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Introduction: Dried blood spot (DBS) samples have been used for diagnostic purposes since its introduction for the neonatal screening of phenylketonuria almost 50 years ago. From that time onwards, the range of its applications has been extended until today, including next-generation sequencing (NGS) for molecular genetics diagnosis. This study aimed to evaluate a standardized organic method to extract DNA from DBS samples, for its use in the diagnostic setting.Methods: The clinical applicability of the method was tested using three samples collected in a newborn screening project for lysosomal storage diseases, allowing the determination of the genotype of the individuals. DNA was extracted from three 3-mm diameter DBS punches. Quality, purity, and concentration were determined, and its performance was assessed through standard PCR, Restriction Length Polymorphism, Sanger sequencing, and Targeted Next-generation sequencing (TNGS).Results: Results were compared with the ones obtained with DNA samples extracted following the internally validated in-house extraction protocol that used six 3-mm punches of DBS and samples extracted from whole blood.Conclusion: This organic method proved to be effective in obtaining high-quality DNA from DBS, being compatible with several downstream molecular applications, in addition to presenting a lower cost per sample., Introduction: Dried blood spot (DBS) samples have been used for diagnostic purposes since its introduction for the neonatal screening of phenylketonuria almost 50 years ago. From that time onwards, the range of its applications has been extended until today, including next-generation sequencing (NGS) for molecular genetics diagnosis. This study aimed to evaluate a standardized organic method to extract DNA from DBS samples, for its use in the diagnostic setting. Methods: The clinical applicability of the method was tested using three samples collected in a newborn screening project for lysosomal storage diseases, allowing the determination of the genotype of the individuals. DNA was extracted from three 3-mm diameter DBS punches. Quality, purity, and concentration were determined, and its performance was assessed through standard PCR, Restriction Length Polymorphism, Sanger sequencing, and Targeted Next-generation sequencing (TNGS). Results: Results were compared with the ones obtained with DNA samples extracted following the internally validated in-house extraction protocol that used six 3-mm punches of DBS and samples extracted from whole blood. Conclusion: This organic method proved to be effective in obtaining high-quality DNA from DBS, being compatible with several downstream molecular applications, in addition to presenting a lower cost per sample.

DNA-based identification tools are of great importance in plant genetic studies, where DNA isolation and purification are crucial steps. The aim of the present study was to test the efficiency of conservation and maceration methods of biological materials in the extraction of genomic DNA from leaf and stipe of x Butyagrus nabonnandii (Prosch.) Vorster. The data were analyzed with the help of the software Genes via variance analysis, considering the factorial scheme 3x2x2x2, with three replications (three specimens of the hybrid; two types of biological material – stipe and leaf; two types of conservation – fresh and dehydrated; two types of maceration – with and without liquid nitrogen). The means were analyzed by Tukey test at 5% error probability. Genomic DNA was evaluated by spectrophotometry to determine the concentration. Integrity was determined by agarose gel eletrophoresis. Two primers from the WRKY gene Family were used to test the quality of the DNA obtained in PCR reactions. Statistical analyses revealed significant differences in DNA concentrations between the evaluated methods. Higher amounts of DNA were obtained from the extraction of fresh leaves when compared to dehydrated ones. DNA yield from fresh and dehydrated stipe did not vary between the methods tested. The use of liquid nitrogen can be dispensed, as a result of band patterns in PCR reactions. It was possible to extract quality DNA and sufficient amounts of biological materials from x B. nabonnandii, which amplified the genomic regions of interest. Las herramientas de identificación de ADN son de gran importancia en los estudios genéticos de plantas, donde el aislamiento y la purificación son pasos cruciales. El objetivo del presente estudio fue probar la eficiencia de los métodos de conservación y maceración de muestras de hoja y estípite de x Butyagrus nabonnandii (Prosch.) Vorster en la extracción de ADN genómico. Los datos fueron analisados con el software Genes mediante análisis de varianza, considerando el esquema factorial 3x2x2x2 con tres repeticiones (tres ejemplares del híbrido; dos tipos de material biológico, estípite y hoja; dos tipos de conservación – fresco y deshidratado; dos tipos de maceración – con y sin nitrógeno líquido). Las medias se analizaron por el test de Tukey con 5% de probabilidad de error. El ADN genómico fue evaluado por espectrofotometria para determinar la concentración. La integridad se determinó por electroforesis en gel de agarosa. Se utilizaron dos iniciadores de la família de genes WRKY para comprobar la calidad del ADN obtenido en reacciones de PCR. Los análisis estadísticos revelaron diferencias significativas en las concentraciones de ADN entre los métodos evaluados. Se obtuvieron mayores cantidades de ADN en la extracción de hojas frescas en comparación con las hojas deshidratadas. El rendimiento de ADN del estípite fresco y deshidratado no varió entre los métodos probados. Se puede prescindir del uso de nitrógeno líquido como resultado de los patrones de bandas en las reacciones de PCR. Fue posible extraer ADN de calidad y cantidades suficientes de material biológico de x B. nabonnandii, que amplificó las regions genómicas de interés. Ferramentas de identificação baseadas em DNA são de suma importância em estudos genéticos de plantas, onde o isolamento e a purificação são passos cruciais. O objetivo do presente estudo foi testar a eficiência de métodos de conservação e de maceração de materiais biológicos na extração de DNA genômico de folha e estipe de x Butyagrus nabonnandii (Prosch.) Vorster. Os dados foram analisados com ajuda do software Genes via análise de variância, considerando o esquema fatorial 3x2x2x2, com três repetições (três espécimes do híbrido; dois tipos de material biológico, estipe e folha; dois tipos de conservação, fresco e desidratado; dois tipos de maceração, com e sem nitrogênio líquido). As médias foram analisadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade de erro. O DNA genômico foi avaliado por espectrofotometria para determinar a concentração. A integridade foi determinada por eletroforese em gel de agarose. Foram utilizados dois primers da família gênica WRKY para testar a qualidade do DNA obtido em reações de PCR. As análises estatísticas revelaram diferenças significativas nas concentrações de DNA entre os métodos avaliados. Obteve-se maiores quantidades de DNA a partir da extração de folhas frescas quando comparadas às folhas desidratadas. O rendimento do DNA a partir de estipe fresco e desidratado não variou entre os métodos testados. O uso de nitrogênio líquido pode ser dispensado, conforme resultado dos padrões das bandas nas reações de PCR. Foi possível extrair DNA de qualidade e quantidades suficientes dos materiais biológicos de x B. nabonnandii, que amplificaram as regiões genômicas de interesse.

Considerando-se que a atual tendência do melhoramento florestal é a integração das técnicas clássicas com as de análise genética molecular, faz-se necessária a obtenção de protocolos de extração de DNA genômico ajustados a cada espécie estudada. O objetivo do trabalho foi determinar o efeito de diferentes adaptações no protocolo de extração de DNA genômico CTAB para acácia-negra. Foram testados diferentes componentes na fase de extração orgânica: clorofórmio, fenol e proteinase K, além da aplicação de RNase após a fase de precipitação e limpeza do DNA. Também, foi investigada a eficiência destes tratamentos em amostras de folíolos frescas ou armazenadas em baixa temperatura durante sete dias. Foi verificada a presença de DNA de todas as amostras submetidas à extração pelo protocolo de CTAB com os diferentes tratamentos. O tempo de armazenamento das amostras não influenciou na integridade do DNA, entretanto, foi possível observar que a adição de RNase melhorou a qualidade do DNA extraído. Deste modo, sugere-se a utilização do protocolo CTAB com uso de clorofórmio e RNase, com amostras frescas ou armazenadas em baixas temperaturas.

O estabelecimento de protocolo de extração de DNA de espécies vegetais é uma técnica empregada para a obtenção de um DNA puro e de qualidade. Diante disso, objetivou-se neste estudo padronizar um protocolo para a extração de DNA da espécie Acianthera ciliata, visando posteriores estudos de diversidade genética. Foram testados dois métodos de trituração do tecido foliar, sendo eles: Tampão STE e nitrogênio líquido. Para cada método de trituração foram testadas duas concentrações de β-mercaptoetanol (0% e 2%). Os dois métodos utilizados, foram eficientes na extração do DNA genômico de A. ciliata. As amostras extraídas com 0% de β-mercaptoetanol, para os dois métodos, STE e nitrogênio líquido, apresentaram menor quantidade de DNA quando comparado com as amostras extraídas com 2% de β-mercaptoetanol. Os dois primers testados amplificaram regiões do genoma de A. ciliata. Para a extração de DNA de A. ciliata indica-se a utilização de CTAB 5% no tampão de extração e β-mercaptoetanol a 2%. Os iniciadores ISSR foram eficientes na amplificação e são recomendados para estudos de diversidade genética de A. ciliata.Palavras-chave: diversidade genética; CTAB; marcadores moleculares; orquídeas. EVALUATION OF TWO MACERATION METHODS IN Acianthera ciliata (Orchidaceae) LEAVES FOR DNA EXTRACTION ABSTRACT: The establishment of DNA extraction protocol for plant species is a technique employed to obtain pure and good quality DNA. In this study, we standardized a protocol for the extraction of DNA of the species Acianthera ciliata, aiming studies of genetic diversity subsequently. Two maceration methods for foliar tissue were tested, and they were STE buffer and liquid nitrogen. Two concentrations of β-mercaptoethanol (0% and 2%) were tested for each method. The two methods used were efficient for genomic DNA extraction of A. ciliata. In both methods the samples extracted using 0% of β-mercaptoethanol, they presented lesser amount of DNA than the samples extracted using 2% of β-mercaptoethanol. The two tested primers amplified genomic regions of A. ciliata. For the DNA extraction of A. ciliata, we indicated the use of CTAB 5% in the extraction buffer as well as β-mercaptoethanol to 2%. The ISSR primers were efficient in amplification and thus they are indicated for studies of genetic diversity of A. ciliata.Keywords: genetic diversity; CTAB; molecular markers; orchids.

Molecular characterization and genetic diversity studies based on molecular markers require a quality DNA, free of contaminants such as phenols and polysaccharides, and also a sufficient quantity to perform polymerase chain reactions (PCR). Plant DNA extraction protocols are mostly based on the CTAB (Cetyltrimethylammonium Bromide) method, however due to the particularities of each plant, adjustments are required regarding the reagents used and the amount of them. The objective of this study was to evaluate different concentrations of CTAB and β-mercaptoethanol in the DNA extraction protocol of Solenidiumlunatum (Lindl.) Kraenzl (Orchidaceae), aiming future studies of genetic diversity using molecular markers. For the CTAB, 2% and 5% concentrations were tested, while for β-mercaptoethanol, 0% and 2% weretested. To verify if the extracted material was amenable to amplification, tests were performed with three primers ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). The results indicated that all the methods were efficient in extracting DNA with quantity and quality required to perform PCRs. However, it is recommended to use the 2% CTAB protocol without addition of β-mercaptoethanol, since no significant differences in amplification results were found. The use of this protocol produces a quality material, capable of amplification, with reduction of costs and risk of intoxication. Estudo de caracterização molecular e de diversidade genética com base em marcadores moleculares requer DNA de qualidade, livre de contaminantes como fenóis e polissacarídeos, e também em quantidade suficiente para realização de reações em cadeia da polimerase (PCR). Os protocolos de extração de DNA vegetal são, em sua maioria, baseados no método CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio), contudo devido às particularidades de cada planta, são necessários ajustes quanto aos reagentes utilizados e à quantidade dos mesmos. Diante do exposto, este estudo teve por objetivo avaliar diferentes concentrações de CTAB e de β-mercaptoetanol no protocolo de extração de DNA de Solenidium lunatum (Lindl.) Kraenzl (Orchidaceae), visando futuros estudos de diversidade genética com utilização de marcadores moleculares. Para o CTAB foram testadas as concentrações 2% e 5%, enquanto que para o β-mercaptoetanol, foram testados 0% e 2%. Para verificar se o material extraído era passível de amplificação, realizam-se testes com três primers ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). Os resultados indicam que todos os métodos foram eficientes na extração do DNA em quantidade e qualidade necessárias para realização de PCRs. Todavia, recomenda-se a utilização do protocolo CTAB 2% sem adição de β-mercaptoetanol, uma vez que não foram verificadas diferenças significativas nos resultados de amplificações. A utilização desse protocolo produz material de qualidade, passível de amplificação, com redução de custos e de riscos de intoxicação.

