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Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 10-09-2019, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 10-03-2021, La participación de la prolactina (PRL) en más de 300 procesos biológicos ha conllevado a que se considere a esta molécula como una hormona pleiotrópica que actúa en diversos procesos fisiológicos y patológicos. No obstante, la propia naturaleza de la PRL y el limitado número de herramientas biotecnológicas de las que se dispone para el estudio de su función, hacen complicado delimitar su contribución en muchos de estos procesos. Por lo tanto, es necesario la generación de nuevas herramientas que permitan modular la acción de la PRL y ayuden a esclarecer su participación en varios de estos escenarios biológicos, entre los que destaca la homeostasis hepática. El objetivo de este trabajo de investigación fue generar un sistema lentiviral que permitiera la modulación de la acción de la PRL y fuera útil para el estudio de su función en diferentes procesos biológicos. Así, clonamos la secuencia codificante de la PRL humana (hPRL), generamos dos de sus mutantes antagonistas y expresamos estas hormonas recombinantes en células eucariotas. Tras comprobar su correcta expresión y respectivas bioactividades, transferimos estas secuencias a vectores lentivirales (LVs) para co-expresarlas junto con la proteína verde fluorescente (GFP) a partir de un único transcrito gracias a la secuencia P2A (hPRL-P2A-GFP). Nuestros resultados mostraron que estos LVs fueron capaces de transducir y expresar de forma eficiente las hPRL recombinantes en distintos tipos celulares. Las hPRL fusionadas al P2A se secuenciaron mediante espectrometría de masas y se comprobó la bioactividad de cada una de ellas en experimentos in vitro. La expresión de los transgenes hPRL-P2A-GFP permitió identificar tanto a las células productoras de hormonas (células GFP positivas), como a las hormonas recombinantes que contienen el epítopo P2A. Además, estas proteínas recombinantes secretadas por las células transducidas fueron capaces de reproducir las acciones autocrinas y paracrinas esperables en cultivos celulares. Tras la caracterización del sistema lentiviral, nuestro siguiente objetivo fue evaluar su capacidad para transducir diferentes líneas celulares establecidas de origen hepático y hepatocitos primarios humanos ex vivo. Nuestros resultados demostraron que los hepatocitos transducidos con nuestro sistema lentiviral expresaban y procesaban correctamente las construcciones hPRL-P2A-GFP in vitro. En resumen, el sistema lentiviral descrito en este trabajo muestra unas características apropiadas para el estudio de las acciones de hPRL en diferentes procesos biológicos, siendo particularmente útil para el estudio de las acciones de la PRL en la homeostasis hepática.

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 18-11-2016, La ataxia de Friedreich (AF) es una enfermedad neurodegenerativa causada por una mutación en el gen de la frataxina (FXN), que genera una deficiencia de la proteína mitocondrial esencial frataxina (FXN). Esta enfermedad presenta un patrón de herencia autosómica recesiva y en la actualidad no se dispone de ninguna terapia efectiva para su tratamiento o cura. Recientemente, un ensayo clínico para terapia del dolor (Dr Fink, Michigan 2011) demuestra que la administración de vectores genómicos no replicativos derivados del virus del herpes simple tipo 1 (VHS-1) en los ganglios de las raíces dorsales, principal diana para terapia génica de AF, no desencadena ningún efecto adverso. Basándonos en estos resultados y en experimentos previos de nuestro laboratorio que demuestran que mediante el uso del locus genómico de FXN se consigue una expresión sostenida de FXN, nuestro objetivo es el desarrollo de una terapia génica para el tratamiento de la neuropatología de AF. El abordaje de este trabajo ha consistido en la generación y caracterización preliminar de un vector genómico no replicativo y de gran capacidad derivado del VHS-1 (vector 27_4_Or2_β22 FXNinlZ) que contiene una versión reducida del locus genómico humano de FXN: el promotor de 5 kb seguido de la secuencia del ADN complementario manteniendo el intrón 1. En este estudio se observa que: i) tras eliminar 23 kb del vector genómico no replicativo derivado del VHS-1 se mantiene su capacidad de crecimiento; ii) la versión reducida del locus FXN contiene los elementos necesarios para preservar la regulación fisiológica de la expresión de FXN humana en neuronas; iii) tras la transducción in vitro de neuronas de los ganglios de las raíces dorsales de fetos de ratas con el vector 27_4_Or2_β22 FXNinlZ, hay tanto una transcripción como una traducción sostenida de FXN. Finalmente, los experimentos in vivo demuestran que la inoculación intraplantar de nuestro vector en ratas permite la detección de la expresión de FXN humana en los ganglios de la raíces dorsales, la cual se mantiene al menos 1 mes tras la inoculación. Nuestros resultados apoyan la idea del uso de nuestro vector 27_4_Or2_β22 FXNinlZ para la expresión a largo plazo de FXN humana en el desarrollo de una futura terapia génica para el tratamiento de AF.

