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Las bacterias pertenecientes al género “Desulfovibrio” son desconocidas dentro del campo de las enfermedades infecciosas de los animales domésticos. Sin embargo, en la medicina humana se aprecia que cada día aumenta el número de publicaciones que ponen de manifiesto su papel patógeno, especialmente en las personas de la tercera edad, en las que su sistema inmunitario se suele encontrar debilitado. Esta Tesis Doctoral pretende poner de manifiesto la participación de los desulfovibrios en los procesos diarreicos que aparecen en el cerdo (tanto ibérico como blanco). Los aislados fueron identificados mediante diversas pruebas bioquímicas y genéticas. El proceso se completó con la técnica MALDI TOF MS. Así mismo, se investigó la sensibilidad de las cepas a los antimicrobianos haciendo hincapié en el estudio de la producción de beta-lactamasas., Little is known about “Desulfovibrio” as an infectious pathogen of domestic animals. On the other hand, the reports of isolations of these bacteria in patients, especially elderly and other inmuno-depressed people have increase dramatically since recent years. This Doctoral Thesis pretends to highlight the participation of desulfovibrios in diarrheal processes appearing in pigs (both Iberian and white). Isolates were identified and characterized by various microbiological, biochemist and genetic procedures (MALDI TOF MS, for instance). Finally, the sensitivity of the strains to antimicrobial agents was investigated, emphasizing the study of beta-lactamase production.

El estudio de sistemas biológicos se puede realizar a partir de dos enfoques opuestos y complementarios: el análisis del sistema completo o la evaluación de sus componentes aislados. Éste último permite explicar los fenómenos que ocurren cuando las unidades que forman parte del mismo interactúan. En el presente trabajo de tesis se han utilizado espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica y espectroscopia de rotación para el estudio de enzimas involucradas en el ciclo del azufre y obtenidas de la bacteria sulfato-reductora Desulfovibrio desulfuricans desde los dos enfoques mencionados anteriormente. En la reducción de sulfato a sulfito, intervienen ATP sulfurilasa y APS reductasa presentando ambas metaloenzimas centros paramagnéticos en su estructura. Mediante la técnica de resonancia paramagnética electrónica en fase condensada, se caracterizaron estructural y magnéticamente estas dos metaloproteínas y el sistema modelo de cobre [Cu(glu)phen].siendo glu = ácido L-glutámico y phen = 1,10-fenantrolina Se determinaron el rol del metal en la estructura y las propiedades magnéticas de ATP sulfurilasa; las interacciones de los sitios paramagnéticos durante el proceso de transferencia electrónica en APS reductasa y los caminos químicos e interacciones magnéticas de sitios metálicos en presencia de los ligandos orgánicos, glu y phen en el complejo de cobre [Cu(glu)phen]. En fase gas se caracterizaron dos ligandos de interés biológico: ácido picolínico y nicotinamida, mediante espectroscopia de rotación siendo las muestras sólidas previamente ablacionadas e inyectadas en un jet supersónico. Ambas moléculas presentan un anillo piridínico lo que ofrece posibilidades conformacionales para la formación de complejos con metales de transición y posibilita interacciones puente hidrógeno e hidrofóbicas, típicas de las que aparecen en metaloproteínas. De cada uno de los ligandos, se determinaron los confórmeros teóricos y experimentales y se caracterizaron mediante parámetros propios de la espectroscopia rotacional. Se compararon las estructuras cristalinas de los ligandos (fase condensada) con sus confórmeros en fase gas, lo que permitió el análisis de la configuración más estable para generar caminos químicos entre centros metálicos presentes en metaloproteínas. The study of biological systems can carried out from two opposite and complementary approaches: the complete system analysis or the evaluation of its individual components. The latter explains the phenomena that occur when units that are part of it interact. In this thesis we have used electron paramagnetic resonance spectroscopy and rotation spectroscopy for the study from these two approaches in enzymes involved in the sulfur cycle, obtained from the sulfate-reducing bacteria Desulfovibrio desulfuricans. In the reduction of sulfate to sulfide, the metalloenzymes ATP sulfurylase and APS reductase are involved, both have paramagnetic centers. By the technique of electron paramagnetic resonance in condensed phase, these two structurally and magnetically metalloproteins and a copper model