Marcadores moleculares permitem acompanhar o progresso de um programa de melhoramento genético. Marcadores SSR (simple sequence repeats), por serem codominantes, multialélicos e apresentarem alto polimorfismo, são ideais para estudos de criação de mapas gênicos, variabilidade e confirmação de retrocruzamentos. Porém, o uso deste tipo de marcador molecular é limitado, visto que são apenas disponíveis primers para espécies com expressão comercial. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a transferibilidade de 21 loci microssatélites desenvolvidos e desenhados de P.edulis e P. alatapara quatro espécies silvestres de Passiflora. As espécies utilizadas foram: P. cincinnata, P. quadrangularis, P. mucronata, e P. nitida. A extração de DNA foi realizada através do Kit Promega Wizard®. O protocolo de amplificação utilizado foi adaptado do proposto para o maracujazeiro comercial. Foram utilizados dezenove marcadores microssatélites desenhados para a espécie P. edulis e dois desenhados para P.alata. Os amplicons foram levados à eletroforese horizontal em gel de agarose a 3% e corados com o buffer Nancy 520. Os géis foram revelados em fotodocumentador digital e analisados. A transferibilidade foi verificada através da avaliação de presença ou ausência de banda. Os loci microssatélites projetados para P. edulis e P. alata mostraram-se transferíveis para ao menos uma das espécies com uma taxa altamente variável sendo, P. cincinnata (33,33%), P. quadrangularis (23,81%), P. mucronata (19,05%) e P. nitida (14,28%). Os marcadores PE13 e PE54 podem ser indicados para estudos de caracterização molecular por serem os únicos capazes de amplificar todas as espécies de maracujá silvestre estudadas.

Submitted by Renato Marcelo Ferreira de Souza (zoo_renato@hotmail.com) on 2018-11-29T10:28:56Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final.pdf: 1535505 bytes, checksum: a18db783a482fc97ca047a2936f502ec (MD5) Rejected by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 1: A ficha catalográfica não consta no seu trabalho. Solicite-a no site da biblioteca: www.biblioteca.btu.unesp.br Problema 2: Incluir o Abstract e as palavras-chaves em ingles nos metadados do Repositório Problema 3: Retirar o sobrenome "Souza" do prenome nos metadados do Repositório Assim que efetuar essa(s) correção(ões), submeta o arquivo em PDF novamente. Agradecemos a compreensão. on 2018-11-29T18:35:16Z (GMT) Submitted by Renato Marcelo Ferreira de Souza (zoo_renato@hotmail.com) on 2018-11-30T11:02:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final c ficha II.pdf: 1606781 bytes, checksum: f56e6c95b82086f16c3928a1980f7fdc (MD5) Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-11-30T11:08:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 souza_mfs_me_bot.pdf: 1606781 bytes, checksum: f56e6c95b82086f16c3928a1980f7fdc (MD5) Made available in DSpace on 2018-11-30T11:08:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 souza_mfs_me_bot.pdf: 1606781 bytes, checksum: f56e6c95b82086f16c3928a1980f7fdc (MD5) Previous issue date: 2018-10-01 O Brasil é um país megadiverso detentor de grande parte da riqueza ecológica do mundo, porém seus biomas, importantes devido aos serviços ecossistêmicos, sofrem com a pressão antrópica. Assim, os grandes predadores, que possuem efeito regulatório no ecossistema, geram conflitos direto com o homem. O Puma concolor é um predador generalista, atuando no perfil trófico onde reside. Estudos de populações in situ são importantes na elaboração de planos de manejo e a utilização de amostras não invasivas nos permitem ter acesso a informações biológicas a baixo custo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso de amostras não invasivas para contribuir com informações nos planos conservacionistas da região. Foram percorridas bordas de mata e áreas de transição da APA-Botucatu. As amostras de fezes encontradas foram georreferenciadas, coletadas, selecionadas, fotografadas, classificadas e seu DNA extraído por meio da técnica empregando fenol/clorofórmio. O DNA obtido foi quantificado em espectrofotômetro e sua qualidade avaliada em eletroforese. Trinta e cinco amostras foram classificadas quanto ao seu grau de degradação, submetidas à extração de DNA e seu produto avaliado. A presença de material genético nas fezes frescas ou pouco degradadas apresentaram maiores concentrações de DNA além de melhor qualidade quando comparadas com as mais degradadas. Estes resultados evidenciam que, o DNA obtido empregando metodologia de baixo custo, possui quantidade e qualidade suficientes para seu emprego em técnicas de biologia molecular com a acurácia necessária. Além disso, este material biológico pode responder diversas questões biológicas tais como ecologia trófica, parasitismo, comportamento territorial, entre outros. Brazil is a highly diverse country that holds a significant part of the world’s ecological wealth. However, its biomes, important due to its role in the ecosystemic services, suffer from anthropic pressure. Therefore, large predators, that have regulatory effect on the ecosystem, generate direct conflicts with humans. The Puma concolor is a large generalist predator that acts on the trophic profile where it lives. Populational studies in situ are important for the elaboration of management plans and the use of non-invasive samples allow us to have access to biological informations at a low cost. This project aimed to evaluate the use of non-invasive samples in conservationist plans of the region. Transitioning areas and edges of Forrest were analysed and samples of faeces were collected, selected, geo-referenced, photographed and classified. The DNA was extracted using phenol/chloroform and quantified with spectrophotometer and its quality was analysed through electrophoresis. 35 samples were classified regarding the degradation level, submitted to DNA extractions and its product evaluated. The presence of genetic material in the fresh faeces or low degraded showed higher concentrations of DNA and better quality of this material in comparison to the higher degraded samples. This results show that the DNA obtained through a non-invasive method (low cost methodology) can provide enough quality and quantity for molecular biology analyses while also be used to answer other different biological issues, such as trophic chain, parasitism, territorial behaviour, among others. Making the use of this methodology financially viable for this type of study.

The determination of values of abundance of antibiotic resistance genes (ARGs) per mass of soil is extremely useful to assess the potential impacts of relevant sources of antibiotic resistance, such as irrigation with treated wastewater or manure application. Culture-independent methods and, in particular, quantitative PCR (qPCR), have been regarded as suitable approaches for such a purpose. However, it is arguable if these methods are sensitive enough to measure ARGs abundance at levels that may represent a risk for environmental and human health. This study aimed at demonstrating the range of values of ARGs quantification that can be expected based on currently used procedures of DNA extraction and qPCR analyses. The demonstration was based on the use of soil samples spiked with known amounts of wastewater antibiotic resistant bacteria (ARB) (Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Acinetobacter johnsonii, or Pseudomonas aeruginosa), harbouring known ARGs, and also on the calculation of expected values determined based on qPCR. The limits of quantification (LOQ) of the ARGs (vanA, qnrS, blaTEM, blaOXA, blaIMP, blaVIM) were observed to be approximately 4 log-units per gram of soil dry weight, irrespective of the type of soil tested. These values were close to the theoretical LOQ values calculated based on currently used DNA extraction methods and qPCR procedures. The observed LOQ values can be considered extremely high to perform an accurate assessment of the impacts of ARGs discharges in soils. A key message is that ARGs accumulation will be noticeable only at very high doses. The assessment of the impacts of ARGs discharges in soils, of associated risks of propagation and potential transmission to humans, must take into consideration this type of evidence, and avoid the simplistic assumption that no detection corresponds to risk absence. The results suggest that the limits of quantification and detection of antibiotic resistance genes may be too high to infer about potential risks.

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:15:01Z No. of bitstreams: 1 Marcos Vinicius de Lima Coelho Dissertacao completa.pdf: 6747500 bytes, checksum: c3fbd22cfd6e53fd5ff5166de5f7bba4 (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:15:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcos Vinicius de Lima Coelho Dissertacao completa.pdf: 6747500 bytes, checksum: c3fbd22cfd6e53fd5ff5166de5f7bba4 (MD5) Previous issue date: 2017-03-22 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Polypteriformes is a basal group of Actinopterygii easily recognized by its elongated body, dorsal fin composed of 5 to 18 finlets, presence of gular plates, presence of ganoid scales, lung, upperjaw fixed to neurocranium and four gill arcs. This group is composed by 14 living species, all restricted to continental African waters. The aims of this study are: to redescribe the cranial osteology of 4 species of the Polypteridae family, to analyze the morphological differences of the finlets to test intra and interspecific variation and validate the diagnostic characters for taxonomy and systematics and to test protocols of DNA extraction in samples of a species of polypteriformes, with the goal to propose, in the future, the use of the same protocol in a phylogenetic study. Due to the large intraspecific numerical variations, extrascapulars and bones of the spiracular series were inefficient to separate taxa. The species of this study can be separated by the following characters: presence of dermosphenotic and dermohyal in P. senegalus, fusion of the dermosphenotic with frontal allied to the presence of dermohyal in P. delhezi, gular plates connecting only in their anterior portion allied with the absence of dermohyal in P. palmas, and the gular plates do not connect medially allied with the absence of subopercle in E. Calabaricus. Analysis of all the other species in the group is needed to confirm that the diagnostic characters suggested to the 4 species described here also separate them from the other species. Polypteriformes finlets do not have identical morphology in the same individual, which doubts the identification of fossil pinnulae, thus making necessary a revision of the previously proposed fossil species, as well as a morphometric study that characterizes the pinnulae of extant species. Finally, the 'salting-out' extraction protocol attested efficient for extracting DNA from Polypteridae samples, and will probably be applied in future phylogenetic studies on Polypteriformes. Os Polypteriformes constituem o grupo basal de Actinopterygii. São facilmente reconhecidos por seu corpo alongado, nadadeira dorsal composta por 5 a 18 pínulas, presença de placas gulares, presença de escamas ganóides, pulmão, maxila imóvel e quatro arcos branquiais. O grupo é composto atualmente por 14 espécies viventes, todas restritas a águas continentais africanas. O presente estudo tem como objetivo redescrever a osteologia craniana de 4 espécies da família Polypteridae, analisar as diferenças morfológicas das pínulas que compõem a nadadeira dorsal com o objetivo de testar variações a nível intra e interespecífico e a validação de caracteres diagnósticos viáveis para taxonomia e sistemática e testar protocolos de extração de DNA em amostras de uma espécie de Polypteriformes, com o intuito de propor, futuramente, a utilização dos mesmos em um estudo filogenético do grupo. Devido às grandes variações numéricas intraespecíficas, extra-escapulares e ossos da série espiracular se mostraram ineficientes para separar táxons. Podem-se separar as espécies deste estudo pelos seguintes caracteres: P. senegalus apresenta dermoesfenótico e dermohial, P. delhezi apresenta o dermoesfenótico fusionado ao frontal e dermohial, P. palmas apresenta placas gulares se conectando apenas em sua porção anterior e não apresenta dermohial e E. calabaricus apresenta placas gulares que não se conectam medialmente e não apresenta subopérculo. É necessária a análise de todas as outras espécies do grupo, a fim de confirmar se os caracteres que separam as 4 espécies deste estudo também as separam das demais. As pínulas de Polypteriformes não possuem morfologia idêntica em um mesmo indivíduo, o que põe em dúvida a identificação de pínulas fósseis fazendo, assim, ser necessária uma revisão das espécies fósseis, além de um estudo morfométrico que caracterize as pínulas de espécies atuais. Por fim, o protocolo de extração 'salting-out' se mostrou eficiente para a extração de DNA de amostras de Polypteriformes, e este será usado futuramente em um estudo filogenético do grupo.

OBJETIVO: A perda de heterozigosidade (LOH) é capaz de avaliar as alterações genéticas de lesões potencialmente malignas. Este ensaio avalia as regiões cromossômicas polimórficas que estão próximas ou na região dos oncogenes e genes supressores de tumor conhecidos. Os objetivos desta tese foram três principais: 1) Avaliar a frequência de perda de heterozigosidade de leucoplasias bucais com diferentes graus de severidade histopatológico em regiões cromossômicas próximas aos genes supressores de tumores. 2) Comparar e correlacionar o perfil de perda de heterozigosidade entre indivíduos da British Columbia (Canadá) e Rio Grande do Sul (Brasil). 3) Avaliar os danos ao DNA que podem ocorrer durante o processamento e armazenamento das amostras de tecido parafinado. MÉTODOS: Amostras de leucoplasia bucal (com e sem displasias), fixadas em formalina tamponada 10% e parafinadas, obtidas nos laboratório de patologia bucal do Canadá e do Brasil foram selecionadas e microdissectadas. Procedeu-se a extração de DNA, amplificação por PCR das seguintes regiões microssatélites: 4q (D4S243, FABP2), 9p21 (IFNA, D9S171, D9S1748, D9S1751), 17p11.2 (CHRNB1) e 17p13.1 (tp53 e D17S786). Após o produto do PCR foi separado e visualizado em gel de poliacrilamida por autoradiografia. RESULTADOS: Observou-se uma forte correlação entre o perfil de perda de heterozigosidade entre indivíduos com leucoplasia bucal de ambos os países, independentemente da etnicidade. Além disso, pode-se notar que amostras de tecidos parafinados submetidos a mais de 24 horas de fixação em formalina tamponada 10% não serão, em sua maioria, boas amostras para análises de DNA. CONCLUSÃO: As lesões potencialmente malignas, provavelmente não são influenciadas em sua etiopatogênia pelas diferenças étnicas. O modelo de risco genético validado por Zhang e colaboradores (2012) parece ser aplicável em nossa comunidade, sendo necessário a sua validação, respeitando procedimentos técnicos padronizados. Ainda, vale ressaltar, que é imprescindível que a comunidade científica passe a adotar metodologias que preservem o material genético das peças dos bancos de tecidos parafinados, que são de inestimável valor para a pesquisa biomédica. OBJECTIVE: Loss of heterozygosity (LOH) can evaluate genetic alterations of pre-malignant lesions. This assay evaluates the chromosomal polymorphic regions that are present in tumor suppressor genes and oncogenes. The main objectives of this thesis were: 1) Evaluate the frequency of LOH of oral leukoplakias with different histopathological degrees at chromosomal regions of tumor suppressor genes. 2) Compare the profile of LOH between individuals from British Columbia (Canada) and Rio Grande do Sul (Brazil). 3) Evaluate the DNA damage that may occur with FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) tissues. METHODS: FFPE samples of oral leukoplakia (with and without dysplasia), obtained in Canadian and Brazilian oral pathology laboratories were selected and microdissected. DNA extraction and PCR amplification of the following microsatellite regions were conducted: 4q (D4S243, FABP2), 9p21 (IFNA, D9S171, D9S1748, D9S1751), 17p11.2 (CHRNB1) and 17p13.1 (tp53 and D17S786). PCR products were separated and visualized on polyacrylamide gel by autoradiography. RESULTS: A strong correlation between the LOH profile among individuals with oral leukoplakia from both countries was observed, regardless ethnicity. Furthermore, FFPE tissues subjected to more than 24 hours of fixation in 10% buffered formalin are not, generally, good samples for DNA analysis. CONCLUSION: Pre-malignant lesions etiopathogenesis may not be influenced by ethnicity. The genetic risk model validated by Zhang et al. (2012) seems to be applicable in our community, requiring its own validation, respecting standardized procedures. Still, it is important to emphasize that it is imperative that a scientific community adopts methodologies that preserve the genetic material FFPE tissues that are an invaluable resource for biomedical research.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Soybeans are one of the crops with the highest expression in Brazil, both in area planted as in sales volume. The culture has as main pests defoliating caterpillars. Among these, stands out Chrysodeixis includens, pest that went from of secondary status in the 90s to a major defoliating caterpillar soybeans. Studies on genetic variation among populations and genetic structure of this species have not yet been carried out, and can help to indicate management practices. Molecular markers are tools indicated to genetically characterize insect populations. In order to use molecular tools, first, it is necessary a method for DNA extraction in quantity and quality that enables the practice in the laboratory. The goals of the study were to compare three DNA extraction methods for soybean caterpillars to applicate in PCR techniques, and analyze the molecular variability and the genetic structure of populations of C. includens in soybeans. Caterpillars of C. includens and S. eridania were collected from different sites in center soybean regions of Brazil, in 2011/12. The confirmation of the species was based on morphological characteristics of caterpillars according to identification keys. Samples of C. includes and S. eridania coming from Goiás were used for DNA extraction comparison test. The methods used were based on cell lysis by Sarcosyl, CTAB and SDS. Each method was compared for quantity, quality, economy and performance in PCR. The best DNA extraction method was chosen for extraction of all the caterpillars samples for molecular characterization work. Thirty populations of C. includens from nine Brazilian states were subjected to analysis of molecular variability and genetic structure with ISSR markers. The observed DNA extraction method with the best performance in the variables o was the DNA extraction method by Sarcosyl. ISSR generated 247 loci in 262 specimens analyzed. The estimated genetic diversity (HE) in populations ranged between 0.072 and 0.120, while the average was 0.094. The analysis of molecular variance indicates that 94% of the variability between individuals was expressed in 6% of the population and among populations (FST = 0.056, p = 0.001). The high level of gene flow and low genetic structure are indicatives of genetic information exchange between different sampling locations. The analysis of the genetic structure suggests the presence of two major groups which are not correlated to their sampling locations in Brazil. These results may indicate the recent colonization of C. includens in Brazil or the pattern of migration of moths following the cropping system in Brazil. Furthermore, the presence of two groups of C. includens suggest that the studies of development of resistance need to be further assessed for them both. A soja é uma das culturas de maior expressão no Brasil, tanto em área plantada como em volume comercializado, e tem como principais pragas desfolhadoras as lagartas. Dentre essas, se destaca Chrysodeixis includens, praga que passou de secundária na década de 90 para uma das principais lagartas desfolhadoras da soja. Estudos sobre variações genéticas entre populações e estruturação genética dessa espécie ainda não foram realizados, e podem auxiliar na indicação práticas de manejo. Marcadores moleculares são ferramentas indicadas para caracterizar geneticamente populações de insetos. Mas para utilizar ferramentas moleculares, primeiramente, se faz necessário a extração de DNA em quantidade e qualidade que possibilita a prática no laboratório. Dessa forma, os objetivos do trabalho foram comparar três métodos de extração de DNA para lagartas da soja visando a aplicação com técnicas que utilizem a PCR. E analisar a variabilidade molecular e a estruturação genética de populações de C. includens na cultura da soja. Espécimes de lagartas de C. includens e Spodoptera eridania foram coletados de diferentes sítios de coleta nas principais áreas produtoras de soja do Brasil, safra de 2011/12. A confirmação da espécie foi baseada em características morfológicas das lagartas de acordo com chaves de identificação. As amostras de C. includens e S. eridania procedentes de Goiás foram utilizadas para o teste de comparação de extração de DNA. Os métodos utilizados eram cada um baseados na lise celular por Sarcosyl, CTAB e SDS. Cada método foi comparado quanto à quantidade, qualidade, economia e desempenho na PCR. O melhor método de extração de DNA foi utilizado para a extração de todas as amostras de lagartas para o trabalho de caracterização molecular. Trinta populações de C. includens de nove estados brasileiros foram submetidas a análise da variabilidade molecular e estrutura genética com marcadores ISSR. O método de extração de DNA que apresentou melhor desempenho nas variáveis observadas foi o método de extração de DNA por Sarcosyl. Os marcadores ISSR geraram 247 locos em 262 espécimes analisados. A diversidade genética estimada (HE) nas populações variaram entre 0,072 e 0,120, enquanto a média foi 0,094. A análise da variância molecular indica que 94% da variabilidade foi expressa entre indivíduos dentro das populações e 6% entre populações (FST = 0,056, p = 0,001). O alto nível de fluxo gênico e baixa estrutura genética são indicativos de troca de informação genética entre as diferentes locais de amostra. A análise da estrutura genética sugere a presença de dois grupos maiores que não se correlacionam com seus locais de amostragem no Brasil. Esses resultados podem indicar a recente colonização de C. includens no Brasil ou o padrão de migração das mariposas seguindo o sistema de cultivo no Brasil. Além disso, a presença de dois grupos de C. includens sugere que estudos sobre o desenvolvimento de resistência precisa ser avaliado sob outros ângulos para ambos os grupos.

A variabilidade genética no gênero Capsicum é ampla, tanto nas características quantitativas como nas qualitativas. O mercado de pimentas tem expressiva importância socioeconômica devido ao grande número de agricultores familiares que as cultivam. A pimenta do tipo Jalapeño tem tido uma crescente demanda nos últimos anos pela grande quantidade de polpa que essa pimenta pode produzir, característica importante para a produção de molhos de pimenta. Vinte e quatro linhagens S4 de pimenta Jalapeño amarelo do programa de melhoramento da Embrapa Hortaliças, e duas testemunhas oriundas do Banco de Germoplasma da Universidade Estadual Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) foram submetidas à análise molecular com marcadores SSR com o objetivo de estudar a variabilidade genética entre e dentro dessas linhagens. Foram utilizados 63 iniciadores (primers) na triagem inicial e destes, somente 15 confirmaram polimorfismo. O conteúdo de informação polimórfica (PIC) médio para os 15 iniciadores foi de 85% e destes, onze apresentaram PIC acima da média. A partir do padrão de bandas obtidas, foi possível verificar que as 24 linhagens se encontram em homozigose e que há diferença entre estas. The genetic variability found in the genus Capsicum is broad, both in quantitative as well as in qualitative traits. In Brazil, the hot pepper market has expressive socioeconomic relevance due to the high number of small farmers involved in the production of different pepper types. An increase in the demand of Jalapeño peppers has been observed in the past years due to the thick pulp produced, a trait of interest in the production of hot pepper sauces. Twenty-four S4 yellow Jalapeño inbred lines from the Capsicum breeding program at Embrapa Vegetables and two controls from the Universidade Estadual Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) germplasm bank were analyzed with SSR markers with the objective of studying the genetic variability within and among the inbred lines. Sixty-three primers were used for the initial trial and fifteen of these detected polymorphism. Average polymorphic information content (PIC) for the fifteen primers was 85% and out of these, eleven had PIC above the average. The band pattern indicated that the 24 lines are highly homozygous and that there is variability between them.

