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Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-06T20:57:48Z No. of bitstreams: 1 Cecilia de Andrade Bhering Dissertacao completa.pdf: 2170942 bytes, checksum: d862756248d590b09b2635a7fd970229 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-06T20:57:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cecilia de Andrade Bhering Dissertacao completa.pdf: 2170942 bytes, checksum: d862756248d590b09b2635a7fd970229 (MD5) Previous issue date: 2012-07-31 Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Emodin is an anthraquinone structurally similar to aloe-emodin and both have been identified as capable of causing oxidative damage by ROS production. Its presence in skin cosmetics and toiletries, associated to the information that the photoactivation of anthraquinones leads to increased oxidative damage caused by ROS, make studies about the association of emodin with UVA relevant. The aim of this study was to evaluate the cytotoxicity induced by the combination of emodin with sublethal doses of UVA radiation in Escherichia coli cells (wild strain and strains deficient in enzymes of BER) by bacterial survival assay (UVA dose rate equal to 20J/m²/s, totaling 108kJ/m² at the end of 90min of experiment); and in A549 cell line by trypan blue exclusion assay and clonogenic survival(dose rate of UVA equal to 20J/m²/s, totaling 36kJ/m² at the end of 30 minutes of experiment). Furthermore, the genotoxicity of these agents was studied by electrophoresis on agarose gel of plasmid DNA (dose rate of UVA equal to 16J/m²/s, totaling 57,6kJ/m² at the end of 60 minutes of experiment). According to the results: i) concentrations equal or below 5.55mM of emodin did not affect the survival in any of the studied strains; ii) proteins Xth and Fpg appear to have an important role in the repair of lesions induced by emodin, at high concentrations, suggesting the involvement of base excision repair (BER) in this process, iii) the association of emodin with UVA showed to be cytotoxic in all strains of E. coli iv) The nfo gene was the most important in bacterial resistance to damages induced by the association of the two agents, reinforcing the involvement of BER and indicating a possible role of the nucleotide incision repair (NIR), v) emodin appears to have interacted with plasmid DNA, altering its migration pattern in the agarose gel; vi) in A549 cell line, emodin caused immediate toxic effects that seemed to be repaired with time. However, when the drug remained for 24 hours in contact with the cells, there was a reduction in cell survival which seems to be in a dose dependent mode, vii) The concentrations of 10μM and 25μM of emodin, when associated with UVA, were responsible for a survival reduction of more than 50% survival in A549 cells, reaching 100% of death with the concentration of 50μM of emodin, viii) UVA radiation potentiates the cytotoxic effect of emodin in two experimental models in the present study, indicating that this interaction is genotoxic and therefore harmful to health. A emodina é uma antraquinona estruturalmente semelhante à aloe-emodina e ambas tem sido apontadas como capazes de causar lesões oxidativas pela produção de ERO. Sua presença em produtos dermocosméticos e de higiene pessoal, associada às informações de que a fotoativação de antraquinonas levaria ao aumento de lesões oxidativas causadas por ERO, torna relevante o estudo da associação da emodina com a radiação UVA. O objetivo desse trabalho foi avaliar a citotoxicidade induzida pela associação da emodina com doses subletais de radiação UVA, em células de Escherichia coli (selvagem e cepas deficientes em enzimas do BER), através de ensaios de sobrevivência bacteriana (taxa de dose de UVA igual a 20J/m²/s, totalizando 108kJ/m² ao final de 90min de experimento), e em células da linhagem A549 pela exclusão do corante azul de tripan e sobrevivência clonogênica(taxa de dose de UVA igual a 20J/m²/s, totalizando 36kJ/m² ao final de 30min de experimento). Além disso, a genotoxicidade desses agentes foi estudada por eletroforese em gel de agarose de DNA plasmidial (taxa de dose de UVA igual a 16J/m²/s, totalizando 57,6kJ/m² ao final de 60min de experimento). De acordo com os resultados: i) Concentrações iguais ou abaixo de 5,55mM de emodina não alteraram a sobrevivência em nenhuma das cepas estudas; ii) As proteínas Xth e Fpg parecem ter um papel importante no reparo das lesões causadas pela emodina, em altas