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Ilstraciones, tablas Se realizó una caracterización taxonómica bacteriana (16S) y fúngica (ITS) utilizando metabarcoding sobre un gradiente altitudinal en la cordillera occidental del Valle del Cauca, Colombia, que incluyó ecosistemas de Bosques Andino, Seco Tropical y Páramo en las localidades de Laguna de Sonso (LS) (900 msnm), Yotoco (Yt) (1800 msnm), Bosque del Duende (BD) (2400 msnm) y páramo del Duende (PDU) (3200 msnm). Los análisis fisicoquímicos mostraron suelos con materia orgánica alta (>10%), sin problemas de compactación, pHs extremadamente ácidos (4,4) para zonas con mayor altitud, ligera y fuertemente ácidos en zonas bajas (5,5-6,1). Se identificaron 59 familias de plantas en las zonas de muestreo, siendo las más abundantes Araceae, Lauraceae y Fabaceae. Las asignaciones taxonómicas bacterianas fueron dominadas por los phyla Acidobacteriota (33,1%) y Proteobacteria (23,9%), para hongos dominaron Ascomycota (38,6%,) y Basidiomycota (11,3%). En general los análisis diversidad alfa mostraron alta diversidad, riqueza y baja dominancia, demostrando que las comunidades son altamente diversas, mientras la diversidad beta reflejó las diferencias de la composición en las localidades y la heterogeneidad de estas. Las predicciones funcionales reflejaron que la abundancia absoluta más alta para bacterias presentó actividad quimioheterotrofa y se relaciona con diferentes componentes del ciclo del nitrógeno mientras en hongos se clasifica por gremios ecológicos, donde los relacionados con actividad patogénica tanto en animales como en plantas, endofitismo, saprofitismo y epifitos fueron más representativos. Los resultados encontrados demuestran una variabilidad genética ecológica de los microorganismos entre las zonas de muestreo, además, respondieron a los cambios fisicoquímicos y de vegetación propios del gradiente altitudinal. (Texto tomado de la fuente) A bacterial (16S) and fungal (ITS) taxonomic characterization was carried out using metabarcoding over an altitudinal gradient in the western mountain range of Valle del Cauca, Colombia, which included ecosystems of Andean, Tropical Dry and Paramo Forests in the localities of Laguna de Sonso (LS) (900 masl), Yotoco (Yt) (1800 masl), Bosque del Duende (BD) (2400 masl) and paramo of Duende (PDU) (3200 masl). The physicochemical analyses showed soils with high organic matter (>10%), no compaction problems, extremely acidic pHs (4.4) for higher altitude zones, and slightly and strongly acidic in lower zones (5.5-6.1). Fifty-nine plant families were identified in the sampling areas, the most abundant being Araceae, Lauraceae, and Fabaceae. Bacterial taxonomic assignments were dominated by the phyla Acidobacteriota (33.1%) and Proteobacteria (23.9%), for fungi Ascomycota (38.6%) and Basidiomycota (11.3%). In general, alpha diversity analyses showed high diversity, richness, and low dominance, demonstrating that the communities are highly diverse. In contrast, beta diversity reflected the differences in the composition of the localities and their heterogeneity. Functional predictions reflected that the highest absolute abundance for bacteria presented chemoheterotrophic activity and was related to different components of the nitrogen cycle. At the same time, fungi were classified by ecological guilds, where those related to pathogenic activity in animals and plants, endophytes, saprophytes, and epiphytes were more representative. The results show an ecological genetic variability of the microorganisms among the sampling zones, in addition, they responded to the physicochemical and vegetation changes characteristic of the altitudinal gradient. Maestría Magíster en Ciencias Biológicas En 3 de las 4 localidades evaluadas, se establecieron 3 parcelas de 100 m2 respectivamente, de cada una se tomaron 3 cilindros (submuestras) obteniendo 27 muestras, en el PDU, donde por ser una zona agreste se pudo establecer 2 parcelas con 5 submuestras donde finalmente se recolectaron 10 muestras, en total se recolectaron 37 muestras Las muestras de suelo fueron tomadas de una fracción entre 0 a 25 cm de profundidad del suelo, homogenizadas y almacenadas en tubos Falcon de 25 ml que posteriormente se preservaron a temperatura de -80°C para para preservar la integridad y estabilidad del ADN hasta la realización de extracción del mismo. Así mismo, dentro de las zonas se realizó una caracterización de la abundancia de la flora presente en cada una de las parcelas. Ecología microbiana Ciencias Agropecuarias.Sede Palmira

Ilustraciones, tablas Los microorganismos del suelo en bosques y páramos son ejes claves en el mantenimiento de los ecosistemas por sus actividades de descomposición, nutrición de plantas e intervención en los ciclos biogeoquímicos. En esta investigación se recolectaron muestras de suelo en cuatro localidades en la cordillera central de los Andes en el Valle del Cauca, Colombia siguiendo un gradiente altitudinal entre los 1000 y 3800 msnm. Seguidamente se secuenciaron el gen 16S de ARNr para bacterias y la región ITS1 para hongos empleando metabarcoding. Los análisis de composición taxonómica de microorganismos mostraron variaciones de abundancias a través del gradiente altitudinal, siendo las bacterias Acidobacteriota y Proteobacteriota favorecidas en las mayores alturas y Actinobacteria, Firmicutes y Verrucomicrobia en las menores elevaciones. En hongos, Ascomycota tuvo asignación máxima de lecturas en la mayor elevación, Basidiomycota tendió a dominar en las dos menores altitudes y Mortierellomycota reportó la mayoría de sus lecturas en elevaciones intermedias. Las tendencias de esas clasificaciones presentaron relaciones con parámetros fisicoquímicos del suelo como el carbono orgánico, nitrógeno y pH. El índice de Shannon indicó alta diversidad de bacterias y hongos (>3) en todas las localidades, presentándose un patrón de “U” invertida con máximos de diversidad en la reserva el Pailón a 2400 msnm. Además, se evidenciaron asociaciones de géneros de microorganismos con plantas dentro de los ecosistemas y anotaciones funcionales predictivas diferenciales a través el gradiente. Concluimos que las comunidades de bacterias y hongos del suelo difirieron en estructura y diversidad conforme variaron factores preponderantes para los microorganismos edáficos. (Texto tomado de la fuente) Soil microorganisms in forests and páramos are key axes in the maintenance of ecosystems due to their decomposition activities, plant nutrition and intervention in biogeochemical cycles. In this research, soil samples were collected in four localities in the central Andes mountain range in Valle del Cauca, Colombia, following an altitudinal gradient between 1000 and 3800 masl. The 16S rRNA gene for bacteria and the ITS1 region for fungi were sequenced using metabarcoding. Analysis of the taxonomic composition of microorganisms showed variations in abundance across the altitudinal gradient, with Acidobacteriota and Proteobacteriota being favored at higher altitudes and Actinobacteria, Firmicutes and Verrucomicrobia at lower elevations. In fungi, Ascomycota was more abundant at higher elevations, Basidiomycota tended to dominate at lower elevations and Mortierellomycota reported most of their readings at intermediate elevations. Trends in these classifications showed relationships with soil physicochemical parameters such as organic carbon, nitrogen and pH. The Shannon index indicated high diversity of bacteria and fungi (>3) in all localities, presenting an inverted "U" pattern with maximum diversity in the Pailón reserve at 2400 masl. In addition, associations of microorganism genera with plants within the ecosystems and differential predictive functional annotations across the gradient were evidenced. We conclude that soil bacterial and fungal communities differed in structure and diversity as factors preponderant for edaphic microorganisms varied. Maestría Las localidades del estudio fueron el parque natural regional El Vínculo (bosque seco tropical, 1000 msnm), el parque natural regional Mateguadua (bosque seco tropical, 1200 msnm), la reserva de la sociedad civil El Pailón (bosque andino, 2400 msnm) y distrito regional de manejo integrado páramo Las Domínguez (páramo, 3800 msnm) (Figura 1). En cada localidad se conformaron tres parcelas de 10 m x 10 m, separadas entre sí por 20 metros (12 parcelas en total). Para análisis microbiano, de cada parcela se obtuvieron tres muestras de suelo en tubos falcon de 15 mL de los primeros 25 centímetros de profundidad (36 muestras en total). Además, se recolectaron tres muestras de un kilogramo de suelo en los mismos puntos para análisis fisicoquímico y se realizó una caracterización taxonómica de las plantas presentes en el área de las parcelas. Las muestras de suelo se transportaron al laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, en donde se mantuvo el suelo para el análisis microbiano a -80 °C hasta la extracción del ADN Ciencias Agropecuarias.Sede Palmira

ilustraciones, mapas El cadmio (Cd) es un metal pesado altamente tóxico presente en el suelo que puede alterar la comunidad microbiana y las plantas que habitan en él. En América Latina, se han reportado altas concentraciones de este elemento en los suelos y granos de cacao, lo que representa una gran preocupación debido al impacto potencial en la salud humana, la seguridad alimentaria y la economía del cacao. Entre las estrategias para mitigar la absorción de Cd por parte de la planta se encuentra el uso de bacterias nativas tolerantes al Cd. Sin embargo, se desconoce el efecto que pueda causar el Cd en los microbiomas bacterianos. Con el objetivo de estudiar el efecto del Cd en la estructura y función de las comunidades bacterianas presentes en los suelos cacaoteros, se muestrearon tres fincas productoras de cacao en el municipio de Yacopí-Cundinamarca (F1, F2 y F3). En cada finca, se seleccionaron dos lotes de muestreo, uno con cultivo de cacao (SCC) y otro sin cultivo de cacao (SWC). En cada lote, se seleccionaron tres puntos de muestreo y para cada punto se recolectó suelo rizosférico (RZ, solo para SCC, y suelo a dos profundidades diferentes (D1: 0-30 cm; D2: 31-100 cm). En total se recolectaron 36 muestras de suelo, de las cuales 24 correspondieron a SCC y 12 a SWC. Todas las muestras se sometieron a análisis fisicoquímicos (textura, pH, Cd total, Cd disponible, Ca, Mg, K, CICE, P, Fe, Cu, Mn, Zn, CO). Las concentraciones de Cd total y disponible variaron entre lotes, fincas y nivel de profundidad. Se encontró una concentración significativamente más alta de Cd total en las muestras de suelo RZ, y los niveles promedio de Cd en las fincas fueron: F1 > F3 > F2. La extracción del ADN comunitario se realizó con el kit DNeasy® PowerSoil®; la amplificación y secuenciación de la hipervariable 4 del gen 16S RNAr se realizó mediante PCR de punto final y la plataforma Illumina MiSeq respectivamente. Las curvas de rarefacción indicaron que la mayoría de las muestras fueron secuenciadas con suficiente profundidad y los índices de diversidad alfa evaluados (Chao1, Shannon y Gini-Simpson) reflejaron comunidades altamente diversas con valores promedio de 973, 5.9 y 0.98 respectivamente. El Análisis de Componentes Principales (PCoA) basado en la métrica Unifrac ponderado reveló que las comunidades de F1 son significativamente diferentes a F2 y F3, y hay mayor similitud entre F2 y F3. A nivel taxonómico se identificaron 39 filos bacterianos, donde los más abundantes correspondieron a: Proteobacteria (36,5%), Acidobacteria (15,0%), Firmicutes (9,8%), Planctomycetes (8,6%), Verrucomicrobia (6,0), Chloroflexi (6,0%) y Nitrospirae (5,1%). A nivel de género se identificaron 122, entre los que se destacaron Bradyrhizobium (13,0%), Bacillus (8,8%), DA101 (4,5%), Nitrososphaera (1,8%) y Nitrospira (1,2%), algunos de los cuales se han relacionado con procesos de tolerancia a Cd. Por otra parte, las vías funcionales identificadas con mayor abundancia relativa estaban involucradas con la tolerancia al Cd. Esta investigación proporciona información valiosa sobre la comunidad bacteriana presente en el cultivo del cacao y su posible papel en la bioacumulación de Cd presente en el suelo. (Texto tomado de la fuente) Cadmium (Cd) is a highly toxic heavy metal present in soil that can alter the microbial community and the plants that inhabit it. In Latin America, high concentrations of this element have been reported in cacao soils and beans, which is of great concern due to the potential impact on human health, food safety and the cocoa economy. Strategies to mitigate Cd uptake by the plant include the use of native Cd-tolerant bacteria. However, the effect of Cd on bacterial microbiomes is unknown. In order to study the effect of Cd on the structure and function of bacterial communities present in cocoa soils, three cocoa farms in the municipality of Yacopí-Cundinamarca (F1, F2 and F3) were sampled. On each farm, two sampling plots were selected, one with cocoa cultivation (SCC) and one without cocoa cultivation (SWC). In each lot, three sampling points were selected and for each point rhizospheric soil (RZ, only for SCC, and soil at two different depths (D1: 0-30 cm; D2: 31-100 cm) were collected. A total of 36 soil samples were collected, of which 24 corresponded to SCC and 12 to SWC. All samples were subjected to physicochemical analysis (texture, pH, total Cd, available Cd, Ca, Mg, K, ECEC, P, Fe, Cu, Mn, Zn, CO). Total and available Cd concentrations varied among plots, farms and depth level. A significantly higher concentration of total Cd was found in the RZ soil samples, and the average Cd levels in the farms were: F1 > F3 > F2. Community DNA extraction was performed using the DNeasy® PowerSoil® kit; amplification and sequencing of the 16S rRNA gene hypervariable 4 was performed using endpoint PCR and the Illumina MiSeq platform respectively. Rarefaction curves indicated that most samples were sequenced with sufficient depth and the alpha diversity indices evaluated (Chao1, Shannon and Gini-Simpson) reflected highly diverse communities with mean values of 973, 5.9, and 0.98 respectively. Principal Component Analysis (PCoA) based on the weighted Unifrac metric revealed that F1 communities are significantly different from F2 and F3, and there is greater similarity between F2 and F3. At the taxonomic level, 39 bacterial phyla were identified, where the most abundant corresponded to: Proteobacteria (36.5%), Acidobacteria (15.0%), Firmicutes (9.8%), Planctomycetes (8.6%), Verrucomicrobia (6.0), Chloroflexi (6.0%) and Nitrospirae (5.1%). At the genus level, 122 were identified, among which Bradyrhizobium (13.0%), Bacillus (8.8%), DA101 (4.5%), Nitrososphaera (1.8%) and Nitrospira (1.2%), some of which have been related to Cd tolerance processes. On the other hand, the functional pathways identified with higher relative abundance were involved with Cd tolerance. This research provides valuable information on the bacterial community present in the cocoa crop and its possible role in the bioaccumulation of Cd present in the soil. Maestría

Resumen: Introducción: El papel de la microbiota en los modelos animales de esclerosis múltiple está bien establecido; por el contrario, los estudios en humanos son escasos. Métodos: Estudio transversal descriptivo que compara la composición relativa de la microbiota intestinal en 30 pacientes con esclerosis múltiple (15 tratados con interferón β-1b, 15 sin tratamiento) y 14 controles sanos utilizando la secuenciación de última generación. Resultados: Los sujetos control y los pacientes con esclerosis múltiple presentaron diferente abundancia de los filos Euryarchaeota, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, y Lentisphaerae y 17 especies bacterianas. Concretamente, la abundancia en Firmicutes, Actinobacteria y Lentisphaerae y 6 especies mostró diferencias al comparar los grupos control y sin tratamiento, desapareciendo esta diferencia cuando se compararon con los pacientes tratados. Se observó reducción estadísticamente significativa en la abundancia de Prevotella copri en pacientes sin tratamiento en comparación con controles, mientras que los tratados con interferón β-1b presentaron un aumento significativo frente a pacientes sin tratamiento, asemejándose al grupo de pacientes sanos control. Conclusión: La composición de la microbiota intestinal fue diferente entre los pacientes con esclerosis múltiple y los controles, y entre los pacientes sin tratamiento y los tratados con interferón β-1b. En la mayoría de los casos, no se encontraron diferencias entre los pacientes tratados y los controles sanos, siendo especialmente evidente con P. copri. Esto podría indicar que la influencia del interferón β-1b sobre la microbiota intestinal podría subyacer en los beneficios clínicos observados en pacientes con esclerosis múltiple que siguen este tratamiento. Serán necesarios estudios longitudinales y funcionales para poder mostrar causalidad. Abstract: Introduction: The association between gut microbiota and animal models of multiple sclerosis has been well established; however, studies in humans are scarce. Methods: We performed a descriptive, cross-sectional study comparing the relative composition of gut microbiota in 30 patients with multiple sclerosis (15 treated with interferon β–1b, 15 not receiving this treatment) and 14 healthy controls using next generation sequencing. Results: Patients with multiple sclerosis and controls showed differences in the proportion of Euryarchaeota, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, and Lentisphaerae phyla and in 17 bacterial species. More specifically, we found significant differences in the proportion of Firmicutes, Actinobacteria, and Lentisphaerae and 6 bacteria species between controls and untreated patients; however, these differences disappeared when compared with treated patients. Untreated patients showed a significant reduction in the proportion of Prevotella copri compared to controls, while the bacteria was significantly more abundant in patients treated with interferon β–1b than in untreated patients, with levels resembling those observed in the healthy control group. Conclusion: We observed differences in gut microbiota composition between patients with multiple sclerosis and controls, and between patients treated and not treated with interferon β–1b. In most cases, no differences were observed between treated patients and healthy controls, particularly for P. copri levels. This suggests that the clinical improvements observed in patients with multiple sclerosis receiving interferon β–1b may result from the effect of the drug on gut microbiota. Longitudinal and functional studies are necessary to establish a causal relationship.