Pertencente à família Papillomaviridae, o papilomavírus humano (HPV) é formado por um capsídeo e uma única fita dupla de DNA. Sua infecção ocorre principalmente por forma sexual, apresentando grande tropismo por células cutâneas e mucosas. OBJETIVO: Avaliar a presença do HPV em mucosa oral de pacientes assintomáticos e em paralelo correlacionar os hábitos sociais comportamentais com a presença viral. MATERIAL E MÉTODO: Estudo de coorte contemporânea com corte transversal. O diagnóstico da presença viral foi realizado por PCR, utilizando os primers gerais MY09/11 em 125 amostras de mucosa oral, submetidas à extração de DNA e PCR para a pesquisa do gene da beta-globina para avaliação da qualidade do DNA extraído. Em paralelo, foi realizado um estudo de questões comportamentais dos pacientes. RESULTADOS: Todas as amostras apresentaram o diagnóstico positivo para o gene da betaglobina. O HPV foi diagnosticado em 23,2% das amostras analisadas. CONCLUSÃO: O vírus esteve presente em 29 dos 125 pacientes, sem que estes apresentassem qualquer manifestação clinicopatológica relacionada com o HPV. Quanto ao comportamento social dos pacientes, concluiu-se que a prática de sexo oral está correlacionada de forma estatisticamente significante com a presença viral, além de o HPV ter sido estatisticamente mais prevalente em pacientes do sexo feminino. The Human Papillomavirus (HPV) belongs to the Papillomaviridae family and has a capsid and a single DNA strand. Its infection occurs mainly through sexual intercourse, having an important tropism for skin and mucosal cells. AIM: To evaluate the HPV presence in normal oral mucosa of asymptomatic subjects and; in parallel, to correlate social behavioral habits with the virus. MATERIALS AND METHODS: Contemporary cohort cross-sectional study. The HPV was found by PCR, using general primers MY09/11 in 125 oral mucosa samples submitted to DNA extraction and PCR to search for the beta-globin gene in order to assess the quality of the extracted DNA. In parallel, we carried out a study of behavioral issues associated with the patients. RESULTS: All the samples had a positive diagnosis of the beta-hemoglobin gene. HPV was diagnosed in 23.2% of the samples analyzed. CONCLUSION: The virus was present in 29 of the 125 patients, without them having any clinical-pathological manifestation associated with the HPV. As to the social behavior of the patients, we concluded that oral sex is statistically correlated to the virus, and besides the HPV has been statistically more present in female patients.

Foram testados três métodos de extração de DNA em amostras de queijo, com o objetivo de identificar uma técnica eficiente para extração de DNA em amostras com várias limitações, como alto teor de gordura, alto grau de degradação do DNA e grande concentração de impurezas. A técnica que faz uso do tiocianato de guanidina mostrou-se mais adequada para identificação de adição intencional não declarada de leite bovino em queijos bubalinos, podendo ser empregada para certificação de produto específico (selo de Identidade de Espécie). Three methods of DNA extraction were tested in cheese samples. The objective of this study was to identify an efficient technique for DNA extraction in different samples with several limitations, such as high fat tenor, high degree of DNA degradation and great sludge concentration. The technique using Guanidine thiocyanate was more appropriate for identification of intentional undeclared addition of bovine milk in buffalo cheeses. This technique can be used for certification of a specific product (stamp of Identity of Species).

O cultivo de cana-de-açúcar está em expansão no Brasil, devido ao crescente consumo de etanol por carros bicombustíveis. A área plantada está em crescimento, mas a produtividade nos últimos anos vem decrescendo, e fatores como incidência de doenças podem estar contribuindo para tal situação. Dentre as doenças, as bacterianas, como o Raquitismo das Soqueiras e a Escaldadura das Folhas, possuem grande importância para a cultura, pois podem reduzir a produtividade em até 30% e nem sempre os sintomas são visualizados em campo, necessitando assim de técnicas avançadas de detecção. Dentre as técnicas para diagnose, a mais utilizada por laboratórios são os testes sorológicos, que tem como vantagem detectar quantitativamente a presença das bactérias nos colmos mas, no entanto, possui a desvantagem de detectar somente quando a população bacteriana está relativamente alta. A técnica de PCR é mais sensível, detectando níveis baixos da população dessa bactéria nos colmos, e as etapas de extrações de DNA devem purificar o DNA para a redução da presença de substâncias inibidoras presentes no extrato. Assim, neste trabalho foram testadas cinco diferentes metodologias de extração de DNA para Xanthomonas albilineans e Leifsonia xyli subsp. xyli realizadas em três fontes: bactérias puras, bactérias adicionadas diretamente no caldo de cinco diferentes variedades de cana-de-açúcar, e caldo de colmos infectados com as bacterioses. Os resultados demonstram que as amplificações acontecem com maior freqüência e repetibilidade quando os produtos das extrações são diluídos em uma proporção de 10-4 para Escaldadura das folhas. Sem diluições as amplificações não ocorrem, mesmo com o método de extração de DNA com elevado grau de pureza, tal como CTAB. Assim, conclui-se que a detecção não ocorre se o produto das extrações de DNA não for diluído ao menos 1000 vezes, provavelmente reduzindo-se desta forma, o nível de inibidores presentes, proporcionando resultados positivos na técnica de amplificação via PCR. Para Raquitismo das soqueiras não conseguimos detectar Leifonia xyli subsp. xyli através de métodos rápidos de extração de DNA. The sugarcane production areas are increasing in Brazil due to increased ethanol consumption by flex fuel cars. The planted area is growing, but productivity has been declining in recent years, and factors such as incidence of diseases in the crop may be contributing to this situation. Among the diseases, bacteria such as scald of the leaves and ratoon stunting disease, are of great importance to the crop because they can reduce productivity by up to 30% and the symptoms are not always displayed in the field, thus requiring advanced techniques to detect such bacterial diseases. Among the most used techniques for diagnosis serological tests are quite common, which has as main advantage the capacity of quantitative detection of the presence of bacteria in the culms. However, this detection is only possible if the bacterial title is relatively high. The PCR technique method is more sensitive for detecting low levels of bacteria in stems, but the DNA extractions should be performed in order to purify the DNA to reduce the presence of inhibitory substances in the extract. Thus in this study five different methods of DNA extraction of Xanthomonas albilineans and Leifsonia xyli subsp. xyli were tested and performed in three steps: pure bacteria, bacteria inoculated directly in the extract from five different varieties of sugarcane, and extract from a stem knowingly infected with these bacteria. The results indicate that the amplifications occur more frequently when the products and repeatability of the extractions are diluted by 10-4 in the Leaf Scald. Without this diluition steps, the amplification does not occur, even with the method of DNA extraction considered as a standard. Thus, it is concluded that the detection does not happen if the DNA extraction product is not diluted at least 1000 times, which should prevent the action of inhibitory factors that can hinder the PCR reactions. As for the ratoon stunting disease additional studies are needed to enable its detection by PCR.

OBJETIVO: Identificar polimorfismos genéticos do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), posições +936C/T e -2578C/A, em mulheres com pré-eclâmpsia. MÉTODOS:Trata-se de um estudo transversal,constituído por 80 mulheres distribuídas em dois grupos: pré-eclâmpsia e grupo controle. A caracterização da amostra foi realizada mediante entrevista pré-estruturadae complementada por dados transcritos dos prontuários. Para identificação dos polimorfismos foi realizada extração de DNA, amplificação das sequências pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com primers específicos e análise por Polimorfismos de Comprimentos de Fragmentos de Restrição (RFLP). A análise estatística dos resultados foi realizada de forma descritiva e pelo teste do . O modelo de regressão logística múltipla foi utilizado para determinar o efeito dos polimorfismos na pré-eclampsia. RESULTADOS: Evidenciou-se uma maior frequência do alelo T do polimorfismo VEGF +936C/T nas pacientes com pré-eclâmpsia, embora com diferença não significativa.A presença do alelo A do VEGF -2578C/A foi maior no grupo controle, com diferença significativa. CONCLUSÕES: Não foi observada associação significativa do polimorfismo VEGF +936C/T com a pré-eclâmpsia. Para o polimorfismo VEGF -2578C/A observa-se diferença significativa entre os grupos, sendo o alelo A mais frequente no controle, sugerindo a possibilidade da portadora do alelo A apresentar menor suscetibilidade para o desenvolvimento de pré-eclâmpsia. PURPOSE: To identify genetic polymorphisms of endothelial growth factor (VEGF), positions +936C/T and -2578C/A, in women with pre-eclampsia. METHODS: This was a cross-sectional study conducted on 80 women divided into two groups: pre-eclampsia and control. The sample was characterized using a pre-structured interview and data transcribed from the medical records. DNA extraction, amplification of sequences by the Polymerase Chain Reaction (PCR) with specific primers and polymorphism analysis of Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) were performed to identify polymorphisms. The statistical analysis was performedin a descriptive manner and using the test. The multiple logistic regression model was used to determine the effect of polymorphisms on pre-eclampsia. RESULTS:Ahigher frequency of the T allele of theVEGF +936C/T polymorphism was observedin patients with pre-eclampsia, but with no significant difference. The presence of allele A of the VEGF -2578C/A was significantly higher in the control group. CONCLUSIONS:No significant association was observed between VEGF +936C/Tpolymorphism andpre-eclampsia. For the VEGF -2578C/A polymorphism a significant differencewas observed between thecontrol and pre-eclampsia group, with allele A being the most frequent in the control, suggesting the possibility that carriers of allele A have lower susceptibility to the development of pre-eclampsia.

Genomic DNA extraction from mature leaf tissue of native species). Great amounts of contaminants in DNA samples hamper the extraction of high-quality genomic DNA. The main problem is the presence of polysaccharides, phenols and other secondary metabolites that impair the DNA isolation procedure and subsequent application, by inhibiting the Taq DNA polymerase and restriction enzyme activity. This study describes a modified procedure based on hexadecyltrimethylammonium (CTAB) from which genomic DNA, ap-propriate for subsequent manipulation such as PCR reactions and restriction enzyme diges-tion, is derived. This protocol uses different β-mercaptoethanol concentrations in the extrac-tion buffer ( 0.0; 0.2; 10 ; 15; 25 and 50 uL β-mercaptoethanol/ml from the extraction buffer: 100mM Tris-HCl, pH 8 ; 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl ; 2% CTAB; 1% PVP ). The procedure was tested on mature leaves of Annona crassiflora (araticum), Eugenia dysenterica (cagaita), Anacardium humilis (caju-do-campo), Hancornia speciosa (mangaba) e Caryocar brasiliensis (pequi ).The protocol was efficient in the isolation of polysaccharide and polyphenol-free DNA of high molecular weight using β-mercaptoethanol concentrations of over 1 % in the extraction buffer. The purity of thereby isolated DNA isolated was high according to the di-gestion analyses by PCR restriction and amplification. RESUMO - (Extracao de DNA genomico de tecidos foliares maduros de especies nativas). Grandes quantidades de contaminantes na amostra de DNA dificultam a obtencao de DNA genomico de qualidade durante a extracao. A presenca de polissacarideos, fenois e outros compostos secundarios representa o principal problema com o procedimento de isolamento do DNA e sua aplicacao subsequente, por inibir a atividade das enzimas Taq DNA polimera-se e enzimas de restricao. Neste estudo, descreveu-se um procedimento modificado baseado no hexadecyltrimethylammonium (CTAB), rendendo DNA genomico satisfatorio para tecnicas de manipulacao subsequente, como reacoes de PCR e digestao com enzima de restricao. Nesse protocolo foram utilizadas diferentes concentracoes de β-mercaptoetanol no tampao de extracao (0,0; 0,2; 10; 15; 25; e 50 uL de β-mercaptoetanol/mL do tampao de extracao: 100 mM de Tris-HCl, pH 8; 20 mM de EDTA; 1,4 mM de NaCl; 2% de CTAB; 1% de PVP), cujo procedimento foi aplicado no caso de folhas maduras e testado em Annona crassiflora (arati-cum), Eugenia dysenterica (cagaita), Anacardium humilis (caju-do-campo), Hancornia speciosa (mangaba) e Caryocar brasiliense (pequi). O protocolo foi eficiente no isolamento de DNA livre de polissacarideos e polifenois, com rendimento do DNA com alto peso molecu-lar, utilizando-se concentracoes a partir de 1% de β-mercaptoetanol no tampao de extracao. O DNA isolado por esse metodo mostrou alta pureza, de acordo com as analises de digestao por restricao e amplificacao por PCR. Palavras-chave: Annona crassiflora (araticum). Eugenia dysenterica (cagaita). Anacardium humilis (caju-do-campo).

