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Los hongos entomopatógenos (HEs) son efectivos agentes de control biológico de especies fitófagas —causantes de pérdidas de rendimiento y calidad de los cultivos. Estudios recientes destacan nuevos caracteres funcionales en la ecología de los HEs: endófitos de plantas vasculares, antagonistas frente a patógenos, promotores del crecimiento y mejoradores nutricionales de la planta huésped. No obstante, la mayoría de los estudios previos se han realizado en condiciones controladas, minimizando los factores ambientales que pueden condicionar su comportamiento. En esta tesis, dos HEs, Beauveria bassiana (cepa EABb 04/01–Tip) y Metarhizium brunneum (cepa 01/58-Su), caracterizados por su uso en prácticas de biocontrol, se inocularon en trigo cultivado en suelos naturales no estériles, a fin de observar sus efectos en el crecimiento, rendimiento y nutrición de la planta. Se evaluó en primer lugar el comportamiento de trigo duro y blando cultivado en dos vertisoles calcáreos tras la aplicación de B. bassiana y M. brunneum usando diferente metodología —aplicación directa de la suspensión fúngica al suelo o revestimiento de la semilla—, en condiciones de laboratorio y usando suelos no estériles. Ambos hongos demostraron ser competentes en la rizosfera, persistentes en el suelo a lo largo de todo el cultivo y colonizadores de trigo duro y blando. En el cultivo de trigo blando se incrementó la biomasa aérea en un 17.4% con B. bassiana aplicada a la semilla y un 20.6 y 26.9% con la aplicación de M. brunneum al suelo y a la semilla, respectivamente, a los 69 días después de la siembra. En el trigo duro, la aplicación de B. bassiana y M. brunneum directamente al suelo disminuyó leve pero significativamente la biomasa aérea en cosecha (5.3% y 6.1%, respectivamente) y el rendimiento en grano (6.6% y 5.5%, respectivamente), mientras que la aplicación a la semilla de ambos hongos incrementó hasta en un 4.3% y 2.9% la biomasa aérea en cosecha y rendimiento de grano, respectivamente. En trigo blando no se vieron diferencias significativas de rendimiento a pesar de que este llegó a incrementarse con la aplicación de B. bassiana a la semilla hasta en un 10.5% respecto al control. La aplicación al suelo de ambos HEs y la aplicación a semilla de B. bassiana incrementó la absorción y la concentración de Mn en el grano de trigo duro. Metarhizium brunneum incrementó significativamente la cantidad de Zn en el trigo blando cultivado en el suelo con los valores de Zn más bajos. Finalmente, la concentración de Zn en grano estuvo inversamente relacionada con la producción de este. En el siguiente experimento en cámara de cultivo se examinó como afectan las propiedades edáficas al rendimiento del trigo duro inoculado con B. bassiana y M. brunneum —aplicación a la semilla— y cultivado en 12 suelos agrícolas. Las plantas fueron fertilizadas con todos los nutrientes excepto P y Zn. Las plantas inoculadas con B. bassiana tuvieron mayor rendimiento en grano e índice de cosecha (17% y 14%, respectivamente), mientras que en las tratadas con M. brunneum el aumento no fue significativo (6% y 6%, respectivamente). El incremento en el rendimiento en grano del trigo inoculado con B. bassiana estaba positiva y significativamente correlacionado con los niveles de P disponible del suelo y en el del inoculado con M. brunneun con el contenido de óxidos de Fe poco cristalinos. Además, el incremento en la biomasa aérea de las plantas inoculadas con B. bassiana respecto al control estaba inversa y significativamente correlacionado con los niveles de Zn disponible en el suelo. Se observó también un efecto dilución (disminución de la concentración en grano por un incremento en el rendimiento) para P y Zn. Sin embargo, se incrementó la removilización de Zn al grano y el contenido total de Zn en el mismo con el tratamiento de B. bassiana. Finalmente, en dos campos de la Campiña de Córdoba —y durante 2 campañas sucesivas (2015- 2017)— se examinó el comportamiento y efecto de las dos cepas de HEs sobre trigo duro cultivado en vertisoles calcáreos pobres en Zn. Los hongos se aplicaron directamente al suelo (campaña 2015– 2016) o por revestimiento de la semilla (campaña 2016–2017). La persistencia de ambos hongos en el suelo durante la primera campaña fue relativamente baja. El re–aislamiento de M. brunneum en plantas de trigo fue del 16.6% y 4.1% con la aplicación al suelo y a la semilla, respectivamente, mientras que B. bassiana fue re–aislada únicamente tras la aplicación a la semilla (16.6%). La diferencia en la producción de grano entre la primera y segunda campaña (~1 frente a ~4 t ha-1, respectivamente) se debió en esencia a la mayor precipitación en la segunda. Ambos hongos incrementaron la biomasa aérea en 5 de los 7 muestreos realizados antes del espigado en el periodo de estudio, 3 de los cuales con P < 0.10 con ambos hongos y 