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Es de vital importancia conocer la etiología y patogénesis de una enfermedad para desarrollar las formas más efectivas de prevención y tratamiento. Por ello, conocer y comprender la microbiología endodóntica, específicamente la biología de las biopelículas, que se forman en el interior de los conductos radiculares, es esencial para comprender el potencial patogénico de la microbiota y el desarrollo de tratamientos efectivos y eficientes. Las interacciones entre microorganismos presentes en un biofilm dotan a la comunidad de propiedades y funciones que no pueden observarse en cada componente de forma individual. Por este motivo, puede observarse un aumento de la virulencia, mayor resistencia frente a diferentes antimicrobianos y una mejoría en la eficiencia metabólica. Por lo tanto, las estrategias de desinfección deben ser probadas en condiciones lo más parecidas posible a la realidad. La composición bacteriana del interior de los conductos radiculares presenta una alta variabilidad. La etiología de la infección endodóntica es heterogénea, hallándose múltiples combinaciones bacterianas. En la literatura disponible se ha detectado en el interior de los conductos radiculares una media de 13 phyla y 574 especies correspondientes a 190 géneros por estudio. Respecto a los géneros con mayor proporción en las muestras se han descrito: Prevotella (8,9%), Fusobacterium (6,3%), Bacteroides (5,7%), Porphyromonas (3,8%) y Lactobacillus (3,5%). No existe un modelo de estudio ideal, estandarizado y aceptado para el estudio de las infecciones endodónticas. Dicho modelo debería ser representativo de la realidad para que los resultados in vitro de las investigaciones sean extrapolables a las diferentes situaciones clínicas in vivo. El sistema de Análisis Celular en Tiempo Real (RTCA) xCELLigence® es un modelo de estudio que permite la cuantificación continua de formación de biofilm mediante valores de impedancia. Este modelo permite el crecimiento de biofilm monoespecie y multiespecie a partir de muestras procedentes de saliva, placa supra- y subgingival y de la lengua. Sin embargo, todavía no se ha utilizado como modelo de biofilm endodóntico. Un uso correcto de los antibióticos permite resolver infecciones, prevenir y evitar la propagación de la enfermedad y minimizar las complicaciones graves a causa de la infección. Sin embargo, un uso incorrecto de los mismos conlleva una serie de riesgos y efectos secundarios como son: náuseas, vómitos, diarreas e infecciones oportunistas por hongos. Su uso excesivo e indiscriminado está creando bacterias resistentes que no son susceptibles a ningún antibiótico. La resistencia a los antibióticos es considerada una de las mayores amenazas para la salud mundial. Una mejora de los métodos para evaluar la susceptibilidad a los antibióticos es fundamental para lograr una mayor efectividad, individualizar los tratamientos y disminuir la formación de cepas resistentes. OBJETIVOS. 1. Desarrollar y testar el sistema RTCA xCelligence® de medida de impedancia como modelo in vitro para medir el crecimiento de biofilms endodónticos a partir de muestras del interior de los conductos radiculares y analizar en tiempo real la dinámica de formación de biofilm de origen endodóntico. 2. Determinar la composición bacteriana del interior de los conductos radiculares en pacientes con necrosis pulpar que no habían tomado tratamiento antibiótico en el último mes previo a la toma de la muestra. 3.Identificar la composición bacteriana del interior de los conductos radiculares en pacientes con necrosis pulpar que habían tomado tratamiento antibiótico en el último mes previo a la toma de la muestra. 4.Evaluar in vitro el efecto de amoxicilina – ác. clavulánico, metronidazol y azitromicina sobre la dinámica de formación de biofilm y su composición en dientes necróticos de pacientes que no habían tomado tratamiento antibiótico en el último mes previo a la toma de la muestra. 5.Relacionar las características clínicas con la respuesta de crecimiento microbiano a los antibióticos testados. METODOLOGÍA. Se tomaron muestras de conductos radiculares necróticos de 40 pacientes. El estudio de la formación del biofilm se llevó a cabo in vitro mediante el sistema RTCA xCELLigence® (ACEA Biosciencies), que registra medidas de impedancia expresadas en valores de “Índice Celular” reflejando el crecimiento del biofilm en tiempo real durante 8 horas. Cada muestra fue testada por duplicado con 8 µg/ml de amoxicilina – ác. clávulánico, 16 µg/ml de metronidazol y 0,4 µg/ml de azitromicina. Se calculó el porcentaje de inhibición/estimulación de la formación del biofilm con respecto a su control sin antibiótico. Por otra parte, se secuenciaron mediante el sistema Illumina 28 de las 40 muestras obtenidas, obteniendo al menor 20.000 secuencias del gen 16S ARNr amplificado previamente por PCR. Además, se secuenciaron 4 muestras procedentes de conductos radiculares necrótico que habían tomado antibiótico en el último mes. Se realizó un análisis canónico de correspondencia y el test estadístico ADONIS para comparar la composición bacteriana de las diferentes muestras y el efecto de los antibióticos testados sobre el biofilm de origen endodóntico obtenido en el sistema RTCA xCElligence®. Se analizó la influencia de las diferentes situaciones clínicas sobre el efecto antibiótico