Search

Sluznični melanom je redka bolezen. Za njo najpogosteje zbolijo starejši ljudje, ženske bolj kot moški. Incidence ja relativno stabilna. Ob postavitvi diagnoze ima četrtina bolnikov s sluzničnim melanom napredovalo obliko bolezni, kar je posledica agresivnosti bolezni in ˝skritih˝ lezij s posledično zapoznelo diagnozo. 5-letno preživetje je najnižje v primerjavi z drugimi oblikami melanoma, če izključimo najredkejšo obliko melanoma, primarni leptomeningealni melanom. Biološke lastnosti sluzničnega melanoma se precej razlikujejo od lastnosti kožnega melanoma. Adjuvantno sistemsko zdravljenje je nujno potrebno, zaenkrat ni dovolj podatkov o njem. Kombinirana imunoterapija je terapija izbora zdravljenja metastatske oblike bolezni. Tarčna terapija ima svoje mesto le pri zdravljenju bolnikov z natančno določenimi tarčami (V600 Braf mutacija oz. cKIT mutacija).

Osnovno zdravljenje nemelanomskih kožnih rakov je kirurški poseg. Izrez kože s tumorjem v lokalni anesteziji še vedno predstavlja zdravljenje, ki zagotavlja življenje z majhnim tveganjem za ponovitev bolezni. Da bi to zagotovili, moramo ob tumorju odstraniti tudi ustrezen pas zdrave kože v skladu s priporočili za posamezno vrsto nemelanomskega kožnega raka in mesto, kjer se ta nahaja. Vedno stremimo k primarnemu zaprtju nastalega defekta kože. Nemelanomski kožni raki redko zasevajo, ko odkrijemo regionalne zasevke teh rakov, sprva opravimo disekcijo bezgavk prizadete lože. Le redko je potrebno pri kirurškem zdravljenju lokoregionalno napredovale bolezni poseči po metodah kot so hipertermična izolirana ekstremitetna perfuzija uda ali elektrokemoterapija.

Karcinom Merklovih celic je redek nevroendokrini maligni tumor kože. Njegova incidenca v zadnjih letih narašča, njegova biologija je podobna biologiji kožnega melanoma in tudi zdravljenje je podobno zdravljenju bolnikov z melanomom. Kirurško zdravljenje predstavlja osnovni način zdravljenja karcinoma Merklovih celic. Diagnozo postavimo s pomočjo biopsije, ki je lahko citološka punkcija ali kirurška biopsija s 5-mm varnostnim robom. Pri bolnikih s klinično negativnimi regionalnimi bezgavkami opravimo široko ekscizijo z 1–2 cm lateralnega varnostnega roba do spodaj ležeče fascije in biopsijo varovalne bezgavke. Pri bolnikih s klinično pozitivnimi regionalnimi bezgavkami opravimo široko ekscizijo primarnega tumorja in disekcijo regionalne bezgavčne lože, ki je indicirana tudi po pozitivni biopsiji varovalne bezgavke. Kirurško zdravljenje oddaljenih zasevkov opravimo le v skrbno izbranih primerih oligometastaske bolezni po predstavitvi na multidisciplinarnemu konziliju.

Karcinom Merklovih celic (KMC) je redek, agresiven nevroendokrini kožni rak s slabo prognozo, posebej ko je v napredovalem stadiju. Incidenca na splošno narašča, čeprav podatki o incidenci kažejo na razlike med geografskimi področji. Med dejavnike tveganja štejemo starost, imunosupresijo ter izpostavljenost ultravijoličnem sevanju. Znana je povezava med MCC in okužbo s poliomavirusom, čeprav natančnega mehanizma, ki vodi v karcinogenezo še ne razumemo v celoti. Pri lokalizirani bolezni je zdravljenje izbora kirurgija (ko je to mogoče), sledi ji dopolnilno obsevanje ali obsevanje v kombinaciji s kemoterapijo. Pri razsejani bolezni že nekaj let uporabljamo imunoterapijo z zaviralci nadzornih točk, kemoterapija pa v nadaljnih linijah, če imunoterapija ni uspešna. Imunoterapija v prvem in drugem redu zdravljenja ima dobre rezultate s sprejemljivim varnostnim profilom zdravljenja, zato je tovrstno zdravljenje postalo standardno in je nadomestilo kemoterapijo. Glede na to, da je onkogeneza tumorja povezana z integracijo poliomavirusa Merklovih celic in mutacijami povzročenih z ultravijoličnim sevanjem, obstaja logična osnova za zdravljenje z imunoterapijo oz. protitelesi, ki ciljajo PD-L1/PD-1 pot. Novost v letu 2022 je učinkovitost nivolumaba v adjuvantnem zdravljenju. Monoterapija z avelumabom pa je pri bolnikih z metastatskim MCC, vodila v pomembno podaljšanje OS kar nadalje podpira vlogo avelumaba v zdarvljenju bolnikov z napredovalim MCC.