2 con P < 0.05 con B. bassiana. Además, el tratamiento con B. bassiana incrementó significativamente la longitud radicular y el área superficial en las raíces más finas con ambos métodos de aplicación, mientras que la longitud radicular y el área superficial total de la raíz lo hizo únicamente con la aplicación al suelo. El rendimiento final del cultivo no se vio significativamente afectado por ningún HE ni por la forma de aplicación. Finalmente, M. brunneum incrementó la concentración de P y Na en grano con la aplicación al suelo mientras que B. bassiana aplicada a la semilla disminuyó la vitrosidad del grano. En esta tesis, las cepas de HEs, Beauveria bassiana EABb 04/01–Tip y Metarhizium brunneum 01/58- Su han demostrado, en resumen, su potencialidad como biofertilizantes y bioestimulantes, pero condicionadas a factores ambientales y métodos de aplicación que deben de tenerse presentes antes de la inoculación. Entomopathogenic fungi (EF) are effective biocontrol agents against phytophagous species, which can severely impair crop quality and yield. Recent studies have revealed new traits in EF ecology and exposed previously unknown roles as vascular plant endophytes, pathogen antagonists, growth promoters and nutritional enhancers for host plants. However, most of the studies uncovering the new roles were performed under controlled conditions and hence with a minimal influence of environmental factors. In this doctoral work, the entomopathogenic fungal strains Beauveria bassiana EABb 04/01–Tip and Metarhizium brunneum 01/58-Su, which are typically used for biocontrol purposes, were inoculated on wheat grown in non-sterilised natural soils in order to examine their effects on plant growth, yield and nutrition. Experiments involved assessing the performance of durum and bread wheat grown in two calcareous Vertisols under the effect of B. bassiana and M. brunneum directly applied to the soil or used for seed dressing, and also under growth chamber conditions and on nonsterilised soils. Both fungi proved rhizosphere-competent, persistent in soil throughout the crop cycle and effective colonizers of the two wheat species. Seed dressing with B. bassiana increased aerial dry matter (ADM) 69 days after sowing (DAS) in bread wheat by 17.4%; on the other hand, application to soil and seed dressing with M. brunneum increased this variable by 20.6 and 26.9%, respectively. By contrast, direct application of B. bassiana and M. brunneum to the soil slightly but significantly decreased ADM at harvest in durum wheat by 5.3 and 6.1%, respectively, and grain yield by 6.6 and 5.5%, respectively. On the other hand, seed dressing of either fungus increased ADM and grain yield by 4.3 and 2.9%, respectively. Bread wheat exhibited no significant differences in grain yield despite its levels with B. bassiana seed dressing being up to 10.5% higher than with the Control treatment (no fungus added). Application to soil of either fungus, and seed dressing with B. bassiana, increased Mn absorption and grain concentration in durum wheat. Metarhizium brunneum significantly increased the Zn content of bread wheat grown in the soil with the lowest available Zn levels. Finally, Zn grain concentration was inversely correlated with yield. A growth chamber was used to examine the effects of edaphic properties on performance in durum wheat seed-dressed with B. bassiana or M. brunneum and grown on 12 different agricultural soils. Plants were supplied with all nutrients except P and Zn. Fungal inoculation increased grain yield and harvest index significantly with B. bassiana (17 and 14%, respectively), but not with M. brunneum (6 and 6%, respectively). The increase in grain yield was positive and significantly correlated with soil available phosphorus in plants inoculated with B. bassiana, and also with soil content in poorly crystalline Fe oxides in those inoculated with M. brunneum. The increase in ADM resulting from inoculation with B. bassiana was negatively correlated with soil available Zn. There was also a dilution effect (viz., grain nutrient concentrations were decreased by effect of an increased grain yield) for P and Zn. However, inoculation with B. bassiana increased Zn remobilization and plant Zn uptake. In an additional experiment, two experimental fields in the countryside Cordoba, southern Spain, were used to examine the behaviour and effects of the two EF on durum wheat grown on Zn-poor calcareous Vertisols over two consecutive seasons (2015–2017). The fungi were either directly applied to the soil (2015–2016 season) or used for seed dressing (2016–2017 season). Fungal persistence of both species in the soil was low in the first season. Re-isolation of M. brunneum within wheat plants was 16.6% with soil application and 4.1% with seed dressing. On the other hand, re-isolation of B. bassiana within durum wheat was only observed with seed dressing and