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Los resultados obtenidos al estudiar el posible rol fisiológico y las propiedades cinéticas y estructurales de la enzima málica dependiente de NADP purificada de trigo sugieren la existencia de una única isoforma de 72 kDa en los tejidos de esta especie C3. Esta enzima fue purificada a homogeneidad a partir de tallos y raíces de trigo y con ella se realizaron estudios cinéticos. La enzima no presenta histéresis. Los valores obtenidos de pH óptimo coinciden con los anteriormente descriptos para otras enzimas de plantas C3 y CAM y difieren con el comportamiento de la enzima de plantas C4. La actividad enzimática fue absolutamente dependiente de la presencia de un catión bivalente (Mg2+ o Mn2+), mostrando cinéticas de saturación no hiperbólicas como sucede con la EM-NADP de plantas C4. Por otra parte, las curvas de saturación obtenidas en función da la concentración de NADP y L-malato fueron hiperbólicas. La actividad de EM-NADP fue inducida por tratamiento con celulasa macerosima y glutatión, y este aumento fue asociado con aumentos de proteína determinado a partir de Western blots. Estos resultados sugieren que la EM-NADP de plantas C3 podría estar involucrada en la biosíntesis de lignina relacionada con respuestas de defensa de la planta, proveyendo de NADPH a los dos pasos dependientes de NADPH de la biosíntesis de monolignol. Las EM-NADP de maíz y de trigo se disocian en un medio acidico y bajas temperaturas de manera secuencial siguiendo el orden T-D-M. Las entalpías para los equilibrios fueron negativas, pero el proceso total provoco un cambio de energía libre estándar positiva siendo la entropía del sistema un factor importante en ambos equilibrios. La presencia de Mg2+, NADP y L-malato modifican los equilibrios entre M, D y T dependiendo de la fuente enzimática. El catión indujo la agregación de ambas enzimas hacia la forma tetramerica, mientras que el L-malato no modifico el estado oligomérico de la EM-NADP de ambas fuentes. El NADP no cambio el estado multimérico de la enzima de maíz aunque la enzima de trigo se asoció en presencia de la coenzima. Por último, el glicerol estabilizo la forma tetramerica en ambos sistemas, mientras que un aumento en la fuerza iónica favoreció la disociación de la estructura oligomérica de la EM-NADP. Estos resultados favorecen la idea de que la EM-NADP de maíz y de trigo existiría en varios estados oligoméricos (M, D y T) in vivo y que este proceso de asociación-disociación podría estar mediada por la concentración de metabolitos en el medio, condiciones de luz, fuerza iónica y el pH. La actividad de la enzima málica dependiente de NADP fue inducida por radiación UV-B, al igual que el contenido proteico y el ARNm a casi el mismo nivel que por altos niveles de luz blanca dependiendo de la intensidad de la luz y la duración del tratamiento. El efecto de la radiación UV-B fue también eficaz cuando se administraron pequeñas dosis de UV-B seguidas por un tratamiento de oscuridad. La luz roja fue efectiva en la inducción de EM-NADP, de manera similar a la radiación UV-B, administrada tanto en forma continua como por periodos cortos. Nuestros resultados también muestran también que luego de una exposición corta bajo luz roja lejana aplicada inmediatamente después de los pulsos de luz UV-B o roja el efecto inductivo sobre la enzima málica se reduce significativamente, y el efecto de la luz roja lejana se revierte por un pulso final con luz roja o UV-B. De esta manera proponemos que elevados niveles de EM-NADP podrían proveer a las plantas con mayor cantidad de poder reductor para reparar a la célula y además aumentar el contenido de piruvato y NADPH para la respiración mitocondrial. Las especies C3 de Flaveria poseen baja actividad de EM-NADP, que es principalmente atribuida a la forma de mayor masa molecular de la enzima, mientras que las especies C4 de Flaveria poseen muy altas actividades de EM-NADP en hojas atribuible a la presencia en forma mayoritaria de la isoforma de baja masa molecular. La isoforma de mayor masa molecular en las especies de Flaveria C3 parece poseer una mayor Km para el NADP que la forma de menor masa molecular de las especies de Flaveria C4. Los Western blots realizados con extractos proteicos de hojas de distintas especies C3 muestran que la banda inmunoreactiva mayoritaria es el monómero de 72 kDa y presenta bajos niveles de las formas de menor masa molecular (62 y 64 kDa), mientras que las especies de Flaveria C4 muestran una banda muy reactiva de 62 kDa de la EM-NADP, y bandas menores de 64 y 72 kDa. En las especies C3 y C4 existen hasta tres formas monoméricas de la enzima de 62, 64 y 72 kDa, y la cantidad relativa de cada forma puede variar entre los intermediarios. En hojas de especies similares a C4, existen dos bandas predominantes (62 y 64 kDa), estando la forma de 72 kDa presente en muy bajos niveles. En conjunto, todos estos resultados demuestran la presencia de 3 isoformas de la EM-NADP con diferentes masas moleculares en Flaveria, un aumento en la expresión de las forma de 64 kDa desde las especies C3 