concentrações, sugerindo a participação do reparo por excisão de bases (BER) nesse processo; iii) A associação da emodina com a radiação UVA se mostrou citotóxica em todas as cepas de E. coli; iv) O gene nfo foi o mais importante na resistência bacteriana às lesões induzidas pela associação dos dois agentes, reforçando o envolvimento do BER e indicando uma possível participação do reparo por incisão de nucleotídeos (NIR); v) A emodina parece ter interagido com o DNA plasmidial, alterando seu padrão de migração no gel de agarose; vi) Em células da linhagem A549, a emodina causa efeitos tóxicos imediatos que parecem ser reparados ao longo do tempo. Porém, quando a droga permaneceu por 24 horas em contato com as células, houve uma diminuição na sobrevivência celular que parece ser dosedependente; vii) As concentrações de 10μM e 25μM de emodina, quando associadas ao UVA, se mostraram responsáveis pela redução de mais de 50% na sobrevivência nas células A549, chegando a 100% de morte quando a concentração de emodina foi de 50μM; viii) A radiação UVA potencializou os efeitos citotóxicos da emodina, nos 2 modelos experimentais do presente estudo, indicando que a interação da emodina com a radiação UVA seja genotóxica e portanto prejudicial à saúde.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-06T20:52:35Z No. of bitstreams: 1 Ellen Serri da Motta.pdf: 3123994 bytes, checksum: 875973e718a730fafc4b492a32e4054f (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-06T20:52:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ellen Serri da Motta.pdf: 3123994 bytes, checksum: 875973e718a730fafc4b492a32e4054f (MD5) Previous issue date: 2010-03-30 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Stannous chloride (SnCl2) and ultraviolet radiation A (UVA) are able to induce lesions in different cellular structures, including DNA, manly through ROS generation. The aim of this work was to study the mutagenesis and repair of lesions induced by the association of UVA (pre treatment) with SnCl2. It was evaluated the action of base excision repair (BER) enzymes in Escherichia coli (E. coli) by alkaline gel electrophoresis and bacterial survival. It was also evaluated the SoxRS system induction by chromotest and mutagenesis through the Ames test. According to the results: i) UVA induced DNA strand breaks in all strains and fpg-nfo and fpg mutants showed greater delay in the repair of lesions; ii) SnCl2 induced more breaks than UVA and nfo and fpg mutants showed more difficult to repair the damage; iii) UVA + SnCl2 caused more breaks than the SnCl2 and nfo and fpg mutants also showed a slowest repair of injuries; iv) UVA did not inactivate any bacterial strains tested; v) nfo and fpg strains were more sensitive to SnCl2; vi) UVA + SnCl2 caused higher mortality in all strains tested, when compared to SnCl2, and, again, nfo and fpg mutants were the most sensitives to the treatment with both agents; vii) the transformation of nfo mutant with the plasmid pBW21 (nfo+) and fpg mutants with plasmid pFPG (fpg+) increased the survival of the strains to SnCl2 and UVA + SnCl2 treatments; viii) SnCl2 was able to induce SoxRS system; ix) SnCl2, UVA + SnCl2 and UVA did not induce mutagenesis; x) damage repair seems to be preferentially performed by Fpg and Nfo proteins. O cloreto estanoso (SnCl2) e a radiação ultravioleta A (UVA) são agentes que lesam diversas estruturas celulares, inclusive o DNA, principalmente pela geração de espécies reativas de oxigênio. O objetivo deste trabalho foi estudar a mutagênese e o reparo das lesões produzidas pela combinação do UVA, na condição de préiluminação, com o SnCl2. Avaliou-se a ação de enzimas do reparo por excisão de bases (BER), em Escherichia coli (E. coli), por eletroforese em gel alcalino de agarose e sobrevivência bacteriana. Também se estudou a indução do sistema SoxRS pelo cromoteste, e a mutagênese pelo teste de Ames. De acordo com os resultados: i) o UVA induziu quebras no DNA das cepas testadas e os mutantes fpgnfo e fpg apresentaram maior retardo no reparo das lesões; ii) o SnCl2 induziu mais quebras que o UVA e os mutantes nfo e fpg mostraram maior dificuldade em reparar as lesões; iii) o UVA+SnCl2 provocou mais quebras que o SnCl2 e os mutantes nfo e fpg também apresentaram maior lentidão no reparo das lesões; iv) o UVA não inativou as cepas testadas; v) as cepas nfo e fpg foram as mais sensíveis ao SnCl2; vi) o UVA+SnCl2 provocou maior letalidade em todas as cepas testadas, em relação ao SnCl2, e os mutantes nfo e fpg também foram os mais sensíveis ao tratamento com ambos os agentes; vii) a transformação dos mutantes nfo com o plasmídio pBW21 (nfo+) e dos mutantes fpg com o plasmídio pFPG (fpg+) aumentou a sobrevivência das cepas aos tratamentos com SnCl2 e UVA+SnCl2; viii) o SnCl2 induziu o sistema SoxRS; ix) o SnCl2, UVA e UVA+SnCl2 não induziram mutagênese; x) o reparo das lesões parece ser preferencialmente realizado pelas proteínas Fpg e Nfo.