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El género Bordetella está compuesto por especies que pueden causar infecciones respiratorias en diversos organismos. Entre ellas se encuentra Bordetella pertussis, un patógeno exclusivo de humanos y agente causal de la enfermedad conocida como tos convulsa. Para llevar a cabo la infección, B. pertussis expresa una serie de factores de virulencia que se encuentran regulados principalmente por la actividad del sistema de dos componentes BvgAS. Sin embargo, en los últimos años han surgido evidencias que demuestran que hay otros mecanismos regulatorios adicionales involucrados en la expresión de los factores de virulencia. En nuestro laboratorio, nos encontramos abocados al estudio del sistema de señalización mediado por el segundo mensajero c-di-GMP y su rol en la patogénesis de bacterias del género Bordetella. Los niveles de c-di-GMP en la célula se encuentra controlados por la actividad de dos familias de proteínas: diguanilato ciclasas y fosfodiesterasas, que sintetizan y degradan el segundo mensajero, respectivamente. Estas proteínas pueden identificarse en los genomas bacterianos debido a la presencia de dominios conservados: GG(D/E)EF para las diguanilato ciclasas y EAL o HD-GYP para las fosfodiesterasas. En este contexto, el objetivo del presente trabajo de tesis es evaluar si la señalización por c-di-GMP es importante para el control de procesos asociados a la patogénesis de B. pertussis. Para ello, nos centramos en dos proteínas en particular: BP1492, una proteína con dominio GG(D/E)EF, y BP1092, una proteína “dual” que posee un dominio GGDEF, un dominio EAL y un dominio histidina quinasa. A través de la utilización de diversas técnicas de microbiología y biología molecular pudimos evidenciar que BP1492 es una diguanilato ciclasa activa, capaz de modificar fenotipos asociados a c-di-GMP y que estaría involucrada en la resistencia a pH ácido de B. pertussis. Por otra parte, describimos un mecanismo de señalización local entre la proteína “dual” BP1092 y una diguanilato ciclasa, que podría regular la expresión proteínas asociadas a la virulencia de B. pertussis. En conclusión, en el presente trabajo se obtuvieron resultados que demuestran que la señalización por c-di-GMP regula procesos que podrían estar relacionados a la virulencia de B. pertussis. Por otra parte, se realiza un aporte a la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en este sistema regulatorio., Facultad de Ciencias Exactas

Las Bordetellas clásicas son patógenos capaces de colonizar las vías respiratorias en humanos y otros mamíferos. Para poder llevar a cabo una colonización exitosa, evadir la respuesta inmune y permanecer dentro del tracto respiratorio de los animales estas bacterias emplean una serie de factores de virulencia altamente caracterizados, como FHA, CyaA, PRN y SST3, entre otros. Estos factores de virulencia están regulados por el sistema de dos componentes BvgAS: Cuando el sistema está activo, BvgA es fosforilada y activa la expresión de los factores de virulencia. Esta fase en la que el sistema BvgAS se encuentra activo y se expresan los factores de virulencia es conocida como fase virulenta. La misma ha sido definida como la fase necesaria y suficiente para establecer una colonización. En los últimos años se ha visto que la regulación de estos factores de virulencia es aún más compleja, y otros sistemas de regulación pueden participar en la regulación de estos factores y superponerse con la regulación de este sistema en respuesta a las diversas señales del entorno del huésped a la que está sometida la bacteria. Adicionalmente, componentes regulados negativamente por el sistema BvgAS se expresan in vivo pudiendo tener un rol importante en la persistencia de la bacteria dentro del huésped. Comprender con exactitud los mecanismos que contribuyen a la patogénesis de estas bacterias en el huésped es importante para mejorar las estrategias preventivas. En este contexto, nuestro grupo de trabajo ha iniciado, en el año 2013, el estudio del sistema de señalización mediado por c-di-GMP en B. bronchiseptica. Este segundo mensajero casi ubicuo en bacterias ha sido implicado en la regulación de varios fenotipos relacionados con la virulencia en diversos patógenos. Sin embargo, hasta esa fecha no se conocía el rol de este mensajero en la fisiología de B. bronchiseptica. A partir de los estudios llevados a cabo pudimos describir que el c-di-GMP regula la formación de biofilm y la movilidad en B. bronchiseptica y hemos identificado proteínas específicas involucradas en estos fenotipos. Análisis de sobreexpresión de la diguanilato ciclasa BdcA nos permitió conocer que este segundo mensajero, además de regular la movilidad y la formación de biofilm de B. bronchiseptica, también participa en la represión de componentes del SST3. Tanto la formación de biofilm como el SST3 son importantes para