Search

Inflammatory mediators derived from arachidonic acid by the enzymes cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX) are involved in the pathogenesis of various inflammatory diseases. Inhibition of the COX pathway is thought to lead to potentiation of the LOX pathway, and inhibition of both pathways represents a rational approach to the design and development of more effective and safer anti-inflammatory drugs (1). The aim of this study was the synthesis and physico-chemical characterization of 1f, 1g and 1h derivatives derived from a previously conducted 3D-QSAR study and molecular docking (2). The sulfhydroxamic acid derivative 1f was synthesized in a two-step process. Sulfonyl chloride was synthesized from commercially available sulfonic acid and thionyl chloride in the presence of a catalytic amount of DMF. Sulfhydroxamic acid was further obtained from previously synthesized sulfonyl chloride and hydroxylamine hydrochloride in the presence of 10% NaHCO3 solution. Sulfhydroxamic acid derivatives, 1g and 1h were synthesized from commercially available sulfonyl chlorides and hydroxylamine hydrochloride in the presence of 10% NaHCO3 solution. The reaction mixtures were purified by liquid-liquid extraction and preparative TLC to give derivatives 1f, 1g, 1h in yields: 26%, 53% and 63%. The structure and purity of the synthesized compounds were confirmed by determination of the melting points and spectroscopic techniques (ATR-FTIR, 1H-NMR, 13C-NMR, MS/MS). Based on a previously conducted in silico study, the voluminous sulfhydroxamic group is responsible for iron chelation within 5-LOX active center and for COX-2 selectivity, as COX-2 has wider side pocket, so potent inhibition of COX-2 and 5-LOX enzymes is expected. Inflamatorni medijatori koji nastaju iz arahidonske kiseline posredstvom enzima ciklooksigenaze (COX) i lipooksigenaze (LOX) učestvuju u patogenezi brojnih inflamatornih oboljenja. Smatra se da inhibicija COX puta dovodi do potenciranja LOX puta, te inhibicija oba puta predstavlja racionalan pristup dizajniranja i razvoja novih, efikasnijih i bezbednijih antiinflamatornih lekova (1). Cilj rada je bila sinteza i fizičko-hemijska karakterizacija derivata 1f, 1g i 1h proisteklih iz prethodno sprovedene 3D-QSAR studije i molekulskog docking-a (2). Derivat sulfhidroksamske kiseline 1f je sintetisan u dvostepenom postupku pri čemu se najpre iz komercijalno dostupne sulfonske kiseline i tionil hlorida u prisustvu katalitičke količine DMF dobija odgovarajući sulfonil hlorid. Odgovarajuća sulfhidroksamska kiselina (1f) se dobija u drugom koraku iz prethodno sintetisanog sulfonil hlorida i hidroksilamin-hidrohlorida u prisustvu 10% rastvora NaHCO3 . Derivati sulfhidroksamske kiseline, 1g i 1h su sintetisani jednostepenim postupkom iz komercijalno dostupnih sulfonil hlorida i hidroksilamin-hidrohlorida u prisustvu 10% rastvora NaHCO3 . Nakon postupka sinteze jedinjenja su prečišćena tečno-tečnom ekstrakcijom i preparativnom TLC pri čemu se dobijaju derivati 1f, 1g, 1h u prinosima 26%, 53% i 63%. Struktura i čistoća sintetisanih jedinjenja je potvrđena određivanjem temperature topljenja i spektroskopskim (ATR-FTIR, 1 H-NMR, 13 C-NMR, MS/MS) tehnikama. Na osnovu prethodno sprovedene in silico studije, voluminozni centar i sulfhidroksamska grupa sintetisanih derivata su odgovorni za COX-2 selektivnost zbog prisustva šireg vezivnog mesta unutar COX-2 enzima, dok sulfhidroksamska grupa unutar 5-LOX enzima helira gvožđe aktivnog centra i inhibira enzim, te se očekuje potentna dualna COX-2 i 5-LOX inhibitorna aktivnost sintetisanih derivata. VIII Kongres farmaceuta Srbije sa međunarodnim učešćem, 12-15.10.2022. Beograd