Um equino, sem raça definida, macho com três anos de idade apresentou múltiplos nódulos na pele, em diversas regiões do corpo. As lesões localizavam-se predominantemente nos lábios, nas bochechas, na região submandibular e na região inguinal direita. Os tumores caracterizavam-se como sarcoides dos tipos misto, fibroblástico, verrucoso e oculto. Histologicamente apresentaram proliferação de fibroblastos dérmicos, muitas vezes ulcerado, com ou sem hiperplasia pseudoepiteliomatosa da epiderme e formação de pequenos grupos isolados de fibroblastos neoplásicos na derme superficial. Três amostras de tecido foram submetidas à extração de DNA e amplificação por PCR com oligonucleotídeos iniciadores genéricos direcionados para uma região interna do gene L1 dos papilomavírus. Os produtos resultantes da amplificação de duas amostras foram sequenciados e demonstraram identidade de 99% com o papilomavírus bovino (BPV) BR-UEL-4. Essa é a primeira descrição da infecção de equinos, bem como de sua associação com sarcoide pelo BPV BR-UEL-4, um suposto novo tipo de BPV identificado recentemente no Brasil a partir de papilomas cutâneos em bovinos. A 3-year-old, mixed breed, male horse showed multiple nodules in different areas of the skin. Lesions occurred predominantly on the lips, cheeks, and submandibular and right inguinal regions. The nodules were characterized as mixed, fibroblastic, verrucous and occult types of sarcoid. Histologically there was proliferation of dermal fibroblasts, with or without pseudoepitheliomatous hyperplasia of the epidermis (frequently ulcerated), and formation of small isolated groups of neoplastic fibroblasts in the superficial dermis. Three tissue samples were submitted to DNA extraction and PCR amplification with generic primers for the internal region of the papillomavirus L1 gene. The amplified products from two samples were sequenced and showed 99% identity with the bovine papillomavirus (BPV) BR-UEL-4. This is the first description of BPV BR-UEL-4 infecting a horse and causing sarcoid in this species. BPV BR-UEL-4 is a putative new BPV type recently identified in skin papillomas in a Brazilian cattle herd.

O objetivo deste trabalho foi detectar e mapear locos de caracteres quantitativos (QTL) que afetam os conteúdos de proteína e óleo em soja (Glycine max L. Merr.). Plantas F2, derivadas do cruzamento entre a linhagem CS3032PTA276 e a variedade UFVS2012, foram cultivadas em casa de vegetação e forneceram as folhas para extração e análise de DNA. Quarenta e oito marcadores microssatélites (SSR) polimórficos foram avaliados na população F2. A avaliação dos fenótipos foi realizada em 207 famílias das progênies F2:3, em um delineamento em blocos ao acaso, com três repetições, conduzido em Viçosa, MG, em 2006. Foram detectados quatro QTL associados ao conteúdo de proteína, nos grupos de ligação D1a, G, A1, e I, e três QTL associados ao conteúdo de óleo, nos grupos A1, I e O. A variação fenotípica explicada pelos QTL variou de 6,24 a 18,94% e 17,26 a 25,93%, respectivamente, para os conteúdos de proteína e óleo. Foram detectados novos QTL associados aos conteúdos de proteína e óleo, além dos previamente relatados em outros estudos. Regiões distintas das atualmente conhecidas podem estar envolvidas no controle genético do teor de proteína e óleo na soja. The objective of this study was to detect and map quantitative trait loci (QTL) affecting soybean (Glycine max L. Merr.) protein and oil contents. F2 plants, derived from the cross between the CS3032PTA276 line and the variety UFVS2012, were grown in a greenhouse and provided the leaves for DNA extraction and analysis. Forty-eight polymorphic microsatelite markers (SSR) were evaluated in the F2 population. Evaluation of the phenotype was performed in 207 families from F2:3 progenies, in a complete block design with three replicates, carried out in Viçosa, MG, Brazil, in 2006. Four QTL associated with protein content, in linkage groups D1a, G, A1, and I, and three QTL for oil content in groups A1, I and O were identified. Phenotypic variation for protein and oil explained by QTL ranged from 6.24 to 18.94% and 17.26 to 25.93%, respectively. New QTL associated with protein and oil contents were detected, besides those previously reported in other studies. Other regions may be involved in the genetic control of protein and oil contents in soybean besides those already known.

A pseudoraiva (PR) é uma enfermidade viral responsável por consideráveis perdas econômicas na indústria de suínos. O vírus da pseudoraiva (PrV) apresenta apenas um sorotipo, mas, por análise de restrição enzimática, foi classificado em quatro genótipos denominados I, II, III e IV. Os métodos usados para genotipagem dependem do isolamento do vírus, da purificação do DNA viral, da restrição enzimática do genoma completo e da visualização após eletroforese. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um método mais rápido e sensível para detectar e genotipar o PrV por nested-PCR e análise de restrição enzimática. Vinte isolados do PrV das regiões Sul e Sudeste do Brasil e a estirpe padrão Shope foram replicadas em células PK-15 e submetidas à nested-PCR para o gene da glicoproteína E. Além desses vírus previamente isolados, foram avaliadas 75 amostras clínicas de cérebro de suíno em um total de 25 animais positivos para a PR no isolamento e na soroneutralização viral e 50 amostras negativas provenientes de animais negativos na soroneutralização viral e de granjas sem histórico de PR. Todas as amostras clínicas tiveram resultados compatíveis com o isolamento e a soroneutralização, e a totalidade das amostras positivas foi classificada como genótipo II. A sensibilidade analítica da nested-PCR foi de 10-1,3 TCID50 mL-1. A combinação da nested-PCR e da restrição enzimática foi capaz de detectar e genotipar o vírus com resultados em um a dois dias, sendo mais rápida que os métodos convencionais de restrição do genoma completo que podem demorar até sete dias. Pseudorabies is a disease caused by Suid herpesvirus 1 (PrV) and is responsible for considerable economic losses in the swine industry. The PrV has only one serotype, but based on RFLP (restriction fragment length polymorphism) the virus was divided into four genotypes named I, II, III, IV. The classical methods for PrV genotyping usually require virus isolation, DNA purification enzyme restriction analysis and a long electrophoresis. The aim of this research was to describe a faster and more sensitive method to detect and genotype PrV based on nested-PCR and restriction enzyme analysis. Twenty PrV isolates from south and southeast regions of Brazil, and the standard strain Shope were grown in PK-15 cells and submitted to PCR for glycoprotein E gene amplification. Additionally were tested 75 clinical samples (swine brain), with 25 positives for virus isolation and seroneutralization, and 50 negatives from a flock free PR with negative results in seroneutralization test. There was 100% of agreement between results of nested-PCR and virus isolation and seroneutralization and all samples detected were classified as genotype II. The nested-PCR, combined with restriction enzyme analysis, was able to detect and genotype PrV in 1-2 days with a sensitivity of 10-1,3 TCID50 mL-1. It was faster than classical methods described in the literature that require at least 7 days to be completed.

O objetivo deste estudo foi padronizar uma metodologia de extração de DNA de alta qualidade a partir de amostras de sangue coagulado. Quarenta e oito amostras de sangue humano coagulado foram utilizadas para a extração de DNA pelo kit comercial EZ-DNA® (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), pelo kit de coluna Neoscience® (One Lambda Inc., San Diego, CA) e pelo método modificado de salting out. Apenas o método de salting out foi capaz de extrair altas concentrações de DNA (média, 180ng/µL), as quais foram medidas pelo detector de fluorescência Qubit® (Invitrogen, USA). Este método permitiu a amplificação dos genes HLA (human leukocyte antigens) pela tecnologia PCR-SSO (polymerase chain reaction - specific sequence of oligonucleotides) Luminex, a qual exige DNA de boa qualidade, e de genes KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) pela técnica made in house PCR-SSP (polymerase chain reaction-sequence specific of primers), a qual demanda uma concentração específica de DNA (10ng/µL). Concluímos que a técnica de salting out modificada foi muito eficiente, simples e rápida para a extração de DNA de amostras de sangue humano coagulado, com o objetivo de realizar a genotipagem de genes HLA e KIR. The objective of this study was to standardize a method for extracting high-quality DNA from samples of coagulated blood. Forty-eight samples of human coagulated blood were used for DNA extraction by means of the EZ-DNA® commercial kit (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), the Neoscience® column kit (One Lambda Inc., San Diego, CA, USA) and a modified salting-out method. Only the salting-out method was able to extract high concentrations of DNA (mean, 180 ng/¼l), which were measured using the Qubit® fluorescence detector (Invitrogen, USA). This method enabled amplification of HLA (human leukocyte antigen) genes using the Luminex PCR-SSO (polymerase chain reaction - sequence-specific oligonucleotide) technology, which demands good quality DNA, and amplification of KIR (killer-cell immunoglobulin-like receptor) genes using an in-house PCR-SSP (polymerase chain reaction - sequence-specific primer) technique, which demands a specific concentration of DNA (10 ng/¼l). We concluded that the modified salting-out technique was very efficient, simple and fast for DNA extraction from human coagulated blood samples, with the aim of genotyping the HLA and KIR genes.

Aedes aegypti (L.) é vetor de importantes doenças como a febre amarela e a dengue, presentes em regiões tropicais e subtropicais. Para o sucesso no seu controle biológico é importante conhecer a estrutura genética e os mecanismos que resultaram na diversidade das populações. O objetivo deste estudo foi analisar a variabilidade genética de diferentes populações de A. aegypti utilizando marcadores de RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso). DNA de dez larvas coletadas a partir de três populações de diferentes localidades foi analisado usando dez iniciadores de RAPD. Os resultados indicaram a existência de variabilidade genética inter e intrapopulacional. Isso foi confirmado por um dendrograma que agrupou as populações em dois blocos principais com similaridade genética de 24%. Em um desses agrupamentos foi possível distinguir duas populações que apresentaram grau de similaridade de 50%. A diversidade genética entre as populações (55,01%) foi mais elevada que a diversidade genética dentro das populações (44,99%) aplicando-se análise por AMOVA. Altos níveis de polimorfismo genético (Ht = 0.2656) e de diferenciação genética entre as populações (Gst = 0.3689) foram observados. Além disso, o protocolo de extração de DNA adotado mostrou-se eficiente para a análise do inseto independente do seu estágio de desenvolvimento, evitando-se o acréscimo de reagentes ou etapas adicionais de processamento. Futuros experimentos poderão ser realizados para confirmar se a variabilidade observada pode estar ligada às características de resistência de cada população a um determinado pesticida. Aedes aegypti (L.) is an important vector of diseases such as the yellow fever and dengue, present in tropical and subtropical regions. The objective of this study was to analyze the genetic variability of different A. aegypti populations using RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markers as a basic study to support the use of biocontrol strategies. DNA of ten collected larvae from three different populations were analyzed using ten RAPD primers. The results indicated the existence of genetic variability inter and intrapopulation. This was confirmed by a dendrogram that grouped the populations in two main clusters with a genetic similarity of 24%. In one of these clusters, it was possible to distinguish two populations that showed 50% similarity. The molecular variance analysis indicated that the interpopulation genetic diversity (55,01%) was higher than the intrapopulation genetic diversity (44,99%). A high genetic polymorphism (Ht = 0.2656) and high levels of genetic differentiation between populations (Gst = 0.3689) were found. The adopted DNA extraction protocol proved to be efficient regardless the insect development stage used, avoiding the addition of reagents or additional stages of processing. Future experiments can be performed to confirm if the detected variability is related to the resistance characteristics of each population to a determined pesticide.