la colonización y la persistencia de la bacteria dentro del huésped. Por lo tanto, podemos inferir que sistemas de señalización a través de este segundo mensajero c-di-GMP podrían tener un rol in vivo. Nuestro grupo de trabajo se ha propuesto seguir ampliando el conocimiento del rol de este sistema de señalización en fenotipos implicados en la patogénesis de la bacteria y comprender de qué manera cada una de las enzimas implicadas en el metabolismo de c-di-GMP participa en los fenotipos relacionados a la patogénesis de la bacteria. En este trabajo de Tesis Doctoral nos enfocamos en analizar el rol de una diguanilato ciclasa específica, la proteína BdcB. El objetivo general de la Tesis fue caracterizar a BdcB y analizar su rol en fenotipos relacionados a la patogénesis de B. bronchiseptica., Facultad de Ciencias Exactas

B. pertussis es una bacteria patógena que coloniza las vías respiratorias del humano, siendo el agente causal de la tos convulsa. A pesar de ser una enfermedad prevenible por vacunación se ha detectado un resurgimiento de la misma en las últimas décadas, obligando al replanteo de las estrategias de prevención y tratamiento. Uno de los enfoques para abordar esta problemática se basa en estudiar los mecanismos que utiliza la bacteria para el establecimiento de la infección y la persistencia en el hospedador. En este contexto se puede pensar, entre otras, en dos posibles estrategias del patógeno para evitar ser eliminado: la formación de biofilm en el tracto respiratorio y la capacidad de vivir dentro de células del hospedador. El c-di-GMP (diguanilato cíclico) es una molécula que actúa como segundo mensajero en bacterias, controlando una gran variedad de procesos, entre los que se destaca la transición entre vida plantónica y formación de biofilm. Nuestro grupo ha demostrado que c-di-GMP regula la formación de biofilm en Bordetella bronchiseptica, una bacteria cercanamente relacionada a B. pertussis. Los niveles intracelulares de este segundo mensajero están determinados por la actividad de dos tipos de enzimas: diguanilato ciclasas (DGCs), que lo sintetizan, y fosfodiesterasas (PDEs), que lo degradan. Las DGCs presentan un dominio llamado GGDEF y las PDEs un dominio EAL, con la denominación haciendo referencia a los aminoácidos conservados en su sitio activo. El uso de herramientas bioinformáticas permite la identificación de este tipo de proteínas en los genomas bacterianos. El objetivo central de mi trabajo de tesis es estudiar el rol de c-di-GMP en la regulación de diversos procesos en B. pertussis. En el genoma de B. pertussis Tohama I se predice la presencia de 5 proteínas GGDEF, 1 proteína EAL y 2 proteínas EAL/GGDEF. Nosotros hemos puesto el foco en el estudio de una proteína GGDEF particular, BdcK. Esta DGC no se encuentra en ninguna otra bacteria del género Bordetella y además se encuentra altamente conservada en todos los aislamientos clínicos de B. pertussis secuenciados hasta el momento Para avanzar en la caracterización de BdcK generamos una cepa mutante que no expresa la proteína, con el objetivo de evaluar su rol en procesos asociados a c-di-GMP como la formación de biofilm y la respuesta a ciertas condiciones del entorno que significan un estrés para la bacteria., Universidad Nacional de La Plata

El género Bordetella está constituido por especies capaces de colonizar el tracto respiratorio de una gran variedad de animales, entre ellos el ser humano. La formación de biofilm es una característica fundamental en la biología de muchos patógenos, principalmente en aquellos que como B. bronchiseptica son capaces de establecer infecciones durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto estudiar la formación de biofilm en un organismo como B. bronchiseptica implica abordar uno de los procesos fundamentales que dirigen la interacción entre esta bacteria y sus hospedadores. Nuestro grupo demostró previamente que el segundo mensajero c-di-GMP está involucrado en la regulación de la formación de biofilm en B. bronchiseptica. Este trabajo de tesis doctoral surge de la necesidad de profundizar en la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen el proceso de formación de biofilm dependiente de c-di-GMP. Utilizando una combinación de estrategias de microbiología clásica, biología molecular e ingeniería genética abordamos el estudio del rol de las proteínas LapD, LapG y BrtA en el mecanismo de regulación de la formación de biofilm través de c-di-GMP. Asimismo, y dado la importancia de este fenotipo en la interacción con el huéspd, analizamos el rol de este grupo de proteínas in vivo. Los resultados de este trabajo de tesis constituirán un aporte a la comprensión de los procesos de infección de bacterias formadoras de biofilm y en particular al rol que el segundo mensajero c-di-GMP posee en este contexto., Facultad de Ciencias Exactas

