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Fil: Mestre, Ana Paula. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. La expansión de la frontera agrícola ha afectado las poblaciones silvestres animales en Argentina. Particularmente la distribución natural de la iguana overa (Salvator merianae) ha quedado inmersa en áreas expuestas a plaguicidas. El sistema inmune es un excelente indicador de la salud de los organismos, por lo que este trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto de los agroquímicos más utilizados en el país (cipermetrina, glifosato y clorpirifos) y de sus combinaciones, sobre el sistema inmune de S. merianae. Los parámetros inmunológicos evaluados fueron: recuento total y diferencial de glóbulos blancos, índices de lobularidad y de heterófilos/linfocitos, anticuerpos naturales y actividad del sistema de complemento. Complementariamente, se evaluaron los niveles de corticosterona en sangre y el crecimiento corporal de los individuos. Los resultados sugieren que los plaguicidas aplicados en menores concentraciones que las utilizadas en la agricultura actual, pueden inducir alteraciones en el sistema inmune de embriones y juveniles de S. merianae. Las diferentes respuestas inmunológicas, endócrinas y/o de crecimiento dependieron de las características del formulado, de la marca comercial probada y el método de exposición: individual o combinado, reconociendo interacciones entre los componentes de las mezclas. En animales expuestos durante el desarrollo embrionario, los efectos también dependieron de las diferentes concentraciones y de la etapa embrionaria de los individuos al momento de la exposición. En base a los resultados obtenidos, se sugiere continuar con la evaluación de los efectos de plaguicidas, empleando biomarcadores que permitan identificar las condiciones reales de exposición en las que se encuentra esta especie en su ambiente natural. The expansion of the agricultural frontier in recent years has excessively affected wild animal populations in Argentina. Particularly, the natural distribution of the Tegu Lizard (Salvator merianae) has been immersed in areas exposed to different pesticide formulations. The immune system is an excellent indicator of the health of organisms, so in this Doctoral Thesis, we begin to evaluate the possible effect of the most widely used agrochemicals in the country (cypermethrin, glyphosate, and chlorpyrifos) and their mixtures, on the immune system of S. merianae. The immunological parameters evaluated were: total and differential white blood cell count, lobularity index, heterophils / lymphocytes index, natural antibodies titres, and complement system activity. Besides, corticosterone levels and body growth of individuals were evaluated. The results showed that the formulations tested at lower concentrations to those recommended for crops application, induce immune system alterations of embryos and juveniles S. merianae exposed. Different immune, endocrine, and / or body growth organism’s responses to pesticide exposures, changed according to the compound applied, the glyphosate trademark tested, and the exposure method: individual or combined, recognizing different interactions among components in the mixtures. Finally, in animals exposed during embryonic development, toxic effects also changed according to different tested pesticide concentrations and embryonic stage at the time of topical application. Based on these findings on the results, it is suggested to continue with the evaluation of pesticides effects, through the use of biomarkers to identify the real exposure conditions of this species in its natural environment. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Cátedra de Fisiología Animal. Departamento de Fisiología. Escuela de Biología. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. CONICET. Universidad Nacional de Córdoba. 2015 - 121 h. + CD. tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés. Las situaciones estresantes crónicas, a menudo acompañadas de una desregulación del eje hipotálamo-hipofiso-adrenal (HHA) e hipercortisolemia, pueden desencadenar episodios depresivos y/o desordenes de ansiedad. La anhedonia o pérdida de interés es un síntoma central de la depresión y es controlada a nivel central por el sistema de recompensa mesocorticolímbico. Además, los eventos de la vida temprana pueden producir alteraciones persistentes en circuitos neuronales específicos que controlan la respuesta de estrés y la conducta emocional, confiriéndoles a los individuos vulnerabilidad o resiliencia al estrés en la vida adulta.En este trabajo,se analizó si la separación materna temprana y el estrés crónico variable en el adulto y/o su interacción, afectan la inmunoreactividad de las neuronas que expresan receptores glucocorticoides(GR) y de mineralocorticoides (MR),y el balance MR/GR en el hipocampo dorsal,núcleo paraventricular (NPV) del hipotálamo y núcleos medial y central de la amígdala, estructuras cerebrales participantes de la regulación de la respuesta de estrés. Además, se analizó si estos tratamientos modifican la actividad neuronal, medida a través de la inmunoreactividad a Fos, en las estructuras antes mencionadas y también en núcleo accumbens (NAc), corteza prefrontal medial (CPFm) y área tegmental ventral (ATV), estructuras pertenecientes al circuito de recompensa mesocorticolímbico. Por otro lado, para indagar si estas alteraciones a nivel central se manifiestan con cambios endócrinos y conductuales, se determinaron los niveles plasmáticos de corticosterona y se evaluaron índices de ansiedad y conducta hedónica. Finalmente, nos propusimos analizar si el tratamiento crónico con el antidepresivo tricíclico tianeptina previene o revierte los posibles cambios neuroendócrinos y conductuales provocados por los tratamientos de estrés crónico y separación materna. Todos los grupos sometidos a separación, estrés o a la interacción de ambos tratamientos presentaron una sobre-activación del eje HHA, lo cual fue atenuado por el tratamiento con tianeptina. Mientras que, el balance MR/GR fue aumentado por la separación materna en el NPV y disminuido en el giro dentado hipocampal de animales no estresados y tratados con tianeptina. Además en los animales estresados, la corticosterona aumentó,y esto fue atenuado tanto por el tratamiento previo de separación materna como el tratamiento simultaneo con el antidepresivo. Por otro lado, en los animales estresados, ya sea criados o separados de la madre, disminuyó la actividad neuronal de la CPFm, mientras que ésta no fue afectada por la droga utilizada. En cambio en el ATV sólo se observó efecto de la droga, la cual disminuyó la actividad neuronal en esta estructura. Tanto la separación como el estrés tuvieron un efecto ansiogénico, el cual fue atenuado por el tratamiento con tianeptina. Por último la actividad neuronal del NAc y los índices de anhedonia no fueron afectados significativamente con ninguno de los tratamientos. En conclusión, los resultados muestran que los eventos de la vida temprana producen alteraciones en la regulación de la respuesta de estrés en el adulto y que el tratamiento con tianeptina produce cambios a nivel central y conductual tendientes a atenuar la desregulación del eje HHA y las modificaciones conductuales, alterados en la depresión.