Fil: Irazoqui, José Matías. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. Debido a su composición, principalmente lactosa y proteínas, el lactosuero puede considerarse como materia prima para la elaboración de productos de mayor valor, mediante el uso de enzimas. Las β-galactosidasas son enzimas capaces de transformar la lactosa en galactooligosacáridos con actividad prebiótica. Por su parte, las proteasas son enzimas capaces de hidrolizar las proteínas del suero y liberar péptidos, que presentan una gran variedad de actividades, como antimicrobiana y antihipertensiva, entre otras. Las lagunas de estabilización facultativas son utilizadas por PyMES lácteas para el tratamiento de sus efluentes, entre los cuales se pueden encontrarse restos de suero. En estas lagunas, la comunidades microbianas son las encargadas de estabilizar la carga orgánica de los efluentes, combinando procesos aeróbicos y anaeróbicos. El presente trabajo plantea el estudio de las comunidades microbianas de dos sistemas de lagunas facultativas de PyMES lácteas del centro de la provincia de Santa Fe. Utilizando metagenómica, se reconstruyeron 110 genomas microbianos completos, entre los cuales se destacan 7 grupos taxonómicos que serían claves para sistemas facultativos, por su capacidad metabólica. Luego, se identificaron, clonaron y expresaron exitosamente un total de 5 beta-galactosidasas novedosas que mostraron actividad con orto-nitrofenil-β-galactósido y lactosa. Entre estas 5 enzimas, βgal5 mostró una actividad superior a la del resto de las enzimas expresadas y a la de otras enzimas similares de origen metagenómico. También se identifico, clono y expreso exitosamente una proteasa novedosa que mostró actividad proteasa sobre azocaseína y proteínas de leche. Estas enzimas novedosas representan candidatos de gran interés para procesos industriales. Due to its composition, mainly lactose and proteins, whey can be considered as a source material of interest for the production of higher value products through the use of enzymes. β-galactosidases are enzymes capable of transforming lactose in galacto-oligosaccharides with prebiotic activity. On the other hand, proteases are enzymes that can hydrolyse whey proteins to obtain peptides with a wide range of biological activities, like antimicrobial or anti-hypertensive. Facultative stabilization ponds are common technology for the treatment of small dairy industries’ effluents. The microbial communities in these ponds are tasked with the degradation of all organic matter in the effluents, including remainders of whey, combining both aerobic and anaerobic processes. The present work present the study of two stabilization ponds systems of small dairy industries in Santa Fe province. Using metagenomics, we were able to reconstruct the genome of 110 microorganisms, including members of 7 different taxonomic groups that would be key for this kind of environment, due to their metabolic potential. We also identified, cloned and successfully expressed 5 novel β-galactosidases that showed activity with both ortho-nitrophenyl-β-galactoside and lactose. Among these 5 enzymes, βgal5 showed better activity levels than the rest of the expressed enzymes and other enzymes reported from metagenomes. Finally, we identified, cloned and successfully expressed a novel protease that was active with both azocasein and milk proteins. All these novel enzymes represent strong candidates to be applied on industrial processes. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria

La degradación de materia orgánica por lodos activados es la tecnología más utilizada para el tratamiento de efluentes municipales e industriales en todo el mundo. No obstante, para lograr una depuración eficiente el proceso requiere grandes cantidades de energía, utilizada principalmente para la oxidación de la materia orgánica por microorganismos aeróbicos. Parte de la energía utilizada puede ser suministrada por el biogás obtenido por la digestión anaeróbica de los lodos excedentes producidos durante el tratamiento aeróbico. Sin embargo, la digestibilidad en estos lodos es baja, por lo que la generación de electricidad a partir del biogás no es suficiente para suplir los requerimientos de una planta de tratamiento. La adición de residuo de alimentos (RA) como co-sustrato en digestores anaeróbicos de plantas de tratamiento de efluentes es una estrategia que tiene el potencial de convertir las plantas de tratamiento en autosuficientes en el consumo de energía y al mismo tiempo provee un método ambientalmente sustentable de valorización de los residuos orgánicos. Dado que el tipo de sustrato determina la estructura de la comunidad microbiana en los digestores, es crítico entender cómo estas comunidades responden a un cambio en la composición y concentración de sustrato. El objetivo de este trabajo consiste en entender los mecanismos de adaptación de las comunidades microbianas en digestores anaeróbicos que tratan barros excedentes de plantas de tratamiento de efluentes en co-digestión con residuos de alimentos. Se estudió la comunidad microbiana en cuatro reactores a escala de laboratorio inoculados con sólidos provenientes de un digestor anaeróbico de una planta de tratamiento municipal (Depuradora Norte AYSA, San Fernando, Buenos Aires), y alimentados diariamente con lodos mixtos (LM) y como co-sustrato se utilizaron cantidades crecientes de RA. El LM consistió en una mezcla de lodo primario y secundario extraída de la misma planta de tratamiento de la cual provenía el inóculo. El RA consistió en una mezcla de productos de origen vegetal (68,4 %) y animal (17,3 %) junto con restos de productos de panificadoras (14,3 %). Se tomaron muestras durante el periodo de funcionamiento de los reactores, se realizaron extracciones de ADN y su posterior secuenciación masiva al azar. Se ensamblaron los metagenomas y se reconstruyeron 196 genomas a partir de metagenomas (MAG, por su acrónimo en inglés) con una completitud mayor al 50 % y una contaminación menor al 5 %. Independientemente, se reconstruyeron 539 genes de RNA ribosomal 16S con una longitud mayor a 800 pares de bases (pb). Utilizando análisis de redes, se correlacionó la concentración de RA con la abundancia de los MAGs hidrolíticos y enzimas extracelulares involucradas en la degradación de carbohidratos complejos, que se encuentran comúnmente en la pared celular de plantas. Se resaltó la importancia de uno de los MAGs (Proteiniphillum) por ser la única bacteria que codifica la vía completa de degradación de la pectina. Estos resultados sugieren que los cambios en la composición de la materia prima establecen nuevos nichos microbianos para las bacterias con la capacidad de degradar los nuevos sustratos. De este modo, el trabajo presentado en esta tesis demuestra cómo el cambio de sustrato en los reactores anaeróbicos a escala de laboratorio provoca una alteración en la abundancia y composición de los microorganismos manteniendo estable la función del sistema. The degradation of organic matter by activated sludge is the most used technology for the treatment of municipal and industrial effluents around the world. However, to achieve efficient purification the process requires large amounts of energy, used mainly for the oxidation of organic matter. Part of the energy used can be supplied by the biogas obtained by the anaerobic digestion of the excess sludge produced in the aerobic treatment. However, the digestibility of the sludge is low, getting not enough electricity from the biogas in order to meet the requirements of a treatment plant. The addition of food waste (FW) as a co-substrate in anaerobic digesters of effluent treatment plants is a strategy that has the potential to make treatment plants self-sufficient in energy consumption and at the same time provides an environmentally sustainable method to recover organic waste. Since the type of substrate determines the phylogenetic structure of the microbial community in digesters, it is important to understand how these communities respond to a change in substrate composition and concentration. The objective of this work is to understand the adaptation mechanisms of microbial communities in anaerobic digesters that handle excess sludge from wastewater treatment plants (WWTP) in co-digestion with food waste. The microbial community was studied in 4 laboratory-scale reactors inoculated with solids from an anaerobic digester of a municipal WWTP (Planta Norte AYSA, San Fernando, Buenos Aires), and fed daily with sewage sludge (SS) and as co-substrate increasing amounts of FW were used. The SS consisted of a mixture of primary and secondary sludge extracted from the same WWTP from which the inoculum was used. The FW that was used consisted of a mixture between vegetable products (68.4%) and animal origin (17.3%) together with remains of bakery products (14.3%), prepared in the laboratory. Samples were taken throughout the operation of the reactors, DNA extraction and subsequent massive random sequencing were carried out. With the data obtained, the microbial community was studied at the taxonomic level using ribosomal sequences and metagenomes were assembled. Thanks to the difference in coverage, 196 metagenome assembled genomes (MAGs) were reconstructed with a completeness greater than 50% and a contamination less than 5%. Besides, 539 16S ribosomal RNA genes with a length greater than 800 base pairs (bp) were reconstructed. Using network analysis, the concentration of FW was correlated with the abundance of hydrolytic MAGs and extracellular enzymes involved in the degradation of complex carbohydrates, which are commonly found in the cell wall of fruits and plants. The importance of one of the MAGs (Proteiniphillum) was highlighted, as it is the only bacterium that encodes the complete pectin degradation pathway. These results suggest that changes in the composition of the raw material establish new microbial niches for bacteria with the ability to degrade new substrates. In this way, the work presented in this thesis demonstrates how the change of substrate in anaerobic reactors on a laboratory scale causes an alteration in the abundance and composition of microorganisms, keeping the function of the system stable. Fil: Orellana, Esteban. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

[ES] La metagenómica es una disciplina que surge ante la imposibilidad de aislar y cultivar la (amplia) mayoría de los organismos microbianos que viven en los ecosistemas naturales. El término hace referencia al estudio del conjunto de genomas de los organismos que habitan una muestra natural, al fin de describir, quiénes son y cuáles son sus potencialidades genéticas. Gracias a los considerables avances en el campo de la biología molecular, las nuevas tecnologías de secuenciación masiva (Next Generation Sequencing, NGS) y la bioinformática, la metagenómica se postula como una de las disciplinas con mayor progreso, en la actualidad, en el campo de la ecología microbiana. Una parte fundamental del análisis metagenómico son las herramientas bioinformáticas empleadas para analizar los resultados de secuenciación; aunque esta disciplina puede considerarse bastante reciente, existen ya una gran variedad de bases de datos, pipelines (flujo de trabajo) y programas. Con respecto a los pipelines, estos se desarrollan para la integración de diversos paquetes de software complementarios y para la automatización de los procesos; no obstante, al aumentar la complejidad del análisis aparecen obstáculos que dificultan el uso de pipelines de alto rendimiento: incompatibilidad entre los diferentes paquetes de software, requisitos de actualización contradictorios, gestión de un elevado número de archivos intermedios y temporales u optimización de los recursos de computación. A fin de solventar todos estos problemas, recientemente ha surgido un lenguaje específico de dominio (DLS) llamado Nextflow. Este permite la adaptación de pipelines escritos en cualquier lenguaje de programación. La elección de Nextflow para el desarrollo de un pipeline para análisis metagenómicos se justifica por características como el uso de tecnologías de contenedores multi-escala, su integración en repositorios de software, la paralelización y la definición de canales de entrada y salida para el inicio automático de cada sub-proceso. Además, el modelo de flujo de datos mejora a otras herramientas alternativas; ya que, el procesamiento ¿top-down¿ no necesita gran espacio de almacenamiento. En definitiva, Nextflow se presenta como una solución flexible y robusta debido a la simplificación, al control del flujo de datos y a la gestión de los resultados que se recogen de los análisis metagenómicos. En esta tesis, se presenta un pipeline de análisis basado en Nextflow que recoge los pasos principales del análisis metagenómico. El pipeline propuesto proporciona al usuario una herramienta que evita el proceso de instalación de los programas necesarios en el análisis y ejecuta los pasos más dispendiosos desde el punto de vista comunicacional en el análisis metagenómico. El pipeline recibe como entrada los datos brutos a analizar, procedentes de una o más muestras y continua con los pasos de control de calidad, ensamblado, anotación y cuantificación de cada anotación. Finalmente, proporciona, de forma clara y resumida, los resultados necesarios para los siguientes análisis estadísticos descriptivos y/o diferenciales; actuando de forma transparente, robusta y altamente reproducible, acelerando los tiempos de ejecución, ahorrando espacio de almacenamiento para el análisis y optimizando así los recursos informáticos disponibles., [EN] Metagenomics is a discipline that arose from the impossibility of isolating and cultivating most of microbial organisms that live in natural ecosystems. The term refers to the study of the genomes of the organisms that inhabit a natural sample in order to describe which microorganisms they are and what their genetic potentialities are. Because of the considerable advances in the field of molecular biology, Next Generation Sequencing technologies (NGS) and bioinformatics, metagenomics is currently one of the most advanced disciplines in the field of microbial ecology. The analysis of sequencing results is performed by bioinformatic tools that are an essential part of metagenomic analysis; although this discipline may be considered quite recent, a wide variety of databases, pipelines (workflows) and programs have been developed. Pipelines are used for the integration of different and complementary software packages, and for the automation of processes. However, as the complexity of the analysis increases, obstacles which hinder the use of high-performance pipelines appear: incompatibility between different software packages, conflicting upgrade requirements, management of a large number of intermediate and temporary files, and optimization of computing resources. In order to overcome all these problems, a domain-specific language (DLS) called Nextflow has recently emerged. Nextflow allows the adaptation of pipelines written in any programming language. The choice of Nextflow for the development of a metagenomic analysis pipeline is justified by features such as the use of multi-scale containerization, its integration with software repositories, parallelization and the definition of input and output channels for the automatic start of each sub-process. In addition, the data flow model improves other alternative tools, because the top to bottom processing does not require large storage space. In conclusion, Nextflow stands to be a flexible and robust solution owing to the simplification, data flow control and management of the results collected from metagenomic analysis. In this thesis, a Nextflow-based analysis pipeline, that captures the main steps of metagenomic analysis, is presented. The workflow provides the user with a tool that avoids the process of installing the necessary programs for the analysis and executes the most complex and communicatively problematic stages in metagenomic analysis. The pipeline receives as input the raw data to be analyzed from one or more samples and it continues with the steps of quality control, assembly, annotation, and quantification of each annotation. Finally, it provides, in a clear and summarized way, the necessary results for the following descriptive and/or differential statistical analysis, acting in a transparent, robust and highly reproducible way, speeding up execution times, saving storage space for the analysis, and optimizing the available informatic resources.