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "Clp (Crp-like protein) es un regulador de la expresión de factores de virulencia en la bacteria gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri, fitopatógeno causante del cáncer de los cítricos y de gran importancia económica. Este factor de transcripción pertenece a la familia CRP/FNR presentando 45% de identidad de secuencia con CAP (por sus siglas del inglés Catabolite Activator Protein), sin embargo es único en su clase por dos cuestiones. En primer lugar es capaz de unirse al ADN sin necesidad de unirse a su ligando, y esta unión a ligando solo provoca su inhibición. Además el ligando que une es c-di-GMP, a diferencia de la mayoría de los integrantes de la familia que unen AMPc como es el caso de CAP. Nuestro objetivo es resolver la estructura tridimensional del complejo Clp-ADN. Para esto se expresó Clp en la cepa BL21 (DE3) Star de Echerichia Coli, induciendo la expresión de la proteína con 0.4 mM de IPTG a 28 ⁰C durante 16 horas tras un choque frio de 2 horas. La purificación se realizó mediante tres pasos cromatográficos, IMAC, intercambio iónico y por último exclusión molecular. El proceso tuvo un rendimiento final de 0.6 mg/litro de cultivo. La proteína Clp recombinante obtenida presentó actividad biológica evaluada por un ensayo de movilidad monitoreado mediante exclusión molecular, mostrándose que el tiempo de retención del complejo Clp-ADN disminuye (10 mL = 197242 Da) con respecto al ADN solo (11.8 ml = 65493 Da). Por análisis de Thermofluor se observó que el cloruro de sodio, el glicerol, el cloruro de litio y el ácido glutámico aumentaron la estabilidad térmica de Clp." "The Crp-like protein (Clp) is a global regulator of the expression of virulence factors in gram negative bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri. phytopathogen that causes citrus cancer, which is economically important. This factor belongs to the CRP / FNR family and presents 45% of sequence similarity with Catabolite Activator Protein (CAP). However it is unique in its class for two reasons: first, it is able to bind DNA without binding to its ligand, and the ligand binding causes inhibition. Furthermore, the binding ligand is c-di-GMP, unlike most family members, such as CAP, that bind cAMP. Our goal is to solve the threedimensional structure of Clp-DNA complex. Clp was expressed in the BL21 (DE3) Star Escherichia coli strain, inducing protein expression with IPTG 0.4 mM at 28 ⁰C for 16 hours after a cold shock for 2 hours. Purification was performed by three chromatographic steps, IMAC, ion exchange and lastly molecular exclusion. The process had a final yield of 0.6 mg / liter of culture. Recombinant Clp obtained presented biological activity evaluated by size-exclusion mobility shift assay, showing that the retention time of the Clp-DNA complex decreases (10mL = 197,242 Da) compared to DNA alone (11.8ml=65,493Da). Sodium chloride, glycerol, lithium chloride and glutamic acid increased the thermal stability of Clp."

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "Clp (Crp-like protein) es el factor de transcripción global de la virulencia en la bacteria Gram negativa Xanthomonas campestris pv. campestris, fitopatógeno de una gran relevancia económica. A pesar de pertenecer a la superfamilia de factores de transcripción de CAP, Clp es único en su clase al no requerir de un modulador alostérico para ser capaz de unirse al DNA. De hecho, su ligando el cdi-GMP actúa como inhibidor al producir cambios alostéricos en la estructura terciaria de Clp. Estas características y la poca homología a nivel de secuencia y estructura con otros efectores de c-di-GMP hacen de Clp un factor de transcripción único. Nuestro objetivo es resolver la estructura tridimensional del complejo Clp-DNA. Como parte de nuestro diseño experimental, expresamos Clp en la cepa BL21 (DE3) Star de Escherichia coli utilizando el vector pET28pps La inducción se realizó con 0.2 mM de IPTG a 37 ºC por 8 horas tras un choque frío de 2 horas a 4 ºC. La purificación por cromatografía de afinidad a níquel en un amortiguador optimizado con 250 mM de NaCl, 100 mM de LiCl y 20 mM de Tris a pH 8.0 presentó un rendimiento de purificación de 3mg/L. Por análisis de Thermofluor se observó que el NaCl y el LiCl aumentaron la estabilidad térmica de Clp. El ensayo de movilidad por cromatografía de exclusión molecular mostró que el tiempo de retención disminuye para el complejo Clp-DNA (12.18 min = 242391 Da) con respecto al DNA por sí solo (19.10 min = 11329 Da). Las primeras pruebas de cristalización del complejo Clp-DNA mostraron una proporción de 23.2% de precipitados. De forma paralela se logró la subclonación de CAP en el vector pET28pps, la expresión y purificación arrojó un rendimiento de 24 mg/L. Esto servirá para un análisis comparativo de la interacción con el DNA de Clp y CAP por microscopía de fuerza atómica." "Crp-like protein (Clp) is the