Fil: Moleón Bersani, María Soledad. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Los cocodrilos son representantes de un antiguo linaje de archosaurios con importancia evolutiva, ecológica y económica. Caiman latirostris (yacaré overo) es una de las dos especies del género Caiman (Crocodylia, Alligatoridae) que habitan en Argentina. En la naturaleza, se enfrentan a numerosos factores estresantes: climáticos, sustancias tóxicas e infecciones, pudiendo afectar los procesos fisiológicos con consecuencias sobre su estado físico y su supervivencia. En este contexto, se realizaron dos ensayos de laboratorio (crónico y agudo) utilizando diferentes factores de estrés ambiental y un estudio a campo incluyendo los factores antrópicos, para medir los efectos sobre los parámetros inmunológicos seleccionados, índices genéricos de condición fisiológica y glucocorticoides en sangre. En el estudio de estrés crónico, la privación de alimentos causó efectos negativos sobre los parámetros de crecimiento, pero desencadenó una inversión en la generación de NAb. El tratamiento donde los animales estuvieron expuestos a temperaturas elevadas resultó ser beneficioso, donde se detectó un mayor crecimiento, además de tener mejores condiciones corporales, niveles más altos de NAb y niveles más bajos de corticosterona. En el ensayo de estrés agudo, los individuos bajo restricción física de movimiento incrementaron los niveles de corticosterona e indujeron una redistribución leucocitaria para aumentar la vigilancia inmune en los órganos. En el estudio a campo, se presentan resultados preliminares. Los pichones tuvieron mayor longitud, altos títulos de NAb y menor actividad del complemento. Estos hallazgos proponen una mirada integral del problema y generan nuevos interrogantes acerca de la interrelación estrés-función inmune-ambiente que expandirá nuestra comprensión. Crocodilians are an ancient lineage of archosaurs with evolutionary, economic, and ecological importance. Caiman latirostris (broad snouted-caiman) is one of the two species of the genus Caiman (Crocodylia, Alligatoridae) that occur in Argentina. In the wild, crocodilians face numerous stressors such as climatic factors, toxicant exposure, and infection that may affect the physiological processes, with consequences on its fitness and survival. In this context, two laboratory assays (chronic and acute) using different stress factors and an observational field study were conducted to measure the effects on the selected immunological parameters, generic indices of physiological condition and glucocorticoids in blood. It was found that in the chronic stress study, food deprivation caused negative effects on growth parameters, but triggered an investment in the generation of NAb. While the treatment temperature was beneficial, in which caimans grew more, had better body conditions, higher levels of NAb and lower levels of corticosterone. In the acute stress assay, individuals under restriction of movement increased corticosterone levels and induced a leukocyte redistribution to increase immune protection in the organs. In the field study, hatchlings had longer length, higher NAb titers and lower complement activity. These findings propose a comprehensive view of the problem and elicit new questions about the stress/immune functions-environment interaction that will expand our understanding. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Agencia Nacional para la Promoción Científica y Tecnológica Universidad Nacional del Litoral

La inducción de estrés agudo previo al entrenamiento de una tarea de aprendizaje espacial deteriora la formación de la memoria a largo plazo. Se han descrito algunos de los mecanismos celulares y moleculares asociados a este efecto en cerebros de roedores, pero se desconocen sus mecanismos epigenéticos. Dado que el entrenamiento en tareas espaciales y el estrés intenso tienen efectos opuestos en el nivel de acetilación de las histonas, es concebible que los efectos deletéreos del estrés sobre la memoria estén mediados por la alteración de su balance. Bajo estos supuestos, se hipotetizó que la inhibición farmacológica de las desacetilasas de histonas evitaría los efectos deletéreos del estrés sobre la memoria. En el presente estudio se evaluó la efectividad de la inhibición de las desacetilasas de tipo I y II con Tricostatina-A para prevenir los efectos a largo plazo del estrés agudo por restricción de movimientos sobre la consolidación de la memoria espacial, los niveles de corticosterona en plasma y cambios en la acetilación de histonas y la expresión del receptor de glucocorticoides (GR/Nr3c1), la desacetilasa de histonas 2 (HDAC2/Hdac2) y subunidades del receptor NMDA (Grin1, Grin2a y Grin2b) en la corteza prefrontal, el hipocampo y la amígdala de ratas Wistar macho adultas. Se encontró que la inhibición de las HDACs evitó que el estrés agudo deteriorara la consolidación de la memoria espacial y potenciara el incremento en los niveles de corticosterona después de la prueba de memoria a largo plazo; además, la inhibición de las HDACs evitó que el estrés indujera cambios en los niveles de acetilación de histonas y en la expresión de GR y HDAC2 en la corteza, el hipocampo o la amígdala de animales entrenados y no entrenados en la tarea espacial. Sin embargo, la inhibición de las HDACs no evitó que estrés agudo alterara la expresión de sub-unidades del receptor NMDA, con excepción de los cambios inducidos en Grin2b en la corteza prefrontal de animales entrenados en la tarea espacial. Estos resultados sustentan la hipótesis de que el deterioro en la consolidación de la memoria espacial causado por estrés agudo supone la alteración del balance de acetilación de histonas, y sugieren que este mecanismo epigenético también tiene un papel en la regulación de la respuesta de estrés y la expresión de GR y HDAC2 en regiones del cerebro que participan en la consolidación de la memoria. Abstract: Acute stress induced before spatial training impairs memory consolidation. Although some cellular and molecular underpinnings of such effect have been described, the epigenetic mechanisms involved have not yet been studied. Since spatial training and intense stress have opposite effects on histone acetylation balance, it is conceivable that disruption of such balance may underlie acute stress-induced spatial memory consolidation impairment, and that inhibiting histone deacetylases would prevent such effect. Here it was tested the histone deacetylase inhibition with Trichostatin-A effectivity to prevent delayed effects of acute stress on: a) spatial memory consolidation, b) plasma corticosterone levels, c) histone acetylation, d) glucocorticoid receptor (GR/Nr3c1), e) histone deacetylase 2 (HDAC2/Hdac2), and f) NMDA receptor subunits (Grin1, Grin2a y Grin2b) expression on prefrontal cortex, hippocampus, and amygdala of male adult Wistar rats. Notably, histone deacetylase inhibition (HDACi) prevented stress-induced memory impairment and stress-induced increased plasma corticosterone levels in trained animals; also, HDACi prevented stress effects on histone acetylation, and GR/Nr3c1 and HDAC2/Hdac2 expression in prefrontal cortex, hippocampus or amygdala of trained and non-trained animals. However, HDACi did not prevent stress-induced effects on NMDAs’ subunits expression, except for Grin2b in the prefrontal cortex of trained animals. The aforementioned results support the hypothesis that acute stress-induced memory impairment is related to altered histone acetylation balance, and suggests an epigenetic regulation of GR and HDAC2 expression in brain regions related to memory consolidation and stress response. Doctorado

Estudios previos de nuestro laboratorio han mostrado que diez minutos después de la administración sistémica de corticosterona se dificulta la recuperación de la memoria espacial en el laberinto de Barnes, sin embargo se desconocen los mecanismos que subyacen a este efecto. Dado que los glucocorticoides ejercen sus acciones a través de los receptores de tipo GR y MR, en el presente estudio se evaluó la participación de estos receptores en el efecto perjudicial rápido de la corticosterona sobre la memoria espacial. Para ello 37 ratas Wistar macho fueron entrenadas en la tarea y 24h después recibieron una inyección subcutánea de antagonista GR, antagonista MR o vehículo. 50min después los animales fueron inyectados con corticosterona o vehículo por vía intraperitoneal y 10min después se evaluó la recuperación de la memoria espacial. Los resultados mostraron que la corticosterona perjudicó rápidamente la recuperación de la memoria espacial a largo plazo, pues los animales inyectados con esta hormona presentaron mayores latencias de escape, mayor número de errores, mayor número de exploraciones y mayor distancia recorrida hasta alcanzar la meta; un efecto revertido solamente con la administración del antagonista MR. Este hallazgo concuerda con estudios in vitro donde se muestra que los efectos rápidos de la corticosterona sobre la trasmisión glutamatérgica en el hipocampo están mediados por los receptores MR. Previous studies of our laboratory have shown that it is difficult to recover the spatial memory in the Barnes maze ten minutes after a systemic administration of corticosterone; however the mechanisms that underlie this effect are unknown. Considering glucocorticoids exert their actions through GR and MR type receptors, the present study evaluated the participation of these receptors in the rapid damaging effect of corticosterone on spatial memory. For this, 37 male Wistar rats were trained on the task and 24 h afterwards they received a subcutaneous injection of GR antagonist, MR antagonist or vehicle. 50 min later the animals were injected with corticosterone or vehicle intraperitoneally and 10 min later, the spatial memory recovery was evaluated. The results indicated that corticosterone rapidly impaired spatial long-term memory recovery, as animals injected with this hormone presented higher escape latencies, more errors, higher exploration and greater traveled distance to reach the goal; an effect reverted only with the administration of the MR antagonist. This finding agrees with in vitro studies showing that the rapid effects of corticosterone on glutamatergic transmission in the hippocampus are mediated by MR receptors.