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 18-06-2015, Herpes simplex virus-1 (HSV-1) is one of the most common infectious agents found in humans, although only about a third of infected individuals exhibit symptoms such as cold sores and facial lesions. Its enveloped virions contain a 152 kilobases (kb) linear, double stranded (ds) DNA genome. HSV-1 replicates profusely in epithelial cells but in neurons, enters into latency, from which it can be reactivated to lytic replication by different external cues. The mechanism by which HSV-1 switches between these two life cycle modes is not known. An understanding of this will not only improve understanding of viral physiology but also enhance development of improved tools for viral vector-mediated gene therapy. During productive replication HSV-1 synthesizes approximately 75 proteins out of which five are translated immediately after infection. These are the immediate early (IE) proteins known as ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 and ICP47 (ICP = infected cell protein). ICP0 is the first translated viral product and possesses multiple functions for the efficient progression of productive lytic infection. This thesis aimed to contribute to the understanding of the HSV-1 lytic-latent transition by testing if artificial control over ICP0 transcription can be used to regulate HSV-1 replication. The ICP0 gene is duplicated in the HSV-1 genome; the internal repeat (IR) and terminal repeat (TR) regions each encode one copy. In the present study, I removed one copy of ICP0 by deleting the IR region after which components of the Tetracycline-inducible system were inserted into the remaining copy to impose artificial transcriptional control of the gene. The IR-deleted mutant constructed using BAC technology confirms that the IR deletion does not affect viral replication in Vero cells. My results also indicate that the remaining copy of the ICP0 gene in TR becomes a critical determinant of productive infection when a second gene in this repeat, that of ICP34.5, is additionally deleted. My study further investigates the ability to regulate viral replication through the consensus TAATGARAT element which has a key role in ICP0 promoter function and reports that distal displacement of the TAATGARAT element away from its natural position diminishes immediate-early ICP0 expression but results in surprisingly high late protein accumulation, altered protein cleavage and cytoplasmic translocation, all of which result in impaired viral growth. These defects could be reduced by repositioning the TAATGARAT motif to decrease the displacement but not by binding of tetracycline-responsive regulators to the artificially inserted tetO sites. The results further suggest that the HSV-1 proteins ICP0 and ICP4 can interfere with the tetracycline-responsive system and thereby disrupt the regulation. The study in this thesis supports the role of ICP0 as a critical switch component in HSV-1 productive infection but shows that high levels of ICP0 do not necessarily assure viral growth and may even be detrimental when expression kinetics are altered. Not only simulatory, but also inhibitory effects are mediated by the ICP0 promoter TAATGARAT element to impose complex dynamic control on ICP0 expression, and this cannot be reproduced by simply tethering VP16 to the promoter such as with the tetracycline-responsive system. Most importantly, the present study indicates that: (1) simple ON and OFF switching of ICP0 transcription does not result in efficient viral replication which is dependent on correct ICP0 kinetics and (2) the tetracycline-responsive system may not accurately control ICP0 transcription due to interference by the ICP0 protein itself.