amounted to 16.6%. The difference in grain yield between the first and second season (~1 t ha–1 vs 4 t ha–1) was basically a result of increased precipitation in the second. Both fungi increased ADM in 5 of the 7 samplings conducted before the wheat heading stage for the period of study (3 of them significantly at P < 0.10 with both fungi and 2 at P < 0.05 with B. bassiana). Additionally, B. bassiana increased root length and root surface area in the finest roots with both application methods, and application of this fungus to soil significantly increased total root length and root surface area at the stem elongation stage. Grain yield was significantly affected by neither fungus nor application method. Finally, M. brunneum increased P and Na grain nutrient concentrations, whereas B. bassiana applied by seed dressing decreased grain vitrosity. In summary, the EF strains Beauveria bassiana EABb 04/01–Tip and Metarhizium brunneum 01/58-Su can be effective biofertilizers and bioestimulants provided the potential effects of environmental factors and application method are assessed before inoculation.

La evolución de la agricultura hacia un modelo más sostenible requiere reemplazar progresivamente los insecticidas químicos de síntesis por otras alternativas de control de plagas de insectos más respetuosas con el medioambiente y el ser humano, para garantizar la seguridad e inocuidad alimentarias. El control microbiano de plagas es una de estas alternativas, y dentro de los microorganismos entomopatógenos, los hongos entomopatógenos (HE), por su presencia natural y modo de acción por contacto, presentan un gran potencial para el control de varios grupos de insectos de gran relevancia agrícola, como los fitomizos, y muy en particular los pulgones. Durante el siglo XXI, se han puesto de manifiesto distintas asociaciones de los HE con las plantas con nuevas funciones ecológicas, en la rizosfera, en el filoplano, y como endófitos, que han ampliado las posibilidades de su empleo para el control de plagas, y de forma más amplia, en producción vegetal. Sin embargo, permanecen desconocidos los posibles efectos directos e indirectos de la colonización endofítica de las plantas por los HE no sólo sobre el insecto hospedante, sino sobre las señales químicas producidas por las plantas, y, por tanto, sobre las relaciones insecto fitófago-planta o incluso en las de los insectos fitófagos con sus enemigos naturales En la presente tesis doctoral se ha estudiado el efecto de la colonización endofítica de plantas de melón por cepas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuil. y Metarhizium brunneum Petch, tanto sobre la biología del “pulgón del algodón” Aphis gossypii Glover, (Homoptera: Aphididae), importante plaga polífaga de cultivos hortícolas, como sobre su comportamiento alimenticio y capacidad de transmitir virus persistentes y no persistentes, y además, el impacto de esta colonización sobre las señales químicas producidas por la planta y las relaciones del pulgón con sus enemigos naturales entomófagos, para su posible empleo en estrategias de control integrado del áfido. El capítulo II pone de manifiesto que la cepa EABb 01/33-Su de B. bassiana reduce significativamente la población de A. gossypii tanto cuando los especímenes se alimentan a expensas de hojas pulverizadas y colonizadas, como cuando lo hacen a expensas de hojas colonizadas distantes de las pulverizadas, mientras que las cepas EABb 04/01-Tip de B. bassiana y EAMa 01/58-Su de M. brunneum solo redujeron la población en la primera circunstancia (aunque a un nivel de significación del 10% también en la segunda). La eficacia como endófita de la cepa EABb 01/33-Su para manifestar su máxima virulencia en tejidos distantes a los tratados en plantas de melón ha hecho que fuera seleccionada para ser utilizada a lo largo de los experimentos llevados a cabo en los capítulos III y IV. En este capítulo además, se destaca una falta de efecto de la colonización endófitica de plantas de melón con las tres cepas seleccionadas sobre fecundidad total per capita de los pulgones 5 días después de la exposición, aunque se detecta una modificación en el comportamiento reproductivo de los pulgones que se alimentan a expensas de plantas colonizadas, que, con respecto a los especímenes sanos, aceleran su actividad reproductiva para alcanzar con anterioridad su máximo potencial biótico. En este capítulo, se describen en primicia diferencias cualitativas y cuantitativas en el perfil de compuestos volátiles liberados por las plantas colonizadas endofíticamente e infestadas posteriormente por A. gossypii en comparación con los compuestos que emiten las plantas testigo. Sin embargo, la colonización endofítica de plantas por AMEs no influye en su elección por parte de los pulgones. En el capítulo III se ha estudiado la influencia de la colonización endofítica sobre el comportamiento alimenticio de los