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Background: Exposure to adversity in utero is thought to increase susceptibility to develop posttraumatic stress disorder (PTSD) following later life trauma, due to neurobiological programming effects during critical developmental periods. It remains unknown whether effects of prenatal adversity on PTSD susceptibility are modulated by genetic variations in neurobiological pathways implicated in PTSD susceptibility. Objective: We investigated whether genetic variation in the glucocorticoid receptor (GR) modulated effects of prenatal famine exposure on late adulthood PTSD symptom severity after trauma exposure in childhood and mid-to-late adulthood. Method: We included N = 439 term-born singleton adults (mean age: 72 years, 54.2% women) from the Dutch Famine Birth Cohort, born around the time of the Dutch Famine of 1944/1945, divided into exposure and control groups based on timing of the famine during gestation. Participants filled out self-report questionnaires on childhood (Childhood Trauma Questionnaire) and mid-to-late adulthood (Life Events Checklist for DSM-5) trauma, and current PTSD symptom severity (PTSD Checklist for DSM-5). GR haplotypes were determined from four functional GR single nucleotide polymorphisms (ER22/23EK, N363S, BclI and exon 9β) in previously collected DNA. Linear regression analyses were performed to investigate associations of GR haplotype and prenatal famine exposure in conjunction with later life trauma on PTSD symptom severity. Results: We observed a significant three-way interaction between the GR Bcll haplotype, famine exposure during early gestation, and adulthood trauma exposure on PTSD symptom severity in late adulthood. Only participants exposed to famine during early gestation without the GR Bcll haplotype showed a significantly stronger positive association between adulthood trauma and PTSD symptom severity than non-exposed participants, indicating increased PTSD susceptibility. Conclusions: Our results illustrate the importance of integrated approaches considering genetics and environmental contexts throughout various life periods, including the rarely investigated prenatal environment, to elucidate how PTSD susceptibility evolves throughout life. HIGHLIGHTS Adversity during pregnancy is thought to increase offspring's PTSD risk following later life trauma, but exact neurobiological mechanisms underlying this process remain unknown.We found that effects of prenatal famine exposure on PTSD symptom severity were influenced by genetic variation in the glucocorticoid receptor, which signals effects of the stress hormone cortisol. Integrated approaches considering genetics and environmental contexts throughout both early and later life are important to understand how PTSD risk evolves throughout life.

Tesis doctoral; 181 páginas, ilustraciones. Este estudio se ha desarrollado en el Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), bajo la dirección de la Dra. Paloma Pérez Sánchez, Este trabajo ha sido realizado con el apoyo económico de los proyectos de investigación que se enumeran a continuación: SAF2008-00540 (Ministerio de Ciencia y Tecnología) ACOMP/2011/127 (Generalitat Valenciana) Fundación Ramón Areces (050507070007)

En esta tesis se detallan los resultados obtenidos en la síntesis, actividad biológica y la relación estructura-actividad de nuevos análogos de esteroides bioactivos. Por un lado, se sintetizó un análogo no hidrolizable del 21-hemisuccinoiloxi-6,19-epoxiprogesterona (21HS-6,19OP), para lo cual se desarrolló una metodología one-pot sencilla de alquilación para la posición C-21 de 20- ceto pregnanos que consiste en la formación del sililenoléter, seguido de la condensación de Mukaiyama con un aldehído. El análogo obtenido resultó ser biológicamente inactivo a diferencia de su líder. Por otro lado, se diseñaron y sintetizaron cuatro A-homoanálogos del neuroesteroide allopregnanolona. A partir de progesterona comercial, se preparó un ciclopropilcarbinol que fue sometido a un reordenamiento catiónico catalizado por ácidos y promovido por microondas para dar un A-homo-3,5-pregnadieno. Este se epoxidó regioselectivamente con dioxiranos generados in situ, con un derivado de fructosa como catalizador y oxone® como oxidante para dar los análogos. Uno de ellos resultó tener una actividad in vitro sobre el receptor GABAA similar a la pregnanolona; los otros tres resultaron levemente activos demostrando que la libertad conformacional del anillo A de 7 miembros les permitiría a los análogos alcanzar conformaciones activas. A dos de los A-homoesteroides intermediarios de la síntesis, que por poseer una funcionalidad ceto en el anillo A son análogos de progesterona, se les ensayó la actividad sobre el receptor progestágeno (PR) y mineralocorticoide (MR), encontrando que estos actúan selectivamente sobre el primero, probablemente debido a un aumento en la hidrofobicidad del anillo A. This thesis describes the synthesis, biological activity and structure-activity relationships of seven novel bioactive steroid analogues. In the first part, a non hydrolyzable analogue of 21- hemisuccinoyloxy-6,19-epoxyprogesterone (21HS-6,19OP) was synthesized. To achieve this goal, a straightforward one-pot alkylation methodology at C-21 of 20-keto pregnanes was developed, consisting of silylenol ether formation followed by a Mukaiyama aldol reaction. In contrast with the lead compound, the resulting analogue was biologically inactive. In the second part, four Ahomo neurosteroids analogues where designed and synthesized. Starting from commercially available progesterone, a ciclopropylcarbinol derivative was prepared, which was subjected to an acid catalyzed-microwave promoted cationic rearrangement to give an A-homo-3,5-pregnadiene. This diene was regioselectively epoxydized with a bulky dioxirane generated in situ from a fructose derivative and Oxone®. One of the analogues exhibited an in vitro activity on the GABAA receptor similar to pregnanolone; the other three analogues where only slightly active, proving that the conformational freedom provided by the seven membered A ring would allow the compounds to explore active conformations. Two A-homo synthetic intermediates with a ketone functionality on the A ring proved to be selective progesterone receptor (PR) agonists, lacking mineralo/antimineralocorticoid activity. The selectivity achieved might be due to the enhanced hydrofobicity of the expanded A ring. Fil: Dansey, María Virginia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Caveolina-1es una proteína con un importante papel en el tejido adiposo, donde participa en la respuesta a insulina y el metabolismo de lípidos. La expresión de Caveolina-1 aumenta durante la adipogénesis de células 3T3-L1, pero se desconocen los mecanismos que regulan su expresión. Trabajos preliminares sugieren la participación de receptores nucleares en dicha regulación. El objetivo de este trabajo fue analizar el efecto de la modulación farmacológica de los receptores PPARγ y de Glucocorticoides sobre la expresión de Cav-1 en células 3T3-L1. Células diferenciadas por 4 días fueron tratadas con Rosiglitazona o Dexametasona, analizando la expresión de Cav-1 por RT-PCR. Rosiglitazona no indujo cambios significativos en los niveles de su ARNm. En contraste, el tratamiento por 48 h con Dexametasona 1μM, aumentó tres veces la expresión del ARNm de Cav1 respecto a las células control. Estos resultados sugieren que el receptor de glucocorticoides sería un regulador positivo de la expresión de Cav-1 en células 3T3-L1. / Abstract. Caveolin-1 is a protein with an important role in adipose tissue, where it has been involved in insulin response and lipid metabolism. Caveolin-1 expression increases during adipogenesis of 3T3-L1 cells, but the mechanisms regulating its expression remain unknown. Preliminary work suggests the involvement of nuclear receptors in such regulation. The aim of this work was to analyze the effect of PPARγ and Glucocorticoid receptor’s pharmacological modulation on Cav-1 gene expression in 3T3-L1 cells. Cells at day 4 of differentiation were treated with rosiglitazone or dexamethasone, and Cav-1 expression was analyzed by RT-PCR. Rosiglitazone did not significantly change its mRNA levels. In contrast, treatment with 1 μM dexamethasone by 48 h led to a three-fold increase in Cav1 mRNA levels compared to control cells. These results suggest that the glucocorticoid receptor would be a positive regulator of the Cav-1 gene expression in 3T3-L1 cells. Maestría

A lo largo de esta tesis se investigaron algunos de los mecanismos moleculares que modulan la actividad del receptor de glucocorticoides (GR), un factor de transcripción regulado por ligando. En primer lugar, utilizando cuatro esteroides con diferentes actividades se estudió cómo la estructura del ligando afecta la actividad transcripcional del GR. Además, mediante la técnica de Número y Brillo se demostró por primera vez, en forma directa, que el receptor es capaz de homodimerizar in vivo. Los resultados sugieren que este proceso sería independiente de la unión al ADN y a coactivadores como TIF2. En segundo lugar, se investigaron los mecanismos responsables de la inducción dependiente de glucocorticoides del gen pro‐apoptótico Bax, en células derivadas de timoma de ratón S49. Los resultados indican que el aumento transcripcional de bax no es causado por la estabilización de su ARNm, y que las primeras 6.5 kb del promotor del gen no estarían involucradas en el efecto inductor mediado por el GR. A través del uso de un glucocorticoide disociado, sugerimos que el GR induce la expresión de Bax mediante un mecanismo de transactivación. Más aún, no se descarta la posibilidad que el efecto del GR sea indirecto, es decir, induciendo la expresión de otro gen, necesario para aumentar los niveles totales de Bax. Por último, se investigaron los mecanismos involucrados en el efecto antagónico entre la melatonina (MEL) y los glucocorticoides. Nuestros hallazgos muestran que MEL no inhibe al GR en forma generalizada, sino que sólo lo hace en ciertos tipos celulares, y mediante mecanismos diferentes. Mientras que en timocitos de ratón MEL inhibe la disociación del complejo GR‐Hsp90, en células BHK inhibe la interacción del GR con el coactivador TIF2. Finalmente, presentamos evidencias que sugieren que el inhibidor farmacológico de los receptores de melatonina, el Luzindole, sería también un antagonista del receptor de glucocorticoides. The glucocorticoid receptor (GR) is a transcription factor that regulates gene expression in a ligand‐dependent fashion. This thesis explores some of the molecular mechanisms involved on GR’s activity modulation. By using four different steroid ligands with distinct glucocorticoid and antiglucocorticoid properties, we analyzed ligand structure effects on GR transcriptional modulation. In this sense, by performing Number and Brightness assays we presented for the first time direct evidence of GR homodimerization process in vivo. Results also show that this event can occur without TIF2 coactivator interaction and most likely in a ligand structure and DNA independent manner. On the other hand, we investigated the mechanisms underlying glucocorticoid‐dependent bax induction in S49 cells. Results show that glucocorticoids do not have any effect on bax mRNA stability, suggesting that GR enhances bax’s transcription rate. Moreover, at least 6.5 kb upstream of bax’s start translation site would not be involved on the glucocorticoid‐dependent induction. Results derived from the use of a selective glucocorticoid suggest that GR induces bax expression through a transactivation mechanism. Moreover, we can’t rule out that GR could regulate bax levels through an indirect mechanism involving the expression of another factor. Finally, we studied the molecular mechanisms underlying melatonin (MEL) modulation on the glucocorticoid pathway. Our results show that MEL is not a generalized‐cell type glucocorticoid antagonist. We found that MEL modulates GR response only in a subset of cells, in a cell‐type specific molecular mode of action. In thymocytes, it inhibits GR action by blocking the dissociation of the 90‐kDa heat shock protein; while in BHK cells MEL reduces GR‐TIF2 interaction. Lastly, we also present evidences suggesting that melatonin receptor inhibitor Luzindole is also an antagonist of the glucocorticoid receptor pathway. Fil: Presman, Diego Martín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En esta tesis se investigó la influencia de la conformación global del esqueleto esteroidal sobre la actividad de los esteroides neuroactivos y de los glucocorticoides. Por un lado, se diseñaron y sintetizaron tres 1,11-epoxiesteroides y un 11,19-epoxiesteroide, análogos de esteroides neuroactivos cuya conformación está restringida por la presencia del puente epóxido. Por otra parte, se estudió la actividad glucocorticoide y las bases moleculares de acción de dos análogos rígidos: 21-hidroxi-6,19-epoxiprogesterona (21OH-6,19OP), y su 21-hemisuccinato derivado, 21-hemisuccinoiloxi-6,19-epoxiprogesterona (21HS-6,19OP). La actividad transcripcional de ambos compuestos se determinó utilizando el gen reportero MMTV-LUC y evaluando la capacidad de los mismos de inhibir la actividad del factor de transcripción NFκB. También se estudió el efecto apoptótico de estos compuestos en los fibroblastos de ratón L929. El conjunto de estos resultados muestra que estos análogos rígidos poseen potenciales aplicaciones como drogas glucocorticoides. Finalmente, utilizando la herramienta computacional denominada simulación por dinámica molecular se investigaron las bases moleculares de acción de 21OH- 6,19OP y 21HS-6,19OP. Para ello se determinó el comportamiento dinámico del dominio de unión a ligando del receptor de glucocorticoides unido a cada uno de estos análogos rígidos. Los resultados muestran que cambios en regiones claves del receptor podrían ser utilizadas para explicar los resultados experimentales obtenidos. This thesis explores the influence of global conformation of the steroid skeleton on the activity of neuroactive steroids and glucocorticoids. In the first part, three 1,11-epoxysteroids and one 11,19-epoxysteroid analogs of neuroactive steroids with their conformation restricted by an oxygen bridge, were designed and synthesized. On the second part, the glucocorticoid activity and the molecular basis of action of two rigid analogs, 21-hydroxy-6,19-epoxyprogesterone (21OH-6,19OP) and its hemisuccinate 21-hemisuccinoyloxy-6,19-epoxyprogesterone (21HS-6,19OP), was studied. Transcriptional activity of both compounds was determined using the reporter gene MMTV-LUC and evaluating their capacity to inhibit the activity of the transcription factor NFκB. The apoptotic effect of these compounds was also studied in mouse fibroblasts L929. The results obtained show that these rigid analogs have potential aplications as glucocorticoid drugs. Finally the computational tool known as molecular dyamics simulation was used to investigate the molecular basis of action of 21OH-6,19OP and 21HS-6,19OP. Thus the dynamic behavior of the ligand binding domain of the glucocorticoid receptor bound to these rigid analogs was determined. The results show that changes in key regions of the receptor may explain the experimental results. Fil: Alvarez, Lautaro Damián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil: Rojas, Ana María Luisa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.