hasta las similares a C4, y un aumento en la expresión de la forma de 62 kDa y una disminución de la expresión de la forma de 72 kDa desde las especies C3 hasta las C3-C4, similar a C4 y las C4. La EM-NADP se localiza principalmente en los cloroplastos, tanto en células mesofilicas de las plantas C3 y en ambos tipos de células fotosintéticas en las otras especies siendo mayoritaria la marca en células de la vaina vascular en las especies C4. En especies intermedias, la marca mayoritaria se encontró en los cloroplastos de la vaina vascular mientras que una marca significativa también se observó en cloroplastos mesofilicos. Se observaron tres formas activas de la EM-NADP en hojas de la especie intermediaria C3-C4 F. floridana que se diferencian por masa molecular y puntos isoeléctricos nativos. La EM-NADP se encuentra parcialmente compartamentalizada en los distintos tipos de células fotosintéticas, obteniéndose una mayor actividad específica y una mayor expresión de las formas de 64 y 62 kDa en la fracción correspondiente a los cloroplastos de la vaina vascular. La forma purificada de 62 kDa presenta propiedades cinéticas intermedias entre las enzimas málicas de plantas C3 y C4. La enzima exhibe un máximo de actividad a pH 7,5 de manera similar a lo observado con otras enzimas de plantas C3 y CAM y difiriendo con el comportamiento de la enzima de plantas C4. La actividad enzimática depende de la presencia de un catión bivalente (Mg2+ o Mn2+). Las cinéticas de saturación obtenidas para NADP y L-malato fueron hiperbólicas y no se observó inhibición por L-malato a pH 7,0, difiriendo al comportamiento de plantas C4 e indicando que la enzima presenta características intermedias. En resumen, la forma purificada representa una forma enzimática no descripta hasta el presente. Fil: Casati, Paula. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos (CEFOBI- CONICET); Argentina.

La radiación UV-B es la forma más energética de luz solar que alcanza la superficie terrestre, y a la que las plantas se encuentran inevitablemente expuestas. Dosis elevadas de UV-B, como las que se perciben durante el verano, producen daño en diversas biomoléculas y afectan el crecimiento de las plantas.En particular, la inhibición del crecimiento de las hojas se debe a que el UV-B afecta los procesos de proliferación y/o expansión celular, como consecuencia, en parte, del daño que produce en el ADN. En Arabidopsis thaliana existen diversas vías que controlan estos procesos, aunque la participación de la mayoría de ellas en las respuestas al UV-B, así como la presencia de una conexión entre las mismas, aún no han sido dilucidadas. Conjuntamente, el remodelado de la cromatina es un proceso fundamental en la respuesta al daño en el ADN. El complejo CAF-1, una chaperona de histonas de tipo H3/H4, participa en la reparación del daño al ADN, en los procesos de recombinación y en el control de la expresión de diversos genes. Si bien se ha descripto su participación en la respuesta al estrés causado por diferentes agentes genotóxicos, aún no se ha estudiado si interviene en las respuestas al UV-B.En este trabajo de Tesis se demostró que los factores de transcripción E2Fb y E2Fc, pertenecientes a la vía del Retinoblastoma, participan de la regulación del crecimiento de Arabidopsis luego de la exposición al UV-B a través de mecanismos diferentes, aunque ambos regulan de manera antagónica la expresión de E2Fe, otro factor de transcripción cuya participación en la respuesta al UV-B ya ha sido dilucidada. Por un lado, E2Fc regula la expresión de genes de respuesta al daño en el ADN y actúa de manera epistática sobre el microARN 396, el cual también interviene en la regulación del crecimiento de las hojas bajo condiciones de iluminación con UV-B. Por otro lado, E2Fb contribuye, en parte, con las respuestas al UV-B mediadas por E2Fe, al regular el inicio del endociclo. En lo que respecta a CAF-1, se determinó mediante la utilización de líneas de Arabidopsis deficientes en la actividad de este complejo, que cumple funciones diferentes en las hojas y en las raíces en respuesta a la radiación UV-B. Esto puede deberse a que la participación de CAF-1 en los mecanismos de respuesta a este tipo de estrés sea específica para cada tipo de tejido.En conclusión, los resultados obtenidos indican que existe una compleja red regulatoria para mantener el crecimiento de las plantas en función de las condiciones ambientales, y en particular frente a niveles incrementados de radiación UV-B. Fil: Gomez, Maria Sol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; Argentina