pulgones y a la transmisión de virus persistentes y no persistentes. Mediante el empleo de la técnica de gráficos de penetración eléctrica (EPGs), aplicada por primera vez a pulgones que se alimentan a expensas de plantas colonizadas con hongos entomopatógenos, ha sido posible detectar la actividad del estilete del insecto y relacionarla con los procesos de transmisión de virus en plantas de melón colonizadas con la cepa EABb 01/33-Su de B. bassiana. Los resultados revelan que dicha colonización no afecta al comportamiento alimenticio de A. gossypii asociado a la inoculación del Cucumovirus no persistente, Cucumber mosaic virus (CMV), y al Polerovirus persistente Cucurbit aphid-borne yellows virus, pero modifica algunas relacionadas con el proceso de adquisición de virus no persistentes, posiblemente asociadas con alteraciones en el comportamiento alimenticio del pulgón debidas a un mesófilo con estructuras fúngicas o los metabolitos secretados por ellas o incluso por la activación de las defensas de la planta. Además, los ensayos de transmisión llevados a cabo revelan que la incidencia de los dos virus estudiados se ve significativamente reducida cuando las plantas se encuentran colonizadas endofíticamente con la cepa EABb 01/33-Su de B. bassiana antes de producirse su infestación con pulgones virulíferos, lo que posiblemente se debe a la inducción de resistencia sistémica consecuencia de la colonización de la planta por el hongo. Finalmente, en el capítulo IV se determina el efecto de la colonización endofítica de los AMEs sobre las relaciones tritróficas de los pulgones, no solo con las plantas colonizadas, sino con los enemigos naturales entomófagos de A. gossypii, el depredador generalista Chrysoperla carnea (Stephens) (Coleoptera: Chrysopidae) y el parasitoide de pulgones Aphidius colemani (Dalman) (Hymenoptera: Braconidae), cuando estos depredan o parasitan a pulgones que se alimentan a expensas de ellas. La cantidad de hembras ápteras de A. gossypii consumidas por C. carnea, así como el tiempo de consumo, no se vieron afectadas significativamente tras su exposición directa a una suspensión de conidios de la cepa EABb 01/33-Su, en comparación con lo observado con los pulgones testigo. Sin embargo, las crisopas no consumieron por completo los pulgones con indicios de infección fúngica, como posible mecanismo de seguridad por parte del neuróptero. Además, se ha demostrado que no existe un efecto sobre la eficacia depredadora de C. carnea cuando se alimenta de pulgones que se habían alimentado previamente de plantas de melón colonizadas endofíticamente con B. bassiana, aunque se detecta una tendencia a una reducción en el consumo de presas y un incremento en el tiempo de consumo en comparación con el control. Sin embargo, los resultados obtenidos en los ensayos de elección muestran una preferencia significativa de las crisopas por los pulgones de A. gossypii que se alimentan de plantas de melón colonizadas con la cepa EABb 01/33-Su, con respecto a las plantas testigo, lo que podría estar relacionado con los resultados del capítulo II, ya que algunos de los compuestos detectados en las plantas que se encontraban colonizadas endofíticamente podrían afectar al comportamiento de los insectos actuando como atrayentes. En cuanto al efecto sobre parasitoides, no se han observado diferencias significativas en el número de momias de A. colemani formadas, porcentaje de emergencia y ratio sexual de los adultos emergidos cuando las hembras ápteras de su insecto hospedante A. gossypii se encontraban alimentándose en hojas de melón colonizadas endofíticamente con la cepa EABb 01/33-Su en comparación con el testigo, lo que finalmente refuerza el empleo de hongos entomopatógenos en combinación con otros enemigos naturales como depredadores y parasitoides en programas de control integrado de pulgones. Esta tesis sienta las bases del empleo de hongos entomopatógenos endófitos para el control de pulgones, no solo por el efecto directo de los propágulos fúngicos sobre los áfidos, sino también por los efectos directos e indirectos sobre los mismos que acarrea la colonización endofítica de las plantas por las cepas fúngicas. Además, la tesis ilustra las ventajas de la estrategia, no solo por extender su eficacia a la capacidad de los pulgones para transmitir virus, sino por su compatibilidad en control integrado con entomófagos, parasitoides y depredadores. Agricultural sustainability requires progressively replacing synthetic chemical insecticides by more environmentally friendly pest control measures in order to guarantee food safety and food security. Microbial control is one of these alternatives, and among entomopathogenic microorganisms, entomopathogenic fungi (EF), due to their natural presence and mode of action by contact, show high potential for the control of several groups of insects of great agricultural relevance, such as sapsucking insects, especially aphids. During the 21st century, different associations of the EF with the plants in the rhizosphere, in the phylloplane, and as endophytes, have been discovered, new ecological roles that have expanded the possibilities of their use for pest management, and more broadly, in crop production. However, research on the direct and indirect effects of the endophytic colonization of the crop by EF is needed, with emphasis in the effect of such colonization on the plant semiochemical composition and tritrophic relationships between the insect pest and the crop and between the insect pest and its natural enemies. In this thesis, the effect of the endophytic colonization of melon plants by two strains of Beauveria bassiana (Balsamo) Vuil and one of Metarhizium brunneum Petch, has been studied on both the fitness of the "cotton aphid" Aphis gossypii Glover, (Homoptera: Aphididae), a key pest of horticultural crops, as well as on its feeding behavior and ability to transmit persistent and non-persistent viruses. In addition, the present research focuses on the impact of this colonization on the chemical signals produced by the plant and on the relationships between the aphid and its natural entomophagous enemies for the development of IPM strategies. Hence, in chapter II, it is shown that B. bassiana EABb 01/33-Su strain significantly reduces the population of A. gossypii both when the specimens were fed on sprayed and endophytically colonized leaves (SCL), and when they fed only on nonsprayed colonized leaves (NSCL), distant from the sprayed ones. Meanwhile, strains EABb 04/01-Tip of B. bassiana and EAMa 01/58-Su of M. brunneum only reduced the aphid population when fed on SCL leaves, whereas feeding on NSCL also causes a significant reduction of the aphid population at a significance level of 0.1 (10%). Strain EABb 01/33-Su was shown to have the better endophytic behavior and therefore it was selected to be used throughout the experiments carried out in chapters III and IV. In Chapter II, it is also revealed a lack of effect of the endophytic colonization of melon plants with the three selected strains on total per capita fecundity of the aphids 5 days after the exposure, whereas aphids that feed on colonized plants advanced their average onset of nymph laying. Finally, in chapter II, qualitative and quantitative differences in the blend of volatile compounds released by endophytically colonized plants and subsequently infested by A. gossypii in comparison with the compounds emitted by control plants have been detected. Noteworthy, endophytic colonization of melon plants by the selected fungal strains did not modify aphid choice. In chapter III, the influence of melon endophytic colonization on the aphid feeding behavior and the transmission of persistent and non-persistent viruses has been studied. By using the electrical penetration graph (EPGs) technique, applied for the first time to aphids that feed on plants colonized with entomopathogenic fungi, it has been possible to detect the activity of the insect's stylet and relate it to the transmission processes of viruses in melon plants colonized with the B. bassiana strain EABb 01/33-Su. Melon endophytic colonization did not affect the feeding behavior of A. gossypii associated with the inoculation of the non-persistent Cucumovirus, Cucumber mosaic virus (CMV), and the persistent Polerovirus Cucurbit aphid-borne yellows virus, but modified the acquisition process of nonpersistent viruses, which could be related to modifications of the feeding behavior of the aphid due to presence of fungal propagules or fungal metabolites in the mesophyll. In addition, the transmission bioassays carried out revealed that the incidence of the two target viruses was significantly reduced when the plants were endophytically colonized by the B. bassiana strain EABb 01/33-Su. Finally, in chapter IV, the effect of melon endophytic colonization by EABb 01/33-Su strain on the tritrophic interaction of A. gossypii with the crop and with their natural enemies, the generalist predator Chrysoperla carnea (Stephens) (Coleoptera: Chrysopidae) and the aphid parasitoid Aphidius colemani (Dalman) (Hymenoptera: Braconidae), was investigated. The number of apterous females of A. gossypii consumed by C. carnea, as well as the time of consumption, were not significantly affected by direct exposure to a conidial EABb 01/33-Su suspension as compared with the controls. Noteworthy, the lacewings did not completely consume the aphids with signs of fungal infection, as a possible safety mechanism developed by the predator. In addition, it has been shown the lack of a significant effect of endophytic colonization of the aphid hos plant, melon, on the predatory efficacy of C. carnea, whereas a trend towards a prey consumption decrease and consumption time increase was detected in comparison with the