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En este estudio se estandarizó una metodología para la caracterización molecular de cepas nativas de Bacillus thuringiensis, la cual se basó en la amplificación de los genes cry mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se utilizaron cuatro mezclas de oligonucleótidos: dos Generales (I y II), los cuales reconocen genes de las familias cry1, cry2, cry3, cry4 y cry1Ia, y dos Específicos (A y B), que identifican los genes de la familia cry1 (cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ba, cry1Ca y cry1Da). La calidad y concentración del ADN bacteriano influyó sobre la especificidad y concentración de los productos obtenidos mediante la amplificación de los genes cry. La calidad del ADN purificado a través del método rápido reportado por M. He et al. (Nucleic Ac. Res. 18:1660, 1990) permitió una amplificación eficiente. Para realizar la PCR en condiciones óptimas, se utilizó una mezcla de reacción con un volumen final de 20 µl, la cual contenía 0,4 µM de cada oligonucleótido, 1X PCR buffer (50 mM KCL, wmM Tris-HCl, pH 8,3 y 3,0 mM MgCl 2), 200 µM de cada dNTP y 1U de Taq-ADN-polimerasa, además de 10-100 y 300- 500 ng de ADN bacterial para las mezclas de los oligonucleótidos Generales y Específicos, respectivamente. El programa de amplificación incluyó 30 ciclos de desnaturalización a 94°C, hibridación a 53°C y síntesis a 72°C durante 20 segundos cada uno. La metodología estandarizada se puede utilizar rutinariamente para amplificar los genes cry procedentes de aislamientos nativos de B. thuringiensis, lo cual permite clasificarlos y seleccionarlos de una manera rápida y precisa de acuerdo con su actividad biológica y potencial biotecnológico; adicionalmente, como paso previo de los ensayos de toxicidad contra diversas especies de insectos plaga de interés agrícola.

Nota Técnica BACILLUS thuringiensis (Bt) es el microorganismo más utilizado para el control biológico de insectos plagas en la agricul­ tura. Recientemente, se ha reportado el aislamiento de nuevas cepas de Bt con diferentes especificidades contra insectos lepidópteros, coleópteros y dípteros, así como contra nemátodos, platelmintos y protozoarios (Schnepf, 1995). Con el objetivo de caracterizar molecularmente el banco de cepas nativas colombianas de Bacillus thuringiensis de CORPOICA (Resultados sin publicar), se estandarizó una metodología basada en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), utilizando un grupo de oligonucleótidos generales que reconocen genes de las familias cryI, cryIIA, cryIIIA, cryIVA y cryV en aislamientos de Bt. Esta metodología permite una rápida evaluación de cepas nativas de Bt y la predicción de su actividad biológica como un paso previo a los ensayos de toxicidad de insectos. La PCR ha sido utilizada con éxito para la caracterización molecular de cepas nativas de Bt (Carozzi et al., 1991; Bourque et al., 1993; Gleave et al., 1993; Cerón et al. 1994), debido a su alta sensibilidad y especificidad. Generalmente, el tiempo requerido para una reacción de amplificación estándar de 30 ciclos es de aproximadamente 3 horas, con tiempos de denaturación, hibridación y extensión de 1 minuto cada uno. Tomando como base la experiencia reportada por Liu y Shearn (1995), se realizó un ensayo con el objetivo de disminuir estos tiempos a 1 segundo cada uno. Utilizando un termociclador de bloque (PTC­ 100, MJ Research, USA), se amplificaron los genes cryI, cryIA, IIA, IIIA, IVA y V de Bt, en mezclas de reacción que contenían 100 ng de DNA, 0.5 mM de cada oligonucleótido, 200 mM de cada dNTP (Amersham, UK), 1X PCR Buffer (50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 1.5 mM MgCl2) y 2.5 U de AmpliTaq DNA Polimerasa (Perkin Elmer, USA). Los parámetros para la amplificación consistieron en 1s a 94°C, 1s a 53°C y 1s a 72°C por 30 ciclos. Los resultados muestran que es posible reducir a menos de la mitad el tiempo re­ querido para amplificar fragmentos por PCR, de 3 horas a 1hora y 15 minutos. Utilizando esta PCR extra rápida se han amplificado fragmentos de hasta 800 pares de bases (pb) (Figura 1). Una denaturación y una extensión de 1 segundo es suficiente para obtener un buen producto de amplificación. Esto es debido a que hay un tiempo de transición entre las temperaturas de denaturación, hibridación y extensión de aproximadamente 30 segundos, que es suficiente para una síntesis completa de los fragmentos de genes cry amplificados. Este novedoso avance tecnológico está siendo implementado para la caracterización molecular de cepas nativas de Bt y puede ser empleado para otros propósitos en donde se requiera amplificar por PCR fragmentos de DNA menores de 800 pb.