Capítulo 1: “Estudio del rol de enzimas que participan en la acetilación de histonas en las respuestas frente a la radiación UV-B en plantas de Arabidopsis thaliana” Arabidopsis thaliana posee cuatro familias de histonas acetiltransferasas, la familia GNAT que posee 3 miembros denominados HAG1, HAG2 y HAG3; la familia MYST que posee 2 miembros, HAM1 y HAM2; la familia p300/CBP que posee 5 miembros denominados HAC1, HAC2, HAC4, HAC5 y HAC12; y la familia TAFII250, que posee 2 miembros, HAF1 y HAF2. En este trabajo de Tesis, la utilización de plantas de Arabidopsis thaliana con niveles nulos o disminuidos de las histonas acetiltransferasas de las familias HAG, HAC y HAF nos permitió demostrar que las histonas acetiltransferasas HAG3, HAF1 y HAC1 tienen diferentes roles durante la exposición de las plantas a la radiación UV-B, debido a que regulan la expresión de genes de respuesta al UV-B que son necesarios para el desarrollo de las mismas en respuesta a esta radiación. Capítulo 2: “Estudio del crecimiento de la hoja de plantas de maíz expuestas al UV-B solar” En Argentina, la producción agropecuaria es uno de los ejes de la economía, siendo el maíz uno de los principales cultivos. En trabajos anteriores se demostró que la radiación UV-B inhibía el crecimiento de las hojas de maíz. En este trabajo de Tesis, demostramos que los niveles de radiación UV-B presentes en la radiación solar inhiben el crecimiento de las hojas de maíz como consecuencia de una disminución en la producción celular; y esta respuesta está mediada, en parte, por el factor de transcripción ZmGRF1. Fil: Fina, Julieta Paola. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; Argentina

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014 La DNA glicosilasa METHYL BINDING DOMAIN 4 (MBD4) al igual que el gen codificante para la misma están muy bien caracterizados en animales. Sin embargo, al presente no existen estudios sobre el gen que codifica para esta enzima en plantas, donde se desconoce su patrón de expresión, participación en procesos biológicos y de desarrollo y sus efectos sobre respuestas al estrés. En bacterias y animales MBD4 forma parte de uno de los sistemas de reparación del DNA donde actúa como DNA glicosilasa monofuncional. Estructuralmente MBD4 pertenece a la superfamilia HhH-GPD y actúa sobre diversos sustratos, constituyendo una enzima multifacética implicada en diversos procesos celulares. En este trabajo de Tesis doctoral se seleccionó y caracterizó un homólogo de MBD4 de humanos en Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), llamada METHYL BINDING DOMAIN 4- LIKE (MBD4L). Los resultados contenidos en este trabajo indican que AtMBD4L presenta dos transcriptos alternativos, uno de ellos no descripto anteriormente. Ambos transcriptos codifican para dos proteínas nucleares que conservan intacto el dominio DNA glicosilasa y difieren en la región N-terminal. Se observó, además que el dominio de MBD4L presenta una estructura similar a la descripta para la superfamilia HhH-GPD DNA glicosilasa, a la cual también pertenece MBD4 de animales y está muy conservado desde bacterias hasta humanos, aunque no presenta proteínas homólogas en Arabidopsis. Para contribuir a la caracterización funcional del gen se estudió la participación de AtMBD4L en procesos de desarrollo y en respuestas al estrés biótico y abiótico. Se determinó que MBD4L participa en la decondensación de heterocromatina centromérica que sufre el genoma de Arabidopsis en infecciones con Pseudomonas syringaae pv. tomato DC3000 (P. syringae pv. tomato) y favorece el crecimiento del patógeno en la planta. Además, el análisis de fenotipos en plantas mutantes y silenciadas para AtMBD4L indicó que dicho gen participa en procesos del desarrollo vegetativo y reproductivo de Arabidopsis. Por otra parte, para abordar la participación de MBD4L en respuestas al estrés abiótico se utilizaron plantas mutantes y líneas transgénias sobre-expresantes, las cuales demostraron que MBD4L estimula la tolerancia al estrés oxidativo y salino en plantas adultas, pero no durante la germinación. Finalmente, durante este trabajo de Tesis doctoral se propusieron diferentes blancos para MBD4L, aunque por el momento se desconoce le mecanismo de acción. En condiciones de infección con el patógeno bacteriano, MBD4L podría actuar sobre las repeticiones y transposones centroméricos, permitiendo la activación de reguladores negativos de la defensa. Durante el desarrollo, MBD4L podría regular la expresión de FLC, determinando el tiempo de floración, posiblemente mediante mecanismos epigenéticos. En condiciones de estrés oxidativo y salino en plantas adultas, MBD4L podría participar en la reparación del genoma de Arabidopsis, removiendo mutaciones tales como U:G, T:G y 5-hmU. Fil: Nota, María Florencia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Alvarez, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Alvarez, María Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Paraje, María Gabriela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Escuela de Biología; Argentina. Fil: Paraje, María Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Fil: Genti de Raimondi, Susana Del Valle. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Genti de Raimondi, Susana Del Valle. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Argaraña, Carlos Enrique. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Argaraña, Carlos Enrique. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Casati, Paula. Universidad Nacional de Rosario; Argentina. Fil: Casati, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; Argentina.