controls. Interestingly, the choice experiments revealed a significant preference of lacewings for aphids that fed on EABb 01/33-Su colonized melon plants, which could be related to the overproduction of certain semiochemicals elicited by endophytic colonization with known predator attractant potential. In addition, no significant differences were observed in the number of mummies of A. colemani formed, percentage of emergence and sexual ratio of the emerged adults when the insect host A. gossypii fed on EABb 01/33-Su endophytically melon leaves, which strengthen the potential of the simultaneous use of EF and predators and parasitoids in A. gossypii IPM. On the overall, the results of this thesis support the development of mycoinsecticides for aphid control due to the direct effect of fungal spray on the aphid population, but also due to direct and indirect effects related to the endophytic colonization of the plant by the fungal biocontrol agent, with emphasis in the reduction of the aphid virus-transmission potential. In addition, the results of the thesis highlight the compatibility of endophytic EF with parasitoids and predators.

La agricultura ha provisto de alimentos al ser humano desde su origen, pero en el último siglo, la producción agraria se ha intensificado gracias, entre otros, al empleo de insecticidas. Sin embargo, esta intensificación no ha estado exenta de problemas de contaminación por residuos en los alimentos o de efectos negativos sobre la biodiversidad y el medioambiente. La legislación agraria actual promueve una agricultura acorde con la creciente preocupación de los consumidores por la salud y por el medioambiente. En este escenario, el desarrollo de estrategias ambientalmente sostenibles y seguras para los consumidores se sitúa en primera línea en los programas de investigación para el control de plagas. Los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AMEs) y en particular el género Metarhizium, cumplen los requisitos de seguridad para el ser humano y el medio ambiente y además han mostrado un gran éxito en el control de plagas de insectos debido a su modo de acción por contacto, su presencia natural en diversos ecosistemas y su capacidad de secretar compuestos con actividad insecticida. No obstante, la implantación en el mercado de los micoinsecticidas es lenta, y tropieza con una barrera fundamental que es la escasa información sobre el destino de algunos metabolitos secundarios en la cadena alimentaria y su riesgo para la salud humana y animal, información clave para abordar su registro. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar y validar métodos analíticos con alta sensibilidad para su determinación a bajas concentraciones en diferentes matrices biológicas. La destruxina A es uno de los principales metabolitos secundarios producidos por el AME Metarhizium spp., pero la falta de estudios sobre su producción por parte del hongo es probablemente el mayor obstáculo para el registro de nuevas cepas de esta especie fúngica. El objetivo principal de esta tesis ha sido desarrollar nuevas herramientas para la detección y cuantificación de destruxinas, así como investigar el destino de la destruxina A en la cadena trófica. En el capítulo II de esta Tesis, se ha determinado la producción de destruxinas por parte de cuatro cepas de Metarhizium (BIPESCO5, EAMa 01/58-Su, ARSEF 23 y ART 2825) con un método mejorado de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento en tándem con espectrometría de masas (UHPLC-MS / MS) en cuatro medios de cultivo (CM, MM, CN2, OSM) que representan diferentes condiciones de estrés. Cada 3 días durante 18 días se tomaron muestras para análisis que permitieron detectar 15 destruxinas, siendo las destruxinas A y B las más abundantes. Además, se detectaron diferencias significativas entre las cepas en la producción de destruxinas, que a su vez fue altamente dependiente del medio de cultivo. En el capítulo III la colonización endofítica y la producción de destruxina A en plantas de patata se monitorizaron a las 24, 48, 72, 96 y 120 h después de la inoculación con dos cepas de Metarhizium brunneum Petch. (BIPESCO5 y EAMa 01/58-Su), lo que puso de manifiesto que la concentración de destruxina A en los tejidos vegetales es muy baja en comparación con los niveles de colonización. Aunque se observó una colonización similar para ambas cepas, hubo diferencias a lo largo de la planta, con valores más altos en las hojas a 96 h para EAMa 01/58-Su (83.3 %) y BIPESCO5 (81.6 %), y más bajos en tubérculo y raíz a las 72, 96 y 120 h después de la inoculación para ambas cepas (10.0-13.3 %). Para la cepa EAMa 01/58-Su, la destruxina A se cuantificó a las 24 h en el tubérculo y la raíz (2.0 ± 1.4 y 2.49 ± 1.7 μg / kg, respectivamente) y a las 96 h con igual concentración también en tubérculo y raíz (2.5 ± 1.7 μg /kg); para BIPESCO5, solamente se cuantificó destruxina A en el tubérculo