The objective of this paper was to compare two different protocols for DNA extraction from buffalo (Bubalus bubalis) fur. Also, three sites for the fur source (back of the head, right shoulder and forehead) were compared. For the experiments, four animals were used and three replicates for each site on each animal were performed. For protocol 1, the phenol chloroform technique was used, and the CTAB extraction technique was used for protocol 2. Protocol 2 resulted in a higher average of DNA concentration for the fur samples. Considering the body region from where the fur was extracted, there were no significant differences in DNA concentration. However, the forehead showed a higher concentration when extracted with CTAB. Considering the ease of use for each protocol, protocol 2, in addition to presenting greater concentrations of DNA, took less time to be performed — three hours and fifty minutes, and did not require another toxic reagent, such as phenol. For this reason, it is recommended that the material be extracted from the forehead, asit is an easy site to access the fur. The recommended protocol for DNA extraction is with CTAB, because of its practicality and lower execution time. O objetivo do trabalho foi comparar dois diferentes protocolos de extração de DNA de pelos de búfalos (Bubalus bubalis) e comparar três regiões de coleta de material (nuca, paleta direita e testa). Foram utilizados quatro búfalos com três repetições por animal e por região. No protocolo 1, foi utilizada a técnica do fenol-clorofórmio e no protocolo 2, a técnica de extração com CTAB. O protocolo 2 apresentou maior média de concentração de DNA para as amostras de pelos. Em relação ao local de retirada dos pelos, não foram encontradas diferenças significativas, porém nota-se que a região da testa dos animais apresentou maior concentração de DNA quando extraído com CTAB. Com relação à praticidade de utilização dos dois métodos avaliados, o protocolo 2, além de ter apresentado maior concentração de DNA, apresentou menor tempo de execução, 3h 50 min., além de evitar a utilização de mais um reagente tóxico, como é o caso do fenol. Por esse motivo, sugere-se que a coleta seja efetuada na região da testa, levando-se em consideração a praticidade e a acessibilidade aos pelos e sugere-se também a aplicação do protocolo de extração de DNA com CTAB, pela praticidade e pelo menor tempo de execução.

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T18:43:21Z No. of bitstreams: 1 S1676-24442007000200008.pdf: 174903 bytes, checksum: 12d60178460b3d5cf15953f1edb56e0b (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T18:43:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S1676-24442007000200008.pdf: 174903 bytes, checksum: 12d60178460b3d5cf15953f1edb56e0b (MD5) Previous issue date: 2007-04-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T18:25:12Z (GMT). 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No. of bitstreams: 2 S1676-24442007000200008.pdf: 174903 bytes, checksum: 12d60178460b3d5cf15953f1edb56e0b (MD5) S1676-24442007000200008.pdf.txt: 27350 bytes, checksum: 70f5531ca6707b2c0e77a8a277d93fcc (MD5) Previous issue date: 2007-04-01 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) INTRODUÇÃO: Diversos métodos para extração de DNA a partir de tecidos biológicos inclusos em parafina encontram-se descritos na literatura, sendo o sucesso desse procedimento de grande importância para a realização de métodos moleculares de diagnóstico empregando a reação em cadeia da polimerase (PCR). OBJETIVO: Este estudo avaliou dois métodos de extração de DNA de material parafinado, visando à amplificação do DNA genômico pela técnica da PCR. MATERIAL E MÉTODO: Foram utilizadas 35 amostras de casos de carcinoma epidermóide de assoalho bucal diagnosticados e tratados no Centro de Oncologia Bucal da Universidade Estadual Paulista (Unesp). Os métodos de extração de DNA avaliados incluíram: 1. digestão com proteinase K seguida por purificação com Chelex 100® (BioRad); e 2. sistema QIAamp DNA minikit® (Qiagen). O DNA obtido foi quantificado por espectrofotometria e amplificado pela técnica da PCR, utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores para betaglobina. RESULTADOS: A concentração de DNA obtido do material extraído com o primeiro método apresentou média de 120,62 ng/µl com razão entre as leituras das absorbâncias 260/280 variando de 0,8 a 1,41. Para as amostras extraídas com o segundo procedimento, o rendimento médio foi de 67,38 ng/µl, no entanto a razão 260/280 variou entre 1,11 e 2,53. O material foi submetido à PCR e, das 35 amostras extraídas com cada método, respectivamente, 29 e 30 apresentaram sinal positivo. CONCLUSÃO: Os dois métodos utilizados para obtenção de DNA de material parafinado apresentaram desempenho semelhante, revelando que ambos têm potencial para auxiliar na prática da biologia molecular diagnóstica, assim como no estudo diagnóstico retrospectivo em material parafinizado. BACKGROUND: There are several methods for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded tissues reported in the literature. High success rate on this procedure is important for the use of molecular diagnostic methods based on the polymerase chain reaction (PCR). OBJECTIVE: Two methods of DNA extraction from paraffin-embedded samples were tested aiming at PCR amplification of genomic DNA. MATERIAL and METHOD: Thirty-five samples were obtained from patients with squamous cell carcinoma of mouth floor treated at the Oral Oncology Center in Universidade Estadual Paulista. The DNA extraction methods included: 1. proteinase K digestion followed by Chelex 100® (BioRad) purification and 2. QIAamp DNA minikit® system (Qiagen). Purified DNA was quantified by spectrophometry and a beta-globin gene fragment was amplified using PCR. RESULTS: The DNA concentration from samples applied to the first method presented an average of 120.62 ng/µl and absorbance ratio 260/280 varying between 0.8 and 1.41. From the samples extracted using the second procedure, the mean DNA concentration was 67.38 ng/µl, with absorbance ratio varying between 1.11 and 2.53. DNA samples were submitted to PCR and from 35 samples extracted with both methods, respectively, 29 and 30 were successfully amplified for the beta-globin gene. CONCLUSION: Both methods used to obtain genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissues presented similar performance, revealing their potential to be included in diagnosis of molecular biology, as well as in retrospective studies using archived paraffin-embedded samples. Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Araçatuba Departamento de Patologia e Propedêutica Clínica Unesp Faculdade de medicina veterinária de Araçatuba Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal Unesp Faculdade de Odontologia Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal Unesp Faculdade de Odontologia Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Araçatuba Departamento de Patologia e Propedêutica Clínica Unesp Faculdade de medicina veterinária de Araçatuba Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal Unesp Faculdade de Odontologia Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal Unesp Faculdade de Odontologia Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T19:02:28Z No. of bitstreams: 1 S0365-05962007000100004.pdf: 1550849 bytes, checksum: b78100bf28a6068e12c1189078c864c6 (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T19:02:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S0365-05962007000100004.pdf: 1550849 bytes, checksum: b78100bf28a6068e12c1189078c864c6 (MD5) Previous issue date: 2007-02-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T20:03:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0365-05962007000100004.pdf: 1550849 bytes, checksum: b78100bf28a6068e12c1189078c864c6 (MD5) S0365-05962007000100004.pdf.txt: 22518 bytes, checksum: 686f7d0d6be866a107a34c124cca0d63 (MD5) Previous issue date: 2007-02-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T15:16:15Z No. of bitstreams: 2 S0365-05962007000100004.pdf: 1550849 bytes, checksum: b78100bf28a6068e12c1189078c864c6 (MD5) S0365-05962007000100004.pdf.txt: 22518 bytes, checksum: 686f7d0d6be866a107a34c124cca0d63 (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T15:16:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0365-05962007000100004.pdf: 1550849 bytes, checksum: b78100bf28a6068e12c1189078c864c6 (MD5) S0365-05962007000100004.pdf.txt: 22518 bytes, checksum: 686f7d0d6be866a107a34c124cca0d63 (MD5) Previous issue date: 2007-02-01 FUNDAMENTOS: O queratoacantoma é neoplasia cutânea benigna que incide preferencialmente em indivíduos de pele clara, faixa etária elevada, acometendo áreas fotoexpostas. Além da exposição à radiação ultravioleta, sua etiologia é relacionada a diversos carcinógenos, entre eles a infecção pelo papilomavírus humano (HPV). OBJETIVOS: Avaliar a prevalência do DNA do HPV, bem como seus genótipos, em lesões de queratoacantoma solitário de pacientes imunocompetentes. MÉTODOS: Foram estudados queratoacantomas de pacientes sem evidências de imunocomprometimento, excisados entre 1996 e 2000 em hospital universitário. Realizaram-se cortes histológicos, desparafinização e extração de DNA desses fragmentos. Os espécimes positivos para DNA de HPV foram submetidos ao seqüenciamento gênico, para determinação do genótipo. RESULTADOS: Foram estudados 58 pacientes com idade média de 64,5±13,8 anos. A proporção entre os sexos foi semelhante, e as localizações mais comuns foram os membros superiores (50%) e a face (27,6%). Detectou-se DNA de HPV em 48 (82,7%) fragmentos de queratoacantomas, sendo os genótipos 6, 11 e 16 os prevalentes. CONCLUSÕES: A alta prevalência do achado de DNA de HPV em lesões de queratoacantoma solitário pode sugerir a participação viral em sua oncogênese. BACKGROUND - Keratoacanthoma is a benign cutaneous neoplasm that preferentially affects fair skin individuals of older age groups and involves sun-exposed areas. Apart from ultraviolet radiation exposure, its etiology is related to several carcinogens, including human papillomavirus (HPV) infection. OBJECTIVES: To assess the prevalence of HPV DNA and its genotypes in solitary keratoacanthoma lesions of immunocompetent patients. Methods: Keratoacanthoma lesions of patients with no evidence of immunological involvement, excised from 1996 to 2000, at a university hospital, were assessed. Histological aspects, deparafinization and DNA extraction of these lesions were evaluated. The specimens positive for HPV DNA were submitted to gene sequencing to determine the genotype. RESULTS: Fifty-eight patients were studied, mean age of 64.5±13.8 years. Both sexes were similarly affected, and the most common sites were upper limbs (50%) and face (27.6%). HPV DNA was detected in 48 (82.7%) keratoacanthoma fragments, and the genotypes 6, 11 and 16 were the most prevalent. CONCLUSIONS: The high prevalence of HPV DNA in solitary keratoacanthoma lesions may suggest viral participation in its oncogenesis. Unesp FMB Unesp IBB Departamento de Microbiologia e Imunologia Unesp FMB Departamento de Patologia Unesp FMB Departamento de Dermatologia Unesp FMB Unesp IBB Departamento de Microbiologia e Imunologia Unesp FMB Departamento de Patologia Unesp FMB Departamento de Dermatologia

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T18:43:21Z No. of bitstreams: 1 S1676-24442007000100012.pdf: 184663 bytes, checksum: 39b2446725f8aa6d77ea8b2c5bda741c (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T18:43:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S1676-24442007000100012.pdf: 184663 bytes, checksum: 39b2446725f8aa6d77ea8b2c5bda741c (MD5) Previous issue date: 2007-02-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T18:23:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S1676-24442007000100012.pdf: 184663 bytes, checksum: 39b2446725f8aa6d77ea8b2c5bda741c (MD5) S1676-24442007000100012.pdf.txt: 30149 bytes, checksum: bd34b3b2b233c6ad5dabb9ffa7e0247b (MD5) Previous issue date: 2007-02-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:37:45Z No. of bitstreams: 2 S1676-24442007000100012.pdf: 184663 bytes, checksum: 39b2446725f8aa6d77ea8b2c5bda741c (MD5) S1676-24442007000100012.pdf.txt: 30149 bytes, checksum: bd34b3b2b233c6ad5dabb9ffa7e0247b (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T13:37:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S1676-24442007000100012.pdf: 184663 bytes, checksum: 39b2446725f8aa6d77ea8b2c5bda741c (MD5) S1676-24442007000100012.pdf.txt: 30149 bytes, checksum: bd34b3b2b233c6ad5dabb9ffa7e0247b (MD5) Previous issue date: 2007-02-01 INTRODUÇÃO: Microdissecção e captura a laser (MCL) é uma técnica de desenvolvimento recente que permite a coleta de células individuais ou pequeno conjunto de células para análise molecular. Atualmente, no Brasil, há raros microscópios para MCL, de modo que a divulgação dos procedimentos inerentes a essa técnica é oportuna para destacar seu amplo potencial para diagnóstico e investigação. OBJETIVO: Este trabalho descreve a padronização dos procedimentos de MCL e de extração de DNA de material fixado em formalina e incluído em parafina. MATERIAL E MÉTODOS: Foram estudados o éxon 8 do gene TP53 e o gene da ciclofilina em amostras de tecido normal e de neoplasias de fígado e rim provenientes de modelo de carcinogênese química induzida em rato. A extração do DNA foi comprovada por reação em cadeia da polimerase (nested-PCR). RESULTADOS: Foram padronizados os procedimentos de preparo dos cortes histológicos, de microdissecção e captura a laser e de obtenção de seqüências gênicas pela reação de nested-PCR para tecidos incluídos em parafina. Obtivemos amplificação de 48,3% das amostras para o éxon 8 do gene TP53 e 51,7% para o gene da ciclofilina. Considerando pelo menos um dos dois segmentos gênicos, foram amplificadas 79,3% das amostras. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO: A extração de DNA de tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina e a técnica de nested-PCR foram adequadamente padronizadas para produtos gênicos de interesse, obtidos de material coletado por MCL. Esses procedimentos podem ser úteis para a obtenção de seqüências de DNA de arquivos para análise molecular. BACKGORUND: Laser-capture micro-dissection (LCM) is a recently developed procedure that provides single cells or specific cell groups for molecular analysis. Currently, there are few LCM systems in Brazil, in such a way that it is necessary to disseminate the technical procedures inherent to the methodology, and also to characterize its enormous potential for diagnosis and research. OBJECTIVE: This study describes the standardization of LCM and DNA extraction from formalin fixed and paraffin-embedded tissues. MATERIAL and METHOD: The gene TP53 exon 8 and the cyclophilin gene were studied in normal and neoplastic liver and kidney samples from a chemical carcinogenesis model in rat. DNA extraction was confirmed by nested-PCR. RESULTS: Histological sections preparation for LCM and the nested-PCR procedures were standardized; 48.3% amplifications of the gene TP53 exon 8 and 51.7% of the cyclophilin gene samples were obtained. When at least one of the gene segments was considered, 79.3% samples presented amplification. DISCUSSION and CONCLUSION: Procedures for DNA extraction from formalin fixed and paraffin-embedded tissues collected by LCM were standardized. They can be useful for DNA collection for molecular studies. Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Departamento de Patologia Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Departamento de Patologia