Očesni melanom je redek rak z incidenco 5/ milijon prebivalcev in vrhom pojavnosti okrog 60. leta starosti. Uvealni melanom predstavlja več kot 90% primerov. Enukleacija je bila primarna metoda zdravljenja več kot stoletje, vendar je privedla do izgube funkcionalnega očesa. Danes je radioterapija, primarno brahiterapija, metoda izbora za zdravljenja uvealnega melanoma. Za izvedbo brahiterapije je potrebna kirurška vstavitev radioaktivne ploščice v bližino tumorja, primerna pa je za tumorje debeline 8- 10 mm in premera do 16 mm. Pri večjih tumorjih se uporablja zunanje obsevanje, pri čemer tako obsevanje s protonskim snopom (PBT) kot tudi stereotaktična radioterapija (SRT) kažeta dobre in primerljive rezultate. Radioterapija lahko povzroči neželene učinke, kot so katarakta, radiacijska retinopatija in neovaskularni glavkom, vendar koristi ohranjanja vida pogosto pretehtajo tveganja. Radioterapija je učinkovita možnost zdravljenja uvealnega melanoma, ki dosega primerljive izide z enukleacijo in omogoča ohranitev vida v večini primerov.

Radioterapija je eno izmed osnovnih zdravljenj bazalnoceličnega in ploščatoceličnega karcinoma kože. Indikacije za zdravljenje z radioterapijo izhajajo iz njenih prednosti in slabosti v primerjavi z ostalimi terapevtskimi možnostmi. Kot edino zdravljenje se uporablja pri starejših bolnikih z multiplimi tumorji, še posebej blizu oči, na nosu ali uhljih, in recidivih po predhodni operaciji. Po operaciji obsevamo ob povečanem tveganju za ponovitev tumorja v operativnem polju (nepopoln izrez, perinevralna invazija, infiltrativno rastoči tumorji). Ob pravilni indikaciji in izvedbi je učinkovitost radioterapije primerljiva s kirurgijo.

Zdravljenje lokalno napredovalega skvamoznoceličnega karcinoma in metastatskega skvamoznoceličnega karcinoma je mogoče z radioterapijo, kemoterapijo na osnovi platine, tarčno terapijo z zaviralci receptorjev za epidermalni rastni faktor ali zaviralci receptorjev programirane celične smrti. Cemiplimab je PD-1 inhibitor, ki je odobren za zdravljenje lokalno napredovale in metastatske oblike bolezni, kjer zdravljenje z radioterapijo ali operativno zdravljenje ni indicirano. V študijo je bilo vključenih 28 pacientov, ki so prejemali cemiplimab v prvi liniji zdravljenja. Rezultati so pokazali, da je bilo mediano obdobje brez napredovanja bolezni 4,4 mesece in mediano celokupno preživetje ni bilo doseženo. Večja stopnja odziva je bila dosežena pri pacientih z imunsko pogojenimi neželenimi učinki - splošna stopnja odziva je bila 43 %, stopnja obvladovanja bolezni je bila 71 %.

Bazalnocelični karcinom kože je najpogostejši nemelanomski kožni rak. Zaseva izjemno redko, možne so lokalne ponovitve bolezni in invazivna rast. Tveganje za lokalno ponovitev je odvisno od histopatološkega podtipa. Keratotični podtip vsebuje ploščatocelično komponento. Karcinom najpogosteje vznikne na soncu izpostavljenih mestih, redko na predelu ženskega zunanjega spolovila. V literaturi so bili doslej opisani posamezni primeri razsoja bazalnoceličnega karcinoma vulve v ingvinalne bezgavke. Lokalno napredovali, recidivantni in metastatski bazalnocelični karcinom kože zdravimo z vismodegibom, v 2. liniji ali ob neprenašanju z zaviralcem imunskih kontrolnih točk cemiplimabom. Cemiplimab je indiciran tudi pri lokalno napredovalem in metastatskem ploščatoceličnem karcinomu kože. V približno 10% se pri zdravljenju pojavijo revmatološki neželeni učinki, imunski pogojeni diabetes je zelo redek. Predstavljen je primer 53-letne bolnice s keratotičnim podtipom bazalnoceličnega karcinoma vulve z dokazanim razsojem s prevladujočo ploščatocelično komponento v ingvinalne in retroperitonealne bezgavke. Zdravljena je bila z vismodegibom in s cemiplimabom. Med zdravljenjem s cemiplimabom je razvila imunsko povzročeni diabetes s ketoacidozo, atralgije in mialgije.

