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Trabajo presentado por la Licenciada Dª. Estrella Frutos Beltrán para optar al título de Doctor en Bioquímica por la Universidad de Sevilla

Post-translational modifications often modulate protein function. Actually, phosphorylation of cytochrome c occurs in vivo at threonine 28, serine 47 and tyrosines 48 and 97. Phosphorylation of the two latters, in particular, is related to a wide range of human diseases as cytochrome c plays a pleiotropic role serving as an electron carrier in the respiratory electron transfer and acting as a cell death signal at the onset of apoptosis. The effect that phosphorylation of threonine 28 and serine 47 bears on the physiological functions of this protein remains concealed. The low yield of phosphorylated cytochrome c purification from cell extracts makes its analysis challenging. Also the specific kinases acting on the protein remain unknown. Hence, it has resorted to mutations to mimic targeted phosphorylation. Here, we have replaced threonine 28 and serine 47 by aspartate. And the analysis of tyrosine 48 and 97 phosphorylation has been performed by using the non-canonical amino acid p-carboxymethyl-L-phenylalanine (pCMF), which is a close phosphorylation mimic of tyrosine. Noteworthy, the Y48pCMF mutation significantly lowers the value for the alkaline transition pKa of oxidized cytochrome c. The negative charges at positions 28 and 48 cause a decrease in the midpoint redox potential value of 30 mV and 60 mV, respectively, and lower the affinity towards the distal site of cytochrome c1 in complex III. However, the phosphomimic variants at position 28, 47 and 48 are more efficient as electron donors to cytochrome c oxidase than the wild-type species. Concerning the role of cytochrome c in programmed cell death, negative charges at positions 48 and 97 hinder its ability to triger caspase-3 activation. In addition, any modification of residue 47 affects the pro-apoptotic function of cytochrome c. In summary, phosphorylation of cytochrome c modulates its distinct functions depending on the targeted residue, and can thus be the basis to understand an ample set of molecular diseases. Premio Extraordinario de Doctorado US

La vida se encuentra en casi cualquier lugar de la Tierra, tanto en las grietas hidrotermales de los suelos marinos o en las aguas en ebullición de los géiseres, como en los picos de la cordillera del Himalaya o en las frías extensiones de la Antártida. Los seres vivos se pueden clasificar en función del ambiente en el que habitan y de su adaptación al mismo. Así encontramos organismos psicrófilos o termófilos, adaptados a bajas o altas temperaturas respectivamente; halófilos, en ambientes con una alta concentración salina; acidófilos o alcalífilos propios de ambientes de bajos o altos pH respectivamente; los barófilos en condiciones de alta presión, etcétera. En general, estos organismos se denominan extremófilos y han llamado la atención de numerosos científicos desde los primeros estudios llevados a cabo por Perutz y colaboradores en los años 70 (Perutz y Raidt, 1975; Perutz, 1978). Según la temperatura óptima de crecimiento (TOC), los organismos se clasifican en cuatro grupos: psicrófilos, con una TOC en el rango de -5 a 15 ºC, mesófilos con una TOC entre 15 y 45 ºC, termófilos con una TOC entre 45 y 80 ºC, y los hipertermófilos (o termófilos extremos) con una TOC superior a 80 ºC (Vieille y Zeikis, 2001; Li et al., 2005). Las proteínas originarias de organismos mesófilos se denominan proteínas mesofílicas, y termofílicas las de los organismos termófilos o hipertermófilos (Pantazaki et al., 2008). Desde el punto de vista de la biología celular, los componentes de la membrana y pequeñas moléculas protectoras juegan un papel importante en el caso de las adaptaciones a salinidad, pH o presión extremas, (Jaenicke, 1991; Yancey et al., 1982; van de Vossenberg et al., 1998). En las adaptaciones a temperaturas extremas, los componentes celulares como por ejemplo, las proteínas, deben ser termoestables (Jaenicke y Zavodszky, 1990).

Las interacciones trasitorias entre biomoléculas se han convertido en el centro de la investigación de muchas áreas de la Bioquímica Moderna. La caracterización estructural continuada, utilizando cualquiera de las técnicas estructurales de alta resolución, es vital para comprender la función de este tipo de estos complejos. El trabajo de esta Tesis Doctoral se ha planteado con un doble objetivo. Por un lado, profundizar en el conocimiento acerca de las interacciones moleculares y la caracterización estructural de los complejos transitorios entre proteínas, teniendo como objetivo final la compresión de los factores que controlan la relación entre la estructura y la función de las proteínas, así como el modo de interacción y formación de este tipo de complejos inestables o débiles. Se ha hecho especial énfasis en aquellos rasgos que confieren a una proteína su capacidad para interaccionar especifica y transitoria con otras. El segundo objetivo supone un avance en el desarrollo y conocimiento de dos espectroscopias actualmente imprescindibles, para los estudios de interacción entre biomoléculas en disolución: la Resonancia Magnética Nuclear RMN y la absorción de Rayos X XAS. Este desarrollo tiene a su vez una doble vertiente: a nivel experimental, optimizando la calidad de los espectros de RMN y XAS en concentraciones límite.a nivel metodológico, aplicando, de manera pionera, la XAS al estudio de complejos entre biomoléculas y abordando, por primera vez, la caracterización estructural entre proteínas solubles y de membrana por NMR en disolución. Premio Extraordinario de Doctorado US