Flunixin is a non-steroidal anti-inflammatory drug, as well as an analgesic that has an antipyretic effect. In veterinary medicine, it is used as salt flunixin meglumine. Flunixin shows strong inhibition of the cyclooxygenase system involved in the development of inflammation (1). The decrease in the production of certain inflammatory mediators explains its analgesic, antipyretic and anti-inflammatory properties. A large number of methods have been developed for the separation of flunixin meglumine and structurally related compounds in pharmaceutical preparations, such as: thin layer chromatography, UV/VIS spectroscopy, high pressure liquid chromatography and gas chromatography. The objective of this work is to develop, optimize and validate a method for separating flunixin meglumine and structurally related substances, in solution for injection. Optimal conditions were achieved on a Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 column (150×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase is a mixture of 0.1% (v/v) formic acid in water and methanol in a ratio of 40:60 (v/v). The flow rate is 1.0 mL/min, the injection volume is 20 μL, the detection wavelength is 270 nm and the column temperature is 25°C. The following parameters were examined: selectivity, linearity, precision, accuracy, detection limit, quantification limit, robustness and stability of the solution (2). All these parameters were in line with the criteria for accepting the results. Thereafter, the method was applied to determine the content of flunixin meglumine and its impurities in the solution for injection, and the result was also in accordance with the criteria for accepting the results. Fluniksin je nesteroidni antiinflamatorni lek, kao i analgetik koji ima antipiretički efekat. U veterinarskoj medicini se koristi u obliku soli fluniksin-meglumina. Fluniksin pokazuje snažnu inhibiciju enzima ciklooksigenaze koji je uključen u nastanak inflamacije (1). Smanjenjem produkcije određenih medijatora inflamacije objašnjavaju se njegova analgetička, antipiretička i antiinflamatorna svojstva. Razvijen je veliki broj metoda za odvajanje fluniksin meglumina i strukturno srodnih jedinjenja u farmaceutskim preparatima, kao što su: tankoslojna hromatografija, UV/VIS spektroskopija, visokoefikasna tečna hromatografija, gasna hromatografija. Cilj ovoga rada je razvoj, optimizacija i validacija metode za razdvajanje i određivanje fluniksin-meglumina i strukturno sličnih jedinjenja, u rastvoru za injekciju. Optimalni uslovi postignuti su na koloni Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (150×4,6 mm, 5 μm). Mobilnu fazu činila je smeša 0,1% v/v rastvora mravlje kiseline u vodi i metanola u odnosu 40:60 v/v. Protok mobilne faze je 1,0 mL/min, volumen injiciranja 20 μL, talasna dužina detekcije 270 nm i temperatura kolone 25°C. Ispitivani su sledeći parametri: selektivnost, linearnost, preciznost, tačnost, limit detekcije, limit kvantifikacije, robustnost i stabilnost rastvora (2). Dobijene vrednosti za ispitivane parametre su u skladu sa kriterijumima prihvatljivosti. Validirana metoda je primenjena za određivanje sadržaja fluniksin-meglumina i njegovih nečistoća u rastvoru za injekcije. Dobijeni rezultati zadovoljavali su zahteve specifikacije. VIII Kongres farmaceuta Srbije sa međunarodnim učešćem, 12-15.10.2022. Beograd

Histon deacetilaze su metaloenzimi koji hidrolizuju acetilovane bočne amino grupe lizina na histonskim i nehistonskim proteinima. Uklanjanjem acetil grupe sa lizina generiše se pozitivno naelektrisanje na histonima, koje gradi jonske veze sa negativno naelektrisanim DNK molekulima. Kao posledica građenja jonskih veza, hromatin postaje gusto pakovan, teže dostupan transkripcionim faktorima, koji posledično dovodi do represije genske transkripcije. U epigenetičkim istraživanjima, derivati hidroksamskih kiselina se koriste u dizajniranju inhibitora histon deacetilaza. Posledica inhibicije histon deacetilaza je indukcija apoptoze, zastoj u ćelijskom ciklusu, smanjenje rasta tumora, inhibicija migracije i invazije malignih ćelija. U zavisnosti od homologije u primarnoj sekvenci i ćelijske lokalizacije, histon deacetilaze su podeljene u četiri klase. Klasi I pripadaju HDAC1, HDAC2, HDAC3 i HDAC8 izoforme. Klasa II se deli na dve podklase – klasu IIa (HDAC4, HDAC5, HDAC7 i HDAC9), dok klasi IIb pripadaju HDAC6 i HDAC10. Posebno se izdvaja izoforma HDAC11 u okviru klase IV humanih histon deacetilaza. Prva faza istraživanja u ovoj doktorskoj disertaciji je kompjutersko dizajniranje selektivnih inhibitora histon deacetilaze 6. Dizajniranje pomenutih inhibitora je omogućeno kombinovanjem studija kvantitativnog odnosa strukture i aktivnosti (3D-QSAR), pretrage novih fragmenata, kao i studija molekulskog dokinga na trodimenzionalnim strukturama histon deacetilaza 1 i 6. Druga faza istraživanja bila je sinteza odabranih jedinjenja na osnovu zaključaka in silico studija racionalnog dizajna selektivnih HDAC6 inhibitora. Treća faza istraživanja u ovoj doktorskoj disertaciji je određivanje vrednosti inhibitornih koncentracija (IC50) novosintetisanih jedinjenja na humanim HDAC1, HDAC3, HDAC6 i HDAC8 izoenzimima u in vitro enzimskim testovima. Ispitivanje antikancerskih osobina sintetisanih jedinjenja na ćelijama tumora dojke (MDA-MB-231 i MCF-7) predstavlja četvrtu fazu istraživanja u ovoj doktorskoj disertaciji. Kao rezultat kompjuterskog dizajniranja selektivnih inhibitora histon deacetilaze 6 izdvojeni se validni i prediktivni 3D-QSAR modeli. Tehnikom virtuelnog skrininga odabrani su odgovarajući fragmenti za dizajniranje selektivnih HDAC6 inhibitora. Molekulskim dokingom je predviđen način vezivanja dizajniranih jedinjenja za humane HDAC1 i HDAC6 izoforme. Sintetisane su dve klase derivata hidroksamskih kiselina, derivati 1-benzhidrilnog piperazina i klasa 5,5-difenil-2,4- imidazolidindiona i okarakterisani metodama strukturne analize. Na osnovu rezultata in vitro enzimskih testiranja, identifikovano je sedam nanomolarnih inhibitora histon deacetilaze 6, od kojih su dva inhibitora: BDR-6, IC50 = 186 nM i BDR-9, IC50 = 31 nM selektivna za HDAC6 izoformu i jedan inhibitor je izdvojen kao dualni HDAC6/8 inhibitor. Ispitivanjima uticaja sintetisanih inhibitora na ćelijsko preživljavanje, apoptozu, promene u ćelijskom ciklusu, migraciju i invaziju ćelija kancera dojke (MDA-MB-231 i MCF-7) izdvojen je neselektivni HDAC inhibitor, BDR-8 (HDAC1, IC50 = 408 nM; HDAC3 IC50 = 207 nM; HDAC6, IC50 = 124 nM i HDAC8, IC50 = 245 nM) sa najboljim antikancerskim osobinama. Najpotentniji sintetisani selektivni HDAC6 inhibitor, BDR-9 predstavlja necitotoksično jedinjenje sa antimigratornim osobinama na MCF-7 ćelijama kancera dojke. U ovoj doktorskoj disertaciji prikazan je sistematičan protokol za preklinički razvoj novih selektivnih inhibitora histon deacetilaze 6, koji može da bude iskorišćen u budućim istraživanjima u oblasti otkrića lekova koji deluju na kancerski epigenom. Histone deacetylases are metalloenzymes that hydrolyze acetylated lysine side chains on histone and non-histone proteins. Removal of the acetyl group from lysine generates a positive charge on histones that forms ionic bonds with negatively charged DNA molecules. As a consequence of forming ionic bonds, chromatin becomes densely packed, the access of the transcription factors is prevented, which in turn leads to the repression of gene transcription. In epigenetic drug discovery, hydroxamic acid derivatives are used in the design of histone deacetylase inhibitors. Inhibition of human histone deacetylases leads to induction of apoptosis, cell cycle arrest, tumor growth inhibition, inhibition of migration and invasion of malignant cells. Depending on the homology in the primary sequence and cell localization, histone deacetylases are classified into four classes. Class I is consisted of HDAC1, HDAC2, HDAC3 and HDAC8 isoforms. Class II is divided into two subclasses - class IIa (HDAC4, HDAC5, HDAC7 and HDAC9), and class IIb (HDAC6 and HDAC10). The HDAC11 is the unique isoform within the class IV HDACs. The first goal of research in this doctoral dissertation was computational drug design of selective histone deacetylase 6 inhibitors. The second goal of the research was the synthesis of selected compounds based on the predictions of in silico studies. The third research goal in this doctoral dissertation is to determine the inhibitory concentrations (IC50) of newly synthesized compounds against human HDAC1, HDAC3, HDAC6 and HDAC8 isoenzymes in in vitro enzyme assays. Evaluation of anticancer properties of synthesized compounds on breast tumor cells (MDA-MB- 231 and MCF-7) is the fourth goal set in this doctoral dissertation. As a result of computational drug design study, valid and predictive 3D-QSAR models were generated. The most promising fragments for the design of selective HDAC6 inhibitors were selected by virtual screening technique. Molecular docking study predicted the binding modes of designed compounds toward the human HDAC1 and HDAC6 isoforms. Two classes of hydroxamic acid derivatives, 1-benzhydryl piperazine derivatives and 5,5-diphenyl-imidazolidine- 2,4-dione derivatives were synthesized and characterized by NMR analysis and mass spectrometry. Considering the results of in vitro enzyme assays, seven nanomolar histone deacetylase 6 inhibitors were identified, of which two inhibitors: BDR-6, IC50 = 186 nM and BDR-9, IC50 = 31 nM are selective for HDAC6 isoform and one inhibitor was disclosed as dual HDAC6 / 8 inhibitor. Evaluation of the effects of synthesized inhibitors on cell survival, apoptosis, changes in cell cycle, migration and invasion of breast cancer cells (MDA-MB-231 and MCF-7) singled out a non- selective HDAC inhibitor, BDR-8 (HDAC1, IC50 = 408 nM; HDAC3 IC50 = 207 nM, HDAC6, IC50 = 124 nM and HDAC8, IC50 = 245 nM) with the best anticancer properties. The most potent selective HDAC6 inhibitor, BDR-9 is a non-cytotoxic compound with anti-migratory properties on MCF-7 breast cancer cells. In this doctoral dissertation, a systematic protocol for the preclinical drug discovery of novel selective histone deacetylase 6 inhibitors is presented, that can be used in future research of drug candidates that target the cancer epigenome.

Primena konvecionalnih glukokortikoida je pra'ena brojnim lokalnim i sistemskim neželjenim efektima... The use of traditional glucocorticoids is accompained with various local and systemic side effects...

Primena konvecionalnih glukokortikoida je pra'ena brojnim lokalnim i sistemskim neželjenim efektima... The use of traditional glucocorticoids is accompained with various local and systemic side effects...

U ovoj doktorskoj disertaciji opisana je sinteza sest halkonskih intermedijera kao prekursora za sintezu sest novih aminoalkoksi derivata fenilpropiofenona i flavanona. Aminoalkoksi derivati fenilpropiofenona su strukturni analozi postojeceg antiaritmika Ic grupe, propafenona. U položaje 2 i 4 terminalnog benzenovog prstena uvođeni su supstituenti koji modifikuju hidrofobne i elektronske osobine molekula u cilju povecanja selektivnosti i potentnosti prema određenom tipu jonskog kanala. Sinteza propafenonskih derivata obuhvata pet faza: aldolnu kondenzaciju; kataliticku hidrogenizaciju; formiranje epoksida; aminolizu i građenje hidrohloridnih soli. Ako se alkalni, vodeno-etanolni rastvor trifluorometil halkona podvrgne dejstvu povisene temperature, nastaje flavanon koji hlađenjem kristalise u vidu iglicastih kristala. Cistoca i struktura sintetisanih jedinjenja potvrđena je hromatografskim i spektroskopskim metodama, dok je struktura sintetisanog flavanona potvrđena i kristalografski. Vazorelaksantna aktivnost propafenona i novosintetisanih derivata (1-100 μM) ispitana je na izolovanoj aorti pacova sa i bez endotela, koja je prethodno prekontrahovana rastvorom fenilefrina (10 μM). Svih sest sintetisanih derivata, ukljucujuci i propafenon, pokazali su doznozavisni vazorelaksantni efekat za koji je eksperimentalno potvrđeno da nije endotel zavisan. Ucesce jonskih kanala u vazorelaksantnom mehanizmu dejstva derivata propafenona ispitano je u prisustvu: lidokaina, antagoniste Na+ kanala (3 mM), nifedipina, selektivnog antagoniste LCa2+ kanala (1 μM) i 4-aminopiridina (4-AP), neselektivnog antagoniste K+ kanala (3 mM). Dobijeni rezultati ukazuju da su jonski kanali ukljuceni u mehanizam vazorelaksantnog dejstva i da uvedene strukturne modifikacije u molekulu propafenona doprinose postizanju izvesnog stepena selektivnosti. 4-AP antagonizovao je efekat derivata koji u para položaju terminalnog benzenovog prstena ima –CH3 grupu (5PCH3). Srednja efektivna koncentracija za derivat 5PCH3 (pEC50 4,41) tri puta je veca od koncentracije propafenona (pEC50 4,97) i dva puta od koncentracije sledeceg u nizu po kompeticiji, para fluoro supstituisanog derivata (5PF). U prisustvu nifedipina, najbolji antagonizam postignut je kod orto trifluorometil supstituisanog derivata (5OCF3), sto ukazuje na vecu selektivnost ovog derivata (pEC50 4,55) u odnosu na propafenon (pEC50 4,90), ali i ostale derivate (pEC50 4,70 - 4,97). Lidokain je antagonizovao efekat 5PF derivata. Srednja efektivna koncentracija 5PF derivata je dva i po puta veca u odnosu na propafenon (pEC50 4,89) i druge derivate (pEC50 4,86-5,19). Docking studije koje su sprovedene uz pomoc programa AutoDock v. 4.0.1 doprinele su razjasnjenju rezultata dobijenih u in vitro ispitivanjima antagonistickog dejstva 4-AP-a i nifedipina. Docking eksperimenti sa kristalografskom strukturom bakterijskog KcsA kanala su izvedeni pod pretpostavkom da se ispitivana jedinjenja vezuju za istu aminokiselinsku sekvencu pore kanala (Thr 107, Ala 108 i Ala 111) kao i 4-AP. Na osnovu dobijenih rezultata zakljucuje se, da 5OF derivat ciji vazorelaksantni efekat nije antagonizovan 4-AP-om, pokazuje najveci afinitet za vezivno mesto 4-AP-a u pori kanala. Ako se uporede rezultati dobijeni u docking eksperimentima na izdvojenom peptidu L-Ca2+ kanala, uocava se da 5OCF3 i 5OCl derivati pokazuju veci afinitet prema vezivnom mestu u poređenju sa ostalim orto i para supstituisanim derivatima. Docking eksperimenti na homologom modelu hERG kanala prethodili su in vivo eksperimentima. Najveca pažnja tokom eksperimenata bila usmerena ka interakcijama propafenona i derivata sa aminokiselinama Phe 656 i Tyr 652 za koje se smatra da su odgovorne za neželjene efekte mnogih lekova. Na osnovu dobijenih rezultata izabrana su tri halogenovana derivata (5OCl, 5OF i 5PF) za in vivo ispitivanja. Primenom akonitinskog testa, u in vivo eksperimentima na pacovima u dubokoj anesteziji, ispitivan je antiaritmijski potencijal halogenovanih derivata propafenona...

U ovoj doktorskoj disertaciji opisana je sinteza šest halkonskih intermedijera kao prekursoraza sintezu šest novih aminoalkoksi derivata fenilpropiofenona i flavanona. Aminoalkoksiderivati fenilpropiofenona su strukturni analozi postojećeg antiaritmika Ic grupe, propafenona.U položaje 2 i 4 terminalnog benzenovog prstena uvođeni su supstituenti koji modifikujuhidrofobne i elektronske osobine molekula u cilju povećanja selektivnosti i potentnosti premaodređenom tipu jonskog kanala. Sinteza propafenonskih derivata obuhvata pet faza: aldolnukondenzaciju; katalitičku hidrogenizaciju; formiranje epoksida; aminolizu i građenjehidrohloridnih soli. Ako se alkalni, vodeno-etanolni rastvor trifluorometil halkona podvrgnedejstvu povišene temperature, nastaje flavanon koji hlađenjem kristališe u vidu igličastihkristala. Čistoća i struktura sintetisanih jedinjenja potvrđena je hromatografskim ispektroskopskim metodama, dok je struktura sintetisanog flavanona potvrđena i kristalografski.Vazorelaksantna aktivnost propafenona i novosintetisanih derivata (1-100 μM) ispitana jena izolovanoj aorti pacova sa i bez endotela, koja je prethodno prekontrahovana rastvoromfenilefrina (10 μM). Svih šest sintetisanih derivata, uključujući i propafenon, pokazali su doznozavisnivazorelaksantni efekat za koji je eksperimentalno potvrđeno da nije endotel zavisan.Učešće jonskih kanala u vazorelaksantnom mehanizmu dejstva derivata propafenona ispitano jeu prisustvu: lidokaina, antagoniste Na+ kanala (3 mM), nifedipina, selektivnog antagoniste LCa2+kanala (1 μM) i 4-aminopiridina (4-AP), neselektivnog antagoniste K+ kanala (3 mM).Dobijeni rezultati ukazuju da su jonski kanali uključeni u mehanizam vazorelaksantnog dejstva ida uvedene strukturne modifikacije u molekulu propafenona doprinose postizanju izvesnogstepena selektivnosti. 4-AP antagonizovao je efekat derivata koji u para položaju terminalnogbenzenovog prstena ima –CH3 grupu (5PCH3). Srednja efektivna koncentracija za derivat5PCH3 (pEC50 4,41) tri puta je veća od koncentracije propafenona (pEC50 4,97) i dva puta odkoncentracije sledećeg u nizu po kompeticiji, para fluoro supstituisanog derivata (5PF). Uprisustvu nifedipina, najbolji antagonizam postignut je kod orto trifluorometil supstituisanogderivata (5OCF3), što ukazuje na veću selektivnost ovog derivata (pEC50 4,55) u odnosu napropafenon (pEC50 4,90), ali i ostale derivate (pEC50 4,70 - 4,97). Lidokain je antagonizovaoefekat 5PF derivata. Srednja efektivna koncentracija 5PF derivata je dva i po puta veća u odnosuna propafenon (pEC50 4,89) i druge derivate (pEC50 4,86-5,19). Docking studije koje susprovedene uz pomoć programa AutoDock v. 4.0.1 doprinele su razjašnjenju rezultata dobijenihu in vitro ispitivanjima antagonističkog dejstva 4-AP-a i nifedipina. Docking eksperimenti sakristalografskom strukturom bakterijskog KcsA kanala su izvedeni pod pretpostavkom da seispitivana jedinjenja vezuju za istu aminokiselinsku sekvencu pore kanala (Thr 107, Ala 108 iAla 111) kao i 4-AP. Na osnovu dobijenih rezultata zaključuje se, da 5OF derivat čijivazorelaksantni efekat nije antagonizovan 4-AP-om, pokazuje najveći afinitet za vezivno mesto4-AP-a u pori kanala. Ako se uporede rezultati dobijeni u docking eksperimentima naizdvojenom peptidu L-Ca2+ kanala, uočava se da 5OCF3 i 5OCl derivati pokazuju veći afinitetprema vezivnom mestu u poređenju sa ostalim orto i para supstituisanim derivatima.Docking eksperimenti na homologom modelu hERG kanala prethodili su in vivoeksperimentima. Najveća pažnja tokom eksperimenata bila usmerena ka interakcijamapropafenona i derivata sa aminokiselinama Phe 656 i Tyr 652 za koje se smatra da su odgovorneza neželjene efekte mnogih lekova. Na osnovu dobijenih rezultata izabrana su tri halogenovana derivata (5OCl, 5OF i 5PF) za in vivo ispitivanja.Primenom akonitinskog testa, u in vivo eksperimentima na pacovima u dubokoj anesteziji,ispitivan je antiaritmijski potencijal halogenovanih derivata propafenona...