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La genómica comparativa es la última revolución en biología evolutiva y ofrece, a la vez, desafíos y promesas. Un desafío es encontrar información en los colosales bancos de datos de los que se dispone. La promesa es establecer el puente entre genotipo y fenotipo. Semejante tarea nos permitirá identificar los cambios genómicos vinculados con la adaptación y en nuestra especie saber qué cambios genéticos subyacen a la postura erecta, el tamaño relativo del cerebro, el origen del lenguaje, la habilidad para fabricar herramientas, que son algunos de los aspectos que nos diferencian de los grandes monos y de los homínidos tempranos. Los genomas son un registro completo, un inventario de todos los genes necesarios para construir y operar un organismo y, también, una ventana hacia el pasado, tanto reciente como profundo. Los estudios basados en el ADN han confirmado la tesis darwiniana de la descendencia con modificación a partir de ancestros comunes. Sin embargo, aún hoy la aceptación del argumento evolucionista es limitada y las causas siguen siendo las mismas que en el siglo XIX. Se trata de cuestionamientos a los tres componentes del argumento darwiniano: la variación, la selección y el tiempo. En cuanto a la variación sabemos que la mayoría de las mutaciones que ocurren al azar en los genomas no afectan el fenotipo (por ejemplo, las que ocurren en regiones del genoma que no tienen función) y que la mayoría de las mutaciones que afectan el fenotipo son perjudiciales y solo unas pocas ventajosas. Esta distribución de los efectos de las mutaciones hace difícil pensar en la evolución adaptativa. Sin embargo, la combinación entre mutación al azar y selección natural (SN) sigue siendo la mejor explicación evolutiva. De hecho, los biólogos apreciaron la interacción entre azar, selección y tiempo 50 años después de “El origen de las especies”, cuando los genetistas de poblaciones desarrollaron modelos matemáticos que describían a la SN como mecanismo principal de la evolución. Las mutaciones que no afectan el fenotipo evolucionan al azar (por deriva genética), las perjudiciales son purgadas por la selección natural negativa y las beneficiosas evolucionan por selección positiva. A lo largo del texto se presentan casos que ilustran el papel de los diferentes modos en que la selección ha purgado la variación desde eones, otros en los que la SN ha conducido a la evolución de novedades evolutivas, casos en los que cambios de hábitos han implicado una relajación de la SN que ha llevado a la muerte de algunos genes y, finalmente, un caso que ilustra en nuestra especie cómo la SN puede conllevar al mantenimiento de variantes perjudiciales. Comparative genomics is the last revolution in evolutionary biology and offers challenges and promises. The first challenge is to search for information in the huge DNA data banks. The promise is to establish the link between the genotype and the phenotype. This task will allow to identify the genomic changes involved in adaptation and to unveil the type of changes underlying key traits that differentiate our species from early hominids. Genomes are a complete record, an inventory of all genes that are necessary to make and operate an organism and, also, a window to both the recent and the deep past. DNA based studies confirmed the Darwinian thesis of common descent. However, even today the Darwinian argument is not universally accepted and the causes are the same as in the nineteenth century. In general non acceptance interrogate the three components of the Darwinian argument: variation and chance, natural selection and time. Concerning variation, we know that mutation is a random process, that most changes in the genome have no phenotypic consequences and that among mutations that affect phenotype most have a detrimental effect and a small proportion are advantageous. Such distribution of the effect of mutations on the phenotype makes adaptive evolution rather contra intuitive. However, the combination of random mutation and natural selection is still the best explanation for biological evolution. In fact, biologist understood the interaction between chance, natural selection and time 50 years after the publication of “The origin of species”, with the advent of population genetics. Mutations that do not have phenotypic consequences evolve at random (by means of genetic drift), detrimental mutations are purged by negative selection and advantageous mutations evolve by means of positive selection. Along the text I present study cases that illustrate how natural selection has purged deleterious variation since the common ancestor of all domains of life and others showing how evolutionary novelties have evolved. Fil: Hasson, Esteban Ruben. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Ecología, Genética y Evolución de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Ecología, Genética y Evolución de Buenos Aires; Argentina