en el crecimiento de biofilm endodóntico mediante la prueba del chi cuadrado. Además, se utilizó el test de U de Mann-Whitney para comparar los datos clínicos de los pacientes con la proporción de los géneros más abundantes. RESULTADOS. Tras el análisis de la composición bacteriana del interior de los conductos de 28 dientes necróticos se observa que los géneros con mayor proporción media son: Phocaeicola (10,7%), Prevotella (6,4%), Pseudomonas (5,4%), Streptococcus (4,9%) y Fusobacterium (4,5%). La composición bacteriana del interior de los conductos radiculares presenta una alta variabilidad incluso entre dientes de un mismo paciente. El análisis canónico de correspondencia (CCA) sugiere que las 4 muestras del interior de los conductos necróticos procedentes de pacientes que han tomado antibiótico son más parecidas entre sí, diferenciándose de las 28 muestras de pacientes que no han tomado antibiótico previo a la toma de muestra. Se ha analizado el efecto de las condiciones de cultivo de muestras endodónticas en el sistema RTCA xCElligence® sobre la composición bacteriana del interior de los conductos radiculares. Las abundancias medias de los géneros se mantienen similares entre el inóculo (muestra recogida del paciente y almacenada a -20º C hasta su secuenciación) y la muestra cultivada en la condición control (muestra de biofilm recogida de los pocillos de la placa de microtitulación del sistema RTCA xCElligence® en ausencia de antibiótico). Mediante el test de Wilcoxon se ha comparado la abundancia media de los 17 géneros más abundantes en el inóculo (abundancia >2%), con la abundancia de esos géneros en el control positivo. Se observa que no existe diferencia estadísticamente significativa en el 65% de los géneros, mostrando que el sistema permite el crecimiento de un biofilm que representa razonablemente bien la composición bacteriana del interior de los conductos radiculares En conjunto, los datos muestran que la composición de las muestras recogidas es claramente polimicrobiana y variable entre muestras, que está dominada por un número limitado de géneros, y que el biofilm crecido en condiciones in vitro en el sistema xCELLigence® es similar al del inóculo utilizado, cuando éste se crece durante 8 horas. Tras la obtención de los valores de impedancia, de un total de 40 muestras, del sistema RTCA xCElligence® se observan 4 patrones de respuesta del biofilm frente a los diferentes antibióticos: Ningún antibiótico modifica la curva de crecimiento del biofilm (Tipo I); todos los antibióticos producen inducción en la formación del biofilm (Tipo II); todos los antibióticos producen inhibición en la formación del biofilm (Tipo III); cada antibiótico tiene un efecto diferente sobre la curva de crecimiento del biofilm (Tipo IV). Dentro del patrón Tipo IV se pueden diferenciar: Tipo IVa, uno o dos antibióticos producen inducción del biofilm y el resto no influyen; Tipo IVb, uno o dos antibióticos producen inhibición del biofilm y el resto no influyen; Tipo IVc, uno o dos antibióticos producen inducción del biofilm y uno o dos antibióticos producen inhibición del biofilm. El patrón de crecimiento de biofilm menos frecuente es el tipo I y el más frecuente el tipo IV. El metronidazol fue el antibiótico que consiguió inhibir la formación de biofilm de forma intensa en el mayor número de casos (17%), mientras que la azitromicina fue el antibiótico que tuvo un efecto leve – moderado de inhibición en el mayor número de muestras (48%). Con todos los antibióticos, se halló un porcentaje de casos en los que se produjo inducción del crecimiento del biofilm. Se llevó a cabo el CCA de las 19 muestras de pacientes de las cuales se obtuvo control positivo y biofilm endodóntico tras la aplicación de amoxicilina – ác. clavulánico, metronidazol y azitromicina. Se observa que cada una de las muestras de un mismo paciente, tras la aplicación de los diferentes antibióticos, son muy similares, indicando que aunque algunas especies puedan variar en sus porcentajes relativos, los antibióticos testados no influyen en la estructura general de las poblaciones bacterianas. Respecto a la relación entre los datos clínicos y la respuesta de biofilm a los antibióticos testados, se halló que la percusión fue positiva (dolor a la percusión, con el mango del espejo, en el diente problema en comparación con los dientes contiguos) en el 55,6% de los casos en los que la amoxicilina - ác. clavulánico produjo una inducción del crecimiento de biofilm, siendo negativa en el 40,6% de los casos en los que la inhibió (p=0,03). Se puede observar una mayor cantidad de Prevotella y Treponema cuando el tratamiento de conductos tuvo lugar a causa de la necrosis pulpar por un traumatismo previo (p50%) y la azitromicina el que ha inhibido en el mayor porcentaje de los casos. Todos ellos han provocado inducción de la biopelícula en algunos casos. La variabilidad de la composición bacteriana y las múltiples posibles interacciones entre los diferentes géneros es la causa más probable de los diferentes efectos de los antibióticos sobre la dinámica de formación de biofilm obtenidos en el presente estudio Se observa que existe poca diferencia en los valores de inhibición y estimulación en la formación de biofilm por parte de los antibióticos testados entre las 4 y 8 horas de seguimiento. Esto quiere decir que a las 4 horas se dispone de valores preliminares muy similares a los que se obtendrán a las 8 horas. Por lo tanto, se propone el sistema RTCA xCElligence® como modelo in vitro rápido para realizar pruebas de sensibilidad frente a diferentes antibióticos, puesto que a las 4 horas se podría disponer de información representativa respecto a la sensibilidad de los antibióticos frente al biofilm específico del conducto radicular. Cabe destacar que las pruebas de sensibilidad antibiótica utilizadas de forma rutinaria en el ámbito hospitalario, como las pruebas de microdilución o los E-test, realizadas sobre cultivos puros, llevan al menos 24 horas en producir un resultado, y que las pruebas genéticas de sensibilidad antibiótica realizadas en muestras periodontales también necesitan al menos 24 horas para el diagnóstico. Tras el análisis de los resultados no se observa que los datos clínicos del paciente previos al tratamiento condicionen la eficacia de los antibióticos testados. Algunos autores han detectado una mayor proporción de Porphyromonas (p0,05) cuando los pacientes tuvieron síntomas previos al tratamiento de conductos, en cambio en la presente tesis se detectó una mayor proporción de Streptococcus (p

La metagenómica del gen 16S rRNA se ha convertido en una herramienta eficiente para caracterizar las comunidades bacterianas de la leche cruda infectada por mastitis bovina dado que las técnicas dependientes de cultivo no permiten recuperar todos los microorganismos causantes de la enfermedad. En esta investigación se usó la secuenciación de próxima generación (NGS) Illumina MiSeq de la región hipervariable V4 del gen 16S rRNA para identificar la composición bacteriana de la leche cruda de bovinos infectados con mastitis subclínica. El estudio se desarrolló en el departamento del Valle del Cauca y las muestras se tomaron en tres hatos con diferentes niveles tecnológicos. El análisis bioinformático se desarrolló con el software Mothur V1.35.1 usando la base de datos SILVA como referencia, se alinearon 5.318.994 secuencias con longitud media de 272 pb, se obtuvieron 1.975.322 secuencias únicas y finalmente se obtuvieron los filotipos asignados a nivel género. Los perfiles filogenéticos revelaron que independiente del nivel tecnológico los cuatro filos dominantes fueron: Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria y Bacteroidetes. Se detectaron alrededor de 394 géneros con abundancia variable donde Pseudomonas y Acinetobacter fueron los géneros predominantes en hatos de nivel tecnológico alto y medio, contrario a esto en el hato de nivel tecnológico bajo predominó el género Staphylococcus. El microbioma central mostró que los taxones bacterianos compartidos por todas las muestras fueron en orden descendente: Acinetobacter, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Delftia, Stenotrophomonas. También se identificaron microorganismos patogénicos importantes como el género Escherichia-Shigella. Esta investigación permitió identificar y comparar en las muestras de leche bacterias patógenas asociados a la mastitis subclínica. Los hallazgos de este estudio pueden ayudar a formular estrategias para la prevención y el tratamiento de la mastitis pues se identificó de manera precisa las bacterias causales de la enfermedad y por consiguiente reducir las pérdidas económicas que incurren por ello. //Abstract: Metagenomics has become an efficient tool to characterize the bacterial communities of raw milk infected by bovine mastitis since culture-dependent techniques do not allow recovering of all the microorganisms that cause the disease. In this research, the next-generation sequencing (NGS) of Illumina MiSeq was used to identify the bacterial composition of raw milk from cattle infected with subclinical mastitis using the hypervariable V4 region of the 16S rRNA gene. The study took place in the department of Valle del Cauca and the samples were taken in three dairy herds with different technological development. The bioinformatic analysis was developed with Mothur V1.35.1 using the SILVA database as a reference. 5,318,994 sequences with an average length of 272 bp were aligned, and 1,975,322 unique sequences were obtained. Finally, the assigned phylotype were obtained at the genus level. The phylogenetic profiles revealed that, regardless of the technological development, the four dominant phyla were: Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Bacteroidetes. About 394 genera were identified with variable abundance where Pseudomonas and Acinetobacter were the predominant genera in dairy herds of high and medium technological development. On the contrary, at the dairy herd of low technological development, the genus Staphylococcus was the predominated one. The core microbiome showed that the bacterial taxa shared by all the samples were in descending order as follows: Acinetobacter, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Delftia, Stenotrophomonas. In addition, important pathogenic microorganisms such as the genus Escherichia-Shigella were also identified. This research allowed to identify and compare pathogenic bacteria associated with subclinical mastitis in milk samples. The findings of this study can help to formulate strategies for the prevention and treatment of mastitis since the causal bacteria of the disease were precisely identified and, consequently, the economic losses incurred were reduced. Doctorado