Digital, El suelo es un hábitat diverso, su composición varía dependiendo del uso, condiciones climáticas y actividades antropogénicas; y conocer los microorganismos presentes requiere la implementación de herramientas de secuenciación de nueva generación. Ananás comosus es un cultivo de gran importancia para Santander, sin embargo, los estudios referentes a la caracterización biológica del suelo asociado, son escasas en la región y en el país. En ese sentido, este trabajo se centró en la caracterización microbiana del suelo destinado a un cultivo de piña. Para lograrlo, las muestras se tomaron aleatoriamente de cuatro lotes a 20 cm de profundidad, obteniendo un total de 14 muestras. Se estandarizó el protocolo de extracción de ADN genómico total de suelo y la cantidad de ADN de cada muestra fue >60 ng/μl. Posteriormente se enviaron a secuenciar a MacroGen mediante la plataforma Illumina MiSeq (2x300 pb), obteniéndose un total de 1’518.101 secuencias de las muestras analizadas. El empleo de herramientas metagenómicas como el FASTQC y el MG-RAST, permitieron establecer la calidad de las secuencias obtenidas y la clasificación desde dominio hasta género de los microorganismos presentes en los suelos estudiados. Filo como Actinobacteria (>50%), Acidobacteria (>18%), Firmicutes (>16%) y Verrumicrobia (>10%), se encontraron con mayor predominancia entre las 14 muestras estudiadas. A nivel de género se encontraron en abundancia Candidatus Koribacter, Streptomyces, Isosphaera, Bacillus, Candidatus Solibacter y Actinomadura. Con respecto a la diversidad α, esta varía por las condiciones nutricionales del suelo, es por esto que en la muestra del suelo Blanco los valores de esta diversidad son los más bajos. Finalmente, se evidenció elevada similitud entre la composición de las comunidades microbianas de los cuatro suelos en estudio, indicando que el plaguicida y el bioplaguicida, no tienen un efecto significativo en la composición de la población microbiana presentes en la rizosfera del cultivo de piña., The soil is a diverse habitat, its composition varies depending on the use, climatic conditions and anthropogenic activities; and knowing the groups of microorganisms present requires the implementation of next-generation sequencing tools. Ananas comosus is a crop of great importance for Santander, however, studies referring to the biological characterization of the associated soil are scarce in the region and the country. In this sense, this work focused on the microbial characterization of the soil destined for a pineapple crop. The samples were randomly taken from four batches at a depth of 20 cm, obtaining a total of 14 samples. The total genomic soil DNA extraction protocol was standardized and the amount of DNA in each sample was> 60 ng / μl. Subsequently, they were sent to be sequenced to MacroGen using the Illumina MiSeq platform, obtaining a total of 1,518,101 sequences of the analyzed samples. The use of metagenomic tools such as FASTQC and MG-RAST made it possible to establish the quality of the sequences obtained and the classification from domain to the gender of the microorganisms present in the soils studied. Phylum such as Actinobacteria (> 50%), Acidobacteria (> 18%), Firmicutes (> 16%) and Verrumicrobia (> 10%), were found to be more prevalent among the 14 samples studied. At the genus level, Candidatus Koribacter, Streptomyces, Isosphaera, Bacillus, Candidatus Solibacter and Actinomadura were found in abundance. Concerning the diversit, Pregrado, Microbiólogo Industrial, 1 ed., Introducción ..............................................................................................................................15 Marco Teórico ...........................................................................................................................18 El Suelo .................................................................................................................................18 Aspectos Físicos del Suelo ................................................................................................19 Aspectos Químicos del Suelo ............................................................................................21 Materia Orgánica ...............................................................................................................23 La Agricultura .....................................................................................................................24 Microbiota del Suelo ..............................................................................................................25 Microorganismos de la Rizosfera .......................................................................................25 Funciones de los Microorganismos ....................................................................................26 Secuenciación de Nueva Generación ....................................................................................28 NGS en la Agricultura ........................................................................................................32 Illumina ..............................................................................................................................33 Análisis Bioinformático de Secuencias ..................................................................................39 MG-RAST como Herramienta Bioinformática .....................................................................41 Análisis Estadístico................................................................................................................43 Past Software ....................................................................................................................44 Estado del Arte .........................................................................................................................46 Marco Legal ..............................................................................................................................50 Planteamiento y Justificación del Problema ..............................................................................51 Pregunta de investigación .........................................................................................................52 Hipótesis ...................................................................................................................................53 Objetivos ...................................................................................................................................54 Objetivo General ...................................................................................................................54 Objetivos Específicos ............................................................................................................54 Metodología ..............................................................................................................................55 Especificaciones del Cultivo de Piña .....................................................................................55 Muestreo ...............................................................................................................................56 Extracción de ADN Genómico ...............................................................................................57 Amplificación y Secuenciación del Gen Ribosomal 16S. .......................................................58 Análisis Bioinformáticos .........................................................................................................58 Análisis Estadísticos ..............................................................................................................59 Análisis Físico-Químicos (realizados por los estudiantes de la UPB, sede Bucaramanga) ....59 Resultados y Análisis de Resultados ........................................................................................60 Extracción y Cuantificación de ADN Metagenómico ..............................................................60 Análisis Bioinformático de Secuencias ..................................................................................61 Clasificación por Dominios .................................................................................................61 Clasificación por filo ...........................................................................................................63 Clasificación por Género ....................................................................................................65 Diversidad α .......................................................................................................................67 Abundancia Relativa de Géneros Dominantes ...................................................................68 Géneros Únicos y Comunes en los Tratamientos ..............................................................69 Géneros predominantes .....................................................................................................71 Análisis Estadísticos ..............................................................................................................73 Análisis de Componentes Principales (ACP) ......................................................................73 Diversidad β .......................................................................................................................77 Discusión ..................................................................................................................................78 Análisis Fisicoquímicos .........................................................................................................78 Propiedades Físicas del Suelo ...........................................................................................78 Propiedades Químicas del Suelo .......................................................................................78 Extracción de ADN ................................................................................................................81 Análisis Bioinformático de Secuencias ..................................................................................83 Clasificación por Dominio ...................................................................................................84 Clasificación por filo ...........................................................................................................85 Clasificación por Género ....................................................................................................91 Diversidad α ..................................................................................................................... 101 Abundancia Relativa y Efecto del Plaguicida (Lorsban) y Bioplaguicida (Nicotina y Capsaicina). ..................................................................................................................... 102 Géneros Únicos y Comunes en los Tratamientos ................................................................ 104 Análisis de Componentes Principales (ACP) ....................................................................... 106 Diversidad β ........................................................................................................................ 107 Conclusiones .......................................................................................................................... 109 Recomendaciones .................................................................................................................. 111 Referencias Bibliográficas ....................................................................................................... 112 Apéndices ............................................................................................................................... 149 Apendice A. Protocolo de Extracción de ADN Estandarizado: Kit E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (OMEGA) ............................................................................................................................ 149 Apéndice B. Concentración de ADN Genómico Total de Suelos ......................................... 151 Apéndice C. Calidad del ADN Extraído ................................................................................ 152 Apéndice D. Secuencias Obtenidas por Muestra ................................................................. 153 Apéndice E. Curva de Rarefacción de los Suelos Analizados ............................................. 154 Apéndice F. Prueba de Kruskal Wallis – Composición microbiana sin diferencia significativa ............................................................................................................................................ 156 Apéndice G. Propiedades físicoquímicas de los suelos estudiados, realizados por los estudiantes de la Universidad Pontificia Bolivariana sede Bucaramanga ............................ 157 Cálculo de Nitrógeno de mg NTK/Kg a %. ........................................................................... 159

Resumen La ingeniería de rutas metabólicas, por medio de la biología sintética, se ha convertido en una herramienta de suma importancia para la industria alimentaria, debido a que se busca la optimización de procesos y obtención de compuestos ya existentes. Es posible producir compuestos que son altamente codiciados por el mercado, como enzimas que participan en procesos de fermentación o síntesis de productos de alta demanda, o saborizantes obtenidos de forma natural a partir de microorganismos modificados. Dicha edición genética se ha logrado mediante las técnicas desarrolladas en la rama de la biología sintética a lo largo de los años, como, por ejemplo, el ensamblaje de constructos genéticos y de CRISPR y ARN, mensajeros sintéticos. Estas técnicas son utilizadas para aumentar la productividad de un compuesto de interés en un microorganismo. No obstante, es necesario tomar en cuenta que no todos los microorganismos tienen las herramientas genéticas para realizar las modificaciones post-traduccionales necesarias para otorgar funcionalidad a una enzima o proteína, y que con una ruta metabólica de novo pueden producirse también compuestos e intermediarios tóxicos para el hospedero elegido. Particularmente, en la industria alimentaria es común la elección de microorganismos huéspedes que se consideren seguros para el consumo humano (GRAS) como las bacterias ácido-lácticas (LAB) y, más recientemente, las levaduras del género Saccharomyces. Abstract The engineering of metabolic pathways through synthetic biology has become an important tool for the food industry because it seeks the optimization of processes and production of compounds of interest. It is possible to produce compounds that are highly coveted, such as enzymes that take part in fermentation processes, or synthesis of products of high demand, or flavoring produced naturally by a microorganism. This can be achieved through genetic edition developed by synthetic biology through the assembly of genetic constructs CRISPR and synthetic mRNA. These techniques are used to increase the productivity of an organism that on its own produces a compound of interest, or to genetically modify a microorganism so that it can perform the synthesis of a product. However, it is necessary to take into account that not all microorganisms have the genetic tools necessary for the required post-translational modifications to activate enzyme or protein functions, and that the insertion of de novo pathways may result in both toxic compounds and intermediates for the chosen host. Particularly, it is common, when working in the food industry, to choose host microorganisms safe to be consumed by human beings, like GRAS organisms such as lactic acid bacteria and, more recently, yeasts of the Saccharomyces genus.

The engineering of metabolic pathways through synthetic biology has become an important tool for the food industry because it seeks the optimization of processes and production of compounds of interest. It is possible to produce compounds that are highly coveted, such as enzymes that take part in fermentation processes, or synthesis of products of high demand, or flavoring produced naturally by a microorganism. This can be achieved through genetic edition developed by synthetic biology through the assembly of genetic constructs CRISPR and synthetic mRNA. These techniques are used to increase the productivity of an organism that on its own produces a compound of interest, or to genetically modify a microorganism so that it can perform the synthesis of a product. However, it is necessary to take into account that not all microorganisms have the genetic tools necessary for the required post-translational modifications to activate enzyme or protein functions, and that the insertion of de novo pathways may result in both toxic compounds and intermediates for the chosen host. Particularly, it is common, when working in the food industry, to choose host microorganisms safe to be consumed by human beings, like GRAS organisms such as lactic acid bacteria and, more recently, yeasts of the Saccharomyces genus. La ingeniería de rutas metabólicas, por medio de la biología sintética, se ha convertido en una herramienta de suma importancia para la industria alimentaria, debido a que se busca la optimización de procesos y obtención de compuestos ya existentes. Es posible producir compuestos que son altamente codiciados por el mercado, como enzimas que participan en procesos de fermentación o síntesis de productos de alta demanda, o saborizantes obtenidos de forma natural a partir de microorganismos modificados. Dicha edición genética se ha logrado mediante las técnicas desarrolladas en la rama de la biología sintética a lo largo de los años, como, por ejemplo, el ensamblaje de constructos genéticos y de CRISPR y ARN, mensajeros sintéticos. Estas técnicas son utilizadas para aumentar la productividad de un compuesto de interés en un microorganismo. No obstante, es necesario tomar en cuenta que no todos los microorganismos tienen las herramientas genéticas para realizar las modificaciones post-traduccionales necesarias para otorgar funcionalidad a una enzima o proteína, y que con una ruta metabólica de novo pueden producirse también compuestos e intermediarios tóxicos para el hospedero elegido. Particularmente, en la industria alimentaria es común la elección de microorganismos huéspedes que se consideren seguros para el consumo humano (GRAS) como las bacterias ácido-lácticas (LAB) y, más recientemente, las levaduras del género Saccharomyces.

[ES] Actualmente, existe un interés creciente en la producción agrícola orgánica en todo el mundo, en busca de la sostenibilidad y la mejora de la salud pública. Sin embargo, existe un vacío de conocimiento sobre algunos aspectos de la calidad y seguridad microbiológica de los alimentos ecológicos. Es por ello, que este Trabajo Final de Grado se centrará en el estudio y determinación del microbioma de las amebas de vida libre (FLA) presentes en alimentos orgánicos. Dado que potencialmente las FLA pueden ser un vehículo de transmisión de patógenos humanos, se prestará especial atención en estos. Para ello, se adquirirán muestras de lechugas, espinacas y fresas procedentes de comercios locales. Tras su procesamiento, se analizará la presencia de FLA en los alimentos por visualización en microscopio, y posteriormente se extraerá el DNA para ser secuenciado mediante el sistema Illumina MiSeq. Se procederá a realizar un análisis bioinformático con el objetivo de determinar mediante metagenómica de secuenciación dirigida, la composición taxonómica del microbioma de las amebas aisladas., [EN] Currently, there is a growing interest in organic agricultural production around the world, in search of sustainability and improved public health. However, there is a lack of knowledge about some aspects of the microbiological quality and safety of organic food. Therefore, this Final Degree Project will focus on the study and determination of the microbiome of free-living amoebae (FLA) present in organic food. Given that FLA can potentially be a vehicle for the transmission of human pathogens, special attention will be paid to them. For this purpose, samples of lettuce, spinach and strawberries will be acquired from local shops. After processing, the presence of FLA in the food will be analysed by microscopic visualisation, followed by DNA extraction for sequencing using the Illumina MiSeq system. A bioinformatics analysis will be carried out to determine the taxonomic composition of the microbiome of the isolated amoebae by targeted sequencing metagenomics.

[ES] El alcohol es un compuesto neurotóxico causante del 5,3% de las muertes anuales. Un consumo excesivo de este afecta a un gran número de órganos y tejidos, especialmente el hígado, el sistema nervioso central (SNC) y el tracto gastrointestinal. En otras palabras, el consumo de alcohol se relaciona con consecuencias negativas para la salud como: malnutrición, neurodegeneración, desordenes de conducta y enfermedades inflamatorias. Trabajos recientes del laboratorio de Patología Celular del Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF) han demostrado la participación del alcohol en la activación de la respuesta del sistema inmune innato (SII); centrándose en uno de los mecanismos de la respuesta inflamatoria como es la respuesta de los receptores del sistema innato inmunitario, TLRs (Toll-like receptors). En concreto, se ha demostrado que el etanol es capaz de activar la vía de señalización del receptor TLR4, generando una respuesta inflamatoria que activa al factor de transcripción NF-κB y permite la liberación de citocinas y mediadores inflamatorios. Datos recientes indican la participación de la microbiota gastrointestinal en los procesos de inflamación e inmunidad, y su capacidad de regulación del eje intestino - cerebro. Distintos estudios han demostrado que, tras un proceso de disbiosis, se producen alteraciones de la composición microbiana favoreciendo el desarrollo de los microorganismos patógenos frente a los beneficiosos, efectos que se asocian con diferentes patologías ya que afectan al organismo hospedador. A este respecto, se ha demostrado que el consumo/abuso de alcohol influye negativamente en el mantenimiento del equilibrio microbiano, pues distintos estudios confirman que las personas alcohólicas presentan alteraciones en poblaciones bacterianas, indicando que el consumo modifica la composición de la microbiota. Por tanto, el objetivo del presente trabajo es evaluar posibles diferencias entre la composición microbiana tras un consumo crónico de alcohol y la relevancia del receptor TLR4 en esas diferencias, utilizando ratones wild-type y TLR4 knock-out. El abordaje metodológico se basa en la utilización de protocolos de secuenciación de tercera generación que nos permiten conocer cómo el alcohol influye en los perfiles bacterianos. Los resultados preliminares indican que el alcohol altera al microbioma bacteriano y que existen diferencias importantes en la composición microbiana entre ratones wild-type y ratones TLR4 KO con consumo de alcohol., [EN] Alcohol is a neurotoxic compound which causes 5.3% of annual deaths. Chronic excessive alcohol consumption can affect nearly every organ and tissue, particularly the liver, the Central Nervous System (CNS) and the gastrointestinal tract. To put it another way, alcohol consumption is associated with adverse health consequences like, malnutrition, neurodegeneration, behavioural disorders and inflammatory diseases. Recently researches from the Cellular Pathology Laboratory of the Principe Felipe Research Centre (CIPF) demonstrates the involvement of alcohol in the activation of the innate immune system (SII); focusing on one of the mechanisms of the inflammatory response as is the response of the innate immune system receptors, TLRs (Toll-Like Receptors). Specifically, it was demonstrated that ethanol can activate the signalling pathway of the TLR4 receptor, triggering an inflammatory response that activates the NF-κB transcription factor and allows the release of cytokines and inflammatory mediators. Recent data show the involvement of the gut microbiota in inflammation and immunity events, and its ability to regulate the gut-brain axis. Different studies have proved that after a dysbiosis process, alterations in microbial composition that is favouring pathogenic microbes over beneficial ones, there are some effects that are associated with different health disorders that affects the host organism. In this respect, it has been shown that the alcohol consumption adversely affects the microbiota equilibrium, as other studies have shown that alcoholic people have bacterial alterations, so ethanol can modify the gut microbiota. Therefore, the objective of this work is to study the differences between microbial composition after a chronic alcohol consumption and the relevance of TLR4 receptor. The experiments use wild-type and TLR4 knock-out mice. The methodological approach is based on the use of third generation sequencing protocols that allow us to know how alcohol influences bacterial profiles. Preliminary results indicate that alcohol alters the bacterial microbiome and that there are important differences in microbial composition between wild-type and TLR4 KO mice after an alcohol consumption.