virulence global transcription factor of the Gram negative bacteria Xanthomonas campestris pv. campestris, phytopatogen of great economic relevance. Even though it belongs to the CAP transcription factors superfamily, Clp is unique because it does not require an alosteric modulator for the binding to DNA. In fact, its ligand, c-di-GMP acts in an inhibitory way by triggering alosteric changes on Clp tertiary structure. These characteristics and the low structure and sequence homology with others c-di-GMP effectors make of Clp a unique transcription factor. Our main goal was to obtain the Clp-DNA tertiary structure. Experimental design consist in Clp expression on the pET28pps vector using Escherichia coli BL21 (DE3) Star cells. Expression was induced with IPTG 0.2 mM, 8h at 37 ºC after a thermal shock of 2 h at 4 ºC. Immobilized metal ion affinity chromatography purification on a NaCl 250 mM, LiCl 100 mM and Tris-HCl 20 mM, pH 8.0 buffer showed a 3 mg/L performance. NaCl and LiCl increased Clp thermal stability as observed by Thermofluor. Size-exclusion chromatography movility shift assay (SEC-MSA) showed that the retention of the Clp-DNA complex decreased (12.18 min = 242391 Da) in accordance to the DNA by its own (19.10 min = 11329 Da). The first crystallization trials for the Clp-DNA complex showed a 23.2% precipitates proportion. CAP transcription factor was also cloned in the pET28pps vector, protein expression and purification were achieved with a 24 mg/L performance. The protein-DNA interaction of both Clp and CAP with DNA will be analyzed and compared by means of atomic force microscopy."

El c-di-GMP es un mensajero secundario bacteriano involucrado en la regulación de numerosos procesos biológicos. Además, ejerce un papel esencial en la regulación de la transición de un modo de vida planctónico a biofilm. Para llevar a cabo su función, el c-di-GMP se une específicamente a moléculas efectoras, que traducen esta señal en una respuesta celular específica. Entre dichos efectores se encuentran proteínas con dominios de unión a c-di-GMP (PilZ), reguladores transcripcionales y riboswitches. Los riboswitches son moléculas de ARN no codificantes. Están localizados, generalmente, en la región 5´UTR de un ARNm y regulan la expresión génica mediante la unión a un ligando (como c-di-GMP). Los niveles de c-di-GMP en el citoplasma de una bacteria son muy bajos y su cuantificación resulta difícil. En este trabajo, se han diseñado tres sistemas “reporter” de los niveles intracelulares de c-di-GMP in vivo de aplicación general. Estos sistemas están basados en la utilización de un riboswitch, capaz de controlar la expresión de genes fusionados al mismo en función de los niveles de c-di-GMP. En dos de estos sistemas, la fusión es con genes “reporter”, así, dependiendo de los niveles intracelulares de c-di-GMP, los niveles de proteína reporter varían de forma inversamente proporcional a la cantidad de c-di-GMP. En el último de los sistemas, el riboswitch está fusionado con lac I y el gen reporter está bajo un promotor reprimible por lac I, controlando así la cantidad de proteína reporter de forma directamente proporcional al nivel de c-di-GMP. Para valorar la utilidad de estos sistemas se han utilizado cepas de Salmonella con diferentes cantidades de c-di-GMP. Cyclic di-GMP is a bacterial second messenger that regulates a myriad of biological processes and also plays a key role in the regulation of lifestyle changes, including transition from the motile state to biofilms communities. There are many c-di-GMP specific receptors which translate a specific environmental signal into a specific cellular answer, carrying out c-di-GMP functions. These effectors are proteins with c-di-GMP binding domains (PilZ), transcriptional regulators or riboswitches. Riboswitches are noncoding RNA molecules that are located in the 5’UTR region of an mRNA and regulate the expression of downstream genes by ligand binding (like c-di-GMP). Intracellular levels of c-di-GMP in bacteria are very low and their quantification becomes difficult. In this project, three reporter systems for in vivo measurement of intracellular levels of c-di-GMP in bacteria have been designed. These systems are based on the use of a c-di-GMP riboswitch that regulates the expression of a gene fused with it. In two of these systems, the riboswitch is directly fused with reporter genes, hence high levels of c-di-GMP cause a decrease in levels of the reporter proteins. In the third system, the riboswitch is fused with the lac I gene, and the reporter gene is controlled by a promoter repressible by lac I. In this case, the amount of reporter protein is proportional to the c-di-GMP concentration. In order to validate these systems, three different Salmonella strains with diverse levels of c-di-GMP were used. Máster Universitario en Agrobiotecnología Unibertsitate Masterra Agrobioteknologian