Introducción. En diversos modelos animales, incluido el de la separación materna durante la lactancia, se ha demostrado que las experiencias tempranas adversas, como el maltrato, el abandono materno y el estrés psicosocial, pueden favorecer el desarrollo de algunas enfermedades mentales, pero no se han descrito completamente varios de los cambios que se producen en el sistema neuroendocrino. Objetivo. Determinar si la separación materna durante la lactancia modificaba los niveles basales de neurohormonas como la corticosterona, la corticotropina (ACTH), la oxitocina y la vasopresina (ADH), en ratas jóvenes (35 días) y adultas (90 días). Materiales y métodos. Se separaron ratas Wistar de sus madres durante dos periodos de tres horas diarias a lo largo de los 21 días de lactancia. A los 35 y 90 días se tomaron muestras de los grupos de las ratas de control y de las separadas de la madre, para obtener el suero y posteriormente medir cada una de las hormonas mediante un ensayo inmunoenzimático. Resultados. Las concentraciones de corticosterona fueron mayores en las hembras adultas de control que en el resto de los grupos, y menores en los machos adultos de control. Las de ACTH fueron mayores en los machos y hembras jóvenes separadas de la madre que en los grupos de adultos. Los niveles de oxitocina fueron significativamente mayores en las hembras adultas separadas de la madre que en los otros grupos y significativamente menores en los machos adultos. En cuanto a la vasopresina, los grupos separados de la madre tuvieron concentraciones menores, en comparación con los grupos de jóvenes y adultos de control. Conclusiones. Estos resultados muestran que el estrés temprano al que fueron sometidas las ratas, produjo cambios en las respuestas del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal, las cuales variaron según el sexo y la edad. Introduction: Work with different animal models including that of maternal separation during nursing has shown that early adverse experiences such as abuse, maternal abandonment and psychosocial stress may favor the development of various psychopathologies. However, several neuroendocrine changes have not been completely described yet. Objective: To establish whether maternal separation during nursing modifies the basal levels of neurohormones such as corticosterone, ACTH, oxytocin and vasopressin in juvenile and adult rats (aged 35 and 90 days, respectively). Materials and methods: Wistar rats were separated from their mothers for two periods of 3 hours per day during the 21 days of nursing. Once these rats had reached 35 and then 90 days of age, blood samples were taken from both the separated and control groups to obtain serum for immunoenzymatic assays and measure the levels of each of the hormones. Results: Concentrations of corticosterone were higher in control adult females in comparison with the rest of the groups and lower in the control adult males. Those of ACTH were higher in the separated young males and females than in the adult groups. Oxytocin levels were significantly higher in the separated adult females in comparison with the other groups and significantly lower in the adult males. With respect to vasopressin, the separated groups had lower concentrations than the young and adult control groups. Conclusions: These results show that the early stress to which rats were submitted produced changes in the basal responses of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, that these responses were distinct in males and females and that they also differed according to age.

Diversas evidencias experimentales demostraron que el desarrollo de insulinorresistencia (IR) se acompaña de cambios en la actividad del eje hipotálamo-hipófiso_adrenal (HHA) que se traducen en variaciones en los niveles sanguíneos de glucocorticoides (GC), tanto en pacientes como en modelos animales de la enfermedad. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos un aumento en los niveles de GC en animales tratados con una dieta rica en sacarosa (DRS) durante 7 semanas que se asoció con una respuesta adrenal disminuida en la prueba de estimulación con la hormona adrenocorticotropina (ACTH). Dado que la principal hormona reguladora de la secreción de GC es la ACTH, el objetivo central de este trabajo de tesis consistió en evaluar los efectos de la administración de DRS sobre la producción de ATCH en distintos estadios del dearrollo de IR y estudiar los mecanismos subyacentes a las alteraciones encontradas a nivel adenohipofisario. En ese marco, evaluamos los efectos del tratamiento antioxidante sobre cambios tempranos inducidos por el consumo de DRS y del ejercicio moderado como medida preventiva de los efectos de la exposición prolongada a la dieta. Los resultados obtenidos indicaron que en el modelo animal de IR por la administración de DRS, los animales presentaron cambios en la secreción de ACTH y corticosterona. En etapas tempranas del tratamiento (3 semanas) encontramos un aumento en la actividad del eje HHA, que fue previa a la detección de cambios en la insulinosensibilidad sistémica (evidente a partir de la séptima semana del inicio del consumo de DRS). Sin embargo, en animales tratados por períodos más prolongados (15 semanas) observamos una disminución de los niveles circulantes de ACTH y de corticosterona. Postulamos que la hiperactivación temprana del eje podría estar asociada con la generación de estrés oxidativo a nivel adenohipofisario, dado que el tratamiento antioxidante sistémico previno tanto el aumento de marcadores de este proceso como la hipersecreción de ACTH. La disminución en la actividad del eje HHA detectada en etapas más tardías del tratamiento podría ser consecuencia de la exposición crónica del tejido hipofisario al estrés oxidativo, inducido por concentraciones elevadas de ácidos grasos no esterificados (AGNE) circulantes, un efecto que podría ser medido por la inducción de autofagia. Demostramos que el ejercicio moderado previno la inducción de estos procesos y la inhibición de la secreción de ACTH en animales alimentados con DRS durante 15 semanas, además de evitar el incremento de AGNE. Finalmente, estudiamos con mayor profundidad estos procesos en células adenohipofisarias en cultivo evaluando el efecto de la incubación de células de la línea ArR-20 con ácido palmítico (C16:O) y con inductores de estrés oxidativo y autofagia. En suma, nuestros resultados indican que la administración de una DRS produce un incremento temprano en la expresión de Pomc y ACTH posiblemente mediada por la generación de estrés oxidativo tisular. Una exposición prolongada del tejido a niveles incrementados de nutrientes, como los ácidos grasos, adicionalmente induce el proceso autofágico, lo que lleva a una hipofunción de la glándula. Los GC afectan el metabolismo estimulando la movilización de las reservas energéticas. Sin embargo, un aumento sostenido de los niveles de estas hormonas podría contribuir al agravamiento de las características metabólicas del síndrome de IR, y precipitar la aparición de las complicaciones a largo plazo relacionadas con la enfermedad. En nuestro modelo, el estado de IR crónico se correlacionó con una inhibición de la actividad basal del eje HHA, lo que contribuiría al restablecimiento de la homeostasis metabólica. Sin embargo, también podría dar lugar a complicaciones adicionales, como la insuficiencia adrenal, afectando la respuesta del organismo frente a situaciones de estrés, lo que representaría otro factor de riesgo para los pacientes con IR. It has been previously described that insulin resistant (IR) individuals (humans and animals) have an altered function of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA), which translates into changes in their blood levels of glucocorticoids (GC). Previous studies from our group have shown that animals fed a sucrose-rich diet (SRD) for 7 weeks exhibit an increase in basal GC secretion, associated with an impairment os adrenal response to an exogenous ACTH challenge. Given that the adrenocorticotropic hormone (ACTH) secreted by the pituitary gland is the main regulator of adrenal function, the main goal of the present study was to analyse the effect of SRD consumption on ACTH production at different stages of the development of