A extração de DNA de leucócitos periféricos é o meio de obtenção de DNA mais amplamente utilizado. Entretanto, a coleta de células a partir de swab oral, geralmente utilizada em medicina forense, é útil para obtenção de amostras de DNA de recém-nascidos, crianças e de pacientes que vivem em locais onde a coleta e o envio da amostra de sangue não é factível. Nosso objetivo foi padronizar a técnica de extração de DNA a partir de swab de células de mucosa oral utilizando NaCl, comparando-a com a extração pelo kit comercial. Para testar a qualidade do DNA, amplificamos os 3 éxons do gene PROP1 de 12 pacientes com hipopituitarismo hipofisário em DNA extraído simultaneamente de células da mucosa oral e de sangue periférico. A amplificação de fragmentos maiores foi testada em DNA de mucosa oral de indivíduos normais utilizando-se primers do éxon 10 do gene do FSHR (1000pb) e do gene CYP21A2 (1200pb). Ambos os métodos resultaram em DNA de boa qualidade, permitindo o estudo molecular. O método por NaCl mostrou-se mais rápido e barato, resultando em maior quantidade de DNA quando comparado ao kit comercial. Nos pacientes com hipopituitarismo, identificamos a mutação delAG301-302 em 6 pacientes, 4 em homozigose (33%) e 2 em heterozigose (16%), e a mutação G51A em heterozigose em uma paciente. Em conclusão, padronizamos a técnica de extração de DNA de células de swab oral com NaCl que, quando comparada à extração com kit comercial, apresentou menor custo e maior rapidez, indicando ser esta uma forma confiável de obtenção de DNA para estudos genéticos. DNA extraction of peripheral leukocytes is the most broadly used technique to obtain DNA. However, cell collection from an oral swab, frequently used in forensics, is useful to obtain DNA samples, mainly in newborns, children and patients who live far from the collection sites, where blood sample collection and sending is not feasible. Our objective was to standardize DNA extraction from an oral swab, using the NaCl method, comparing it with a commercial kit. To test DNA quality, we amplified the 3 exons of PROP1 gene of 12 patients with hypopituitarism in DNA obtained from oral cells and peripheral blood cells. Amplification of larger fragments was tested in oral DNA of normal subjects using primers of exon 10 of FSHR gene (1000bp) and of CYP21A2 gene (1200bp). Both methods yielded good quality DNA, allowing the amplification of 3 exons of PROP1 gene. The NaCl method showed to be faster and less expensive, resulting in a larger amount of DNA when compared to the commercial kit. We identified the delAG301-302 mutation in 6 patients, 4 in homozygous (33%) and 2 in heterozygous (16%) state and G51A mutation in heterozygous state in a single patient. In conclusion, we standardized the DNA extraction of oral cells with NaCl, which presented lower costs and faster results, when compared with the extraction by a commercial kit indicating that DNA from oral swabs are a reliable source for genetic studies.

Este trabalho descreve o estabelecimento de um pro!tocolo de “nested-PCR” para a detecção do vírus da anemia das galinhas (CAV, chicken anemia virus), agente causador da anemia infecciosa das galinhas. Para a extração de DNA a partir de amostras clínicas um método baseado no uso de tiocianato de guanidina mostrou-se mais sensível e prático, do que os demais avaliados. Para a PCR inicial foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pares de bases (pb) do gene VP1. Para a “nested-PCR” propriamente dita, foi selecionado um segundo par que amplifica uma região interna de 520 pb. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV. Outras trinta amostras vírus e bactérias, causadoras de doenças em aves, não geraram produto de amplificação. A sensibilidade do teste foi determinada a partir de diluições seriadas de uma amostra vacinal de CAV. A “nested- PCR” mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar pelo menos 0,16 TCID50% da cepa vacinal. Além disso, detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sinais clínicos. Conclui-se que, como técnica para a detecção do CAV, o protocolo de “nested-PCR” aqui descrito, é mais sensível, rápido e menos trabalhoso do que o isolamento viral em cultivo celular. Simionatto S., Lima-Rosa C.A.V., Rubin L.L. & Canal C.W. 2005. [A nested-PCR protocol for detection of the chicken anemia virus.] Um protocolo de “nested-PCR” para detecção do virus da anemia das galinhas. Pesquisa Veterinária Brasileira 25(2):106-110. Laboratório de Virologia, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves 9090, Porto Alegre, RS 91540-000, Brazil. E-mail: claudio.canal@ufrgs.br This paper reports a nested polymerase chain reaction (nested-PCR) protocol for detection of chicken anemia virus (CAV), the causal agent of infectious chicken anemia. For DNA extraction from clinical samples, a method based on guanidine thiocyanate was found more sensitive and practical than other extraction protocols tested. The pair of primers used in the initial PCR targeted a 664 bp fragment on the VP1 gene. The primers for the internal PCR targeted a fragment of 520 bp. The specificity of the primers was evaluated on samples of CAV controlled flocks. Thirty different viruses and bacteria isolated from chickens did not give rise to any amplification product in the assay. The sensitivity of the nested-PCR was determined on serial dilutions of a CAV vaccine. The nested-PCR was more sensitive than a one step PCR and was able to detect at least 0.16 TCID50 of the vaccine strain. In addition, the protocol employed here detected viral DNA from tissues, sera and litter from flocks with or without clinical signs of disease. It is concluded that the nested-PCR protocol described here is more sensitive, faster and less cumbersome than virus isolation in cell culture as a diagnostic technique for detection of CAV.

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T18:40:37Z No. of bitstreams: 1 S1516-84842004000400008.pdf: 205275 bytes, checksum: 1b7408ea2aa4c681cda15e8376560169 (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T18:40:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S1516-84842004000400008.pdf: 205275 bytes, checksum: 1b7408ea2aa4c681cda15e8376560169 (MD5) Previous issue date: 2004-12-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T18:17:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S1516-84842004000400008.pdf: 205275 bytes, checksum: 1b7408ea2aa4c681cda15e8376560169 (MD5) S1516-84842004000400008.pdf.txt: 39738 bytes, checksum: f39f3a70aee4b35b00fa19d54f000239 (MD5) Previous issue date: 2004-12-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:33:28Z No. of bitstreams: 2 S1516-84842004000400008.pdf: 205275 bytes, checksum: 1b7408ea2aa4c681cda15e8376560169 (MD5) S1516-84842004000400008.pdf.txt: 39738 bytes, checksum: f39f3a70aee4b35b00fa19d54f000239 (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T13:33:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S1516-84842004000400008.pdf: 205275 bytes, checksum: 1b7408ea2aa4c681cda15e8376560169 (MD5) S1516-84842004000400008.pdf.txt: 39738 bytes, checksum: f39f3a70aee4b35b00fa19d54f000239 (MD5) Previous issue date: 2004-12-01 Este trabalho visou a comparação de cinco métodos diferentes de extração de DNA de materiais de arquivo (tecidos incluídos em parafina, esfregaços de sangue periférico - corados e não corados com Leishman, lâminas com mielogramas, gotas de sangue em Guthrie Card) e de fontes escassas (células bucais, um e três bulbos capilares e 2 mL de urina), para que fossem avaliadas a facilidade de aplicação e a facilidade de amplificação deste DNA pela técnica da reação de polimerização em cadeia (PCR). Os métodos incluíram digestão por proteinase K, seguida ou não por purificação com fenol/clorofórmio; Chelex 100® (BioRad); Insta Gene® (BioRad) e fervura em água estéril. O DNA obtido foi testado para amplificação de três fragmentos gênicos: Brain-derived neutrophic factor (764 pb), Factor V Leiden (220 pb) e Abelson (106 pb). de acordo com o comprimento do fragmento gênico estudado, da fonte potencial de DNA e do método de extração utilizado, os resultados caracterizaram o melhor caminho para padronização de procedimentos técnicos a serem incluídos no manual de Procedimentos Operacionais Padrão do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro - HC - Unesp - Botucatu. The present work aimed at comparing five different methods of DNA extraction of samples from archived materials (paraffin-embedded tissues, peripheral blood smears - stained or not with Leishman, aspired bone marrow smears and Guthrie card bloodspots) and from rare sources (oral cells, one and three capillary bulbs, 2 mL of urine), to evaluate the ease of application and the possibility of amplification of this DNA by the polymerization chain reaction (PCR) technique. The methods included proteinase K digestion - followed or not by phenol/chloroform purification, Chelex 100® (BioRad), InstaGene® (BioRad) and boiling in the sterile water. The DNA obtained was tested for amplification of three genic fragments: the brain-derived neutrophic factor gene (764 bp), the Factor V Leiden gene (220 bp) and the Abelson gene (106 bp). According to the gene fragment length studied, the DNA potential source and the extraction method used, the results characterized the best way to standardize technical procedures to be included in the Standard Operational Procedure Manual of the Molecular Biology Laboratory of the Blood Center in the Medicine School of Unesp, Botucatu, Brazil. Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Depto. Clínica Médica Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Hemocentro Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Depto. Clínica Médica Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Hemocentro