The use of oil and its derivatives has been intensified by the current high energy demand, but brought with it the increase in environmental accidents such as fuel spills that negatively affect ecosystems. In those environments there are microorganisms capable of surviving such conditions and using petroleum hydrocarbons as a source of carbon and energy; those can be used in bioremediation, with an eco-friendly and cost-effective approach. In this work, bacterial strains with bioremediation potential were isolated and identified in culture media supplemented with oil from an area contaminated from an oil spill in the Peruvian Amazon; also was done out the characterization of the bacterial community by independent analysis of culture by means of next generation sequencing directed to the 16S rRNA gene. The isolated bacterial strains were identified as Acinetobacter rudis, Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Morganella morganii, Proteus hauseri, Proteus terrae, Proteus vulgaris (2), Pseudomonas koreensis, Pseudomonas moraviensis, Pseudomonas prosekii y Serratia marcescens (2). The culture-independent analysis detected the Proteobacteria and Bacteroidetes phylum as predominant in water and soil contaminated with hydrocarbons; Likewise, the taxonomic allocation at the family level highlighted the groups Flavobacteriaceae, Moraxellaceae, Verrucomicrobia and Acetobacteraceae as the most abundant, in addition to the genera Acinetobacter, Flavobacterium and Geobacter present in both samples. In this way, the main groups involved in the degradation of petroleum hydrocarbons were determined using culture-dependent and independent techniques. El uso del petróleo y sus derivados se ha visto intensificado por la alta demanda energética actual; esto ha traído consigo el incremento de accidentes ambientales como los derrames de combustibles que afectan negativamente los ecosistemas. En estos ambientes existen microrganismos capaces de sobrevivir a dichas condiciones y utilizar los hidrocarburos de petróleo como fuente de carbono y energía; siendo propuestos en la biorremediación con un enfoque ecoamigable y costo-efectivo. En este trabajo se aislaron e identificaron cepas bacterianas con potencial biorremediador en medios de cultivo suplementados con petróleo, a partir de una zona contaminada por derrame de petróleo en la Amazonía peruana; también se realizó la caracterización de la comunidad bacteriana por análisis independiente de cultivo mediante secuenciamiento de próxima generación dirigido al gen ARNr 16S. Las cepas bacterianas aisladas se identificaron como: Acinetobacter rudis, Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Morganella morganii, Proteus hauseri, Proteus terrae, Proteus vulgaris (2), Pseudomonas koreensis, Pseudomonas moraviensis, Pseudomonas prosekii y Serratia marcescens (2). En el análisis independiente de cultivo detectaron los filos Proteobacteria y Bacteroidetes como predominantes en agua y suelo contaminados con hidrocarburos; así mismo, la asignación taxonómica a nivel de familia destacó los grupos Flavobacteriaceae, Moraxellaceae, Verrucomicrobia y Acetobacteraceae como más abundantes, además de los géneros Acinetobacter, Flavobacterium y Geobacter presentes en ambas muestras. De esta manera, se determinaron los principales grupos implicados en la degradación de hidrocarburos haciendo uso de técnicas dependientes e independientes de cultivo.

The aim of this study was to characterize the microbiota of the intestinal tract of robalo (Centropomus sp), from natural environment and captivity, and to isolate and identify bacteria with probiotic potential. The intestinal microbiota was characterized by metagenomics directed to the 16S rRNA gene. In addition, samples of intestinal mucus were cultured in MRS medium for bacterial isolation. Molecular identification was done by sequencing the 16S rRNA gene. Probiotic capabilities were evidenced by proteolytic and bacterial antagonism assays against Plesiomona shigelloides, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii and Vibrio harveyi. The most abundant bacterial genera were Clostridium, Photobacterium, Cetobacterium and Rubritepida. Bacterial species, including Klebsiella sp, two strains of Weisiella cibaria and Lactococcus sp were isolated on MRS agar from the intestinal tract. W. cibaria strains showed broad antagonistic spectrum and positive proteolytic activity., El objetivo del estudio fue caracterizar la microbiota del tracto intestinal de robalo (Centropomus sp), proveniente de medio natural y cautiverio, además de aislar e identificar bacterias con potencial probiótico. La microbiota intestinal se caracterizó mediante metagenómica dirigida al gen 16S ARNr. Además, se sembraron muestras de mucus intestinal en medio de cultivo MRS para el aislamiento bacteriano. La identificación molecular se hizo mediante la secuenciación del gen 16S ARNr. Las capacidades probióticas se evidenciaron mediante ensayos proteolíticos y de antagonismo bacteriano frente a Plesiomona shigelloides, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii y Vibrio harveyi. Los géneros bacterianos con mayor abundancia fueron Clostridium, Photobacterium, Cetobacterium y Rubritepida. Las especies bacterianas, incluyendo Klebsiella sp, dos cepas de Weisiella cibaria y Lactococcus sp fueron aisladas en agar MRS a partir del tracto intestinal. Las cepas W. cibaria mostraron amplio espectro antagonista y actividad proteolítica positiva.

RESUMEN : Cada vez más se reconoce la importancia de la relación entre la microbiota intestinal y la salud humana. Ahora está bien establecido que una microbiota intestinal saludable es en gran parte responsable de la salud general del huésped. Así mismo la microbiota intestinal cada vez más se asocia con una gran variedad de enfermedades humanas como el cáncer colorrectal (CCR). La microbiota intestinal produce una serie de metabolitos y factores que afectan el metabolismo y la inmunidad del huésped. Dichas alteraciones del huésped conllevan a la aparición del CCR que se caracteriza por inflamación, disfunción de la barrera intestinal y estando involucrados mecanismos moleculares en el contexto de una disbiosis intestinal. Debido al gran impacto de la microbiota intestinal tanto en la salud como en la enfermedad se plantea la presente revisión que trata de analizar la reciente evidencia del impacto de la microbiota intestinal en el CCR considerando los microorganismos relacionados así como el papel que juega el biofilm en la incidencia del CCR. El objetivo es proporcionar un análisis del conocimiento actual del papel de la microbiota en la eficiencia y toxicidad de las terapias contra el CCR y la necesidad de integración de los datos del microbioma en la medicina de precisión para la prevención diagnóstico y tratamiento del CCR. Finalmente se incide en la modulación de la microbiota con fines terapéuticos. ABSTRACT : The importance of the relationship between the gut microbiota and human health is increasingly recognized. It is now well established that a healthy intestinal microbiota is largely responsible for the general health of the host. Likewise, intestinal microbiota are increasingly associated with a wide variety of human diseases such as colorectal cancer (CRC). The gut microbiota generates a series of metabolites and factors that affect the metabolism and immunity of the host. Such alterations of the host lead to the appearance of CRC characterized by inflammation, dysfunction of the intestinal barrier and molecular mechanisms involved in the context of an intestinal dysbiosis. Given the great impact of the gut microbiota on health and disease, this review considers the recent evidence of the impact of the intestinal microbiota on colorectal cancer considering related microorganisms and the role of biofilm in the incidence of colorectal (CRC). The objective is to provide an analysis of the current knowledge of the role of microbiota in the efficiency and toxicity of CRC therapies and the need for integration of microbial data into precision medicine for the prevention, diagnosis and treatment of CRC. Finally this revision points out, the modulation of the microbiota used for therapeutic purposes. Grado en Medicina

La intensificación de las actividades agrícolas y pecuarias asociada a la creciente demanda mundial de alimentos conducen a cambios en la estructura física y bioquímica de los suelos, como resultado de la adopción de monocultivos y la simplificación de las interacciones biológicas. Esto desencadena en la reducción de la biodiversidad y aumento en la emisión de gases de efecto invernadero. Una de los indicadores de degradación del suelo es la pérdida de la diversidad y de funciones de las comunidades microbianas. En la última década se han empleado como más frecuencia las técnicas de secuenciación de ADN para explorar la composición y función microbiana del suelo, como la secuenciación de marcadores moleculares para evaluar la composición taxonómica (e.g., 16S rARN) y secuenciación metagenómica por shotgun para estudiar los genes funcionales de las comunidades y su potencial funcional. No obstante, la secuenciación metagenómica shotgun del suelo es difícil debido a la mega diversidad de las comunidades microbianas del suelo que requiere de una altísima inversión económica en cuanto a secuenciación y hace imposible emplear esta técnica de forma frecuente en los estudios de suelo. En los últimos años se han desarrollado metodologías como el PICRUSt que permiten realizar predicciones funcionales de genes a partir de secuencias de 16S rARN. Estas herramientas basan sus predicciones en la presencia de genomas completos y disponibles relacionados cercanamente a los taxones identificados por el 16S rRNA. En consecuencia, estos métodos funcionan mejor en ambientes con alto número de genomas secuenciados como los estudios del microbioma del ser humano que en estudios con poca representatividad en las bases de datos como los estudios del suelo. Por lo tanto, el presente estudio pretende establecer si las herramientas de predicción como PICRUSt pueden ser utilizadas en suelo para establecer el potencial funcional de las comunidades microbianas y así establecer el efecto del uso y manejo del suelo en la composición y funciones microbianas. Para esto se comparó la predicción de genes por PICRUSt con datos de secuenciación metagenómica. Una vez establecidas que funciones poseen una alta correlación entre la predicción y el metagenoma se evaluó el efecto de distintos usos y manejos agrícolas sobre dichas funciones. Para establecer el efecto de estas prácticas en el suelo como un paso importante para diseñar mejores prácticas agrícolas a futuro. En el presente trabajo se utilizaron datos de secuenciación que fueron obtenidos en un trabajo de grado anterior. Estos datos se obtuvieron a partir de muestras de suelo colectadas en dos regiones del departamento de Valle del Cauca, Colombia, con diferentes usos y manejo del suelo: silvopastoril intensivo, pasto convencional, caña de azúcar con manejo convencional y agroecológico y bosque seco tropical. PICRUSt predijo 12111 anotaciones funcionales, mientras que el análisis metagenómico identificó solo 6188 anotaciones funcionales. La correlación de Spearman entre la abundancia de todos los genes obtenidos por PICRUSt y por secuenciación metagenómica fue relativamente baja. Esta misma correlación para los genes relacionados con los ciclos de Nitrógeno, Carbono fue considerablemente más alta. Además, se calculó el Índice de Taxón Secuenciado Más Cercano (NSTI), que está relacionada con la incertidumbre de predicción, varían entre 0.25 y 0.05 en los diferentes sitios de muestreo. Para evaluar el efecto del uso y manejo del suelo, así como la región geográfica sobre la abundancia de genes funcionales, se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA), para mostrar el ordenamiento de las muestras en los ciclos de carbono y nitrógeno, además se realizó un análisis estadístico PERMANOVA para determinar los efectos del uso, manejo y región sobre los mismos ciclos. Asimismo, se comparó la abundancia de diferentes genes de los ciclos del nitrógeno y carbono. Se observó una agrupación de todos los genes por manejo y región en la predicción de PICRUSt. En el ciclo del nitrógeno se encontró una separación representativa por región, en el ciclo del carbono se observó una separación entre los suelos de bosques y suelos intervenidas. Las abundancias de genes relacionados con la metanógenesis fueron mayores en sistemas con manejo convencional y bajo en sistemas con manejo agroecológico con un valor P significativo de 0.016, en el metabolismo de carbohidratos valores altos en bosque y todos los sistemas de El Cerrito con valor P 0.001. En oxidación de metano no se encontraron diferencias significativas. En la fijación de carbono valores altos en Bosque y cañas y bajos en silvopastoril y Pasturas, encontrando diferencias significativas del uso del suelo con valor P 0.0186. En cuanto al ciclo del nitrógeno, la fijación de nitrógeno se encontró valores altos en los sistemas de El Cerrito y bajos en Bugalagrande, concordando con diferencias significativas en cuanto a región valor P 2e-16. En reducción asimilatoria de nitratos fue alta en bosque, seguido por altos en manejo agroecológico y bajos en manejo convencional validado por la diferencia significativa del manejo del suelo valor P 0.0034. En la nitrificación se encontró valores bajos en suelos con uso de ganadería y altos en cañas y bosque, afirmando resultados de diferencia significativa del uso del suelo valor P 0.012. Por último, en la desnitrificación los valores fueron muy variables concordando con los resultados de análisis estadísticos donde no se encontró diferencia significativa Pontificia Universidad Javeriana Corporación colombiana de investigación agropecuaria The intensification of agricultural and livestock activities associated with the growing global demand for food leads to changes in the physical and biochemical structure of soils, because of the adoption of monocultures and the simplification of biological interactions. The reduction of biodiversity and an increase in the emission of greenhouse gases. One of the indicators of soil degradation is the loss of diversity and functions of microbial communities. In the last decade, DNA sequencing techniques have been used more frequently to explore soil composition and microbial function, such as molecular marker sequencing to assess taxonomic composition (eg, 16S rRNA) and metagenomic sequencing by shotgun to study functional genes of the communities and their functional potential. However, the shotgun metagenomic sequencing of the soil is difficult due to the mega diversity of the microbial communities of the soil that requires a very high economic investment in terms of sequencing and makes it impossible to use this technique frequently in soil studies. In recent years, methodologies such as PICRUSt have been developed that allow functional predictions of genes from 16S rRNA sequences. These tools base their predictions on the presence of complete and available genomes closely related to the taxa identified by the 16S rRNA. Consequently, these methods work better in environments with a high number of sequenced genomes such as human microbiome studies than in studies with little representation in databases such as soil studies. Therefore, the present study aims to establish whether prediction tools such as PICRUSt can be used in soil to establish the functional potential of microbial communities and thus establish the effect of soil use and management on microbial composition and functions. For this, the prediction of genes by PICRUSt was compared with metagenomic sequencing data. Once established which functions have a high correlation between prediction and metagenome, the effect of different agricultural uses and management on these functions was evaluated. To establish the effect of these practices on the soil as an important step to designing better agricultural practices in the future. In the present work, sequencing data were used that were obtained in a previous grade work. These data were obtained from soil samples collected in two regions of the department of Valle del Cauca, Colombia, with different uses and soil management: intensive silvopastoral, conventional grass, sugarcane with conventional and agro-ecological management and tropical dry forest. PICRUSt predicted 12111 functional annotations, while the metagenomic analysis identified only 6188 functional annotations. Spearman's correlation between the abundance of all genes obtained by PICRUSt and by metagenomic sequencing was relatively low. This same correlation for the genes related to the nitrogen, carbon cycles was considerably higher. In addition, the Nearest Sequenced Taxon Index (NSTI), which is related to the uncertainty of prediction, was calculated varying between 0.25 and 0.05 at different sampling sites. To assess the effect of land use and management, as well as the geographic region on the abundance of functional genes, a principal coordinate analysis (PCoA) was performed, to show the ordering of the samples in the carbon and nitrogen cycles, in addition A PERMANOVA statistical analysis was performed to determine the effects of use, management, and region on the same cycles. Likewise, the abundance of different genes of the nitrogen and carbon cycles was compared. A grouping of all genes by management and region was observed in the prediction of PICRUSt. In the nitrogen cycle, a representative separation by region was found, in the carbon cycle a separation between forest soils and intervened soils was observed. The abundances of genes related to methanogenesis were higher in systems with conventional management and low in systems with agroecological management with a significant P value of 0.016, in carbohydrate metabolism high values ​​in the forest and all El Cerrito systems with P-value 0.001. In methane oxidation, no significant differences were found. In the fixation of carbon high values ​​in Forest and reeds and low in silvopastoral and Pastures, finding significant differences in land use with P-value 0.0186. Regarding the nitrogen cycle, nitrogen fixation was found high in El Cerrito systems and low in Bugalagrande, agreeing with significant differences in value region P 2e-16. In the assimilatory reduction of nitrates was high in the forest, followed by high in agroecological management and low in conventional management validated by the significant difference in soil management value P 0.0034. In nitrification, low values were found in soils with the use of livestock and high in reeds and forest, affirming results of significant difference in land use value P 0.012. Finally, in denitrification, the values were very variable according to the results of statistical analysis where no significant difference was found. Magíster en Ciencias Biológicas Maestría