Uvealni melanom spada med redke rake, predstavlja majhen odstotek vseh melanomov. Se razlikuje od kožnega melanoma, z nizkim tumorskim bremenom in 1-letnim preživetjem v polovici bolnikov z metastatsko boleznijo. Sistemsko zdravljenje metastatske bolezni je malo učinkovito, v primeru prisotnega genotipa HLA-A*02:01 pa je zdravljenje s tebentafuspom izboljšalo prognozo teh bolnikov.

Sluznični melanom je redka bolezen. Najpogosteje se pojavi na sluznici področja glave in vratu, genitalnega trakta in anorektalni sluznici. Bolniki imajo ob diagnozi v večjem deležu prisotne regionalne ali oddaljene zasevke (najpogosteje v jetrih in pljučih). Sluznični melanom se od kožnega melanoma razlikuje v biologiji, kliničnem poteku in prognozi. Aktivirajoče mutacije gena c-KIT so prisotne pri večjem številu bolnikov s sluzničnim melanomom. V primeru prisotne c-KIT mutacije pride v poštev tarčno zdravljenje z imatinibom.

Za karcinom Merklovih celic je značilna visoka stopnja radioobčutljivosti, zato ima radioterapija pomembno vlogo v zdravljenju vseh stopenj v razvoju te bolezni. Redkeje, čeprav primerljivo uspešno kot kirurgija, jo uporabljamo za zdravljenje primarnih tumorjev. Pogosteje dopolnjuje predhodno operacijo, bodisi primarnega tumorja ali področnih zasevkov. Indikacija za pooperativno obsevanje so vsa stanja, ki kažejo na povečano tveganje za ponovitev bolezni v operativnem polju. Radioterapija je učinkovita tudi kot paliativna metoda zdravljenja pri bolnikih z oddaljenimi zasevki ali v slabem splošnem stanju, ki ne dovoljuje intenzivnih kombiniranih zdravljenj.

Ker sta prognoza in obravnava bolnika odvisni od dejavnikov primarnega tumorja in statusa varovalnih bezgavk, mora patolog v izvidu korektno in razumljivo podati potrebne informacije. S standardizacijo izvidov dosežemo, da ti vsebujejo vse potrebne podatke, so bolj pregledni in primerljivi med seboj. Z dosledno uporabo standardiziranega izvida postane manj verjetno, da bi patolog katero od informacij izpustil. Standardizirani izvidi v digitalni obliki olajšajo retrospektivno iskanje podatkov, kar je pomembno za potrebe registrov bolezni in raziskovalno delo. Predpogoj za podajanje podatkov v obliki standardiziranega patohistološkega izvida so ustrezna makroskopska obdelava tkivnega vzorca, pravilna izdelava preparatov v laboratoriju, točni podatki o pacientu in klinični podatki, ki so pogosto ključni za pravilno interpretacijo patohistoloških najdb.

Ne-melanomski kožni rak je eden najpogostejših rakov na svetu. Karcinom bazalnih celic (BCC) predstavlja 75% -80% vseh rakov kože. BCC raste počasi in ga pogosto odkrijemo zgodaj. Večino primarnih bazalnoceličnih karcinomov zdravimo kirurško ali pri površinskih lezijah z ne-kirurškimi metodami. Tveganje za ponovitev povečujejo velikost tumorja, slabo definiranimi robovi lezije, agresiven histološki podtip in prejšnja ponovitev. V nekaterih primerih lahko tumor uniči okolna tkiva (mišice, kosti, hrustanec itd.) zaradi dolgotrajne odsotnosti zdravljenja ali agresivnosti tumorja (lokalno napredovala oblika BCC – lnBCC). V izjemno redkih primerih BCC napreduje v oddaljena tkiva (metastatski BCC – mBCC). Pri večkratnih lokalnih ponovitvah ali pri invaziji okolnih/oddaljenih struktur (lnBCC/mBCC), kjer kirurgija in/ali obsevanje nista primerni, je pomemben multidisciplinarni pristop pri obravnavi bolnika. Rezultati zdravljenja z vismodegibom in sonidegibom kažejo na bistveno zmanjšanje velikosti multiplih lezij in števila novonastalih lezij pri bolnikih z Gorlinovim sindromom. Najbolj pogosti neželeni učinki so mišični krči, spremembe okusa, izguba las in utrujenost. V primeru ko omenjeno zdravljenje ni več učinkovito, lahko pri napredovali bolezni bolnike zdravimo v drugi liniji tudi z imunoterapijo z zaviralci nadzornih točk, proti- PD-1 protitelesi.