OBJETIVO: Padronizar um método alternativo para extração de DNA a partir de tecido fixado em formol e conservado em arquivos de blocos de parafina, visando à realização de estudos retrospectivos. MÉTODOS: Comparou-se a eficiência de protocolos de extração de DNA a partir de tecido parafinado, para análise por reação em cadeia de polimerase (PCR), tomando-se como parâmetro um protocolo baseado em um kit comercial. Foram feitas extrações do DNA de 60 espécimes por três métodos: o protocolo A, baseado no kit GlassMAX; o B, utilizando-se o kit GFX TM; e o C, tendo como base o método de Banerjee et al.(2). A integridade e a suficiência do DNA presente na amostra foram avaliadas pela amplificação por PCR de um segmento de 110pb do gene da beta-globina humana, com visualização por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida, corado pela prata. Resultados: Das 60 amostras analisadas, 45 apresentaram resultado positivo na PCR quando o DNA foi extraído por qualquer um dos três protocolos. Em seis amostras, a amplificação foi positiva apenas para o DNA extraído pelos protocolos A e C. Em três amostras, o resultado foi positivo apenas para o DNA extraído pelo protocolo A, e em duas, apenas para o DNA extraído pelo protocolo C. CONCLUSÕES: O protocolo C apresentou desempenho semelhante ao do protocolo A, com as vantagens de apresentar menor custo, dispensar o uso de kit comercial, além de não utilizar solventes orgânicos, revelando-se uma alternativa viável para a obtenção de DNA a partir de tecido fixado em formol e incluído em parafina. OBJECTIVE: To set up a method for DNA extraction from paraffin embedded cervical cancer specimens, previously formalin-fixed, aiming to accomplish retrospective analysis. METHODS: Sixty specimens were submitted to DNA extraction by three different methods. All of them involved digestion of the tissues by proteinase K, followed by DNA purification, based in three different approaches: protocol A used a DNA isolation kit, GlassMax (Gibco/BRL); protocol B was performed with the kit GFX TM Amersham Pharmacia Biotech; and protocol C was based on the method proposed by Banerjee et al.(2), with modifications. To evaluate the integrity and sufficiency of the DNA, the samples were submitted to a in vitro amplification of a segment of the human beta-globin gene, and the PCR products were analyzed by electrophoresis on 7% polyacrylamide gels, followed by silver staining. Results: Among 60 analyzed samples, 45 showed positive results when submitted to the three protocols. In six samples, PCR fragments were obtained with DNAs extracted through protocols A e C; in three samples, DNA extraction was achieved with protocol A only; and in two samples the DNA was successfully extracted only through protocol C. CONCLUSIONS: Protocols A and C generated similar results. Although protocol C is more labor-intensive and time consuming, it does not require a commercial kit and therefore has a lower cost. Furthermore, it does not require the use of organic solvents and may be considered a good alternative for DNA extraction from paraffin embedded tissues.

É apresentada a padronização de protocolo de extração de DNA de material parafinado para análise da instabilidade de microssatélites de genes relacionados ao leiomioma uterino, utilizando-se 30mg a 40mg de tecido retirado de blocos de parafina. Os blocos são desparafinizados por banhos de xilol a 65ºC, reidratados com soluções de concentrações decrescentes de ETOH e água deionizada. A extração de DNA é obtida através das etapas de lise celular, com solução Promega, digestão de proteínas por proteinase K, precipitação com proteínas com solução Promega e precipitação do DNA com ETOH 70% gelado e ressuspendido com solução Promega. Este protocolo resulta em um DNA viável para uso na reação em cadeia da polimerase (PCR). The standardization of the protocol of the DNA extraction from paraffin material in order to analyze the instability of microsatellites in genes related to the uterine leiomyoma, using 30 to 40mg of tissue removed from paraffin blocks is presented. Desparaffin throught xilol baths to 65ºC, rehydrated with solutions of decreasing concentrations of ETOH and deionisation water. The extraction of DNA was obtained through the stages of cellular lysis, with Promega solution, digestion of proteins by Proteinase K, precipitation proteins with Promega solution and precipitation of DNA with ETOH 70% colded and ressuspended with Promega solution. This protocol results in a viable DNA to be use in the Polimerase Chain Reaction (PCR).

O aumento do número de plantas daninhas resistentes aos herbicidas inibidores da enzima acetolactato sintase é um tema abordado com freqüência por produtores e comunidade científica. No Brasil, nove espécies já foram documentadas por apresentarem tal problema. O objetivo deste trabalho foi determinar a diversidade genética de populações de leiteira (Euphorbia heterophylla L.) resistentes aos herbicidas inibidores da enzima acetolactato sintase. Quarenta populações de plantas oriundas de sementes coletadas em áreas do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil, com suspeita de resistência, foram selecionadas, a partir da aplicação prévia de herbicidas com este mecanismo de ação em casa de vegetação. Vinte plantas de cada população serviram de amostra para a extração de DNA. Trinta marcadores de polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD) foram selecionados, cada um com 10 oligonucleotídeos de seqüência arbitrária. Na análise de agrupamento, cujo coeficiente médio de similaridade foi de 40%, as populações foram separadas em sete grupos. As populações dos municípios de Pontão, Augusto Pestana e Não-me-Toque foram consideradas geneticamente diferentes. Há variabilidade genética relacionada à resistência do herbicida entre as populações de E. heterophylla que ocorrem no planalto do Estado do Rio Grande do Sul. The increase of the number of weed plants resistant to enzyme acetolactate sintase (ALS)-inhibiting herbicides of is a subject frequently discussed by farmers and scientific community. In Brazil, nine species were registered with such problem. The objective of this work was to determine the genetic diversity of wild poinsettia (Euphorbia heterophylla L.) ALS-resistant populations. Forty populations deriving from seeds collected in areas of the State of Rio Grande do Sul, Brazil, with resistance suspicion, were selected from the previous application of herbicides in greenhouse. Twenty plants of each population were sampled for DNA extraction. Analysis of 30 random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers were performed. Each marker had 10 oligonucleotide of arbitrary sequence. On the grouping analysis, the overall coefficient of similarity was 40% and the populations were separated in seven groups. The populations of the counties of Pontão, Augusto Pestana and Não-me-Toque were genetically different. There is genetic variability related to herbicide resistence among E. heterophylla populations from plateaus of the State of Rio Grande do Sul.

A técnica PCR-RAPD tem sido amplamente empregada em estudos genéticos de populações de vários organismos. Entretanto, devido às interações entre os componentes da reação de PCR é improvável que uma única condição de amplificação possa ser adequada para todas as situações. Com o objetivo de determinar as condições ótimas para a utilização da técnica PCR-RAPD em análises taxonômicas do gênero Atta, foram analisados os fatores: concentrações de MgCl2, DNA, BSA, programas de temperaturas e métodos de extração de DNA, utilizando-se os delineamentos Fatorial Fracionado e o Central Composto. Dentre os fatores avaliados, o método de extração de DNA teve pouca influência na reação, enquanto que o programa de temperatura apresentou o maior efeito. Embora a concentração de MgCl2 seja importante para obtenção de um padrão exato de bandas, seu efeito foi menor do que a quantidade de DNA. Com o aumento da concentração de MgCl2 para 3,0 mM e com a diminuição da concentração de BSA de 0,1% para 0,05% e da quantidade de DNA de 2 para 1 ng/mil ocorreu um aumento significativo no número de fragmentos amplificados, sendo esse efeito observado com maior evidência no programa P2. As condições ótimas estabelecidas para as reações PCR-RAPD foram: 25 mil de solução contendo 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 100 miM de cada dNTP, 0,2 miM de primer, 1,0 U de Taq polimerase, 25 ng DNA (extraído pelo método Cheung) e BSA 0,05%, utilizando-se o programa de amplificação: 3 min. a 94ºC, 3 min. a 35ºC, seguidos de 40 ciclos de 1 min. a 94ºC, 1 min. a 36ºC e 2 min. a 72ºC, com extensão final de 5 min. a 72ºC. PCR-RAPD has been widely used for genetic analysis in several organisms. However, due to complex interactions among the components of the PCR reaction it is unlikely that a single amplification condition can be suitable for all situations. In order to determine the optimum conditions for using PCR-RAPD in taxonomical analyses of the genus Atta, the following factors were tested: concentrations of MgCl2, DNA, BSA, cycling programs and methods of DNA extraction, using Fractional Factorial Design and Central Composite Design. DNA extraction methods had little influence on PCR-RAPD reactions, while the cycling programs showed the largest effect. The MgCl2 concentration was less important than the amount of DNA used in the reaction. Using cycling program P2, a significant improvement in the number of DNA fragments was achieved when MgCl2 concentration was increased to 3.0 mM and the BSA and DNA concentrations were reduced from 0.1% to 0.05% and from 2 to 1 ng/mul, respectively. The optimum conditions for PCR-RAPD with Atta specimens obtained in this study were: 25 mul reaction with 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 3.0 mM MgCl2, 50 mM KCl, 100 muM of each dNTP, 0.2 muM of primer, 1.0 U of Taq polymerase, 25 ng template DNA (extracted by Cheung's method) and BSA 0.05%, using the amplification program which consisted of 3 min at 94ºC, 3 min at 35ºC, followed by 40 cycles of 1 min at 94ºC, 1 min at 36ºC and 2 min at 72ºC, and a 5 m final extension at 72ºC.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001Bitstream added on 2014-06-13T19:14:37Z : No. of bitstreams: 1 barea_ja_me_botfm.pdf: 626955 bytes, checksum: 85be35c50f78253f7b270023ffe7687e (MD5) Este trabalho visou a comparação de 5 diferentes métodos de extração de DNA, a partir de amostras de materiais de arquivo (tecido incluído em parafina, lâmina de hemograma corada e não corada com Leishman, lâmina de mielograma, gotas de sangue em Guthrie card) e fontes escassas (células bucais, 1 e 3 bulbos capilares, 2 mL de urina), para avaliar a facilidade de aplicação dos mesmos e possibilidade de amplificação desse DNA pela técnica de PCR. Os métodos incluíram digestão por proteinase K, seguida e não seguida por purificação com fenol/clorofórmio, utilização de Chelex 100 Ò, utilização de InstaGeneÒ e fervura em água estéril. O DNA obtido, foi testado por PCR, para a amplificação de três fragmentos gênicos: de Brainderived neutrophic factor (764 pb), de Fator V Leiden (220 pb) e de Abelson (106 pb), sendo que, a amplificação para o primeiro, eliminava a necessidade dos demais. Conforme o tamanho do fragmento gênico estudado, a fonte potencial de DNA e o método de extração utilizado, os resultados caracterizaram o melhor caminho para padronização dos procedimentos técnicos a serem incluídos e apresentados no manual de Procedimentos Operacionais Padrão do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro – HC – UNESP – Botucatu. The present work aimed to compare five different methods of DNA extraction of archieved materials samples (paraffin-embedded tissues, periferic blood smear – stained or non-stained with Leshman, aspired bone marrow smears and blood guts in Guthrie card) and rare sources (oral cells, 1 and 3 capilar bulbs, 2 mL urine), to avaliate the aplication facility and the amplification possibility one for PCR. The methods included proteinase K digestion – followed or non by phenol/chloroform purification, Chelex 100Ò (BioRad), InstaGeneÒ (BioRad) and boilling in sterile water. The DNA obteined, was tested for amplification of 3 genic fragments: from Brainderived neutrophic factor gene (764 bp), Factor V Leiden gene (220 bp) and Abelson gene (106 bp). According to the genic fragment lenght studed, the DNA potential source and the extraction method used, the results characterized better guidelines for padronization of the techniques procedures for to Good Manufacturing Practices from Molecular Biology Laboratory from Blood Center – Medicine School – UNESP - Botucatu .

O diagnóstico microbiológico de Salmonella sp em amostras de alimentos é demorado, com cinco diferentes etapas, levando cerca de 120 horas até o resultado final. A utilização da técnica da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) pode diminuir esse período, porém sofre influência de substâncias presentes na amostra que afetam a reação. O objetivo deste trabalho foi comparar dois métodos de extração de DNA, a extração por tratamento térmico e a pelo fenol-clorofórmio, em amostras de 100 ovos de galinhas domésticas artificialmente contaminados com uma cepa de Salmonella enterica sorovar typhimurium em fase estacionária. O material obtido com as extrações foi submetido à PCR, utilizando-se um par de iniciadores que amplificam um fragmento de 284pb do gene InvA de Salmonella sp. Comparando os métodos de extração, observou-se uma diferença na capacidade de detecção de 12% a favor do método do fenol-clorofórmio, quando a extração foi realizada a partir do ovo com casca. No momento em que a mesma metodologia foi usada apenas com a parte interna dos ovos, essa diferença subiu para 26% o que foi significativo (P