Se ha propuesto que la divergencia fenotípica entre humanos y chimpancés se debe en gran medida a cambios en la regulación de genes que participan en el desarrollo en lugar de cambios en las secuencias codificantes de proteínas de los genes. Hipotetizamos que la explosión sin precedentes en el repertorio del comportamiento humano se debe a la adquisición de nuevos patrones de expresión de genes preexistentes. Previamente en nuestro laboratorio, se analizó la distribución en el genoma de secuencias genómicas no codificantes (denominados human accelerated elements, HAE) que muestran evidencia de evolución acelerada en el linaje humano (aumento en la tasa de sustitución de nucleótidos). Esto permitió identificar la agrupación más grande de HAEs en el genoma humano ubicada dentro del locus del gen que codifica para la proteína neuronal PAS domain-containing protein 3 (NPAS3). NPAS3 codifica un factor de transcripción bHLH-PAS que se expresa ampliamente en el sistema nervioso en desarrollo del ratón y de humano, y su disfunción se ha asociado con la etiología de la esquizofrenia y el síndrome bipolar en humanos. En el locus de este gen se agrupan 14 HAEs. En este trabajo, realizamos un ensayo comparativo utilizando las secuencias ortólogas de humano y de chimpancé, para determinar si los 14 elementos NPAS3-HAEs funcionan cómo activadores transcripcionales o enhancers en líneas de peces cebra y ratones transgénicos. Identificamos dos NPAS3-HAEs (HAR202 y HACNS658) en los que la versión humana perdió función cómo enhancer en comparación con la versión de chimpancé, que funciona como un fuerte enhancer durante el desarrollo del cerebro. Para determinar si la función enhancer se perdió en el linaje humano o lo que ocurrió fue una ganancia de función en el linaje de chimpancé, seleccionamos el elemento HAR202 y realizamos estudios comparativos con secuencias de mono macaco Rhesus, ratón y pez cebra. Encontramos que el elemento HAR202 perdió específicamente su función enhancer como consecuencia del proceso evolutivo en el linaje humano. Para analizar cuál es el efecto funcional de la perdida de HAR202 sobre la expresión del gen NPAS3 generamos III un linaje de ratones mutantes que carece de este elemento en el genoma. Además, identificamos un elemento regulatorio, HACNS96 que ganó función de activador transcripcional en el sistema nervioso central en el linaje humano. Por otra parte, ha sido ampliamente estudiada la función del gen NPAS3 en el desarrollo del cerebro y también en el desarrollo de las vías respiratorias. Sin embargo, ha sido postulado que este gen podría participar también en el desarrollo craneofacial ya que personas que presentan una deleción en su genoma que incluye al gen NPAS3 presentan holoprocensefalia. La holoprosencefalia (HPE) es la anomalía del desarrollo más común que afecta el patrón del prosencéfalo humano y las estructuras craneofaciales asociadas. Para investigar si npas3 está involucrado en el desarrollo de estructuras craneofaciales, realizamos estudios de genética molecular en el pez cebra. El análisis de npas3 de peces cebra mutantes nulos (knockout) y en los que se indujo una marcada reducción de la expresión (knockdown) reveló anormalidades craneofaciales críticas que indican que este gen desempeña un papel clave en el desarrollo de estas estructuras. Además, npas3 demostró ser esencial para el desarrollo del sistema nervioso y del sistema branquial en el pez cebra. Curiosamente, la ablación o reducción de npas3 afecta la expresión de sonic hedgehog (shha), un gen maestro del desarrollo que cuando se muta produce holoprocencefalia. Nuestros resultados sugieren el gen NPAS3 desempeña un papel en el desarrollo craneofacial. It has been proposed that the phenotypic divergence between humans and chimpanzees is largely due to changes in the regulation of genes involved in the development rather than changes in the protein coding sequences of the genes. We hypothesize that the explosion unprecedented in the repertoire of human behavior is due to the acquisition of new patterns of expression of pre-existing genes. Previously in our laboratory, the genome distribution of non-coding genomic sequences (called human accelerated elements, HAE) that show evidence of accelerated evolution in the human lineage (increase in the rate of nucleotide substitution) was analyzed. This allowed to identify the largest group of HAEs in the human genome located within the locus of the gene