Imunosupresija je eden najpomembnejših dejavnikov tveganja za pojav ploščatoceličnega karcinoma kože. Tveganje je največje pri bolnikih po presaditvi solidnih organov, sledijo bolniki s presaditvijo kostnega mozga, okuženi s HIV in bolniki na imunosupresivnem zdravljenju s kemoterapijo, tarčnimi ali biološkimi zdravili. Običajno razvijejo multiple in recidivne ploščatocelične karcinome kože. Zdravljenje s kirurgijo in radioterapijo je pogosto neučinkovito in lahko povzroči pomembno morbiditeto, vodi v zmanjšano funkcijo organa ter posledično slabšo kvaliteto življenja. Bolniki imajo podvojeno tveganje za razsoj v oddaljene organe. Prognoza imunosuprimiranih bolnikov s ploščatoceličnim karcinomom kože je slabša. Na voljo so omejeni podatki o zdravljenju teh bolnikov z zaviralci imunskih kontrolnih točk kot so zaviralci PD-1.

Z odkritjem zaviralcev imunskih kontrolnih točk in z razvojem tarčno specifičnega zdravljenja so bili postavljeni novi mejniki v zdravljenju bolnikov z melanomom, ki predstavlja najbolj agresivno različico kožnega raka. Pomembno je zgodnje prepoznavanje metastatske bolezni zaradi hitre uvedbe ustreznega sistemskega zdravljenja. 18F - FDG PET/CT preiskava predstavlja uporabno slikovno metodo v diagnostiki melanoma, predvsem pri višjih izhodiščnih stadijih bolezni. Z uporabo določenih PET - parametrov (SUV max, MTV, TLG) lahko uspešno spremljamo odgovor na zdravljenje pri bolnikih na tarčni terapiji in imunoterapiji, v več študijah je je potrjena tudi prognostična napovedna vrednost določenih metaboličnih slikovnih biomarkerjev. PET/CT preiskava omogoča zgodnje prepoznavanje imunsko pogojenih neželenih učinkov pri bolnikih na zdravljenju z imunoterapijo, kar je pomembno za hitro ukinitev terapije in morebitno uvedbo ustrezne imunosupresivne terapije. Z razvojem molekularnih raziskav se odpirajo možnosti tudi v iskanju novih tarčno specifičnih PET - radiofarmakov za diagnostiko in terapijo malignega melanoma.

Zdravljenje z BRAF in MEK inhibitorji je močno izboljšalo preživetje bolnikov z BRAF mutiranim malignim melanomom. Neželeni stranski učinki ob terapiji z BRAF in MEK inhibitorji so pogosti in lahko vodijo v prekinitev zdravljenja. Pri različnih kombinacijah zdravil so najpogostejši neželeni stranski učinki podobni in so mrzlica, povišana telesna temperatura, kožna toksičnost, hepatotoksičnost, driska, arterijska hipertenzija in artralgije. V nadaljevanju je predstavljen primer bolnice, pri kateri smo morali zaradi resnih neželenih stranskih učinkov prekiniti zdravljenje z BRAF in MEK inhibitorji.

Bolniki z metastatskim melanomom, ki imajo možganske zasevke, so posebna podskupina melanomskih bolnikov z zelo slabim preživetjem. Pri obravnavi teh bolnikov je ključen multidisciplinaren pristop, ki vključuje tako lokalno zdravljenje (nevrokirurgija, radioterapija) kot specifično sistemsko onkološko zdravljenje. Z novimi možnostmi lokalne in sistemske terapije so se preživetja bolnikov z možganskimi zasevki izboljšala. Glede zaviralcev imunskih kontrolnih točk je kombinirana imunoterapija s PD-1/ CTLA 4 protitelesi uspešnejša napram mono-imunoterapiji. S kombinirano imunoterapijo je bil v randomiziranih kliničnih raziskavah pri bolnikih z asimptomatskimi možganskimi zasevki ugotovljen visok odgovor na zdravljenje. Ugotavljali so dolgotrajne remisije. Pri bolnikih s simptomatskimi možganskimi zasevki, ki so potrebovali sistemski glukokortikoid, tega uspeha niso beležili. Glede tarčne terapije z BRAF in MEK zaviralci je bil pri kombinaciji dabrafeniba in trametiniba dokazan hiter in visok delež odgovorov, vključno pri bolnikih, ki so prejemali sistemski glukokortikoid. Žal pa je bilo trajanje odgovorov kratko, povprečno manj kot 6 mesecev. Raziskujejo se novi načini zdravljenja, ki bodo dodatno izboljšali preživetja teh bolnikov.