RESUMEN El pollo y el huevo son una fuente importante de proteína para el ser humano a nivel mundial. La producción de estos alimentos se ha intensificado durante los últimos años y se prevé que se produzca alrededor de 1 50 millones de toneladas de carne de pollo en 2020 (OCDE / FAO, 2018). Sin embargo, uno de los mayores problemas ligados a los procesos de producción avícola lo constituyen las enfermedades infecciosas ocasionadas por microorganismos patógenos. Entre los más relevantes se encuentran microorganismos como Salmonella ssp, Campylobacter spp, y Escherichia coli. Por lo tanto, es importante comprender los mecanismos implicados en la colonización de microorganismos patógenos que afectan a las aves de corral y sus interacciones con la microbiota gastrointestinal las cuales son clave en la mejora de la absorción de nutrientes y el fortalecimiento del sistema inmune, que influye en el crecimiento, el bienestar y la salud de las aves de corral. Sin embargo, hay poca información relacionada con la microbiota gastrointestinal de pollos parrilleros y gallinas productoras de huevo. Hasta hace poco, la caracterización se limitaba a los microorganismos que podían recuperarse a través de cultivos tradicionales. Por lo anterior, en el último tiempo se ha intensificado el uso de técnicas moleculares, entre las que se destaca la metagenómica, la cual ofrece una alternativa para una mejor comprensión de las interacciones bacterianas, la identificación de genes de resistencia a los antibióticos, identificación de elementos genéticos móviles, y el diseño de estrategias para intervenciones más efectivas con el objetivo de romper la cadena de transmisión de microorganismos patógenos durante el ciclo de producción avícola. En esta revisión, se describen los principales enfoques metagenómicos para el estudio de microbiomas de aves de corral, las técnicas de secuenciación y herramientas bioinformáticas usadas para su caracterización. ABSTRACT Chicken and eggs are an important source of protein for humans worldwide. Production of these foods has been intensified in recent years and around 150 million tonnes of chicken meat is expected to be produced by 2020 (OECD / FAO, 2018). However, one of the biggest problems linked to poultry production processes are the infectious diseases caused by pathogenic microorganisms. Among the most relevant are found microorganisms such as Salmonella ssp, Campylobacter spp, and Escherichia coli. Therefore, it is important to understand the mechanisms involved in the colonization of pathogenic microorganisms that can affect poultry and their interactions with the gastrointestinal microbiota, which are key in improving nutrient absorption and strengthening the immune system, which it influences the growth, welfare and health of the chicken. However, there is little information related to the gastrointestinal microbiota of chicken. Until recently, the characterization was limited to microorganisms that could be recovered through culture traditional. Therefore, in the last time, it has been intensified use of molecular techniques, among those is remarked metagenomics, which offers an alternative for a better understanding of bacterial interactions, the identification of antibiotic resistance genes, identification of mobile genetic elements, and the design of strategies for more effective interventions with the aim of breaking the chain of transmission of pathogenic microorganisms during the poultry production cycle. In this review, the main metagenomics approaches are describe aimed to study microbiomes from poultry, sequencing techniques and bioinformatics tools used for its characterization.

The composition and abundance of the bacterial microbiota in three portions of the gastrointestinal tract of a piglet, in the balanced feed and in biological ensilages prepared with residues of aquaculture origin were evaluated by metagenomic analysis. The DNA of the samples was extracted, and sequenced. The greatest bacterial diversity was in the balanced feed (44.7%), with the predominance of Candidatus phytoplasma surgarcane. In the biological silage predominated Lactobacillus casei and Lactococcus lactis. The existing diversity was similar between silage and the concentrate feed. Similarities were found between the bacteria of the three gastrointestinal regions (L. ultunensis, Selenomonas bovis, Prevotella copri, Enterococcus lactis y Campylobacter sp). In the stomach predominated Helicobacter rappini and Campylobacter coli, in the small intestine Selenomonas bovis and Lactobacillus ultunensis and in the rectum (faeces) Lactobacillus ultunensis and Prevotella copri., Se evaluó mediante análisis metagenómico la composición y abundancia de la microbiota bacteriana en tres porciones del tracto gastrointestinal de un lechón, en el alimento balanceado y en ensilados biológicos preparados con residuos de origen acuícola. Se extrajo el ADN de las muestras y se procedió con la secuenciación. La mayor diversidad bacteriana estuvo en el alimento balanceado (44.7%), predominando Candidatus phytoplasma surgarcane. En el ensilado biológico predominaron las especies Lactobacillus casei y Lactococcus lactis. La diversidad existente fue similar entre el ensilado y el alimento. Se encontró similitudes entre las bacterias de las tres regiones gastrointestinales (L. ultunensis, Selenomonas bovis, Prevotella copri, Enterococcus lactis y Campylobacter sp). En el estómago hubo predominio de Helicobacter rappini y Campylobacter coli, en intestino delgado Selenomonas bovis y Lactobacillus ultunensis y en el recto (heces) predominio de Lactobacillus ultunensis y Prevotella copri.

Se evaluó mediante análisis metagenómico la composición y abundancia de la microbiota bacteriana en tres porciones del tracto gastrointestinal de un lechón, en el alimento balanceado y en ensilados biológicos preparados con residuos de origen acuícola. Se extrajo el ADN de las muestras y se procedió con la secuenciación. La mayor diversidad bacteriana estuvo en el alimento balanceado (44.7%), predominando Candidatus phytoplasma surgarcane. En el ensilado biológico predominaron las especies Lactobacillus casei y Lactococcus lactis. La diversidad existente fue similar entre el ensilado y el alimento. Se encontró similitudes entre las bacterias de las tres regiones gastrointestinales (L. ultunensis, Selenomonas bovis, Prevotella copri, Enterococcus lactis y Campylobacter sp). En el estómago hubo predominio de Helicobacter rappini y Campylobacter coli, en intestino delgado Selenomonas bovis y Lactobacillus ultunensis y en el recto (heces) predominio de Lactobacillus ultunensis y Prevotella copri. The composition and abundance of the bacterial microbiota in three portions of the gastrointestinal tract of a piglet, in the balanced feed and in biological ensilages prepared with residues of aquaculture origin were evaluated by metagenomic analysis. The DNA of the samples was extracted, and sequenced. The greatest bacterial diversity was in the balanced feed (44.7%), with the predominance of Candidatus phytoplasma surgarcane. In the biological silage predominated Lactobacillus casei and Lactococcus lactis. The existing diversity was similar between silage and the concentrate feed. Similarities were found between the bacteria of the three gastrointestinal regions (L. ultunensis, Selenomonas bovis, Prevotella copri, Enterococcus lactis y Campylobacter sp). In the stomach predominated Helicobacter rappini and Campylobacter coli, in the small intestine Selenomonas bovis and Lactobacillus ultunensis and in the rectum (faeces) Lactobacillus ultunensis and Prevotella copri.

[ES] En este trabajo se ha llevado a cabo un estudio del microbioma bacteriano de los biofilms presentes en las tuberías del sistema de distribución de agua potable de Valencia mediante la aplicación de metagenómica de secuenciación dirigida. Para ello, se tomaron 25 muestras de biofilms. Tras su secuenciación y posterior análisis bioinformático se determinó que los filos bacterianos más abundantes fueron Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria y Bacteroidetes. A nivel de género se observó que las muestras eran muy heterogéneas entre sí. Pese a esto, los géneros más abundantes en el promedio total de las muestras fueron Bacillus, Ralstonia, Desulfovibrio y Methylocystis. Además, se determinó la presencia de géneros bacterianos potencialmente patógenos, tales como Helicobacter, Pseudomonas o Legionella, y de bacterias con una posible implicación en los procesos de corrosión como Sulfuricella, Hyphomicrobium o Methylobacterium. En este estudio no se ha establecido una relación directa entre la microbiota y el material de las tuberías donde se encontraban estos biofilms, siendo necesario analizar un mayor número de muestras para establecer dicha relación., [EN] In this work, a study of the bacterial microbiome of biofilms present in the drinking water distribution system pipes of Valencia has been carried out using amplicon-based metagenomics. To do this, 25 biofilm samples were processed. Once the sequencing process and the subsequent bioinformatics analysis were carried out, it was determined that the most abundant bacterial Phyla were Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Bacteroidetes. At the gender level, samples were found to be very heterogeneous. Despite this, the most abundant genera in the average of the samples were Bacillus, Ralstonia, Desulfovibrio and Methylocystis. Moreover, the presence of potentially pathogenic bacteria genera, such as Helicobacter, Pseudomonas or Legionella, and bacteria with possible involvement in corrosion processes such as Sulfuricella, Hyphomicrobium or Methylobacterium was found out. This study has not established a direct relationship between the microbiota and pipes¿ materials where these biofilms were found, making it necessary to analyze a greater number of samples to establish such a relationship, Gracias al Ajuntament de València por su colaboración y apoyo en todas las iniciativas tecnológicas de la empresa gestora del abastecimiento. Gracias a todas las compañeras y compañeros del equipo de Operaciones de Emivasa por su colaboración en este proyecto. Sin ellos no habría sido posible la extracción del biofilm.

Metagenomic studies aim to reconstruct the structure of microbial communities through the use of DNA sequence data of complex composition. To this end, they generally embed multidimensional data into low dimensional spaces followed by a binning process. The performance of the dimensionality reduction techniques, the clustering methods, and the internal cluster validity indices vary depending on the biological, statistical and computational features that are part of the metagenomic analysis, yet it is seldom evaluated systematically. The explained problematic was explored through an unsupervised binning of metagenomic DNA sequences, based on the Subtractive and Fuzzy c-means algorithms applied to the two- and three-dimensional metagenomic sequences obtained via the Barnes-Hut t-Stochastic Neighbor Embedding (BH-SNE) algorithm in conjunction with Principal Component Analysis (PCA), with the aim of assessing the performance of the BH-SNE including and not including a preliminary PCA, besides the assessment of four Internal Cluster Validity Indices (ICVI) that conditioned the clustering procedure. In addition, the assessment of the ICVIs demonstrated that the Silhouette index had the best performances based on the median values of the F measure. Moreover, Silhouette index was also the most consistent index obtaining the highest values of F median in two- and three-dimensional treatments. In the case of high AAI ranges, the Silhouette index had equal results compared with Calinski-Harabasz index in terms of highest values of F median in three-dimensional treatment, although there were differences between their performance in two-dimensional treatments. In particular, Dunn index generated the worst performances in the low AAI percentages, while the Davies-Bouldin index was the worst in high AAI percentages. Additionally, the Dunn and Davies-Bouldin indices were the most consistent generating the lowest F median values. Moreover, the results of this research suggest that the biology of the metagenomic sequences could have an incidence over the best ICVIs performances. Finally, it was possible to determine that the highest F median values were obtained by the ICVIs in 3D embeddings, with equal results for BH-SNE including and not including preliminary PCA. Furthermore, it was also demonstrated that there was no significance between the results that included or not included a preliminary PCA. In terms of consistency, it was not possible to determine which was the most consistent treatment (2D or 3D embedding with BH-SNE including and not including preliminary PCA) that led the ICVIs to obtaining the best and worst F median results.

Resumen Objetivo. La finalidad de esta revisión es abarcar la temática relacionada con los genes de resistencia a antibióticos, sus orígenes, reservorios y movimientos en los diferentes hábitats mediante la metagenómica funcional que permite aislar, identificar y analizar estos genes, así como el impacto que tienen en salud pública. Durante los últimos años se ha visto un gran avance en la microbiología, una de las grandes limitaciones a las que se venían enfrentado los microbiólogos era no poder acceder a la totalidad de los microorganismos que habitan el planeta. Gracias al desarrollo de diferentes disciplinas como la metagenómica se ha logrado tener el acceso a estos microorganismos. Metodología. La importancia de la metagenómica en la resistencia microbiana radica en que, actualmente, solo el 1 % de los microorganismos que habitan el suelo pueden ser estudiados por técnicas convencionales de microbiología, quedando alrededor del 99 % de estos sin estudiar. Al mitigar este gran inconveniente, la metagenómica permite el estudio de la microbiota del suelo en su totalidad generando nuevo conocimiento e información relevante en diferentes campos científicos. Resultados. Mediante la metagenómica funcional se ha podido determinar que el suelo puede ser un posible reservorio de determinantes de resistencia microbiana, debido a que la microbiota que allí habita contiene en su material genético genes de resistencia a antibióticos que confieren resistencia a un amplio espectro de antibióticos utilizados en terapia humana de forma indiscriminada y además tienen todos los mecanismos de resistencia conocidos, algunos de estos genes son generados por presión selectiva ante diferentes agentes presentes en su medio y otros son genes constitutivos que cumplen con funciones significativas en su hábitat. El gran impacto que tienen estos hallazgos está dado en que pueden representar un posible riesgo en salud pública si se adquieren por los patógenos humanos. Abstract Objective. The purpose of this review is to cover the issues related to antibiotic resistance genes, their origins, reservoirs and movements in different habitats through functional metagenomics that allows to isolate, identify and analyze these genes, as well as the impact they have on health public. During the last years a great advance in the microbiology has been seen, one of the great limitations to which the microbiologists had been facing was not being able to have access to the totality of the microorganisms that inhabit the planet. Thanks to the development of different disciplines such as metagenomics, access to these microorganisms has been achieved. Method. The importance of metagenomics in microbial resistance lies in the fact that currently only 1 % of the microorganisms that inhabit the soil can be studied by conventional microbiology techniques, leaving about 99 % of these without studying, the metagenomics by mitigating this great disadvantage allows the study of the soil microbiota in its entirety generating new knowledge and relevant information in different scientific fields. Results. Through functional metagenomics it has been possible to determine that the soil can be a possible reservoir of determinants of microbial resistance, because the microbiota that live there contain in their genetic material antibiotic resistance genes that confer resistance to a broad spectrum of antibiotics used in human therapy indiscriminately and also have all known mechanisms of resistance, some of these genes are generated by selective pressure against different agents present in their environment and others are constitutive genes that fulfill significant functions in their habitat. The great impact of these findings is that they can represent a possible public health risk if they were acquired by human pathogens.