a las 24 h y en la raíz a las 48 h (6.8 ± 4.8 y 2.1 ± 1.4 μg / kg, respectivamente). En el capítulo IV se investiga por primera vez la dinámica de crecimiento de las cepas BIPESCO5 y EAMa 01/58-Su de M. brunneum y la secreción de destruxina A durante el proceso de infección de larvas del insecto modelo Galleria mellonella L. (Lepidoptera; Pyralidae). Se observó que la secreción de destruxina A fue paralela a la evolución de la cantidad de ADN fúngico en el interior del insecto para la cepa EAMa 01/58-Su, no así para BIPESCO5. Las cepas EAMa 01/58-Su y BIPESCO5 secretaron destruxina A desde los días 2 al 6 y desde el día 2 hasta el día 5 después del tratamiento, respectivamente. Para EAMa 01/58-Su y BIPESCO5, la máxima cantidad de destruxina A producida en el insecto hospedante fue de 0.369 y 0.06 μg/larva a los 4 días del tratamiento, respectivamente, y a lo largo del proceso patogénico, la producción fue de 0.6 y 0.09 μg / larva, respectivamente. En el capítulo V se realizaron bioensayos presa-depredador para evaluar el comportamiento y la supervivencia de las larvas del depredador generalista Chrysoperla carnea (Stephens) (Neuroptera; Chrysopidae) al alimentarse con larvas insecto polífago Spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera; Noctuidae) inoculadas con las cepas BIPESCO5 y EAMa 01/58-Su. Además, se llevaron a cabo estudios ecotoxicológicos para supervisar el destino de la destruxina A en el sistema presa-depredador. La concentración máxima de destruxina A producida por la cepa BIPESCO5 fue el día 4 con un valor de 0.000054 μg/insecto (aproximadamente 0.014 μg/g) y para la cepa EAMa 01/58-Su el día 5 con 0.00012 μg/insecto (aproximadamente 0.031 μg/g), mientras que el metabolito no se detectó en larvas de C. carnea. El porcentaje de crisopas que se alimentó de larvas de S. littoralis 24 horas después de la infección fue de 96.6, 75.0 y 65.0 % para el control, EAMa 01/58-Su y BIPESCO5, respectivamente, mientras que 5 días después de la infección fue 38.3 % para control y 33.3 % en los tratamientos con las cepas EAMa 01/58-Su y BIPESCO5. La cantidad de larvas de S. littoralis consumidas por C. carnea 24 h después de la infección fue 5.6, 2.2 y 2.3 para las tratadas con el control, EAMa 01/58-Su y BIPESCO5 respectivamente, mientras que 5 días después de la infección consumió una sola larva per cápita. Esto puso de manifiesto que los tratamientos de M. brunneum contra las larvas de S. littoralis fueron seguros para C. carnea debido tanto a la ausencia de mortalidad relacionada con los hongos en el depredador como a la falta de movimiento de la destruxina A de la presa al depredador. Es importante resaltar que en los capítulos IV y V, para ambas cepas, la mortalidad de las larvas debido a otras causas fue mucho mayor que la mortalidad con crecimiento fúngico. Sin embargo, la secreción de destruxina A fue mayor para EAMa 01/58-Su que para BIPESCO5, lo que sugiere que la destruxina A podría ser un factor de virulencia de la primera, mientras que la segunda podría requerir la participación de otros factores además de destruxina A durante el proceso de infección. Los resultados obtenidos proporcionan métodos analíticos valiosos para llevar a cabo evaluaciones de riesgo sobre el empleo de AME, así como resultados que indican que su empleo supone un bajo nivel de riesgo para la salud humana, animal y medio ambiental. Agriculture produces the vast majority of the world’s food supply, and in last century the global food production has grown at a huge rate mainly from the increased yields resulting from greater inputs of insecticides and other technologies. Meanwhile overuse or improper use of insecticides and other agrochemicals has raised issues about related environment and health costs, with current legislation promoting sustainable agriculture, in which scenario, the development of environmentally sustainable strategies is mandatory for research programs regarding pest control. The entomopathogenic mitosporic ascomycetes (EMAs) and in particular the genus Metarhizium have shown great success in the control of insect pests due to their contact mode of action, natural presence in the ecosystems and their ability to secrete compounds with insecticidal activity, and even, they comply with the security requirements for human health and environment, whereas information about the fate of their secondary metabolites in the food chain and their risk to human and animal health is still scarce. There is a need to develop and validate analytical methods with high sensitivity for metabolite determination at low concentrations in different biological matrices. Destruxin A is one of the major secondary metabolite produced by the genus Metarhizium spp., but the lack of studies concerning destruxin A production is most likely the biggest obstacle for registration of new fungal strains. The main goal of this research has been to develop new tools for destruxin detection and quantification and to investigate the fate of destruxin A in the trophic chain. In chapter II, destruxin production for Metarhizium strains BIPESCO5, EAMa 01/58- Su, ARSEF 23 and ART 2825 was determined with an improved method of ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS), which has shown high precision in the detection and quantification of destruxins in four culture media (CM, MM, CN2, OSM) representing different stress conditions. Every 3 days samples were taken for analysis over 18 days that allowed detecting 15 destruxins, with destruxin A and B as the most abundant. However, significant differences among strains in destruxin production were detected, and for each strain, destruxin production was highly dependent on culture medium. In chapter III, endophytic colonisation and destruxin A production on potato plants were monitored at 24, 48, 72, 96 and 120 h after inoculation with Metarhizium brunneum strains (BIPESCO5 and EAMa 01/58-Su), which showed that the concentration of destruxin A in plant tissues was very low compared to the colonisation levels. Although a similar colonisation was observed for both strains, there were differences in percentages in different parts of the plants, with the higher values occurring in the leaves at 96 h for EAMa 01/58-Su (83.3 %) and BIPESCO5 (81.6 %), and the lower ones, 10.0-13.3 %, observed in tuber and root at 72, 96 and 120 h post-inoculation for both strains. For strain EAMa 01/58- Su, destruxin A was quantified at 24 h (2.49 ± 1.7 and 2.0 ± 1.4 μg/kg, respectively), and the same concentration was found in both tuber and root at 96 h (2.5 ± 1.7 μg/kg); for BIPESCO5, the concentrations differed in tuber at 24 h and in root at 48 h (6.8 ± 4.8 and 2.1 ± 1.4 μg/kg, respectively). In chapter IV, the dynamic of fungal growth and secretion of destruxin A by strains BIPESCO5 and EAMa 01/58-Su of Metarhizium brunneum Petch. during the infection process of larvae of the model insect Galleria mellonella L. (Lepidoptera; Pyralidae) was monitored for the first time. Data showed that destruxin A secretion was parallel to the fungal growth of EAMa 01/58-Su but not coupled with that for BIPESCO5. EAMa 01/58-Su and BIPESCO5 strains secreted destruxin A from days 2 to 6 and from day 2 to day 5 post treatment, respectively. For EAMa 01/58-Su and BIPESCO5, the maximum titer in the host on day 4 after treatment was 0.369 and 0.06 μg/larva, respectively, and throughout the pathogenic process, the production was 0.6 and 0.09 μg/larva, respectively. In chapter V, predator-prey bioassays were performed to evaluate the behavior and survival of larvae of the generalist predator Chrysoperla carnea (Stephens) (Neuroptera; Chrysopidae) when feeding on larvae of the polyphagous pest Spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera; Noctuidae) challenged by M. brunneum BIPESCO5 and EAMa 01/58-Su strains. In addition, ecotoxicological studies based on HPLC-MS were performed to monitor the fate of destruxin A in the prey-predator system. The maximum concentration of destruxin A produced by the BIPESCO5 strain was on day 4 after treatment with a value of 0.000054 μg/insect (approx 0.014 μg/g), and for EAMa 01/58-Su was on day 5 with a value of 0.00012 μg/insect (approx 0.031 μg/g), whereas the metabolite was no detected in C. carnea larvae. The percentage of lacewings feeding on S. littoralis larvae 24 hour-post infection was 96.6, 75.0, and 65.0 % for the control, EAMa 01/58-Su, and BIPESCO5 treatments, respectively, whereas 5 days-post infection armyworm larvae were consumed by only 38.3 % of the control lacewings and 33.3 % of the EAMa 01/58-Su and BIPESCO5 treatment groups. C. carnea larvae feeding on 24 h-post infection armyworm larvae preyed 5.6, 2.2 and 2.3 larvae for the control, EAMa 01/58-Su and BIPESCO5 treatments, respectively, whereas those predator larvae feeding on 5 days-post infection armyworm larvae preyed on only one per capita larva. It showed that the M. brunneum treatments against S. littoralis larvae were safe for C. carnea due to both the lack of fungus-related mortality in the predator and the lack of movement of destruxin A from the prey to the predator. Notably in chapters IV and V, in both M. brunneum strains, mortality from other causes was higher than mortality with fungal outgrowth. However, destruxin A secretion was higher for EAMa 01/58-Su than for BIPESCO5. These results suggested that destruxin A could be a virulence factor for EAMa 01/58-Su strain, whereas for BIPESCO5, the virulence could require the involvement of other factors as well as destruxin A during the infection process. The results obtained provide valuable analytical methods for carrying out risk assessments on the use of EMAs. In addition, results indicate that their use poses a little potential hazard to human and animal health and the environment.