system were characterized. The role of the metal in the structure and the magnetic properties of ATP sulfurylase, interactions of paramagnetic sites in the electron transfer process in APS reductase and the chemical pathways and interactions between magnetic metal sites in the presence of the organic ligands, L-glutamic acid and 1,10-phenantroline in the copper complex [Cu(glu)phen] were determined. In gas phase two ligands of biological relevance (picolinic acid and nicotinamide) are characterized. The solid molecules being previously ablated and injected into a supersonic jet. Boths molecules have a piridinic ring, which provides conformational possibilities for the formation of transition metal complexes analogous presenting hidrogen bonds and hidrofobic interactions to active sites of proteins. For each ligand, the theoretical and experimental conformers were determined and characterized by spectroscopic parameters specific to it the rotational spectroscopy. The crystal structures of the ligands in condensed phase were compared to the conformers in gas phase, allowed the analysis of the more stable configuration to generate chemical pathways between metal centers present in metalloproteins. Fil: Franco, Vanina Gisela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Física del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Física del Litoral; Argentina

Fil: Ferroni, Felix Martín. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. El molibdeno es un elemento químico de vital importancia en muchos sistemas biológicos y es necesario para la constitución de enzimas que catalizan diversas reacciones clave en los ciclos biogeoquímicos del carbono, azufre y nitrógeno. El metal por si sólo es biológicamente inactivo a menos que esté complejado por un cofactor especial. Con excepción de las nitrogenasas bacterianas donde el Mo forma parte del cofactor FeMOCO (Fe-Mo cofactor), el Mo se encuentra en las proteínas unido a un derivado pterina. El cofactor molibdopterina (MPT) es el sitio activo de todas las enzimas mononucleares de Mo. En esta tesis reportamos el estudio de dos tipos de enzimas mononucleares de Mo: nitrato reductasas (NRs) derivadas de Sinorhizobium meliloti 2011 y aldehído oxidorreductasa de Desulfovibrio gigas (DgAOR). Se caracterizó bioquímicamente una nitrato reductasa de membrana (NRm) involucrada en el metabolismo respiratorio de nitratos, y una enzima con actividad dual nitrato-nitrito reductasa (NR-NiR), ambas derivadas de S. meliloti 2011. Se caracterizó la inhibición de la enzima DgAOR con cianuro, etilenglicol, glicerol y arsenito. Se realizaron estudios cristalográficos y de RPE de la enzima después de la reacción con los alcoholes. Los datos cinéticos de muestras nativas de cristales redisueltos, como de aquellas tratadas con cianuro, confirman que DgAOR no necesita de un ligando azufre coordinado al átomo de Mo para la catálisis, lo que constituye una diferencia fundamental con la enzima xantina oxidasa (XO), y confirma la ausencia del ligando en la esfera de coordinación del átomo de molibdeno en la enzima activa. Molybdenum is of essential importance in many biological systems as it is required by enzymes catalyzing diverse key reactions in the global carbon, sulfur and nitrogen metabolism. The metal itself is biologically inactive unless it is complexed by a special cofactor. With the exception of bacterial nitrogenase, where Mo is a constituent of the FeMo-cofactor, Mo is bound to a pterin molecule forming the molybdenum cofactor (MOCO) which is the active compound at the catalytic site of all other Mo- mononuclear enzymes. In this work we report the study of two kinds of mononuclear Mo enzymes: nitrate reductases from Sinorhizobium meliloti 2011 and aldehyde oxidoreductase from Desulfovibrio gigas (DgAOR). We characterized biochemically the respiratory membrane-bound nitrate reductase (NRm) and the cytoplasmic nitrate-nitrite reductase (NR-NiR) from S. meliloti 2011. We also performed steady-state kinetic studies of DgAOR with the inhibitors cyanide, ethylene glycol, glycerol, and arsenite, together with crystallographic and EPR studies of the enzyme after reaction with the two alcohols. In contrast to what has been observed in other members of the XO family, cyanide, ethylene glycol, and glycerol are reversible inhibitors of DgAOR. Kinetic data with both cyanide and samples prepared from single crystals confirm that DgAOR does not need a sulphur ligand for catalysis and confirm the absence of this ligand in the coordination sphere of the molybdenum atom in the active enzyme. Secretaría de Ciencia y Técnica Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica