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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Tinnitus is an abnormal state of nerve cell activity of the auditory system, leading to perception of phantom sounds such as ringing of the ears. Although tinnitus perception is not harmful per se, it can lead to severe psychological stress, anxiety and depression. Several studies indicate the auditory cortex as a potential target for transcranial magnetic/direct current stimulation to alleviate tinnitus perception, yet little is known of how tinnitus alters cortical circuits. Here we investigate cellular populations of layer 5 (L5) of the primary auditory cortex (A1) in a mouse model of noise-induced tinnitus. L5 pyramidal cells (PCs) were routinely subdivided into putative corticofugal projecting type A, or contra-lateral projecting type B PCs, post hoc. We found that membrane properties were different between younger (P16-23) and mature cells (P38-52), and therefore we opted to only include animals ≥1 month of age for noise-overexposure (4-20kHz, 90dB, 1,5 hrs). Next we compared passive and active membrane properties between the two PC subtypes as well between control and tinnitus-like animals. We also used transgenic Chrna2-cre mice to investigate inhibitory Martinotti cells between the experimental groups. We found that noise overexposure did not change passive membrane properties of either type A or type B PCs when examined 5-8 days later. Instead we found type A PCs to fired with a significantly lower firing frequency in response to positive current injections (150pA) following noise overexposure (control A: 20,3±1,8Hz, n=11, noiseoverexposed: 16,1±1,2Hz, n=19, p=0.050), while contrarily type B PCs significantly increased steady state firing frequency (Control B: 13,3±1,3Hz, n=13, noise-overexposed: 19,5±2,4Hz, n=22, p=0,048). Interestingly, preliminary data from Martinotti cells from noise-overexposed animals show a trend of higher initial firing frequency than control (control M: 70,05±6,5Hz, n=8, noise-overexposed: 80,5±3,4Hz, n=12) and steady state frequency (control M: 20,35±4,4Hz, noise-overexposed: 33,5±4,9Hz). Since Martinotti cells are specifically connected to type A PCs through recurrent inhibition, this could suggest that Martinotti cells protects type A PCs from acoustic over-activity. Preliminary data using a genetic activity marker (CaMPARI, n=4 mice) also suggests that noise-overexposure does not affect cells uniformly in layer 5-6 of the A1.Together, these results are a first step in identifying specific cortical neurons affected by noise-induced tinnitus and quantify electrophysiological differences seen for each subtype. To understand the cellular mechanisms of tinnitus is crucial for improving treatments of tinnitus using cortical stimulation. O tinnitus é um estado anormal de atividade das células nervosas do sistema auditivo, que leva à percepção de sons fantasmas, como um zumbido nos ouvidos. Embora a percepção do tinnitus não seja prejudicial em si, pode levar a um estresse psicológico grave, a ansiedade e depressão. Vários estudos indicam o córtex auditivo como um alvo potencial para a estimulação transcraniana magnética/corrente contínua para aliviar a percepção do zumbido, mas pouco é conhecido sobre como esse zumbido altera os circuitos corticais. Aqui nós investigamos populações celulares da camada 5 (L5) do córtex auditivo primário (A1) em um modelo de tinnitus induzido por ruído. As células piramidais (PCs) da L5 são rotineiramente subdivididas em tipo A, que projetam corticofugal, ou PC tipo B, com projeção contralateral, post hoc. Encontramos que as propriedades de membrana foram diferentes entre as células mais jovens (P16-23) e as maduras (P38-52) e, portanto, optamos por incluir apenas animais com idade ≥1 mês para a superexposição ao ruído (4-20kHz, 90dB, 1,5 h). Em seguida, comparamos as propriedades ativas e passivas da membrana entre os dois subtipos de PCs, bem como entre animais controle e animais expostos ao ruído. Também usamos camundongos transgênicos Chrna2-cre para investigar a atividade de células inibitórias Martinotti entre os grupos experimentais. Vimos que a superexposição ao ruído não alterou as propriedades passivas da membrana das PCs do tipo A e tipo B quando examinadas de 5 a 8 dias após o trauma. Entretanto, encontramos PCs do tipo A tendo uma frequência de disparo significativamente menor em resposta a injeções de corrente positivas (150pA) após a superexposição ao ruído (controle A: 20,3 ± 1,8Hz, n = 11, ruído superexposto: 16,1 ± 1,2 Hz, n = 19, p = 0,050), enquanto as PCs do tipo B, por outro lado, aumentaram significativamente a frequência de disparo no estado estacionário (Controle B: 13,3 ± 1,3 Hz, n = 13, ruído superexposto: 19,5 ± 2,4 Hz, n = 22, p = 0,048). Interessantemente, dados preliminares das células Martinotti de animais superexpostos ao ruído mostram uma frequência de disparo inicial maior do que o controle (controle M: 70,05 ± 6,5 Hz, n = 8, ruído superexposta: 80,5 ± 3,4 Hz, n = 12), assim como maior frequência de estado estacionário (controle M: 20,35 ± 4,4Hz, ruído superexposto: 33,5 ± 4,9Hz). Como as células Martinotti são especificamente conectadas a PCs tipo A através de inibição recorrente, isso poderia sugerir que as células Martinotti protegem as PCs tipo A contra a hiperatividade acústica. Dados preliminares usando um marcador de atividade genética (CaMPARI, n = 4 ratos) também sugerem que a superexposição ao ruído não afeta as células uniformemente na camada 5-6 do A1. Juntos, esses resultados são um primeiro passo na identificação de neurônios corticais específicos afetados pelo zumbido induzido por ruído e quantificam as diferenças eletrofisiológicas observadas em cada subtipo. Entender os mecanismos celulares do zumbido é crucial para aprimorar os tratamentos utilizando estimulação cortical.

Neurônios GnRH e kisspeptina representam as populações neuronais de maior importância no controle da reprodução. Estradiol liga-se ao seu receptor expresso pelos neurônios kisspeptina para regular a libertação de GnRH. No modelo animal OVX+E a atividade do neurônio GnRH e pico de LH é depende do estradiol e hora do dia. Nesse estudo, embora a taxa de disparo dos neurônios GnRH seja similar entre os grupos, o padrão dos potenciais revelou uma mudança para maior duração do estouro em camundongos no proestrous, além do fato de uma maior resposta da hipófise. A prolactina tem grande impacto na modulação do eixo HPG e kisspeptina são mediadores dos efeitos da prolactina sobre a reprodução. Uma pequena porcentagem de neurônios de kisspeptina do AVPV foi indiretamente despolarizada pela prolactina. Este efeito requeria a via de sinalização PI3K. Camundongos portadores de inativação de Stat5a/b em células kisspeptina exibiram um início precoce de ciclicidade estro, indicando que os fatores de transcrição STAT5 exercem um efeito inibitório sobre o momento da puberdade. GnRH and kisspeptina neurons represent the most important neuronal populations in the control of reproduction. Estradiol binds to its receptor expressed by the kisspeptina neurons to regulate the release of GnRH. In the animal model OVX+E the activity of the GnRH neuron and LH surge is dependent of estradiol and time of day. In this study, although the firing rate of GnRH neurons was similar between groups, the pattern of potentials revealed a change to longer burst duration in mice in proestrous, and the pituitary response was greater in this group. Prolactin has impact on HPG axis modulation and kisspeptin is a mediator of the effects of prolactin on reproduction. A small percentage of AVPV kisspeptin neurons were indirectly depolarized by prolactin. This effect required the PI3K signaling pathway. Mice bearing Stat5a/b inactivation on kisspeptin cells exhibited an early onset of estrus cyclicity, indicating that STAT5 transcription factors exert an inhibitory effect on the time of puberty.

Esse estudo objetiva avaliar se a expressão da enzima de reparo de DNA Neil3 é importante para o desenvolvimento funcional dos neurônios. Estudos previos tem demonstrado que Neil3 interfere tanto na neurogênese adulta como na fazer embrionaria. Eu utilizei whole cell patch clamp para estudar propriedades sinapticas e de membrana das células granulares do giro denteado. O giro denteado é uma das regiões com maior expressão de Neil3 no cérebro e estudos previos tem demonstrado que a neurogênese reativa em camundongos adultos é afetada pela ausencia da enzima de reparo Neil3. Eu encontrei que a maioria das propriedades de membrana nas células granulares de camundongos knockout para Neil3 são normais com exceção à resposta de membrana às correntes de hiperpolarização e pós-hiperpolarização. Diferentemente de neurônios imaturos, as células granulares do giro denteado de camundongos com ausência de Neil3, na qual as correntes de hiperpolarização ativadas são geralmente as ultimas a aparecerem durante o desenvolvimento. Além disso, correntes sinapticas excitatorias foram similar em amplitude mas apresentaram um decaimento ligeiramente mais rapido em células de camundongos knockout de Neil3. Esses resultados podem indicar um balanço diferente entre os receptores AMPA e NMDA em camundongos knockout. Analises morfologicas de neurônios preenchidos com biotina e reconstrução post hoc não apresentaram grandes diferenças na morfologia dendritica entre animais controle e knockout. Esse estudo mostra que, em relação diferenças entre animais controle, neurônios do giro denteado de animais knockout de Neil3 não podem ser classificados como imaturos. Eu encontrei diferenças pontuais na corrente de hiperpolarização e pequenas diferenças em propriedades sinapticas. Ainda devem ser avaliadas se essas diferenças podem ser responsáveis por alterações comportamentais encontradas em camundongos Neil3-knockout. Além disso, estudos futuros utilizando marcadores de neurônios recém-nascidos são necessários para analisar o efeito da eliminação da enzima Neil3 no desenvolvimento de neurônios. This study aims to assess whether the expression of the DNA repair enzyme Neil3 is important for the functional development of neurons. Previous studies have demonstrated that Neil3 interferes with both adult and embryonic neurogenesis. I have used whole cell patch clamp to study membrane and synaptic properties of granule cells of the dentate gyrus. The dentate gyrus is one of the regions with the highest expression of Neil3 in the brain, and previous studies have shown that reactive neurogenesis in adult mice is affected by Neil3 deletion. I found that most membrane properties of granule cells in Neil3-knockout mice are normal except from the membrane response to hyperpolarization currents and afterhyperpolarization currents. Different from immature neurons, granule cells of the dentate gyrus from Neil3-knockout mice, in which hyperpolarizing activated currents, are generally the last to appear during development. In addition, excitatory synaptic currents were similar in amplitude but showed a slightly faster decay in cells from Neil3-knockout mice. These results could indicate a different balance between AMPA and NMDA receptors in Neil3-knockout mice cells. Morphological analysis of neurons filled with biocytin and reconstructed post hoc showed no gross difference in dendritic morphology between dentate gyrus neurons of control and Neil3-knockout mice. This study shows that, while different from those of control littermates, dentate gyrus neurons of Neil3-knockout mice cannot be classified as ‘immature’. I found specific differences in hyperpolarizing activated currents and small differences in synaptic properties. Whether these differences may account for behavioral changes found in Neil3-knockout mice is yet to be assessed. In addition, future studies using markers of newly born neurons are necessary for analyzing the effect of Neil3 deletion in developing neurons.

Submitted by Joana Lopes Dias (jdias@ubi.pt) on 2015-04-14T10:42:15Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Mestrado_Bioquímica_Melissa R. Mariana.pdf: 1960505 bytes, checksum: a85474f9b26ea063dac3ec375a253330 (MD5) Made available in DSpace on 2015-04-14T10:42:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Mestrado_Bioquímica_Melissa R. Mariana.pdf: 1960505 bytes, checksum: a85474f9b26ea063dac3ec375a253330 (MD5) Previous issue date: 2013

FUNDAMENTO: O tramadol é um analgésico de ação central cujo mecanismo de ação envolve a ativação de um receptor opioide. Anteriormente, mostramos que o tramadol e seus enantiômeros apresentavam um efeito inotrópico negativo sobre o músculo papilar no qual o (+)-enantiômero era mais potente que (-)- e (±)-tramadol. OBJETIVO: No presente trabalho, investigamos os efeitos do tramadol e seus enantiômeros na corrente de cálcio tipo L (I Ca-L). MÉTODOS: Os experimentos foram realizados em miócitos ventriculares isolados de ratos Wistar utilizando a técnica de patch-clamp com configuração de célula inteira. RESULTADOS: O tramadol (200 µM) reduziu a amplitude de pico do I Ca-L em potenciais de 0 a +50 mV. Em 0 mV, a I Ca-L foi reduzida em 33,7 ± 7,2%. (+)- e (-)-tramadol (200 µM) produziram uma inibição semelhante da I Ca-L, na qual a amplitude do pico foi reduzida em 64,4 ± 2,8% e 68,9 ± 5,8%, respectivamente a 0 mV (P > 0,05). O tramadol, (+)- e (-)-tramadol mudaram a inativação de estado estacionário de I Ca-L para potenciais de membrana mais negativos. Além disso, tramadol e (+)-tramadol alteraram significativamente a curva de recuperação dependente de tempo da I Ca-L para a direita e reduziram a recuperação de I Ca-L da inativação. A constante de tempo foi aumentada de 175,6 ± 18,6 a 305,0 ± 32,9 ms (P < 0,01) para o tramadol e de 248,1 ± 28,1 ms para 359,0 ± 23,8 ms (P < 0,05) para o (+)-tramadol. O agonista do receptor µ-opioide (DAMGO) não tem nenhum efeito na I Ca-L. CONCLUSÃO: A inibição da I Ca-L induzida por tramadol e seus enantiômeros não teve relação com a ativação de receptores opioides e poderia explicar, pelo menos em parte, seu efeito inotrópico negativo cardíaco. BACKGROUND: Tramadol is a centrally acting analgesic, whose mechanism of action involves opioid-receptor activation. Previously, we have shown that tramadol and its enantiomers had a negative inotropic effect on the papillary muscle in which the (+)-enantiomer is more potent than (-)- and (±)-tramadol. OBJECTIVE: In this study, we investigated the effects of tramadol and its enantiomers on L-type calcium current (I Ca-L). RESULTS: Tramadol (200 µM) reduced the peak amplitude of I Ca-L at potentials from 0 to +50 mV. At 0 mV, I Ca-L was reduced by 33.7 ± 7.2%. (+)- and (-)-tramadol (200 µM) produced a similar inhibition of I Ca-L, in which the peak amplitude was reduced by 64.4 ± 2.8% and 68.9 ± 5.8%, respectively at 0 mV (p > 0.05). Tramadol, (+)- and (-)-tramadol shifted the steady-state inactivation of I Ca-L to more negative membrane potentials. Also, tramadol and (+)-tramadol markedly shifted the time-dependent recovery curve of I Ca-L to the right and slowed down the recovery of I Ca-L from inactivation. The time constant was increased from 175.6 ± 18.6 to 305.0 ± 32.9 ms (p < 0.01) for tramadol and from 248.1 ± 28.1 ms to 359.0 ± 23.8 ms (p < 0.05) for (+)-tramadol. The agonist of µ-opioid receptor DAMGO had no effect on the I Ca-L. CONCLUSION: The inhibition of I Ca-L induced by tramadol and its enantiomers was unrelated to the activation of opioid receptors and could explain, at least in part, their negative cardiac inotropic effect.