzyme called oligosaccharyltransferase (OST). Depending on the specific glycoprotein, this modification may be essential for the acquisition of the tertiary structure within the endoplasmic reticulum (ER) lumen, for the quality control of folding in the same subcellular location, for the correct sorting of lysosomal enzymes, or for the many roles that glycoproteins have either in the plasma membrane or in the external milieu. In the rst part of this thesis we studied the role of the N-glycans in the ER-associated degradation of misfolded glycoproteins. It has been postulated that creation of Man8GlcNAc2 isomer B (M8B) by ER- α-mannosidase I constitutes a signal for driving irreparably misfolded glycoproteins to proteasomal degradation. Contrary to a previous report, we were able to detect in vivo (but not in vitro) an extremely feeble ER α-mannosidase activity in Schizosaccharomyces pombe. The enzyme yielded M8B on degradation of Man9GlcNAc2 and was inhibited by kifunensin. Live S. pombe cells showed an extremely limited capacity to demannosylate Man9GlcNAc2 present in misfolded glycoproteins even after a long residence in the ER. In addition, no preferential degradation of M8B-bearing species was detected.Nevertheless, disruption of the α-mannosidase encoding gene almost totally prevented degradation of a misfolded glycoprotein. This and other conflicting reports may be best explained by assuming that the role of ER mannosidase on glycoprotein degradation is independent of its enzymatic activity. The enzyme, behaving as a lectin binding polymannose glycans of varied structures, would belong together with its enzymatically inactive homologue Htm1p/Mnl1p/EDEM, to a transport chain responsible for delivering irreparably misfolded glycoproteins to proteasomes. Kifunensin and 1-deoxymannojirimycin, being mannose homologues, would behave as inhibitors of the ER mannosidase or/and Htm1p/Mnl1p/EDEM putative lectin properties. In the second part of this thesis we studied the donor oligosaccharide specicity for the OST. Most eukaryotic cells show a strong preference for the transfer in vivo and in vitro of the largest dolichol-P-P-linked glycan (Glc3Man9GlcNAc2) to protein chains over that of biosynthetic intermediates that lack the full complement of glucose units. The oligosaccharyltransferase (OST) is a multimeric complex containing eight different proteins, one of which (Stt3p) is the catalytic subunit. Trypanosomatid protozoa lack an OST complex and express only this last protein. Contrary to the OST complex from most eukaryotic cells, the Stt3p subunit of these parasites transfers in cell-free assays glycans with Man7−9GlcNAc2 and Glc1−3Man9GlcNAc2 compositions at the same rate. We have replaced Saccharomyces cerevisiae Stt3p by the Trypanosoma cruzi homologue and found that the complex that is formed preferentially transfers the complete glycan both in vivo and in vitro. Thus, preference for Glc3Man9GlcNAc2 is a feature that is determined by the complex and not by the catalytic subunit. The results included in this thesis led to the following articles: Preferential transfer of the complete glycan is determined by the oligosaccharyltransferase complex and not by the catalytic subunit. Castro O., Movsicho F. and Parodi A.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(40): 14756-60, 2006. Characterization of Schizosaccharomyces pombe ER α-Mannosidase: A Reevaluation of the Role of the Enzyme on ER-associated Degradation. Movsicho F., Castro O.A. and Parodi A.J. Mol. Biol. Cell, 16(10): 4714-4724, 2005. Fil: Movsichoff, Federico. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En el presente trabajo de tesis se realizó la determinación estructural decompuestos liberados al medio de cultivo por formas infectantes de T. cruzi. Elestudio comprendió tres aspectos: Estudio químico de los compuestos lipídicos liberados: Sólo ciertoscomponentes de la membrana son liberados (PC, LPC, sulfátido, IPL, ácidosgrasos). Es significativa la ausencia de PE ya que es un componenteimportante de la membrana. Por otra parte, algunos de los compuestosliberados presentan diferencias estructurales con los análogos del parásito,principalmente en los ácidos grasos componentes. La segunda parte abarcó el estudio estructural del ancla glicolipídica dela trans-sialidasa: se caracterizó una estructura de glicoinositolfosfolípido,formada mayoritariamente por ceramida en las formas trypomastigotemetacíclicas y ceramida y alquilglicerol en relación 3:1 en las formastrypomastigote. La fracción oligosacarídica contiene una unidad de α-galactosacaracterizada por primera vez como componente de anclas en Trypanosoma cruzi. El tercer aspecto consistió en un estudio estructural de la cadena N-glicosidicade Tc-85 liberada al medio: el análisis por HPAE-PAD permitiódeterminar tres cadenas de menor longitud que las presentes en eloligosacárido de la proteína aislada de parásitos. Las cadenas difieren en elmonosacárido presente en el extremo no reductor. In this Thesis a structural determination of compounds shed to the culturemedium by infective forms of Trypanosoma cruzi was performed. The studycovered three topics: Chemical study of the lipidic compounds: only some membrane componentswere shed (PC, LPC, sulfatide, IPL, fatty acids). It was striking the absence of PE,considering that it is an important component of the membrane. Besides, some ofthe shed compounds evidenced structural differences with the analogues isolatedfrom the parasite, mostly in their fatty acid composition. The second part comprised the structural study of the glycolipidic anchor ofthe trans-sialidase. It was characterized a glycoinositolphospholipid structure,containing a ceramide in the metacyclic trypomastigote forms and, ceramide andalkylglycerol in a 3:1 ratio in the trypomastigote forms. The oligosaccharidefraction contained an α-galactose unit, characterized for the first time as acomponent of an anchor in T. cruzi. The third topic was the study of the N-linked oligosaccharides of theglycoprotein Tc-85 shed to the culture medium. An analysis by HPAE-PAD allowedthe determination of three chains shorter than the oligosaccharide present in theprotein isolated from trypomatigote forms. The three chains differed in themonosaccharide unit at the non-reducing terminus. Fil: Agustí, Rosalía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.