IR, and elucidate possible underlying mechanisms operating at pituitary level. In this context, we analyzed the effects of antioxidant treatment on the early changes induced by SRD consumption, and of moderate exercise as a preventive measure to counteract the effects of prolonged exposure to SRD. Our results indicate that in the experimental model of SRD-induced IR, animals present alterations in the production and blood levels of ACTH and corticosterone. In this sense, we observed that SRD treatment induces an early hyperactivation of the HPA axis (3rd week), which was prior to the observed changes in insulin sensitivity (only evident after 7 weeks os treatment). However, as treatment progresses, prolonges SRD-consumption (15 weeks) inhibits basal HPA activity, as evidenced by lower circulating ACTH and corticosterone levels. We propose that the early hyperactivation of the HPA axis found in SRD-treated animals could be associated with the generation of oxidative stress at pituitary level, given that systemic antioxidant treatment prevented the induction of these processes and also ACTH hypersecretion. The impairment in HPA activity induced by long-term SRD treatment (15 weeks), could ba a consequence of chronic overexposure of the pituitary tissue to increased levels of circulating non-esterified fatty acids (NEFA), which could trigger oxidative-stress induced autophagy in ACTH-producing cells. Our results show that moderate exercise prevented the induction of these cellular processes, as well as SRD-induced corticotroph dysfunction, while also normalizing NEFA levels. In order to confirm these results, we studied the underlying mechanisms in cultured corticotrophs by incubating ArT-20 cells in the presence of plamitic acid (C16:O), a main component of the NEFA fraction, or with oxidative stress and autophagy inductors. From these studies we concluded that oxidative stress generation and autophagy mediate POMC inhibition triggered by palmitic acid treatment. Taken together, our results show that SRD administration induces an early increase in Pomc expression and ACTH release, possibly mediated by an increase in oxidative stress at pituitary level. Chronic exposure of pituitary tissue to an increased concentration of nutrients (e.g. fatty acids, among others) additionally induces autophagy in corticotroph cells, which could lead to inhibition of ACTH production. Among other actions, GC affect metabolism by stimulating the mobilization of energy stores in order to cope with increased metabolic demands. However, a sustained increase in circulating GC levels could contribute to aggravate the clinical manifestations of metabolic syndrome. In our animal model, chronic IR correlated with inhibition of basal HPA axis activity, which could help to restore metabolic homeostasis. However, this could also lead to complications, such as adrenal insufficiency, that might affect the response to stressful stimuli, representing an additional risk for patients with IR. Fil: Mercau, María Elisa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Durante el desarrollo prenatal los organismos son vulnerables a factores que puedenafectar su homeostasis. Ha sido demostrado que el estrés durante la preñez tieneefectos en la descendencia que pueden perdurar hasta la adultez, afectandonumerosos procesos fisiológicos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes aún nohan sido completamente dilucidados. El objetivo de esta tesis fue estudiar la participación del óxido nítrico (NO) en lasalteraciones comportamentales y neuroendócrinas inducidas por estrés prenatal (EP). Se observó un incremento en el comportamiento de tipo ansiogénico y un peordesempeño en una tarea de aprendizaje asociativo en machos EP que revirtióparcialmente con un dador de NO. Se detectó una disminución de la óxido nítrico sintasa (NOS) en el hipocampo demachos adultos, mientras que en las hembras no se encontraron cambios. En elhipotálamo se observó un incremento en nNOS en hembras EP, mientras que en losmachos no se observaron cambios. La exposición a estrés agudo en la adultez estimulóel incremento de corticosterona en plasma, que revirtió más lentamente en losmachos EP que en los controles. En las hembras, la recuperación fue más rápida en las EP que en controles. El tratamiento con un dador de NO atenuó la respuesta al estrésen ambos grupos de hembras y en los machos EP, pero no en los controles, en los quefacilitó la reversión. El tratamiento con un inhibidor de nNOS anuló en todos los gruposla reversión de la corticosterona a niveles basales luego del estrés agudo. Por lo tanto,la señalización mediada por NO estaría involucrada en las alteraciones conductuales yneuroendócrinas descriptas en este modelo. During prenatal development organisms are vulnerable to factors that can affecthomeostasis. It has been established that stress during pregnancy affects manyphysiological processes in the offspring that persist in adulthood. However, theunderlying mechanisms have not been fully ellucidated. The objective of this thesis was to study the role of nitric oxide (NO) in the behaviouraland neuroendocrine alterations induced by prenatal stress (PS). An increase in anxiety-like behaviour and an impairment in associative learning in male PS rats were found. Treatment with a NO donor partially reverted these changes. There was a decrease in hippocampal nitric oxide synthase (NOS) in male adults,without changes in females. Levels of hypothalamic nNOS in PS female rats wereincreased, while in male rats there were no changes. Acute stress exposure inadulthood led to an increase in plasma corticosterone levels that reverted slower in PSmales than controls. Treatment with a NO donor atenuated stress response in bothfemale groups and in PS males, while in control males it facilitated reversion. Treatment with a nNOS inhibitor blocked the revertion of corticosterone levels tobasals after stress in all experimental groups. Therefore, NO mediated signaling would be involved in the behavioural andneuroendocrine alterations here described. Fil: Maur, Damián Gustavo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014 Numerosos estudios demuestran que los sistemas neuroendócrino e inmune están en constante comunicación para mantener la homeostasis del organismo y orquestar respuestas coordinadas frente a los distintos desequilibrios y patologías. A pesar de los importantes avances en la comprensión de la interacción entre las distintas hormonas y el sistema inmune, el papel de las hormonas tiroideas (HTs) en el inicio de la inmunidad adaptativa era incierto hasta hace algunos años. En este sentido, el laboratorio en el que se desarrolló esta Tesis Doctoral proporcionó la primera evidencia de la expresión de receptores de HTs (TR), principalmente la isoforma β1, en las principales células presentadoras de antígeno, células dendríticas (DCs) derivadas de médula ósea de ratón. Se demostró que niveles fisiológicos de triiodotironina (T3) inducen la maduración de DCs y la secreción de IL-12. Además, DCs estimuladas con T3 incrementaron la capacidad aloestimulatoria de linfocitos T direccionando la respuesta hacia un perfil T helper 1 mediante la activación de una vía de señalización dependiente de Akt y NF-κB e independiente de PI3K. Por otra parte, el laboratorio en donde se desarrolló esta Tesis Doctoral también demostró la característica del mecanismo de acción de las HTs de interaccionar con otras hormonas en la expresión final de determinadas acciones metabólicas específicas de T3, entre otras con los glucocorticoides (GCs) a nivel hepático. Si bien el tejido hepático es un importante blanco del efecto metabólico de los GCs, éstos son ampliamente utilizados en clínica médica para suprimir diversos estados inflamatorios. Por consiguiente, este trabajo de Tesis Doctoral involucró el estudio de la interrelación entre el sistema endócrino y el sistema inmune. En lo particular, este trabajo se dividió en 2 partes: 1- el estudio de las modificaciones en el mecanismo de acción de las HTs sobre las DCs, inducidas por un GC de síntesis: dexametasona (Dex) y 2- la profundización del estudio del efecto de las HTs a nivel de las DCs. 1- Los resultados obtenidos en la primera parte del trabajo de Tesis Doctoral indicaron que Dex inhibió la maduración, producción de IL-12 y capacidad aloestimulatoria de DCs estimuladas con T3, de manera dependiente del receptor de GCs. Además, los datos revelaron un efecto inhibitorio de los GCs en la maduración y capacidad inmunoestimulatoria de DCs inducidas por T3, a través de mecanismos que implican, al menos en parte, vías de señalización dependientes de NF-κB, Akt y TRβ1. En conclusión, los resultados aquí presentados refuerzan la dinámica interrelación existente entre los GCs y las HTs, sus mecanismos de acción y su regulación tejido-específica, destacando un nuevo mecanismo molecular involucrado en la actividad antiinflamatoria e inmunosupresora de los GCs. 2- Los resultados obtenidos en la segunda parte del trabajo de Tesis Doctoral demuestran que T3 tiene la capacidad de direccionar la respuesta inmune hacia un perfil pro-inflamatorio, ya que aumentó significativamente la producción de las citoquinas TNF-α, IL-6 e IL-23 en las DCs, estimulando la producción de IL-17 en esplenocitos y disminuyendo la población de células T regulatorias. Además, T3 fue capaz de reducir la apoptosis de DCs y aumentar su migración hacia los ganglios linfáticos. En adición, T3 aumentó la capacidad de las DCs para inducir una respuesta inmune citotóxica antígeno-específica in vivo y presentación cruzada in vitro. En consecuencia, se desarrolló una vacunación antitumoral basada en DCs estimuladas con T3 en el modelo tumoral B16-OVA, la cual redujo la incidencia de establecimiento tumoral y el crecimiento del mismo en los ratones afectados, prolongando su sobrevida. Estos efectos estuvieron mediados, al menos en parte, por las células T CD8+ secretoras de IFN-γ. Los hallazgos obtenidos tienen profundas implicancias en la inmunoterapia del cáncer, ya que sugieren fuertemente propiedades adyuvantes de T3 para su utilización en la vacunación antitumoral basada en DCs, que merece evaluación en otros modelos animales y posteriormente en la clínica humana. En conjunto, los resultados de este trabajo de tesis profundizan el conocimiento del efecto de las HTs en el sistema inmune y sientan bases moleculares que permiten tanto la elucidación de disfunciones inmunes en la frecuente patología tiroidea, como así también la manipulación de DCs generadoras de perfiles de células T inmunogénicas y/o tolerogénicas en diferentes estados clínicos. Alamino, Vanina Alejandra. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Pellizas, Claudia Gabriela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Scimonelli, Teresa Nieves. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Cervi, Laura Alejandra. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Juvenal, Guillermo J.. Comisión Nacional de Energía Atómica. División Bioquímica Nuclear; Argentina.

En el presente trabajo se pretende determinar si hay cambios en la concentración de corticosterona en plasma y pelo de ratas Wistar en etapa juvenil sometidas a condiciones de hacinamiento como modelo de estrés crónico. Se utilizaron 18 ratas Wistar machos de 38 días de edad, distribuidas en dos grupos, control y experimental. Los sujetos experimentales se sometieron a un periodo de hacinamiento durante la fase final de la etapa juvenil (27 días). Los sujetos hacinados presentaron disminución significativa P0,05 en el peso final promedio (266,5 ± 9,63g) respecto a los controles (341,2 ± 23,52g), además presentaron aumento significativo P0,05 en los niveles promedio de corticosterona plasmática (470,16 ± 113,24 ng/ml) y pilosa (40,5 ± 9,75pg/mg) frente a los niveles hallados en los controles (232,6 ± 78,72 ng/ml y 19,67 ± 2,57 pg/mg en plasma y pelo respectivamente). Este estudio contribuye al desarrollo científico en la búsqueda de métodos no invasivos para el monitoreo de la corticosterona. Abstract. For this study we determine whether exist changes in levels of plasma and hair corticosterone of young Wistar rats under crowded conditions like chronic stress model. 18 Wistar rats of 38 days old were divided in two groups, control and overcrowding; the experimental subjects were exposed to an overcrowding period during their youth (Post natal day 65). The overcrowded subjects showed significant difference P0, 05 for the final body weight average (266,5 ± 9.63g) compared to control animals (23.52 ± 341,2g). Additionally, the overcrowded group showed higher corticosterone plasma concentration (470, 16 ± 113.24 ng / ml) and also hair corticosterone concentration (40, 5 ± 9.75 pg / mg) compared to control subjects (232, 6 ± 78.72 ng / ml and 19.67 ± 2.57 pg/ml in plasma and hair respectively). This work contributes to the search of noninvasive methods and the monitoring of corticosterone levels. Maestría

Casi toda la investigación farmacológica en estrés y desórdenes de ansiedad es realizada generalmente en poblaciones de animales que se supone son comparables. En el laboratorio de Neurociencia Comportamental de la Pontificia Universidad Católica de Río de Janeiro (Brasil), dos nuevas líneas de ratas Wistar fueron aisladas por la selección fenotípica de la respuesta emocional en el protocolo de condicionamiento de la respuesta de miedo. Una de las líneas, denominada Carioca High Freezing (CHF) muestra una respuesta aumentada de congelamiento en el test, mientras que la otra –Carioca Low Freezing (CLF)– muestra la respuesta opuesta. Aquí presentamos datos orientados a evaluar las condiciones basales y la vulnerabilidad al estrés entre las dos líneas. Los niveles de corticosterona fueron comparados entre las dos líneas tanto en condiciones basales como después de un desafío emocional utilizando el protocolo de miedo condicionado. La comparación entre las concentraciones plasmáticas de corticosterona basal y luego del retest sugiere diferencias basales y diferencias inducidas por el miedo entre las dos líneas. Las diferencias en las condiciones basales es un aspecto importante y relevante que debe ser considerado en experimentos comportamentales que usen o evalúen el estrés y podría ayudar a comprender la variabilidad encontrada en las poblaciones. Nosso grupo no Departamento de Psicologia da Universidade Católica do Rio de Janeiro desenvolveu um modelo genético com ratos que apresentam respostas extremas de congelamento a estímulos contextuais de uma caixa experimental previamente associados a choques elétricos. Uma das linhagens, Carioca High Freezing (CHF) apresenta uma resposta aumentada de congelamento condicionado. A outra linhagem, Carioca Low Freezing (CLF) apresenta a resposta de congelamento condicionada em direção oposta. O presente trabalho comparou os níveis de corticosterona entre as duas linhagens assim como uma terceira linhagem com cruzamento aleatório (RND) tanto em condições basais assim como em um teste onde os animais foram expostos á situação de condicionamento contextual de medo. A comparação entre as concentrações plasmáticas de corticosterona basal e depois do teste sugere diferenças basais assim como diferenças induzidas pelo medo condicionado entre as duas linhagens. As diferenças nas condições basais é um aspecto importante e relevante que deve ser levado em consideração em experimentos que avaliem o estresse e pode ajudar na compreensão da variabilidade nas populações. Our group in the Psychology Department at Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-Rio) developed a rat genetic model of extreme freezing in response to contextual cues in an experimental chamber previously associated with footshock. One of the lines, Carioca High Freezing (CHF), exhibits an enhanced conditioned freezing response, whereas the other line, Carioca Low Freezing (CLF), shows the opposite response. The present study investigated corticosterone concentration between these two lines of animals and a random (RND) line of rats both under basal conditions and test condition after an emotional challenge using a contextual fear conditioning protocol. Comparisons between basal and test plasma corticosterone concentrations suggested differential basal and fear-induced differences between the two lines. The differences between basal conditions is an important and relevant aspect to be considered in behavioral experiments using or assessing stress and could help to understand variability in naïve populations.