Imunoterapija predstavlja skupaj s tarčnimi zdravili steber prve linije zdravljenja napredovalega melanoma. Stranski sopojavi ob imunoterapiji so pogosti. Pojav imunsko povzročenega pnevmonitisa velikokrat zahteva dolgotrajno zdravljenje s kortikosteroidi in prehodno ali trajno prekinitev zdravljenja z imunoterapijo. Predstavljamo klinični primer zdravljenja napredovalega melanoma z imunoterapijo z zaviralci imunskih kontrolnih točk, ob katerem je prišlo do imunsko povzročenega pnevmonitisa in možnosti reindukcije imunoterapije.

Dabrafenib, vemurafenib in encorafenib spadajo med močno potentne in učinkovite tirozin kinazne (TKI) zaviralce pri malignem melanomu z prisotno BRAFV600E mutacijo. So selektivni inhibitorji RAF kinase tipa 1, ki predstavlja ključni del mitogen aktivirajoče protein.kinazne poti (MAPK). BRAFV600E mutacija je prisotna pri cca. 7% vseh rakov, pri malignem melanomu je prisotna v cca. 50% bolnikov. Kot smo navajeni tudi pri drugih tarčnih zdravilih je tudi pri BRAF zaviralcih velika težava pridobljena rezistenca na zdravljenje. Z kombiniranjem BRAF in MEK zaviralcev (trametinib, cobimetinib in binimetinib) lahko to rezistenco do določene mere presežemo in s tem bolnikom z metastatskim malignim melanomom omogočamo še daljša celokupna preživetja (OS) in preživetja brez napredovanja bolezni (PFS).

Melanom je maligni tumor melanocitov. Melanociti so celice, ki proizvajajo pigment melanin in izhajajo iz celic nevralnega grebena. Večina melanomov nastane v koži, sicer lahko nastanejo na vseh lokalizacijah, kjer migrirajo celice nevralnega grebena, kot so na primer sluznice, okularni uvealni trakt ali CŽS. Manj kot 5% kožnih rakov so maligni melanomi, ki sodijo v skupino kožnih rakov z najslabšo prognozo. Zaradi svoje agresivne narave ima najvišjo stopnjo smrtnosti med vsemi kožnimi raki (80%). Zgodnje odkritje melanoma in njegovo pravočasno zdravljenje pomembno vplivata na prognozo same bolezni.

Kožni melanom je z vidika zdravljenja kirurška bolezen, saj kirurgija predstavlja zelo pomemben način zdravljenja pri vseh stadijih bolezni. Ločimo kirurško zdravljenje primarne lezije, regionalnih, in-transit in oddaljenih zasevkov. Pri primarni leziji ločimo diagnostično in široko (radikalno) ekscizijo. Varnostni rob je pri prvi do 5 mm, pri drugi pa med 1 do 2 cm, odvisno od debeline melanoma. Pri regionalnih zasevkih melanoma govorimo glede na njihovo velikost o klinično okultnih in klinično prepoznavnih zasevkih. Prve ugotovimo s pomočjo biopsije sentinel bezgavke in jih nato zdravimo tako kot klinično prepoznavne zasevke z radikalno limfadenektomijo regionalne bezgavčne lože. In-transit zasevke lahko zdravimo s preprosto ekscizijo ali pa v primerih, ko jih je več in so locirani na ekstremitetah s pomočjo tehnično zahtevnih izolirane ekstremitetne perfuzije ali infuzije. Pri sistemskem razsoju je kirurško zdravljenje vedno prvi izbor zdravljenja, v kolikor je možno zasevke odstraniti v celoti. From the treatment perspective, skin melanoma is a surgical disease, as surgery is a very important treatment modality for all stages of this disease. We distinguish between surgical treatments of primary lesions and regional, in-transit and distant metastases. Considering the primary lesion, we distinguish between diagnostic and wide (radical) excision, with the safety margin being up to 5 mm and 1-2 mm, respectively. Depending on their size, locoregional melanoma metastases are either clinically occult or clinically apparent. The first are detected with the help of sentinel lymph node biopsy and are afterwards treated in the same manner as clinically apparent metastases, namely with radical lymphadenectomy of the regional lymph node basin. In-transit metastases can be treated with a simple excision or, in cases of multiple metastases located on the extremities, with the help of technically demanding isolated limb perfusion or infusion. In a systematic assessment, surgical treatment is always the first choice if metastases can be removed completely.

Melanom je eno najbolj imunoloških malignih obolenj. Omenjeno temelji na podatkih o večji razširjenosti pri imunsko oslabljenih bolnikih, dokazih živahnih limfocitnih infiltratov tako pri primarnih tumorjih kot metastazah, dokumentiranem prepoznavanju antigenov melanoma s tumorsko infiltriranimi limfociti T in, kar je najpomembnejše, dokazih da se melanom odziva na imunoterapijo. Uporaba imunoterapije pri zdravljenju metastatskega melanoma je relativno pozno odkritje za to malignost. Nedavne študije so pokazale učinkovitost imunoterapije v monoterapiji, bistveno višjo stopnjo uspešnosti s kombinacijo imunoterapije, radioterapije ali tarčne terapije. Ob zdarvlejnju z imunoterapijo nastajajo imunsko pogojeni nežeelni učinki, ki lahko prizadenejo enega ali več organov in lahko vodijo tudi v ukinitev imunoterapije. Običajno pa so nizkih stopenj in dobro obvladljivi.

Vloga radiologije pri vseh bolnikih je najprej odkrivanje sprememb - detekcija, nato karakterizacija odkritih patoloških sprememb. Po karakterizaciji pride na vrsto ocena razširjenosti bolezni, ocena učinka terapije in po končanem zdravljenju v okviru sledenja bolnikov.

Bolniki z operiranim stadijem III in stadijem IV, brez ostanka bolezni, kot tudi z visoko rizičnim stadijem II, imajo visoko tveganje za ponovitev bolezni. V zadnjem desetletju se je prognoza bolnikov z metastatskim kožnim melanomom v zadnjem desetletju zaradi sistemskega zdravljenja močno izboljšala z daljšimi preživetji, so se tako po zaključenih kliničnih raziskavah faze III v zadnjih letih izboljšali tudi rezultati zdravljenja in prognoza z manjšo verjetnostjo ponovitve bolezni tudi pri bolnikih z operiranim kožnim melanomom v stadijih III in IV brez ostanka bolezni z uvedbo imunoterapije z zaviralci imunskih kontrolnih točk in tarčne terapije v primeru prisotne BRAF mutacije v adjuvantnem zdravljenju, kot tudi pri bolnikih z visoko rizičnim stadijem II z imunoterapijo z zaviralcem imunskih kontrolnih točk.

Melanom je maligni tumor, ki ga lahko relativno učinkovito zdravimo z zaviralci imunskih kontrolnih točk (ZIKT). Kljub temu pri večini bolnikov z melanom opažamo pojav odpornosti na zdravljenje z ZIKT. Biomarker, s katerim bi lahko uspeh zdravljenja z ZIKT zanesljivo napovedali, še vedno ni bil odkrit. Pojav imunsko pogojenih neželenih učinkov (irAE) je povezan z dobrim odgovorom na zdravljenje. Slednjega določa tudi vnetje v tumorju, ki se lahko odraža s sistemskimi vnetnimi procesi. Retrospektivna analiza bolnikov z razsejanim melanomom, zdravljenih z ZIKT v 1. redu, je raziskala povezanost odgovora na zdravljenje z irAE in nekaterimi modeli, temelječimi na razmerji med količinami krvnih celic, ki sodelujejo pri vnetnih procesih. Rezultati so pokazali, da sta velika izhodiščna vrednost sistemskega imunsko vnetnega indeksa (SII) in velika vrednost razmerja med trombociti in limfociti (PLR) pred 2. ciklom zdravljenja potencialna zgodnja negativna prediktivna biomarkerja za zdravljenje z ZIKT. Ponovno je bila tudi potrjena pozitivna korelacija med irAE in dobrim odgovorom na zdravljenje z ZIKT

Vsaka celica telesa ima svoj lasten genski zapis. Kakšen je ta zapis in kako se prevede v beljakovine je odvisno od zarodnih sprememb genov in od vplivov okolja. Genski zapis je osnova za nastanek, razumevanje in dandanes tudi zdravljenje raka. V zadnjih dveh desetletjih so bili melanociti in kožni melanom, ki nastane iz njih predmet številnih molekularnogenetskih raziskav. Tako vemo, da med osebami z družinsko obremenitvijo za kožni melanom najpogosteje odkrijemo patogeno različico CDKN2A gena ob kateri je zvišano tako tveganje za kožni melanom kot za rak trebušne slinavke. Ko govorimo o somatskih mutacijah, je gotovo najbolj znana BRAFV600Emutacija, ki predstavlja enega prvih dogodkov v patogenezi kožnih melanomov nastalih na intermitentno soncu izpostavljeni koži. Leta raziskav tovrstnih gonilnih mutacij so pripeljala tudi do razvoja tarčne terapije.