that codes for the neuronal protein PAS domain-containing protein 3 (NPAS3). NPAS3 encodes a transcription factor bHLH-PAS that is widely expressed in the developing nervous system of the mouse and human, and its dysfunction has been associated with the etiology of schizophrenia and bipolar syndrome in humans. In the locus of this gene, 14 HAEs are grouped. In this work, we conducted a comparative trial using the human and chimpanzee orthologous sequences, to determine if the 14 NPAS3-HAEs elements function as transcriptional activators or enhancers in lines of zebrafish and transgenic mice. We identified two NPAS3-HAEs (HAR202 and HACNS658) in which the human version lost function as an enhancer compared to the chimpanzee version, which functions as a strong enhancer during brain development. To determine if the enhancer function was lost in the human lineage or what happened was a gain of function in the chimpanzee lineage, we selected the HAR202 element and made comparative studies with sequences of Rhesus macaque, mouse and zebrafish monkey. We found that the HAR202 element specifically lost its enhancer function because of the evolutionary process in the human lineage. To analyze what is the functional effect of the loss of HAR202 on the expression of the NPAS3 gene, we generated a lineage of mutant mice lacking this element V in the genome. We also identified a regulatory element, HACNS96 that gained transcriptional activator function in the central nervous system in the human lineage. On the other hand, the role of the NPAS3 gene in the development of the brain and in the development of the respiratory tract has been widely studied. However, it has been postulated that this gene could also participate in the craniofacial development since people who present a deletion in their genome that includes the NPAS3 gene present holoprocensephaly. Holoprosencephaly (HPE) is the most common developmental anomaly that affects the pattern of the human forebrain and the associated craniofacial structures. To investigate if npas3 is involved in the development of cranio-facial structures, we conducted molecular genetic studies in zebrafish. The analysis of npas3 of zebrafish mutants’ nulls (knockout) and in which a marked reduction of expression was induced (knockdown) revealed critical skull-facial abnormalities that indicate that this gene plays a key role in the development of these structures. In addition, npas3 proved to be essential for the development of the nervous system and the branchial system in the zebrafish. Interestingly, the ablation or reduction of npas3 affects the expression of sonic hedgehog (shha), a master gene of development that, when mutated, produces holoprocensephalia. Our results suggest the NPAS3 gene plays a role in craniofacial development. Fil: Cinalli, Alejandro Raúl. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentina

Los programas genéticos del desarrollo en organismos multicelulares son regulados por cambios en la expresión génica. Estos cambios determinan los procesos de diferenciación celular que suceden durante el desarrollo de los metazoos. Los genes que gobiernan estos programas en general poseen regiones regulatorias de la transcripción con una arquitectura genética compleja. Las mismas contienen codificada la información necesaria para establecer dónde, cuándo y cuánto se expresa el gen en cuestión. Este trabajo de tesis tiene como objetivo general entender de manera integral cómo funcionan las regiones regulatorias de la transcripción en metazoos.En este trabajo utilizamos a la mosca Drosophila melanogaster como modelo experimental. Nos centramos en el análisis de la arquitectura y función de la región regulatoria de la transcripción del gen shavenbaby (svb). svb es un gen modelo establecido para el estudio de la estructura y evolución de regiones regulatorias. Este gen se expresa en las células epidérmicas del embrión y es indispensable para la formación de pelos no sensoriales (llamados ?tricomas?) en la cutícula de la larva de primer estadio. El patrón de expresión embrionario de svb es generado por siete enhancers que están localizados en una región de 90 kilobases ubicada río arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen. Con el objeto de comprender in toto la arquitectura genética de la región regulatoria de svb generamos moscas transgénicas con construcciones reporteras de su actividad transcripcional. Encontramos que svb se expresa en el estadio larval y pupal de Drosophila melanogaster además de la ya descripta expresión en el embrión. La expresión de svb en tejidos internos de larva que no forman tricomas sugiere que svb puede tener otra función, además de generar tricomas, a lo largo del desarrollo de Drosophila.Luego estudiamos el patrón de expresión de svb en los estadios de larva y pupa y los elementos regulatorios que generan dicho patrón. Encontramos que los siete enhancers embrionarios de svb generan también expresión en los tejidos de larva y pupa. Esto indica que los enhancers de svb funcionan de manera pleiotrópica, es decir, presentan actividad en distintos tejidos a lo largo del desarrollo. Otra característica relevante que se desprendió de este análisis es que todos los enhancers presentan un alto nivel de redundancia en los patrones de expresión que generan en la epidermis del estadio pupal. Evaluamos el rol de la redundancia de los enhancers en la epidermis pupal y verificamos que la ausencia de cuatro de los siete enhancers de svb, no modifica el patrón de tricomas en la pupa. Por lo tanto, la redundancia de los enhancers en la epidermis pupal contribuye a la robustez del fenotipo de tricomas en este estadio.Finalmente exploramos la existencia de nuevos elementos regulatorios de la transcripción a través de deleciones de secuencias de ADN, sin función asignada hasta el momento, dentro de la región regulatoria de svb. Encontramos que existen otros elementos funcionales, además de los enhancers ya descriptos, que modulan la expresión de svb tanto en el estadio larval como pupal de Drosophila melanogaster.En esta tesis analizamos la regulación transcripcional de un gen a lo largo de la ontogenia. Nuestros resultados ayudan a comprender cómo está codificada la información dentro de las regiones regulatorias de la transcripción en genes que son requeridos durante distintas instancias del desarrollo y diferentes contextos celulares. Developmental programs in multicellular organisms are regulated by switches in gene expression. These switches determine the cellular differentiation processes that occur in development. The master control genes that govern developmental programs often have complex cis-regulatory regions, that define where, when and how much a gene is expressed. The main aim of this thesis was to shed light -on how Cis-regulatory regions function in metazoans. We have worked with the fly Drosophila melanogaster, focusing in the architecture and function of the cis—regulatory region of the shavenbaby (svb) gene. svb is an established model for the study of the structure and evolution of cis—regulatory regions. This gene is expressed in the epidermal cells of the embryo where it is necessary for the formation of non—sensory hairs (called "trichomes") that decorate the cuticle 0f the first instar larva. The embryonic expression pattern of svb is generated by seven enhancers that are located in a region of 90 kilobases, upstream of the transcription start site of the gene. In order to understand the genetic architecture of the cis-regulatory region of svb in toto we generated transgenic flies with different reporter constructs. We found that 51/19 is expressed in the lawal and pupal stage of Drosophila melanogaster as well. The expression of svb in larva tissues that do not form trichomes suggests that svb might have another function (in addition to generating trichomes). We studied the expression pattern of svb in larva and pupa and searched for the regulatory elements that generate these expression patterns. We found that the seven embryonic enhancers of 51/19 also generate svb expression in larval and pupal tissues. This indicates that the enhancers of 51/19 work in a pleiotropic manner -i.e. they are active in different tissues throughout development. Another relevant feature that emerged from this analysis is that all seven enhancers drive redundant patterns in the epidermis of the pupa. We evaluated the role of this redundancy by deleting four of the seven enhancers in the native svb locus. We observed that the lack of four of the seven enhancers of 51/17 does not modify the trichome pattern in the pupa. Thus, redundancy in the pupal epidermis contributes to robustness of the trichome phenotype in this stage. Finally, we looked for uncharacterized regulatory elements within the cis— regulatory region of svb through DNA deletions. We found novel regulatory elements that modulate svb expression both in larva and pupa. In this thesis we have analyzed the transcriptional regulation of a gene throughout the ontogeny of D. melanogaster. Our results shed light on how regulatory information is encoded within genes that are deployed in multiple time-points of development. Fil: Sabarís Di Lorenzo, Gonzalo Julián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Ecología, Genética y Evolución de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Ecología, Genética y Evolución de Buenos Aires; Argentina