En el presente estudio, se realizaron dos experimentos con el propósito de evaluar los efectos del estrés agudo inducido por restricción motora sobre los niveles sistémicos de corticosterona (hormona secretada en situaciones estresantes) y la memoria de dos tipos de omisión de recompensas, extinción en el laberinto de Barnes y Contraste Sucesivo Negativo Consumatorio (CSNc), empleando ratas Wistar macho como sujetos experimentales. En el experimento 1, la restricción fue inducida durante una hora antes de iniciar un ensayo de prueba, 24 horas después de la extinción de la tarea espacial en el laberinto circular de Barnes. Se encontró un efecto leve, en el que el estrés aparentemente facilitó el recobro de la extinción de la preferencia espacial, aunque no afectó los niveles de corticosterona, que fueron similares en los dos grupos evaluados. En el experimento 2, el estrés por restricción, inducido antes del ensayo luego de la devaluación en el procedimiento de CSNc, produjo una supresión del consumo de sacarosa, específico para los animales del grupo con estrés y devaluación. Este efecto se prolongó durante la primera parte de los siguientes ensayos y fue de carácter temporal. De manera congruente, los animales de este grupo presentaron niveles de corticosterona mayores que los sujetos del grupo que solo fue devaluado. Se discute sobre diferencias en las tareas que no permiten hacer una interpretación análoga de los efectos del estrésen ambos experimentos y se plantea la realización de modificaciones procedimentales, para obtener un efecto más robusto del estrés en la recuperación de la extinción. / Abstract. In the present study, two experiments were conducted to evaluate the effects of acute stress induced by restraint on systemic levels of corticosterone (hormone secreted in stressful situations) and the memory of two types of reward omission, extinction in the Barnes maze and Consummatory Successive Negative Contrast (cSNC), using male Wistar rats as experimental subjects. In Experiment 1, the restraint was induced for one hour, before starting a trial run 24 hours after the extinction of the spatial task in the Barnes circular maze. Results show a slight effect. Apparently stress facilitated the recovery of the extinction of the spatial preference, but did not affect corticosterone levels that were similar in both groups evaluated. In Experiment 2, there was a significant enhancement of the cSNC effect by restraint stress, induced prior to the trial after the downshiftin the cSNC procedure,which was specific to the downshifted condition.This effect lasted for the first part of the following trials and was temporary. Consistently, the animals in this group had higher corticosterone levels than subjects in the group only downshifted. It is discussed,the differences in the tasks that do not allow a similar interpretation of the effects of stress in both experiments and considers the implementation of procedural changes, to obtain a more robust effect of stress on recovery from extinction Maestría

Una gran cantidad de evidencia indica que las hormonas liberadas en respuesta al estrés agudo son capaces de mejorar la adquisición o la consolidación de una gran variedad de tareas. Sin embargo, son pocos los estudios realizados para determinar los efectos de la corticosterona en la recuperación de la memoria de reconocimiento de objetos, por lo que el objetivo del presente estudio fue evaluar el posible efecto de la administración sistémica de dos dosis de corticosterona (0,125 o 0,5 mg/kg) en la recuperación a largo plazo de una tarea de reconocimiento de objetos en ratas Wistar macho. Los resultados mostraron que los animales exploraron con mayor frecuencia y durante una mayor cantidad de tiempo el objeto novedoso en comparación con el objeto explorado veinticuatro horas antes, independientemente del tratamiento administrado. Estos resultados muestran que la corticosterona no afecta la recuperación de la información adquirida veinticuatro horas antes (largo plazo), en contraste con lo observado en estudios realizados en nuestro laboratorio en este mismo tipo de tareas evaluadas a corto plazo (una hora). Se sugiere que cuando la tarea es evaluada a largo plazo, ésta ya se encuentra bien consolidada, lo que la hace resistente a los efectos de la corticosterona, de forma análoga a lo observado por otros autores con el uso de inhibidores de la síntesis de proteínas. / Abstract. Considerable amount of evidence indicates that hormones liberated during acute stress improve memory acquisition and memory consolidation in a wide variety of tasks. However, there are few studies that approach the effects of corticosterone on the retrieval of object recognition memory, that is why this study evaluates the possible effect of systemic administration of two doses of corticosterone (0.125 or 0.5 mg/kg) on the retrieval of a long term object recognition task in male Wistar rats. The results show that animals explore more frequently and during more time the new object, in comparison to the sample object, shown twenty four hours earlier, regardless of the treatment received. These results show that corticosterone doesn�t affect memory retrieval for information acquired twenty four hours earlier (long term), in contrast with the results of previous studies fulfilled in our laboratory on this same task evaluated at short term (one hour). It�s suggested that when the task is evaluated at long term, this one is already well consolidated, which makes it resistant to the corticosterone effects, in the same way with the observed by other authors using protein synthesis inhibitors. Pregrado

Las hormonas adrenales, administradas inmediatamente antes o después de una tarea de aprendizaje, modulan la memoria. Este efecto varía de acuerdo al tiempo y a la intensidad con que se incrementan las hormonas. La liberación o administración de glucocorticoides inmediatamente antes o después de una tarea, facilitan la memoria. Por el contrario, la elevación o administración de glucocorticoides antes de una prueba de aprendizaje, deteriora la evocación de la información previamente adquirida. En este trabajo se revisan los principales estudios realizados con animales y humanos acerca del papel de los glucocorticoides sobre la memoria de eventos aversivos. A su vez se describe el efecto de la elevación aguda y crónica de las hormonas adrenales sobre la memoria. The adrenal hormones administered immediately before or after a learning task modulate memory. This effect varies according to time and intensity with which hormones increase. The release or administration of glucocorticoids 0before or after a task, facilitate memory. Althought, the elevation of glucocorticoids before a test of learning deteriorates evocation of information previously learned. This paper presents a review of the animal and human´ studies on the role of glucocorticoids on the memory of aversive events. Also, this paper presents a description about the effect of acute and chronic elevation of adrenal hormones on memory. Fil: Ruetti, Eliana Martha. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Médicas. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; Argentina Fil: Mustaca, Alba Elisabeth. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Médicas. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; Argentina Fil: Bentosela, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Médicas. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; Argentina

Las hormonas adrenales, administradas inmediatamente antes o después de una tarea de aprendizaje, modulan la memoria. Este efecto varía de acuerdo al tiempo y a la intensidad con que se incrementan las hormonas. La liberación o administración de glucocorticoides inmediatamente antes o después de una tarea, facilitan la memoria. Por el contrario, la elevación o administración de glucocorticoides antes de una prueba de aprendizaje, deteriora la evocación de la información previamente adquirida. En este trabajo se revisan los principales estudios realizados con animales y humanos acerca del papel de los glucocorticoides sobre la memoria de eventos aversivos. A su vez se describe el efecto de la elevación aguda y crónica de las hormonas adrenales sobre la memoria. The adrenal hormones administered immediately before or after a learning task modulate memory. This effect varies according to time and intensity with which hormones increase. The release or administration of glucocorticoids 0before or after a task, facilitate memory. Althought, the elevation of glucocorticoids before a test of learning deteriorates evocation of information previously learned. This paper presents a review of the animal and human´ studies on the role of glucocorticoids on the memory of aversive events. Also, this paper presents a description about the effect of acute and chronic elevation of adrenal hormones on memory.

Dado que en la síntesis de hormonas esteroides a partir de colesterol participan distintos citocromos P450, que son hemoproteínas, es posible que exista una relación entre la síntesis de esteroides y la de hemo. Con el fin de analizar esta posibilidad, en el presente trabajo se estudió el efecto del agregado de hemina sobre la síntesis de esteroides en adrenales de rata. Se encontró que la adición de hemina in vitro a homogenatos de adrenal o la administración de hemina a ratas in vivo, estimulan la síntesis de esteroides. Por otro lado, 3,5-dietoxicarbonil-1,4-dihidrocolidina, fue capaz de inhibir la síntesis de hemo en adrenal similarmente a lo que ha sido descripto en hígado, por inhibición de la última enzima de esta biosíntesis, la ferroquelatasa. El bloqueo de la síntesis de hemo en adrenal con DDC produjo una disminución de la acumulación de aldosterona y corticosterona producida por ACTH. Este efecto del DDC fue parcialmente revertido por tratamiento de las ratas con hemina. Es decir que el contenido de hemo es un factor limitante de la respuesta de un estimulador de la síntesis de esteroides como ACTH. El fenobarbital, un conocido inductor de la síntesis de hemo, que estimula la transcripción de la enzima regulatoria de esta biosíntesis, el ALA-sintasa, actuando sobre el promotor de este gen que es el mismo que se expresa en adrenal, fue capaz de estimular la síntesis de aldosterona y corticosterona en adrenales de rata. Además, se encontró que estimuladores de la síntesis de esteroides en adrenal, como ACTH y endotelina, son capaces de aumentar el mRNA de ALA-sintasa de modo de asegurar una suficiente provisión de hemo para transformar los apociticromos libres, involucrados en síntesis de esteroides, en holocitocromos activos. Es decir que la disponibilidad de hemo afecta la síntesis de esteroides y los estimuladores de la síntesis de esteroides aumentan el mRNA de ALA-s para asegurar esta disponibilidad. También en este trabajo se investigó la participación de glicosilfosfatidilinositol (GPI) en la respuesta de ACTH. Teniendo en cuenta que se había informado que ACTH estimula una fosfolipasa C que hidroliza GPI, lo que libera inositolfosfoglicano (IGP), que es capaz de inhibir la acumulación de esteroides mediada por ACTH y que ACTH estimula la liberación al medio extracelular de fosfatasa alcalina, una enzima anclada a la superficie celular por GPI; se quiso investigar si la liberación de fosfatasa alcalina por ACTH está mediada por una fosfolipasa C que hidroliza GPI y el mecanismo involucrado en la activación de esta fosfolipasa. Se encontró que ACTH a través de AMPc activa una Gi que es necesaria para la activación de una fosfolipasa C de GPI involucrada en la liberación de fosfatasa alcalina por la hormona. Es decir que el receptor de ACTH, como ha sido descripto con otros receptores acoplados a Gs que estimulan la producción de AMPc, es capaz de producir un posterior acoplamiento a Gi mediado por AMPc. Este acoplamiento a Gi media la activación de una fosfolipasa C de GPI lo que produce IPG que, como se había visto, es capaz de inhibir la respuesta de la hormona. Por lo tanto, la respuesta de ACTH se inicia con un acoplamiento a Gs y posteriormente un acoplamiento a Gi que mediaría una señal de apagado de la respuesta. Since different cytochromes P450, which are hemeproteins, are involved in steroid biosynthesis; an interdependence between heme and steroid biosynthesis might occur. In order to evaluate this possibility, the effect of the addition of hemin on steroid biosynthesis in rat adrenals was investigated. It was found that in vitro addition of hemin to adrenal homogenates as well as hemin administration to rats in vivo increase steroid production. On the other hand, DDC, 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydro-2,4,6-trimethylpyridine, was able to inhibit heme biosynthesis in adrenal in a way similar to that reported for liver, by inhibiting the last step in heme biosynthesis, ferrochelatase activity. The blockage of heme biosynthesis in adrenal with DDC provoked a decrease in ACTH-mediated aldosterone and corticosterone accumulation. The effect of DDC was partially reversed by ACTH treatment. Thus adrenal heme content is limiting the response of an stimulator of steroid synthesis such as ACTH. Phenobarbital, a known activator of heme synthesis, which stimulates the transcription of the regulatory enzyme of this pathway, ALA-synthase, upon activation of the promotor of this gene that is also expressed in adrenal, was able to increase aldosterone and corticosterone synthesis in rat adrenal. In addition, it was found that simulators of steroid biosynthesis, such as ACTH and endothelin, were able to increase, the mRNA of ALA-synthase, in order to provide enough heme to transform steroidogenic apocytochromes into active holocytochromes. In conclusion, heme availability affects steroid biosynthesis and stimulators of steroid biosynthesis increase ALA-synthase mRNA to ensure this availability. It was also investigated the involvement of glycosylphosphatidylinositol (GPI) in ACTH action. Taking into account that it was reported that ACTH activates a GPI-phospholipase C releasing inositolphosphoglycan (IPG) which inbhibits ACTH-mediated steroid accumulation and that ACTH increases the release to the extracellular medium of a GPI-anchored protein, alkaline phosphatase; the involvement of GPI-phospholipase C on the release of this enzyme by the hormone and its mechanism of activation was evaluated. It was found that ACTH through cAMP activates Gi, which mediates the activation of a GPI-phospholipase C that releases alkaline phosphatase. Thus ACTH receptor, as it was reported for other Gs-coupled receptors which increase cAMP production, is able to couple to Gi and the switch is mediated by cAMP. Once coupled to Gi, ACTH receptor activates a GPI-phospholipase C which in turn produce IPG that is able to inhibit ACTH action. ACTH action is initiated by coupling to Gs, then cAMP-mediated switch to Gi occurs, which signals to turn off the response. Fil: Martini, Claudia Noemí. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Los glicosilfosfatidilinositoles (GPIs) son una familia decompuestos que pueden actuar como anclas de proteínas a membranascelulares y también pueden estar libres en estas membranas. Porhidrólisis de GPI con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC)se libera inositolfosfoglicano (IPG) que ha sido propuesto como segundomensajero de insulina y otras hormonas. Resultados del laboratoriomostraron que ACTH es capaz de hidrolizar GPI y que un IPG conestructura conservada purificado de Trypanosoma cruzi es capaz deinhibir la acumulación de aldosterona mediada por ACTH en célulasadrenocorticales de vaca. El objetivo de este trabajo fue estudiar: a) GPIs presentes encorteza adrenal bovina, b) La participación de estos compuestos en larespuesta de ACTH y c) GPI y sus precursores en Schizosaccharomycespombe, una sistema no estudiado hasta el presente, con el fin de buscaruna fuente de GPI para los estudios biológicos. En este trabajo se mostró la presencia de anclas de GPI en cortezaadrenal pues se encontraron compuestos suceptibles a ácido nitroso y sepurificó parcialmente una enzima anclada por GPI la fosfatasa alcalina, FAL, cuyo ancla fue utilizada como fuente de IPG y se probó su efectoinhibitorio sobre la respuesta de ACTH. Con respecto a la participación de GPI en la respuesta de ACTH,se encontró que esta hormona es capaz de activar una PI-PLC, a travésde una proteína G inhibible por toxina de pertussis, Gi/o, en célulasadrenocorticales, lo que muestra que el receptor de ACTH puedeacoplarse a más de un tipo de proteína G (Gs, Gi). La activación de PI-PLCpor la hormona sugiere la producción de IPG. Se encontró que un IPG purificado de T. cruzi, fue capaz de inhibir en célulasadrenocorticales la producción de aldosterona, corticosterona (en rata) ycortisol (en vaca). ACTH utiliza AMPc como segundo mensajero. Losresultados sugieren que el efecto inhibitoriode IPG estaría mediado poruna activación de fosfodiesterasa, enzima que degrada AMPc, y unainhibición de PKA. Se sabe que IPG es liberado al medio extracelular y luego entra enla célula donde actúa. En concordancia con este hecho hemos visto que: a) los sobrenadantes de células tratadas con ACTH son capaces deinhibir la respuesta de la hormona y b) el agregado del anticuerpo anti-CRDcontra IPG aumenta la acumulación de esteroides mediada por ACTH. Estos resultados muestran que ACTH es capaz de liberar IPG elcual inhibe su respuesta y reafirman la hipótesis de que el IPG participaen la respuesta fisiológica de esta hormona. Por otro lado, con el objeto de obtener una fuente de GPI pararealizar los estudios biológicos, más fácil de trabajar que eltrypanosoma, se estudiaron GPI y sus precursores, losinositolfosfolípidos, en S. pombe, pues se ha encontrado que en otralevadura, Saccharomyces cerevisiae, estas anclas son abundantes. S.cervisiae es la única levadura cuyos GPIs han sido estudiados hasta elmomento por lo cual fue interesante encarar el estudio de otra levadura, Schizosaccharomyces pombe de caracteristicas biológicas diferentes a S.cervisiae. Se ha visto que los inositolfosfolípidos consisten principalmente enfosfatidilinositol y no contienen alquilglicerol ni ceramida. Se ha obtenidola estructura completa de estos inositolfosfolípidos por estudios en TLC, RPTLC y CGL, a partir de cultivos con o sin incorporaciones de palmiticoradioactivo. Se encontró un único ácido graso esterificando la posición 2de fosfatidilinositol y una mezcla en posición 1. A pesar de que no seincorporó ceramida en inositolfosfoceramidas, se demostró la existenciade [³H]-esfingomielina, esfingofosfolípido característico de mamíferos,conteniendo ceramida radioactiva. Se detectó una banda de proteínas de PM 19.000 aproximadamente que incorpora [³H]-ácido palmitico. Luegode digestión con proteasa e hidrólisis con GPI-PLD se liberaron lípidosmarcados que prueban la existencia de anclas en esta fracción. Por otra parte, se evidenció la presencia de GPIs libres enextractos orgánicos por susceptibilidad a ácido nitroso y PIPLC. Estoscompuestos, fueron utilizados como fuentes de IPG y se probó su efectoinhibitoriosobre la acumulación de corticosterona por ACTH. Glycosylphosphatidylinositols (GPIs) are best known as membraneanchors found on many eukaryote plasma membrane proteins rangingfrom protozoal to mammalian molecules. The hydrolysis of GPI byphosphatidyl-inositol phospholipase C (PI-PLC) releases an inositolphosphoglycan (IPG) which has been proposed to mediate the action ofdifferent hormones. Previous studies from our group demonstrated that ACTH was ableto induce hydrolysis of GPI and that the IPG derived from T.cruzi inhibited ACTH-mediated accumulation of aldosterone in bovine adrenocorticalcells. In this study we have investigated: a) the presence of GPI in bovineadrenal cortex, b) the involvement of this compound in ACTH signaling c)the presence of GPI and its precursors in Schizosaccharomyces pombe inorder to obtain a GPI source for biological studies. Compounds sensitive to nitrous acid treatment were found inadrenal cortex which proved the presence of GPI in this system. Anenzyme anchored by GPI, alkaline phosphatase, was partially purifiedfrom this tissue and was used as a source for IPG. This IPG was able toinhibit ACTH-mediated steroid accumulation. It was found that ACTH activates PI-PLC through a pertussis toxinsensitive G protein, Gi/o, in adrenocortical cells. This indicates that the ACTH receptor can activate different G proteins (Gs, Gi). PI-PLCactivation would release IPG. An IPG of chemically defined structure obtained from T. cruzi wasshown to inhibit ACTH-stimulated aldosterone and corticosteroneproduction in rat adrenocortical cells as well as cortisol accumulation inbovine adrenocortical cells, suggesting that IPG signaling could be aconserved mechanism in mammalian ACTH action.cAMP is the second messenger in ACTH response. In agreement, IPG inhibition of ACTH action was found to be a consequence of aphosphodiesterase activation and protein kinase A inhibition. It is known that IPG is released to the extracellular medium andthen re-enters the cell by an energy-dependent mechanism. Accordingly,we found that: a) the supernatants from ACTH-treated cells were able toinhibit the stimulation of corticosterone production by the hormone; b) theaddition of IPG antibodies (anti-CRD) to adrenocortical cells increased ACTH-response. These results demonstrate that ACTH stimulates IPGrelease which in turn inhibits adrenal steroids production by the hormone. In order to obtain GPI for signaling experiments from an enrichedsource different from Trypanosoma cruzi, GPI and related lipids from afission yeast, S. pombe, were studied. At present, S. cerevisiae is the onlyyeast where GPI structures have been determined and seem to beabundant. It was interesting to study these compounds from anotheryeast, S. pombe, which differs from S. cerevisiae in several biologicalfeatures.lnositolphosphoceramide was found to be the main usphingolipid in S. cerevisiae. In contrast, diacylglycerol containing inositol phospholipidshave been identified as the unique inositolphospholipids (IPLs) in S.pombe extracts and the complete structure of these compounds havebeen determined by TLC, RPTLC and GLC from [³H]-palmitic acid labeledor non-labeled cultures. A unique fatty acid esterified the sn-2 position of IPLs. In contrast, different fatty acids were found in the sn-1 position ofthese compounds. Sphingomielin, a sphingophospholipid characteristic ofmammalian cells, containing [³H]-palmitic acid-labeled ceramide wasdetected. A GPI-anchored protein of 19 kDa has been found by [³H]palmiticacid metabolic labeling. Evidence for free GPIs was shown bynitrous acid release of inositol phospholipids from sugar containing lipids. IPGs obtained from these GPIs by PI-PLC treatment proved to inhibit ACTH action. Fil: Vaena, Silvia Graciela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.