Na Onkološkem inštitutu Ljubljana smo leta 2018 v okviru Registra raka Republike Slovenije vzpostavili prvi nacionalni onkološki klinični register – klinični register kožnega melanoma. Poleg kazalnikov bremena raka (incidence, prevalence in preživetja), ki jih že 70 let spremljamo v okviru nacionalnega Registra raka, lahko sedaj na populacijski ravni merimo tudi kazalnike kakovosti obravnave bolnikov z melanomov. Kožni melanom sodi med rake, pri katerih incidenca v zadnjih desetletjih najbolj strmo narašča. Število novo zbolelih že presega mejo 600 oseb letno s čimer zavzema kožni melanom 6. mesto med vsemi novo odkritimi raki. Tako po incidenci, kot po umrljivosti je Slovenija zelo visoko na lestvici evropskih držav po preživetju pa se uvrščamo nad evropsko povprečje. Kazalniki kakovosti obravnave in skladnosti obravnav s smernicami so na voljo za zbolele od leta 2017 naprej. Stroka si je že postavila ciljne vrednosti za vsakega od definiranih kazalnikov - kar nekaj postavljenih ciljev ostaja še pred nami

Metoda ELISPOT (angl. Enzyme-Linked ImmunoSpot) se zaradi preproste izvedbe in visoke občutljivosti pogosto uporablja v diagnostiki in raziskavah na različnih področjih. Test interferon (IFN)-γ ELISPOT omogoča štetje antigensko (Ag)-specifičnih limfocitov T po Ag-specifični stimulaciji. Glavni namen magistrskega dela je bil vzpostaviti test na osnovi metode ELISPOT za določanje Ag-specifičnega imunskega odziva CD8+ citotoksičnih limfocitov T (CTL). Iz levkocitnih pripravkov zdravih krvodajalcev smo izolirali enojedrne celice periferne krvi (PBMC), ki smo jih uporabili za različne poskuse. Izvedli smo metodo mešane levkocitne reakcije (MLR), PBMC ex vivo stimulirali z različnimi peptidnimi mešanicami ali iz PBMC z imunomagnetno selekcijo izolirali celokupne CD8+ limfocite T in monocite. Slednje smo diferencirali v dendritične celice (DC), ki smo jih nadalje uporabili za in vitro stimulacijo avtolognih CD8+ CTL. Na podlagi rezultatov optimizacije metode ELISPOT smo določali Ag-specifičnost limfocitov T. Pokazali smo, da lahko z metodo ELISPOT zaznamo alo-Ag-specifične limfocite T in virusno-specifične limfocite T v populaciji PBMC po 24-urni ex vivo stimulaciji z mešanico peptidov citomegalovirusa (CMV), virusa Eppstein-Barr in virusa gripe A (CEF) ter mešanico peptidov CMV fosfoproteina 65 (pp65). Dokazali smo tudi, da lahko z metodo ELISPOT zaznamo redke klone melanomsko-specifičnih CD8+ CTL po in vitro stimulaciji z zrelimi avtolognimi DC (αDC in zDC), pulziranimi s peptidi, značilnimi za melanom, gp100, Melan-A in tyr. V sklopu in vitro stimulacije CD8+ CTL z DC smo dokazali tudi, da imajo zrele zDC ojačano sposobnost prožitve melanomsko-specifičnega imunskega odziva CTL v primerjavi z αDC. The ELISPOT (angl. Enzyme-Linked ImmunoSpot) method is a highly sensitive and user-friendly method, commonly applied in different areas of research and diagnostics. The interferon (IFN)-γ ELISPOT assay is used to enumerate antigen (Ag)-specific T cells upon Ag-specific stimulation. The principal aim of our study was to establish an ELISPOT assay for the determination of Ag-specific immune response of CD8+ cytotoxic T cells (CTL). Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from blood samples obtained from healthy human blood donors. PBMCs were used to run the mixed lymphocyte reaction (MLR) and were ex vivo stimulated with different peptide pools. Whole CD8+ T cells and monocytes were isolated from PBMC by positive immunomagnetic selection and monocytes were used for dendritic cell (DC) differentiation. The latter were used for in vitro stimulation of autologous CD8+ CTL. After its optimization, the ELISPOT assay was applied to determine the Ag-specific immune response of T cells. Our results show that the ELISPOT assay enables the detection of allo-Ag-specific T cells and can be used to determine virus-specific T cells in PBMCs upon 24 h ex vivo stimulation with peptide pool from cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus and influenza A virus (CEF) and peptide pool of the phospohoprotein 65 (pp65) from CMV. The ELISPOT method also enables the detection of rare clones of melanoma-specific CTL upon in vitro stimulation with autologous mature DC (αDC and zDC), pulsated with melanoma-associated peptides gp100, Melan-A and tyr. Finally, our results demonstrate zDC are superior in their capacity to induce melanoma-specific CTL compared to αDC.