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The genome of all organisms is subject to injuries that can be caused by endogenous and environmental factors. If these lesions are not corrected, it can be fixed generating a mutation which can be lethal to the organisms. In order to prevent this, there are different DNA repair mechanisms. These mechanisms are well known in bacteria, yeast, human, but not in plants. Two plant models Oriza sativa and Arabidopsis thaliana had the genome sequenced and due to this some DNA repair genes have been characterized. The aim of this work is to characterized two sugarcane cDNAs that had homology to AP endonuclease: scARP1 and scARP3. In silico has been done with these two sequences and other from plants. It has been observed domain conservation on these sequences, but the cystein at 65 position that is a characteristic from the redox domain in APE1 protein was not so conservated in plants. Phylogenetic relationship showed two branches, one branch with dicots and monocots sequence and the other branch with only monocots sequences. Another approach in order to characterized these two cDNAs was to construct overexpression cassettes (sense and antisense orientation) using the 35S promoter. After that, these cassettes were transferred to the binary vector pPZP211. Furthermore, previously in the laboratory was obtained a plant from nicotiana tabacum containing the overexpression cassette in anti-sense orientation. It has been observed that this plant had a slow development and problems in setting seeds. After some manual crossing, some seeds were obtained (T2) and it was analyzed the T2 segregation. The third approach used in this work was to clone the promoter region from these two cDNAs by PCR walking. The sequences obtained were analyzed using the program PLANTCARE. It was observed in these sequences some motives that may be related to oxidative stress response O genoma de todos os organismos está sujeitos a lesões que podem ser causados por fatores endógenos e ambientais. Uma vez no genoma, as lesões podem levar a formação e acúmulo de mutações, as quais podem ser prejudiciais ao desenvolvimento do organismo. As vias de reparo de DNA são um mecanismo que permite o organismo detectar e corrigir essas lesões ou minimizar seus efeitos. Várias vias de reparo de DNA são conhecidas e bem caracterizadas em animais e microorganismos. Em plantas, as vias de reparo ainda não são bem caracterizadas, mas muitas pesquisas têm revelado a participação de todas as vias conhecidas no reparo do genoma das plantas, sendo os modelos mais estudados Arabidopsis thaliana e Oriza sativa. A via de reparo de interesse deste trabalho é a via de BER, a qual apresenta várias proteínas atuando no reparo do DNA. Porém, a classe de proteínas da via BER focadas são as AP endonucleases, responsáveis pela hidrólise do sítio AP. Este trabalho teve como objetivo caracterizar dois cDNAs de cana-de-açúcar: scARP1 e scARP3, homólogos a AP endonucleases de A.thaliana e identificados num trabalho de data-mining do projeto SUCEST. Para tanto, foram construídos cassetes de super-expressão, contendo o cDNA scARP1 sob o controle do promotor forte 35S. Além disso, anteriormente no laboratório foi obtido uma planta de icotiana tabacum contendo o cassete de super-expressão (35S+scARP1) em orientação anti-senso. Foi analisado o desenvolvimento desta planta, e foram obtidas também algumas sementes (T2) desta planta. Estas sementes foram germinadas e analisadas quanto à presença do cassete de super-expressão e desenvolvimento. Além disso, para estes dois genes foram clonados as regiões promotoras por PCR walking. Os fragmentos obtidos foram clonados, sequenciados e, analisados por meio do programa PLANTCARE. Os motivos encontrados nessas regiões dos genes de cana-de-açúcar foram comparados com potenciais regiões promotoras das plantas de Arabidopis, O. sativa e S. bicolor. Estas análises mostraram a presença de diferentes motivos relacionados à respostas ao estresse oxidativo