The last past two decades, there has been a tremendous expansion in the discovery and description of novel insect- specific viruses (ISVs). This has corresponded with progresses in metagenomic analyses for virus revealing and the increasing attention in insect microbiomes. Plentiful of the new ISVs seem to be members of the family Flaviviridae, genus Flavivirus, and are usual in insect populations in wildlife, with a global geographic circulation., En las últimas dos décadas, ha habido una gran expansión en el descubrimiento y la descripción de nuevos virus específicos de insectos (ISV). Esto se ha correspondido con los avances en los análisis metagenómicos para la revelación de virus y la creciente atención en microbiomas de insectos. Muchos de los nuevos ISV parecen ser miembros de la familia Flaviviridae, género Flavivirus, y son habituales en poblaciones de insectos en la vida silvestre, con una circulación geográfica global.

Megaplatypus mutatus es una especie nativa de Sudamérica que pertenece al grupo de los “coleópteros de la ambrosia”. Dicho grupo de organismos presenta asociaciones simbióticas, muchas de ellas mutualistas, con comunidades fúngicas. Debido al amplio rango de plantas susceptibles, la capacidad de atacar árboles vivos y los daños que ocasiona, M. mutatus está considerado una importante plaga forestal. Afecta principalmente a plantaciones comerciales frutícola-forestales, a nivel nacional e internacional. En Argentina, el principal daño económico se registra en las plantaciones forestales del género Populus (Álamo). Esta tesis está focalizada en el estudio de la interacción M. mutatus-Fungi, y sus objetivos fueron: i) Caracterizar la comunidad fúngica asociada a M. mutatus en Populus deltoides, mediante técnicas de cultivo dependiente e independiente; ii) Determinar la especificidad de la interacción micobiota-M. mutatus y el modo en que se establece dicha interacción; iii) Reconocer los organismos fúngicos clave para el establecimiento de M. mutatus; iv) Caracterizar la galería como microhábitat de la comunidad fúngica, estudiar su topología y posibles factores abióticos que modulan su desarrollo; v) Caracterizar los compuestos volátiles orgánicos, emitidos por organismos fúngicos seleccionados de la micobiota asociada a M. mutatus; y vi) Detectar y evaluar potenciales antagonistas fúngicos de los organismos estudiados en el objetivo iii. La caracterización de la comunidad fúngica se realizó utilizando distintas metodologías de aislamiento fúngico y aplicando diferentes aproximaciones; se estudiaron caracteres morfológicos, caracteres moleculares a partir de cultivos axénicos o muestras ambientales (estudios metagenómicos), caracteres fisiológicos mediante el estudio de los compuestos volátiles emitidos por especies fúngicas seleccionadas, y la caracterización del microhábitat representado por las galerías generadas por los insectos, analizando alguno de los factores implicados en su desarrollo, mediante imágenes de resonancia magnética y tomografía computada. Se evaluaron dos plantaciones de Populus deltoides y una plantación de Casuarina cunninghamiana. La comparación de las comunidades descriptas indica que las especies de los géneros Candida, Fusarium, Graphium y Raffaelea poseerían un rol clave en la interacción; en algunos casos con vías diferenciales de vectorización. Se identificaron un total de 72 compuestos volátiles y se evaluó el rol de los mismos a través de bioensayos de olfatometría. Se describieron diferentes topologías de galerías. Integrando la información obtenida se evaluaron posibles antagonistas fúngicos y se seleccionó una cepa, nativa del sistema, del género Trichoderma como agente de biocontrol, obteniendo resultados positivos para todos los casos evaluados. Los resultados obtenidos indican la existencia de una gran diversidad fúngica con diferentes roles ecológicos en la interacción, los cuales deben ser considerados como posibles puntos ¨blanco¨ en el diseño de estrategias que involucren el manejo integrado de la plaga forestal. Megaplatypus mutatus is a native species from South America that belongs to the group called ¨ambrosia beetles¨. This group of organisms has symbiotic associations, many of them mutualistic with fungal communities. Due to the wide range of susceptible plants, the ability to attack living trees and the damage it causes, M. mutatus is considered an important forest pest. It mainly affects commercial fruit and forest plantations, at national and international level. In Argentina, the main economic damage is registered in Populus (Poplar) plantations. This thesis is focused on the study of M. mutatus-Fungi interaction, and its objectives were: i) To characterize the fungal community associated with M. mutatus in Populus deltoides using both culture-dependent and independent approaches; ii) To determine the specificity of the interaction mycobiota-M. mutatus and the way in which this interaction is established; iii) To recognize key fungal organisms for the establishment of M. mutatus; iv) To characterize the gallery as the fungal community`s microhabitat, to study the topology of the gallery and analyse the abiotic factors that modulate its development; v) To characterize the organic volatile compounds of selected fungal organisms from the mycobiota associated with M. mutatus; vi) To detect and evaluate potential fungal antagonists of the organisms studied in objective iii. The characterization of the fungal community was carried out using different methodologies of fungal isolation and applying different approaches; morphological characters, molecular analyses from axenic cultures or environmental samples (metagenomic studies), physiological characters were analysed by studying the volatile organic compounds emitted by selected fungal species and the characterization of the microhabitat represented by the galleries generated by the insects, analysing some of the factors involved in their development, by means of magnetic resonance imaging and computed tomography. Two plantations of Populus deltoides and a plantation of Casuarina cunninghamiana were evaluated. The comparison of the described communities indicates that the species of the genera Candida, Fusarium, Graphium and Raffaelea would play a key role in the interaction; in some cases with differential pathways of vectorization. A total of 72 volatile compounds were identified and their role was evaluated through olfactometry bioassays. Different topologies of galleries were described. Integrating the obtained information, possible fungal antagonists were evaluated and a strain of Trichoderma genus, native to the system, was selected as a biocontrol agent, obtaining positive results for all evaluated cases. The obtained results indicate the existence of a great fungal diversity with different ecological roles in the interaction, which should be considered as possible target points in the design of strategies that involve the integrated management of the forest pest. Fil: Ceriani Nakamurakare, Esteban Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental. Laboratorio de Micología, Fitopatología y Liquenologia; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria; Argentina

Resumen El corredor marino Isla del Coco-Galápagos, en su conjunto, constituye un santuario para la protección de especies marinas en la región oriental del Pacífico Tropical. La alta biodiversidad de macroorganismos ha sido estudiada por décadas, sin embargo, la diversidad de microorganismos del fitoplancton, que constituyen el sustento de la vida en este ecosistema, no se conoce al mismo nivel de detalle. En este trabajo utilizamos datos metagenómicos de libre acceso para examinar la diversidad funcional de proteínas y de especies microbianas presentes en seis puntos de este corredor marino. Se identificó una altísima diversidad de microorganismos que comprende 2132 géneros distribuidos en 68 filos taxonómicos (6 Archaea, 33 Eukaryota, 38 Bacteria y 1 Virus). En particular, los taxones más abundantes fueron Candidatus Pelagibacter, Prochlorococcus, Synechococcus, el Fago T4 y Pseudomonas, los cuales coexisten con una gran cantidad de organismos poco representados. Por similitud en su composición, las comunidades pelágicas y litorales pudieron agruparse, sin embargo, estadísticamente no hubo diferencias significativas entre todas las comunidades del corredor. Este trabajo resalta la importancia ecológica del fitoplancton para el ecosistema y representa una justificación adicional protección del corredor en su conjunto. Abstract The marine corridor Isla del Coco-Galápagos, as a whole, constitutes a sanctuary for the protection of marine species in the eastern region of the Tropical Pacific. The high biodiversity of macroorganisms has been studied for decades, however, the diversity of phytoplankton microorganisms, which constitute the sustenance of life in this ecosystem, is not known at the same level of detail. In this work we use open access metagenomic data to examine the functional diversity of proteins and microbial species present in six points of this marine corridor. A very high diversity of microorganisms was identified, comprising 2132 genera distributed in 68 taxonomic phyla (6 Archaea, 33 Eukaryota, 38 Bacteria and 1 Virus). In particular, the most abundant taxa were Candidatus Pelagibacter, Prochlorococcus, Synechococcus, T4-like virus, and Pseudomonas, which coexist with a large number of poorly represented organisms. By similarity in their composition, the pelagic and coastal communities could be grouped, however, statistically there were no significant differences among all the communities of the corridor. This work highlights the ecological importance of microbial phytoplankton for the ecosystem, and represents an additional justification protection for the corridor as a whole.

Congreso Español sobre Cuevas Turísticas (7º. 2018. La Vall d’Uixó, Castellón). - Congreso Iberoamericano sobre Cuevas Turísticas (2º. 2018. La Vall d’Uixó, Castellón). - Texto en español con resumen y palabras claves en español e inglés., En este estudio se ha llevado a cabo el análisis de la diversidad microbiana presente en muestras de agua tomadas en la Cova des Pas de Vallgornera, situada en la zona sur de la isla de Mallorca y desarrollada en una plataforma carbonática arrecifal del Mioceno superior (Messiniense). El muestreo se realizó en la Galería “d’en Pau” ubicada en el centro del sistema endokárstico y a unos 2 km de boca de entrada, donde se tomaron muestras de gotas de agua de percolación, de los gours y de agua freática de acuífero en galerías semisumergidas. El estudio de la diversidad microbiana se realizó a partir de una aproximación metagenómica, que básicamente se trata de la secuenciación del ADN extraído de forma global de las muestras y que refleja la composición de los genomas y genes de los organismos mayoritarios. Se observó que las muestras que pertenecen al flujo de agua de percolación y los gours presentan una menor diversidad y comparten un mayor número de grupos taxonómicos que el agua procedente de las galerías Freáticas. Además, la metagenómica permitió la reconstrucción de los genomas microbianos (denominados MAGs) de las poblaciones más abundantes y permitió realizar estudios filogenéticos y hacer predicciones de su función metabólica a partir de la anotación de los genes detectados. De un total de 14 MAGs recuperados de las muestras de agua de percolación y los gours, los más abundantes se asociaron al género Acinetobacter, a la familia Sphingomonadaceae y a la clase Gammaproteobacteria. Los primeros, que serían los genomas más abundantes en estas muestras, y que tal vez conformarían dos especies distintas, se han asociado a procesos de biomineralización contribuyendo a la formación de estructuras calcáreas. Además, se obtuvieron MAGs casi completos de arqueas de la familia Nitrosophaeraceae y Nitrosopumilaceae, cuyo metabolismo quimiolitoautótrofo y oxidador de amonio podría ser responsable de parte de la producción primaria del sistema. Por otra parte, las muestras de agua freática presentaron una mayor diversidad y en la cual se reconstruyeron un total de 29 MAGs. Los mayoritarios se afiliaron a la familia Comamonadaceae y Nitrospiraceae y tres adicionales se afiliaron al dominio Arquea, como Candidatus Nitrosoarchaeum (el más abundante de las muestras) y Nitrososphaera del filo Thaumarchaeota, indicando también que en estos sistemas la producción primaria puede ser por oxidación de amonio como en las anteriores muestras = In the current study was analyzed the microbial diversity from the Cova des Pas de Vallgornera located in the southeast coast of Mallorca Island, which was developed in an arrecifal carbonate platform of the Upper Miocene (Messiniense). The samples were taken in “d’en Pau” gallery placed in the center of the endokarstic system and from 2 km of the entrance. There were taken samples from drip-water falling from speleothems, water from gours and phreatic lakes in semi-submerged galleries. The microbial diversity was evaluated by a metagenomic approach, which basically consisted on the sequencing of the total DNA extracted from the sample. Metagenomes mirrors the genomic composition and genes functions from the more abundant microbial populations. Drip-water and gours samples showed a lower diversity and shared a major number of taxonomic units than the sample related to phreatic lakes. Moreover, the metagenomes allowed the binning of the Metagenomes Assembly Genomes (called MAGs) from the most abundant populations and allowed perform phylogenetic studies and predict the metabolic function from the annotated genes. From a total of 14 MAGs recovered form drip-water samples and gours, the most abundant were associated to Acinetobacter genus, Sphingomonadaceae family and the class Gammaproteobacteria. Members of the genus Acinetobacter represented by 2 different species, has been associated to bio-mineralization processes contributing to calcareous structures formation. Additionally, related to Archaea domain, was recovered MAGs associated to the family Nitrosophaeraceae and Nitrosopumilaceae, whose chemolithoauthotroph and ammonia-oxidizing metabolism could be linked to part of the primary production in the cave. On the other hand, samples from phreatic lakes showed the higher diversity and it was possible to recover 29 MAGs. The most abundant MAGs were affiliated to the family Comamonadaceae and Nitrospiraceae. Additionally, 3 MAGs were affiliated to Archaea domain: Candidatus Nitrosoarchaeum, and Nitrososphaera of the phylum Thaumarchaeota, also indicating that in these systems the primary production can be associated by ammonia-oxidizing microorganisms as in the other samples., Instituto Mediterráneo de Estudios Avanzados, España, Unidad de Baleares, Instituto Geológico y Minero de España, España, Instituto Geológico y Minero de España, España

El sistema de barros activados es uno de los modelos más estudiados en ecología microbiana. En las últimas décadas se han realizado grandes avances en el conocimiento de la composición de las complejas poblaciones microbianas participantes en dicho proceso. Si bien se ha visto que las variables ambientales y operativas son factores críticos en la estructuración de las comunidades bacterianas, aún son escasos los estudios sobre los diferentes niveles tróficos presentes en el sistema. El objetivo de este trabajo es comprender la influencia de factores bióticos y abióticos en la estructura y dinámica de los diferentes niveles tróficos de comunidades microbianas de un sistema de tratamiento de efluentes cloacales. Para ello, se estudiaron los tres niveles tróficos principales de los barros activados: bacterias, eucariotas y bacteriófagos, en una planta de tratamiento de efluentes domiciliarios de Buenos Aires. El período evaluado comprendió tres años en los que la planta operó bajo un gradiente creciente de tiempo de residencia de sólidos (TRS) y atravesó una etapa de fluctuaciones operacionales. Los microorganismos eucariotas se analizaron por microscopía mientras que la composición bacteriana se estudió por secuenciación de amplicones de la región hipervariable V3-V4 del gen ARNr 16S y secuenciación al azar sobre el ADN metagenómico. La presencia y abundancia de bacteriófagos se siguió por secuenciación al azar del ADN presente en el sobrenadante (metaviroma). Luego del co-ensamblado de los 60 metagenomas, de la serie temporal, se utilizó una metodología de binning basada principalmente en cobertura diferencial con la que se reconstruyeron 257 genomas. Los perfiles de co-ocurrencia de especies bacterianas resultaron altamente dependientes del régimen operativo, donde el período de fluctuaciones y de bajo TRS, fue dominado por filos mayormente compuestos por estrategas-r (copiótrofos); contrastando con el período de alto TRS, en el que predominaron los estrategas-K (oligótrofos). La partición de poblaciones bacterianas en base a diferencias en las estrategias de crecimiento fue confirmada por la determinación del número de operones ARN ribosomales (rrn) estimados a partir de los genomas ensamblados. Por su parte, el índice biótico de barros (SBI), basado en la abundancia y diversidad de protozoos, correlacionó positivamente con la abundancia total de bacterias oligotróficas, apoyando el uso del SBI como indicador para el control de calidad del tratamiento y reflejando la modulación por depredadores eucariotas. Finalmente, los cambios en la composición de fagos reflejaron un patrón similar al revelado por las poblaciones bacterianas. La reducción en la abundancia relativa de virus de la familia Podoviridae y el correspondiente aumento en Siphoviridae que acompañan el aumento en TRS es consistente con el hecho de que los Podoviridae infectan principalmente Proteobacteria, mientras que sifovirus pueden ser lisogénicos por varias generaciones, un comportamiento que ha sido asimilado a estrategas K. Las interacciones entre los fagos y las poblaciones bacterianas, detectadas a través de la búsqueda de elementos CRISPR y por similitud de secuencias, permitieron la identificación de mecanismos de interacción tipo Lotka-Volterra depredador-presa, así como de modelos alternativos de interacciones múltiples, en los que un fago infecta a más de un hospedero y/o un hospedero es infectado por más de un tipo de fago. Se concluye que los parámetros de proceso determinan la composición de poblaciones bacterianas en base a sus estrategias de crecimiento, mientras que sobre esta estructuración, determinada por factores abióticos, se superpone una modulación fina mediada por depredadores. Activated sludge system is one of the most studied models in microbial ecology. In the last decades, large progress has been made in the knowledge of the composition of these complex microbial populations. Although it has been seen that environmental and operative variables are critical factors on the bacterial community structuring, there are still few studies regarding to different trophic levels in this system. The aim of this work is to understand the influence of biotic and abiotic factors on the structure and dynamics of different trophic levels of microbial communities of a sewage treatment system. For this, the three main trophic levels in activated sludge: bacteria, eukaryotes and phages, were studied in a wastewater treatment plant of Buenos Aires. The evaluated period comprise three years in which the plant operates under an increasing gradient of sludge retention time (SRT) and went through a stage of operational fluctuations. Eukaryotic organisms were analyzed by microscopy while bacterial composition was studied by amplicon sequencing of the 16S rRNA gene V3-V4 hypervariable region and metagenomic DNA shotgun sequencing. Phages presence and abundance were followed by shotgun sequencing of DNA present in the supernatant (metavirome). After co-assembling the 60 metagenomes, from the time series, we applied a binning methodology, based mainly on the differential coverage, from which 257 genomes were reconstructed. The co-ocurrence profiles of bacterial species resulted highly dependent on the operational regime, where the disturbed period with low SRT was dominated for phyla mostly composed of r-strategist (copiotrophs); contrasting with the high SRT period, where K-strategist (oligotrophs) predominated. The separation of bacterial populations based on differences in their growth strategies was confirmed by determining the ribosomal RNA (rrn) operon number, estimated from the assembled genomes. Meanwhile, the sludge biotic index (SBI), based on protozoa abundance and diversity, correlated positively with total abundance of oligotroph bacteria, supporting the use of the SBI as an indicator of treatment quality control and displaying a modulation by Eukaryotic predators. Finally, changes in phage composition showed a similar pattern than observed in bacterial populations. Reduction of the relative abundance of Podoviridae family viruses and the corresponding increase on Siphoviridae along with the increase on SRT is consistent with the fact that Podoviridae mainly infect Proteobacteria, while siphoviruses could be lysogenic for several generations, a feature assimilated to K-strategists. Phage-bacteria interactions, detected by searching for CRISPR elements and sequence homologies, allowed to identify prey-predator interactions mechanisms type Lotka-Volterra, as well as multiple interactions alternative models, in which a phage infects more than one host and/or a host is infected by more than one type of phage. We conclude that bacterial population composition based on their growth strategies is determined by process parameters, while this structuring, determined by abiotic factors, is superposed by a fine modulation mediated by predators. Fil: Pérez, María Victoria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Se han evidenciado cambios en la composición de la microbiota fecal en pacientes con CU en actividad frente a sanos, pero no queda claramente establecido si los cambios disbióticos son secundarios a la enfermedad o por el contrario pueden jugar cierto papel en la fisiopatología de la inflamación intestinal. La literatura es controvertida con respecto a si estos cambios se mantienen en períodos de remisión de la enfermedad. La primera parte de esta tesis trata de establecer si los cambios disbióticos desaparecen durante los periodos de remisión y la estabilidad de la microbiota se restituye completamente. Para ello se estudia una población de sujetos incluidos en el estudio METAHIT, compuesto por pacientes con colitis ulcerosa en remisión con alta tasa de brotes, baja tasa de brotes, familiares emparentados y voluntarios sanos. Bajo la hipótesis de que en la colitis ulcerosa hay una disbiosis intestinal permanente que puede demostrarse durante los periodos de remisión de la enfermedad, comparamos la composición de la microbiota fecal de pacientes con CU en remisión con la de personas sanas empleando técnicas de secuenciación de alto rendimiento. Apreciamos que existe una gradación en cuanto a riqueza genética entre pacientes con CU en remisión, familiares emparentados y voluntarios sanos. La segunda parte de esta tesis, trata de establecer si los cambios que tienen lugar en la microbiota de pacientes con colitis ulcerosa, se deben a un mayor tránsito colónico (efecto de lavado por aceleración del tránsito intestinal). Para ello se analiza si la preparación de limpieza colónica con PEG produce cambios permanentes en la composición de la microbiota intestinal de individuos sanos y pacientes con colitis ulcerosa en remisión mediante la aplicación de técnicas de secuenciación del gen 16S rRNA. Los resultados indican que tras la administración del PEG se produce una pérdida en la diversidad de la microbiota que tiende a recuperarse a los 2 meses., There have been described changes in fecal microbiota composition in patients with UC with inflammatory activity versus healthy individual, but it is not clear whether the dysbiotic changes are secondary to the disease itself or, on the contrary, may play a role in the pathophysiology of intestinal inflammation. The literature is controversial as to whether these changes are maintained during remission periods. The first part of this thesis tries to establish whether the dysbiotic changes disappear during the remission periods and the stability of the microbiota is completely restored. For this purpose, a population of subjects included in the METAHIT study, composed with patients with ulcerative colitis in remission with high outbreak rate, low outbreak rate, related relatives and healthy volunteers are studied. Under the hypothesis that ulcerative colitis has permanent intestinal dysbiosis changes that can be demonstrated during periods of remission, we compare the fecal microbiota composition of UC patients in remission with that of healthy individuals using high throughput sequencing techniques. We appreciate that there is a gradation in bacterial gene count among patients with CU in remission, related relatives and healthy volunteers. The second part of this thesis, tries to establish if the fecal dysbiosis are due to a greater colonic transit. To this purpose, it is analyzed whether the colonic cleansing with PEG induces permanent changes in the composition of the intestinal microbiota of healthy individuals and patients with ulcerative colitis in remission, through the application of 16S rRNA gene sequencing techniques. The results indicate that after the administration of the PEG there is a loss in the diversity of the microbiota that tends to recover at 2 months.

El establecimiento de organismos sobre superficies vivas (epibiosis), es un fenómeno importante en el ambiente marino. Las bacterias epífitas intervienen en diversos procesos relacionados con la morfología y defensa de su hospedero macroalgal. Por su parte las macroalgas producen polisacáridos, que son asimilados por las bacterias epífitas mediante la síntesis de enzimas. Este trabajo tuvo como propósito estudiar la comunidad de bacterias epífitas de Ulva lactuca presentes en el litoral rocoso de la Punta de la Loma, la cual hasta la fecha no había sido descrita. Para tal fin se empleó una aproximación metagenómica, complementada con el estudio de bacterias cultivables aisladas de la superficie de U.lactuca, para en primer lugar describir la comunidad de bacterias epífitas y en segunda instancia, evaluar su potencial en la síntesis de enzimas marinas. En cuanto a la descripción de la comunidad de bacterias epífitas, los resultados mostraron que el género Vibrio es de los constituyentes cultivables más abundantes en la superficie macroalgal. Por otro lado, los análisis de rarefacción indicaron que los muestreos realizados durante tres años (2014-2016), representaron la diversidad de bacterias epífitas. Al comparar entre años, se observó que en el 2016 ocurrió un aumento de la abundancia de algunas familias, lo que podría explicarse por la ocurrencia del fenómeno de El Niño, que afectó la región de Santa Marta en el periodo de estudio. Con respecto a los niveles taxonómicos superiores, los grupos fueron similares a los de otras regiones del mundo. Sin embargo; las diferencias encontradas a nivel de familia y género, apoyan la teoría de Burke y colaboradores (2011), que propone la no existencia de una comunidad “core” de bacterias epífitas de U. lactuca. En lo referente a la búsqueda de enzimas, la evaluación del componente cultivable de bacterias aisladas de superficies macroalgales, reveló que el 56% de los aislamientos presentaron actividad enzimática, además de producir sideróforos. Por otro lado la construcción y tamizaje de una librería metagenómica, permitió la obtención de una esterasa expresada en E. coli LMG194, la cual se caracterizó por presentar propiedades de termoestabilidad exhibiendo la mayor actividad a 60°C, en condiciones de pH 8 y a una concentración de cloruro de sodio de 1 mol L-1. Estos resultados demuestran el potencial de las bacterias epífitas de U. lactuca como una nueva fuente de enzimas de origen marino. Abstract. The establishment of organisms on living surfaces (epibiosis) is an important phenomenon in the marine environment. Epiphytic bacteria participate in several processes related to the morphology and defense of their macroalgal host. Macroalgae produce polysaccharides, which are assimilated by epiphytic bacteria through the synthesis of enzymes. This work aimed to study the community of epiphytic bacteria from Ulva lactuca present in the rocky coast of Punta de la Loma, which to date had not been described. To this end, a metagenomic approach was used, complemented by the study of cultivable bacteria isolated from the surface of U.lactuca, in order to first describe the community of epiphytic bacteria and secondly to evaluate its potential in the synthesis of marine enzymes. Regarding the description of the community of epiphytic bacteria, the results showed that the genus Vibrio is one of the most abundant cultivable constituents on the macroalgal surface. On the other hand, the rarefaction analyzes indicated that the samplings collected during three years (2014-2016), showed the diversity of epiphytic bacteria. When comparing between years, it was observed that in 2016 there was an increase in the abundance of some families, which could be explained by the occurrence of the El Niño phenomenon, which affected the Santa Marta region during the study period. With respect to higher taxonomic levels, the groups were similar to those in other regions of the world. Nevertheless; the differences found at family and genus level support the theory of Burke et al. (2011), which proposes the non-existence of a core community of U. lactuca epiphytic bacteria. Regarding the search for enzymes, the evaluation of the cultivable component of bacteria isolated from macroalgal surfaces, revealed that 56% of the isolates had enzymatic activity, besides producing siderophores. On the other hand, the construction and screening of a metagenomic library allowed the obtaining of an esterase expressed in E. coli LMG194, which has thermostability properties exhibiting the highest activity at 60 °C, pH 8 and sodium chloride concentration of 1 mol L-1 . These results demonstrate the potential epiphytic bacteria from U. lactuca as a new source of marine-derived enzymes. Doctorado

El presente trabajo tuvo como objetivo la bioprospección de ADN metagenómico derivado de comunidades microbianas asociadas a un agroecosistema de importancia nacional. Este análisis permitió realizar la producción, expresión, purificación y caracterización de una enzima novedosa con actividad esterasa. Esta enzima, denominada LipM, había sido previamente identificada en clones metagenómicos derivados de suelos dedicados al cultivo de papa criolla (Solanum pureja), mediante secuencia de nueva generación y análisis bioinformáticos. La secuencia codificante de la enzima fue clonada en el vector pBADgiii y expresada en E. coli como sistema de expresión, lo que permitió optimizar el proceso de producción recombinante y su posterior purificación. Funcionalmente la enzima presentó una mayor afinidad por sustratos de p-nitrofenil con ácidos grasos de cadena corta (

We are in the midst of the fastest growing revolution in molecular biology, perhaps in all of life science, and it appears to be speeding up. We still know very little about the vast diversity of micro-organisms, their metabolic pathways and microbial activity in natural environments. Modern genomic tools are providing deep access to natural microbial diversity and ecology. Interdisciplinary approaches will be required to fully understand microbial ecology by: (1) analysis of genomes, transcriptomes, proteomes and metabolomes and (2) analysis at various levels of individuals, populations, communities and ecosystems. Data gathered is not only theoretical. It holds the promise of practical applications in the control of infectious diseases, in the production of biotechnology goods and services and in environmental remediation. It is an incredibly exciting time in science for the newer generation of scientists, “loaded” with opportunities. It is an excellent time to develop and apply tools to solve problems of local and global importance. DOI: http://dx.doi.org/10.5377/encuentro.v0i93.914 Encuentro No. 93, 117-125, 2012

El presente trabajo tuvo como objetivo la bioprospección de ADN metagenómico derivado de comunidades microbianas asociadas a un agroecosistema de importancia nacional. Este análisis permitió realizar la producción, expresión, purificación y caracterización de una enzima novedosa con actividad esterasa. Esta enzima, denominada LipM, había sido previamente identificada en clones metagenómicos derivados de suelos dedicados al cultivo de papa criolla (Solanum pureja), mediante secuencia de nueva generación y análisis bioinformáticos. La secuencia codificante de la enzima fue clonada en el vector pBADgiii y expresada en E. coli como sistema de expresión, lo que permitió optimizar el proceso de producción recombinante y su posterior purificación.Funcionalmente la enzima presentó una mayor afinidad por sustratos de p-nitrofenil con ácidos grasos de cadena corta (C8). LipM mostró completa funcionalidad a temperaturas entre 30 – 37 ºC y en valores de pH cercanos al fisiológico (entre 7.0 y 8.0). Igualmente, esta enzima exhibió buena estabilidad en presencia de varios iones metálicos, inhibidores y 0.1% (p/v) de SDS. Su alto nivel de estabilidad en presencia de iones metálicos e inhibidores, así como su particular especificidad en cuanto a sustratos, la hacen una enzima óptima para utilización en diferentes aplicaciones biotecnológicas.Palabras clave: metagenómica, enzima esterasa, caracterización, suelos, Lipasa/esterasa The present work had as a main objective to bioprospect metagenomic DNA from microbial communities associated with an agro-ecosystem of national importance. This analysis allowed the production, expression, purification and characterization of a novel enzyme with esterase activity. This enzyme, named here as LipM, was previously identified in metagenomic clones derived from soils dedicated to creole potato (Solanum pureja) crops by means of next-generation sequencing and bioinformatics analyses. The coding sequence of the enzyme was cloned into pBADgiii vector and expressed in E. coli as an expression system, allowing to optimize its recombinant production process and its further purification.The enzyme functionally showed a greater affinity for p-nitrophenyl substrates with short-chain fatty acids (C8). LipM showed full functionality at temperatures between 30 - 37°C and close to physiological pH (between 7.0 and 8.0). This enzyme also exhibited proper stability in the presence of various metal ions, inhibitors and at 0.1% (w/v) of SDS. Its high level of stability in the presence of inhibitors, metal ions and its particular specificity of substrates make it optimal for use in various biotechnology applications.Key words: Metagenomics; esterase enzyme; characterization; soil; lipase/esterase.

[ES] Gracias al desarrollo de las tecnologías, los campos dentro de la Bioinformática se ven favorecidos al aumentar la cantidad de datos experimentales con los que pueden trabajar. El problema aparece cuando se intenta manejar y analizar dichos datos de una manera eficiente. Se cree que con herramientas capaces de visualizar dichos datos, se puede llegar a facilitar dicho trabajo aunque necesite de la intervención del factor humano. En este trabajo, nos centramos en el desarrollo de una herramienta capaz de visualizar datos experimentales del campo particular de la Metagenómica mediante el uso de grafos., [CA] Gràcies al desenvolupament de les tecnologies, els camps dins de la Bioinformàtica es veuen afavorits en augmentar la quantitat de dades experimentals amb els que poden treballar. El problema apareix quan s’intenta gestionar i analitzar aquestes dades d’una manera eficient. Es creu que amb eines capaces de visualitzar aquestes dades, es pot arribar a facilitar aquesta feina encara que necessite de la intervenció del factor humà. En aquest treball, ens centrem en el desenvolupament d’una eina capaç de visualitzar dades experimentals del camp particular de la Metagenòmica mitjançant l’ús de grafs., [EN] Improvements in technology have favoured research fields in Bioinformatics, by increasing the amount of experimental data that researchers can handle. Difficulties arise while trying to compare and analyze the data in an efficient way. It is thought that the usage of data visualization tools may ease these tasks, even though the interevention of a person is still going to be needed. This project is focused in the particular field of Metagenomics, and consists in the development of a visualization tool capable of representing data with the usage of graphs.

La microbiota oral es uno de los ecosistemas microbianos más antiguos en ser reconocido, y su descripción inicia en 1863 cuando Anton van Leeuwenhoek observa por primera vez en el microscopio a estos microorganismos en placas dentales. En la actualidad, las técnicas de secuenciación y el análisis del genoma a gran escala ha permitido construir bases de datos genómicas, realizar linajes microbianos específicos y conocer que no solamente hacen parte de la microbiota oral humana unos 600 o 700 taxones, sino que se estima que el número de filotipos podrían estar en alrededor de 19000. Todo este conocimiento es una herramienta valiosa para la identificación correcta de las bacterias que están involucradas en complejas biopelículas orales y nos facilitaría así comprender su potencial genético. Además, nos permitiría entender y dilucidar mejor la patología oral, y conocer si los cambios que predisponen a la enfermedad ocurren primero en el huésped o por el contrario a nivel microbiano. En conclusión, el estudio del metagenoma de la microbiota no solo de la cavidad oral es clave para la creación de herramientas diagnósticas y terapéuticas que repercutirán en la calidad de vida de los pacientes. Esta revisión pone en contexto lo que se ha publicado en los últimos años en este tema. The oral microbiota is one of the oldest microbial ecosystems recognized. The oral microbiota description began in 1863 when Anton van Leeuwenhoek observed, using the microscope, microorganisms in dental plaque. Recently, DNA sequencing and genome analysis have allowed researchers to build large-scale genomic databases, characterize specific microbial lineages, and discover that the human oral microbiota is compose by approximately 600 to 700 taxa and 19000 phylotypes. All this knowledge is a valuable tool for the precise identification of the bacteria that are involved in complex oral biofilms. In addition, the characterization of oral microbiota will allow us to understand different oral pathologies, and to know whether changes that predispose to a disease, occur first in the host or conversely at the microbial level. In conclusion, the study of the metagenome of the oral cavity microbiota is key to develop new diagnostic and therapeutic tools that will improve the quality of the patients life. This review puts into context what has been published in recent years on this subject.

[ES] Los objetivos principales del trabajo son analizar la población bacteriana presente en muestras ambientales de biofilms y comparar los resultados obtenidos mediante tres técnicas: secuenciación de metagenomas completos antes del cultivo, búsqueda activa de las regiones del 16S en estos metagenomas y secuenciación de regiones específicas del 16S rDNA. La parte experimental del proyecto consistirá en el análisis individual de las colonias crecidas en cultivo, empleando extracción del material genético, amplificación de las regiones hipervariables V1-V4 del 16S rDNA con cebadores universales, purificación de los amplicones, secuenciación mediante la técnica Sanger y análisis de las secuencias, apoyándose en herramientas bioinformáticas y bases de datos fundamentadas en el DNA ribosomal. Se compararán las especies bacterianas detectadas mediante cada enfoque, así como su abundancia relativa, identificando las variaciones y señalando posibles razones de los sesgos encontrados., [EN] The main purposes of this study are to characterize the bacterial community present in environmental samples of biofilms and compare the results obtained using three different approaches: metagenomics without prior culturing using NGS technologies, active search of 16S ARNr regions within the metagenomes obtained and sequencing of specific regions of the 16S rRNA from colonies grown in culture. The analyzed samples were obtained in natural springs in the region of Alcoy (Alicante, Spain) and they show epidemiological interest due to the known endemism of the pathogenic bacteria Legionella pneumophila in this area. The experimental workflow of the project involved the analysis of individual colonies grown on GVPC medium using DNA extraction, amplification of the V1-V4 hypervariable regions with universal 16S rRNA primers, amplicons purification, Sanger sequencing and sequence analysis, using bioinformatic tools and databases focused on the ribosomal RNA. This methodology allowed assigning most sequences to the genus level, but the resolution was not enough for the accurate identification of species, except for a low number of the colonies. According to the 16S sequencing, the bacterial community studied is made up of 3 phyla, 6 classes, 13 orders, 19 families and 26 genera. Within the main phyla, the community was found to be dominated by Proteobacteria, with a relative abundance greater than 80 %, especially the Gammaproteobacteria class, representing 70 % of the total population. Regarding the order and family levels, Aeromonadales and Aeromonadaceae stood out, respectively, both with a relative abundance greater than 50 %. At the genus level, the abundance of Aeromonas (53'61 %) was remarkable, pointing out the possibility that the culture medium used (GVPC) somehow improves their growth. About the presence of pathogens, the genus Legionella was not detected despite its endemism in the area. Nevertheless, it was found a surprisingly high percentage of pathogenic related genera. In the comparison between the community characterized according to the regions of 16S rRNA and the distribution obtained with the metagenomic approach by NGS only minor similarities or just at general levels were found, but at the genus level the results were very different. According to the data generated from the 16S sequences retrieved from the metagenomes, no strong correlation was found. Differences and biases are likely due to the sample size (in the 16S study only a fraction of the community was analyzed), the step of culturing on GVPC medium and the databases in which each approach rely.

[ES] El uso de antibióticos y antimicrobianos tan expandido es uno de los factores que propia la aparición de microorganismos multirresistentes, entre los que se incluyen diversas clases de patógenos. En este proyecto hemos investigado la existencia de genes de resistencia a antibióticos utilizando como modelo de estudio la microbiota intestinal de ejemplares recién capturados de cucaracha de la especie Blattella germanica, conocida como “Cucharacha alemana”. Por un lado, hemos comprobado la existencia de resistencias mediante técnicas habituales en los trabajos de microbiología para el cultivo de bacterias, concretamente mediante el aislamiento de las colonias resistentes que crecen en medio con una cierta concentración de antibiótico, utilizando antibióticos que se emplean en el tratamiento de importantes patologías humanas. Por otro lado, hemos empleado técnicas de secuenciación masiva nos ha demostrado una gran variedad de posibles resistencias, entre las que se encuentran las determinadas anteriormente mediante las técnicas de cultivo. Por los modos de acción tenemos un amplio espectro tanto de mecanismos de resistencia como de antibióticos a los que las bacterias no son sensibles. Algunas de las resistencias encontradas se encuentran diseminadas en gran variedad de especies de microorganismos, entre ellos muchos patógenos., [EN] The expanded usage of antibiotic and antimicrobials is one of the main causes of the appearance of multirresistent organisms, including different pathogenic strains. In this project we have researched the existence of antibiotic resistance genes in the intestinal flora of newly captured specimens of Blattella germanica, commonly known as “German cockroach”. During the essay we have proceeded by the usual techniques employed in Microbiology for bacterial culture, isolating these resistant colonies which are capable of growing in a medium with a certain concentration of antibiotic. These are antibiotics which are habitually used for the treatment of important human pathologies. At the same time, high-throughput sequencing has been used to check up on the existence of resistance genes which ended up on finding a great variety of possible resistances. Among those there are also the ones that were found with the culture techniques. Looking at the modes of action we have an extended spectrum of both resistance mechanisms as antibiotics to which the bacteria are not sensitive. Some of the resistance encountered are scattered in a great variety of microorganisms, including many pathogens.

La microbiota humana es inmensamente diversa y varía dependiendo del nicho biológico que ocupa; factores como elambiente, dieta, etnia y edad contribuyen con la diversidad microbiológica de cada sitio anatómico.

Resumen Las enfermedades periodontales son un significativo problema mundial a nivel de salud humana. Décadas de investigaciones, evidencian que en la mayoría de los casos la periodontitis crónica es la más común, caracterizada por ser de evolución lenta, con formación de bolsas periodontales, posterior reabsorción del hueso alveolar, pérdida y destrucción de piezas dentarias y tejido óseo. Si bien se reconoce el origen multifactorial en el desarrollo de la periodontitis, es relevante la participación de la microbiota subgingival en la etiología de la enfermedad periodontal. Algunas de las especies bacterianas patógenas que han sido asociadas con el desarrollo de la enfermedad periodontal son Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum, entre otras. En este estudio, nos propusimos investigar cuáles de éstas cinco especies estaban presentes en las bolsas periodontales de 51 pacientes uruguayos con periodontitis crónica. Para alcanzar éste objetivo se utilizó una técnica convencional microbiológica y metagenómica (multiplex-PCR). Los resultados de la técnica convencional microbiológica evidenciaron la presencia de A. actinomycetemcomitans (33%) y de bacterias negras pigmentadas anaerobias (100%) en las muestras. De los resultados obtenidos en la multiplex-PCR, se demostró que las especies de mayor prevalencia fueron F. nucleatum (100%), T. forsythia (92%) y P. gingivalis (88%). Por el contrario, las especies de menor prevalencia fueron P. intermedia (39%) y A. actinomycetemcomitans (33%) Abstract Periodontal diseases are a major problem in human health. Decades of research have shown that the most common disease is chronic periodontitis, characterized by a slow evolution with the formation of periodontal pockets, subsequent alveolar bone resorption, loss and destruction of teeth and bone tissue. While we know the multifactorial origin of the development of periodontitis, the participation of subgingival microbiota is relevant in the etiology of periodontal disease. Some pathogenic bacteria species that have been associated with the development of periodontal disease are Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum, among others. In this work we studied which of these five species were present in the periodontal pockets of 51 Uruguayan patients with chronic periodontitis. To achieve the results a conventional microbiological technique and metagenomics (multiplex-PCR) were used. The results of the microbiological conventional technique showed the presence of A. actinomycetemcomitans (33%) and black pigmented anaerobic bacteria (100%) in the samples. From the results obtained in the multiplex-PCR we saw that the most prevalent species were F. nucleatum (100%), T. forsythia (92%) and P. gingivalis (88%). In contrast, lower prevalence species were P. intermedia (39%) and A. actinomycetecomitans (33%)

Las Enzimas lipolíticas son carboxil-ester-hidrolasas que rompen los enlaces éster de acilglicéridos mediante la adición de una molécula de agua, dando lugar a ácidos grasos libres y glicerol. Las lipasas se han convertido en uno de los principales biocatalizadores o bioaceleradores con potencial uso bioindustrial y su uso comercial es un negocio multimillonario que comprende una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo la producción de biodiesel, especialidades farmacéuticas, agroquímicos, cosméticos y detergentes entre otros. Como parte de los trabajos que adelanta el Centro Colombiano de Genómica y Bioinformática de Ambientes Extremos GeBiX, relacionados con la exploración metagenómica en el Parque Nacional Natural los Nevados PNN,, en este trabajo de tesis doctoral se propuso realizar la búsqueda de enzimas lipolíticas a través del tamizaje funcional de una biblioteca metagenómica de suelo de bosque alto andino ipara la búsqueda de enzimas lipolíticas. La asignación taxonómica y funcional de las secuencias metagenómicas, reveló que se encuentran relacionadas con secuencias genómicas de bacterias pertenecientes a los phylum Actinobacteria, Proteobacteria y Acidobacteria y en su gran mayoría están comprometidas con el metabolismo de carbohidratos, proteínas, lípidos y con funciones catalíticas como fosfatasa, deshidrogenasa, metiltransferasa y epóxido hidrolasa entre otras. El tamizaje funcional de los 20.000 clones en medio con tributirina, permitió identificar dos clones positivos con base en la formación de halo de hidrólisis alrededor de las colonias. Los clones nombrados como BAA3G2 y BAA3C3 fueron recuperados, el DNA plasmídico extraido y el inserto metagenómico secuenciado. En los dos casos se logró identificar un marco abierto de lectura (ORF) relacionado con la actividad lipolítica. Las enzimas producidas por los dos clones, EstGBX1 y EstGBX2, tienen preferencia por ácidos grasos de cadena corta (C2 y C4) y actividad máxima de 0.142 U / mg a 40 ° C y pH 8.0, y 6,97 U/mg a 60°C y pH 7.0 respectivamente. El análisis filogenético sugiere que las proteínas expresadas por los dos clones, pertenecen a una nueva familia, relacionada con las familias VI y VII de enzimas lipolíticas. Las propiedades bioquímicas de la enzima EstGBX1 y su estructura tridimensional, sugieren que se trata de una enzima novedosa con potencial uso industrial. Los hallazgos derivados de este trabajo, indican que la exploración de ambientes extremos a través del tamizaje funcional de bibliotecas metagenómicas, representa una buena opción para la bioprospección de ecosistemas naturales. Lipolytic enzymes are carboxyl ester hydrolases that break acylglycerides ester bonds through the addition of a water molecule resulting in a free fatty acids and glycerol. Lipases have become in a major biocatalysts with bio-industrial potential. Their commercial use is a multimillion-dollar business that includes a wide variety of applications such as synthesis of biopolymers and biodiesel, the production of pharmaceuticals, agrochemicals and detergents among others. As part of the work done by the Colombian Center for Genomics and Bioinformatics of Extreme Environments GeBix, related to metagenomic exploration at the Nevados National Natural Park PNN, in this doctoral thesis it was proposed the construction and functional screening of a metagenomic library from high andean forest soil, to search for lipolytic enzymes. The Taxonomic and functional assignment of metagenomic sequences present in 1% of the clones revealed that are related with genomic sequences from bacteria belonging to the phylums Actinobacteria, Proteobacteria and Acidobacteria. The vast majority of these sequences are involved with the metabolism of carbohydrates, proteins, lipids and catalytic functions as phosphatase, glycosyltransferase, dehydrogenase, methyltransferase, and epoxide hydrolase dehydratase among others. After functional screening of 20,000 clones, using tributiryn as lipid substrate, two positive clones were identified, based on the formation of hydrolysis halo around the colonies. The clones designated as BAA3G2 and BAA3C3 were recovered, plasmid DNA extracted and the metagenomic inserts sequenced. The size of the inserts was determined at 4.5 and 4.9 Kb respectively and in both cases, it was possible to identify an open reading frame (ORF) related to lipolytic activity. Enzymes produced by the two clones, EstGBX2 EstGBX1, have a preference for short-chain fatty acids (C2 and C4) and maximum activity of 0142 U / mg at 40 ° C at pH 8.0, and 6.97 U / mg at 60 ° C at pH 7.0 respectively. Phylogenetic analysis of the putative lipolytic enzymes from clones BAA3C3 and BAA3G2, suggests that the expressed proteins belongs to a new family of lipolytic enzymes, related to families VI and VII. The biochemical properties of EstGBX1 and its predicted 3D structure, suggest that it is a novel enzyme with potential industrial use. Findings from this study indicate that exploration of extreme environments through the functional screening of metagenomic libraries, irepresents a good choice for bioprospecting of natural ecosystems. Doctor en Ciencias Biológicas Doctorado

El arsénico, como metaloide carcinogénico, de alto riesgo para la salud humana y el medio ambiente, ha incrementado su concentración en varios ecosistemas de la Sabana de Bogotá, especialmente en la cuenca media del Río Bogotá. La alta utilización de pesticidas en los terrenos hortícolas, así como la descarga de aguas de desecho industrial y doméstico han generado condiciones in situ de resistencia y adaptación microbiana a la presión de selección natural de varios contaminantes, metales pesados y metaloides. En este trabajo se realizó una búsqueda de genes involucrados en la resistencia a arsénico, presentes en las comunidades bacterianas endémicas de distintos ambientes de la Sabana de Bogotá, mediante un enfoque metagenómico. Se construyó una librería metagenómica de aproximadamente 50.000 clones a partir de muestras de suelos y sedimentos de la Sabana de Bogotá. Mediante un tamizaje que empleó arsenato como agente de selección, se logró la identificación de 11 clones de resistencia a altas concentraciones de arsénico y se identificaron genes reportados del operón ars, que están involucrados en la reducción de este metaloide. Abstract. Arsenic, as a human and environmental hazardous agent, has raised its concentration in many ecosystems of the Bogota Savannah, especially in the middle basin of the Bogota River. The constant utilization of pesticides in farmlands, together with the discharge of domestic and industrial sewage, has contributed to the generation of in situ processes of microbial resistance and adaptation to those contaminants, including heavy metals and metalloids. A search of arsenic resistance genes present in bacterial endemic communities of distinct ecosystems from the Bogota Savannah was conducted using a metagenomic approach. A soil and sediment based library of about 50.000 clones was performed. An arsenate based functional screening allowed the identification of 11 clones resistant to high arsenic concentrations. Its genomic sequences revealed known genes related to arsenic operon system ars which are involved in arsenic reduction processes. Maestría