Kalcijeva elektroporacija (CaEP) je novejša metoda lokalnega zdravljenja tumorjev, pri kateri se za sprožitev celične smrti uporablja visoke koncentracije kalcija in elektroporacija kot dostavna metoda. Učinkovitost CaEP je že bila preizkušena v kliničnih študijah, vendar še niso pojasnjeni mehanizmi protitumorskega delovanja. V doktorski nalogi smo raziskali protitumorsko delovanje CaEP na treh nivojih. Raziskali smo direkten citotoksičen učinek na endotelijske in tumorske celice ter učinek na citoskelet in celične stike endotelijskih celic. Poleg tega smo in vivo pokazali, da ima CaEP žilno razdiralni učinek tako na normalno kot tudi tumorsko žilje, slednje pa se je izkazalo za bolj občutljivo na terapijo s CaEP. Zanimal nas je tudi imunološki učinek terapije. Zato smo preučili, ali po CaEP pride do imunogene celične smrti in sproščanja signalov nevarnosti. Pokazali smo, da se po CaEP sprošča HMGB1 in v manjši meri ATP, prav tako pride v in vitro pogojih do prerazporeditve HSP70, v in vivo pogojih pa tudi do ko-asociacije kalretikulina z membrano. Ovrednotili smo tudi uspešnost terapije na dveh različnih tumorskih modelih, mišjem melanomu B16-F10 in mišjem karcinomu 4T1, pri katerih smo v in vitro pogojih dokazali dozno odvisno preživetje tumorskih celic, prav tako imata obe celični liniji primerljivo intrinzično občutljivost na CaEP. V in vivo poskusih na podkožnih tumorjih je občutljivost tumorskih modelov zelo različna. Po terapiji z različnimi koncentracijami kalcijevih raztopin se nakazuje trend dozne odvisnosti, ki pa je nismo statististično potrdili, prav tako se je tumorski model 4T1 izkazal za bolj občutljivega na CaEP pri višjih koncentracijah. Ovrednotili smo tudi uspešnost kombinacije CaEP z genskim elektroprenosom plazmida z zapisom za IL-12, s katero lahko dodatno spodbudimo imunski odziv. Pokazali smo, da je uspešnost kombinirane terapije odvisna ne le od tumorskega modela, pač pa tudi od uspešnosti same CaEP. In sicer, znatno povečanje preživetja miši po kombinirani terapiji smo dosegli pri tumorskem modelu B16-F10, medtem ko pri modelu 4T1 dosežemo popolne odgovore že pri samem injiciranju 250 mM kalcijeve raztopine in s kombinirano terapijo ne doprinesemo k izboljšanju izida terapije. Učinkovitost terapije smo primerjali z elektrokemoterapijo z bleomicinom. Z rezultati doktorske naloge bomo pomembno prispevali k izboljšanju razumevanja delovanja CaEP. Calcium electroporation (CaEP) is a novel local ablative method for tumor treatment, where high concentrations of calcium are used for induction of cell death, and electroporation is used as a delivery method. The effectiveness of CaEP was already tested in several clinical studies however, its mechanisms are not yet completely clarified. In this study, the effectiveness of CaEP was studied on three levels. First, the direct cytotoxic effect on endothelial and tumor cell lines was tested, as well as the effects on cytoskeleton and cell-cell junctions of endothelial cells. In in vivo studies was shown, CaEP has a vessel disrupting effect, where tumor vasculature was shown to be more sensitive to CaEP than normal. Besides that, we tested immunological consequences of CaEP on two different tumor models, murine melanoma B16-F10 and murine carcinoma 4T1. We showed in B16-F10 tumor model that induction of immunogenic cell death occurs after CaEP, as excretion of HMGB1 and ATP transpires, as well as translocation of HSP70 to the cell surface, in ex vivo experiments, co-association of calreticulin with membranes was confirmed. We also evaluated the effectiveness of different concentrations of calcium, where we showed dose-dependent survival of cells with similar sensitivity of both cell lines to CaEP however, in subcutaneous tumors in vivo, this was not the case. Here, 4T1 tumor model proved to be more sensitive to CaEP as B16-F10. A combination of CaEP with gene electrotransfer of plasmid encoding IL-12 was also evaluated, which proved to be dependent on tumor type as well as on the effectiveness of CaEP alone. Combined therapy showed significantly enhanced survival in B16-F10 model, whereas, in 4T1 model, calcium injection alone resulted in tumor cures and IL-12 did not improve the outcome. Electrochemotherapy was used as a positive control in all experiments. The results of this study will importantly contribute to the understanding of CaEP mechanisms.