Fil: Arce, Agustín Lucas. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. La familia HD-Zip de factores de transcripción (FTs) de plantas está compuesta por proteínas que unen ADN a mediante un homodominio y dimerizan a través de un cierre de leucinas. Los miembros de la subfamilia I están principalmente involucrados en respuestas relacionadas al ABA y reconocen con máxima afinidad la misma secuencia. Sin embargo, generan una variedad de fenotipos cuando son expresados utilizando el promotor 35SCaMV. Para estudiar esta divergencia funcional, se realizó un análisis filogenético y se identificaron 6 clados con regiones C terminales (RCTs) características. Éstas presentaron motivos de activación AHA y sitios putativos de fosforilación y sumoilación. Mediante ensayos de símple híbrido en levaduras se observó la capacidad de transactivar de la RCT de AtHB13. La expresión en Arabidopsis de proteínas quiméricas mostró que estas regiones son funcionalmente divergentes in planta. Por otra parte, se reconstruyó una red de regulación transcripcional involucrando FTs HD-Zip I y II. Se utilizaron microarreglos de tratamientos de estrés abiótico de Arabidopsis, obteniéndose listas de blancos directos putativos para cada FT, llamadas módulos de actividad transcripcional (MATs). Los promotores de los genes de los MATs presentaron elementos ABRE, señalando una potencial regulación cruzada con otros FTs. La coordinación de la expresión en estrés por calor sugirió una participación de los FTs HD-Zip en esta respuesta. La caracterización funcional de los MTAs mostró categorías nuevas y desconocidas para los FTs estudiados. Este trabajo profundiza nuestro conocimiento sobre los mecanismos de acción de los FTs HD-Zip y genera nuevas hipótesis para investigaciones futuras. The HD-Zip family of transcription factors (TFs) is composed of proteins that bind DNA through a homeodomain and dimerize through a leucine zipper. Subfamily I members are mainly involved in ABA responses and bind the same sequence with maximum affinity. Nonetheless, they generate a variety of phenotypes when expressed under the 35SCaMV promoter. To study the source of this functional divergence, a phylogenetic and functional analysis was performed with 178 proteins, allowing the identification of 6 clades with characteristic C-terminal regions (CTRs) outside the HD-Zip domain. These regions presented AHA activation motifs and putative phosphorylation and sumoylation sites. Yeast-one hybrid assays verified the activation capability of the CTR of AtHB13. The overexpression in Arabidopsis of chimerical proteins from HaHB1 and HaHB4 and their phenotypical analysis showed that these regions are also functionally divergent in planta. The reverse engineering of the transcriptional regulatory networks in which HD-Zip I and II TFs participate was also performed. A dataset involving different abiotic treatments in Arabidopsis was used and lists of putative targets were obtained for each TF, called modules of transcriptional activity (MTAs). The promoters of MTA genes presented ABRE elements, indicating a potential cross-talk with TFs from other families. Coordinated expression of MTA genes was observed under heat stress, suggesting a previously unknown participation of HD-Zip TFs in this stress. The functional characterization of MTA genes revealed new and previously associated categories. This work improves our knowledge on the mechanism of action of HD-Zip TFs and generates new hypothesis for future research. Universidad Nacional del Litoral Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas