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Dissertação de mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química, O crescente surgimento e desenvolvimento de feridas crónicas tem-se tornado um problema grave a nível mundial. Com o aumento da esperança média de vida e o envelhecimento da população, a incidência de doenças venosas e arteriais, que levam ao aparecimento destas feridas tende a agravar se, sendo já considerado pela Organização Mundial de Saúde uma epidemia global. Estas feridas não estão somente associadas a uma diminuição drástica da qualidade de vida dos pacientes, como também a graves infeções, desregulações do sistema imunitário e até à morte. A aplicação de péptidos antimicrobianos e/ou imunoregulatórios no tratamento destas feridas surge como uma alternativa de elevado potencial para ultrapassar estas dificuldades. Neste trabalho foram sintetizados através da técnica de síntese peptídica em fase sólida os péptidos AAPV, dotado de capacidades para regular a atividade da elastase de neutrófilos humanos (HNE), demasiado elevada em feridas crónicas, e o péptido CW49, capaz de estimular a fase de angiogénese e de diminuir a prolongada ação inflamatória também característica das feridas crónicas. Os péptidos foram estruturalmente caracterizados por ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa com ionização por electrospray e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier por refletância total atenuada. A sua pureza foi confirmada por cromatografia líquida de alta eficiência. Foram produzidas por wet-spinning fibras com estrutura co-axial. A camada externa foi construída com alginato de sódio (2% m/v) combinado com N-carboximetilquitosano (ao dobro da sua concentração mínima bactericida estabelecida contra a bactéria Staphylococcus aureus), um polímero responsivo a pH neutro e básico, e um núcleo por policaprolactona (10% m/v) e o péptido AAPV (a 1,5 µg/mL, concentração que garante mais de 40% de inibição da HNE). As fibras foram quimicamente e morfologicamente avaliadas por ATR-FTIR e microscopia ótica de campo claro, o seu grau de hidratação e perfil de degradação a 28 dias estudados e a sua capacidade de inibir a HNE assim como a sua atividade antimicrobiana contra S. aureus confirmadas. Os dados recolhidos demonstraram o potencial das fibras co-axiais de SA-NCMC-PCL-AAPV para o desenvolvimento de uma nova geração de pensos bioativos para o tratamento de feridas crónicas., The emergence and development of chronic wounds has become a huge problem worldwide. With the increase in average life expectancy and consequent ageing populations, the frequency of venous and arterial diseases, that lead to the appearance of this wounds tends to get worse. It is already considered a global epidemic by the World Health Organization. These wounds are not just associated to a drastic decrease of patient life quality, they are also associated to serious infections, immune system dysregulations and even dead. The application of antimicrobial peptides emerges as an alternative to overcome these difficulties with high potential. In this work, the peptides AAPV, with the ability to regulate the human neutrophil elastase (HNE) activity, too high in chronic wounds, and the CW49 peptide, capable of stimulating the angiogenesis and decreasing the prolonged inflammatory stage characteristic of chronic wounds, were synthesized by solid phase peptide synthesis. The peptides were structurally characterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy, electrospray ionization mass spectrometry and Fourier transform infrared spectroscopy– attenuated total reflectance, and its purity accessed by high performance liquid chromatography. Coaxial fibers were produced by wet-spinning techniques, with the external layer constituted by sodium alginate (2% w/v) and N-carboxymethyl chitosan (at the double of its minimum bactericidal concentration stablished against Staphylococcus aureus), a responsive polymer to neutral-basic pH, and a core of polycarolactone (10% w/v) and AAPV peptide (at 1.5 µg/mL, the concentration that ensures more than 40% inhibition of HNE). The fibers were chemically and morphologically characterized by ATR FTIR and brightfield microscopy, its swelling degree and degradation profile at 28 days studied and its capacity of HNE inhibition as well as its antibacterial activity against S. aureus confirmed. Data showed the potential of SA-NCMC-PCL-AAPV coaxial fibers in the development of a new generation of bioactive wound dressings., Agradeço ao Centro de Ciência e Tecnologia Têxtil (2C2T) da Universidade do Minho pela disponibilidade para que fosse desenvolvida parte do trabalho nas suas instalações e à Fundação para a Ciência e a Tecnologia pelo financiamento do projeto onde este trabalho se insere, o projeto PEPTEX PTDC/CTM-TEX/28074/2017 (POCI-01-0145-FEDER-028074).

Submitted by Ingrid Bernardes Santana Martins (ingrid.martins@unesp.br) on 2021-07-26T17:54:57Z No. of bitstreams: 1 Tese_v1 (1).pdf: 17311819 bytes, checksum: 0881ef28c940da7e9eb94a91b8647706 (MD5) Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: 01 – Na ficha catalográfica solicitamos corrigir a entrada do nome do autor: Martins, Ingrid Bernardes Santana e também diminuir o tamanho da fonte (8 ou 9) para não ultrapassar a dimensão da ficha. 02 - Na folha de rosto solicitamos corrigir: Orientador: Prof. Dr. Alexandre Suman de Araujo Coorientador: Prof. Dr. Sidney Jurado de Carvalho 03 – Solicitamos que você corrija a formatação da FOLHA DE APROVAÇÃO conforme o template: nome, titulação dos componentes da banca examinadora e instituições a que pertencem. Ex: Comissão organizadora Prof. Dr. Alexandre Suman de Araujo UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Orientador Prof. Dr. Jorge Chahine UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Assim por diante 04 – A data de defesa deve ser colocada no rodapé da FOLHA DE APROVAÇÃO: São José do Rio Preto 28 de junho de 2021 05 - Nos agradecimentos: segundo a Portaria CAPES nº 206, de 4 de setembro de 2018, todos os trabalhos que tiveram financiamento/BOLSA CAPES deve constar a expressão EXATA: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. 06 - Segundo a norma ABNT NBR 10520, a epígrafe é uma citação e deve ser referenciada. 07 - A ordem correta das páginas pré-textuais (capa, folha de rosto, ficha catalográfica, folha de aprovação, dedicatória, agradecimentos, epígrafe, resumo na língua vernácula, resumo em língua estrangeira, listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e sumário), no seu trabalho o resumo e abstract está colocado após o sumário. 08 – Solicitamos retirar do SUMÁRIO a indicação de Lista de Ilustrações e Lista de Tabelas, segundo a norma ABNT NBR 6027 os elementos pré-textuais não devem constar no sumário. 09 – Solicitamos corrigir as Palavras-chave/keywords: iniciando com letras maiúsculas e separadas por ponto. 10 – No SUMÁRIO e no texto, a seção REFERÊNCIAS não é numerada, e o correto é REFERÊNCIAS e não REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 11 - Observamos que na ficha catalográfica você selecionou a formatação em páginas? Caso seja em páginas observar a margem, as margens devem ser: para o anverso, esquerda e superior de 3 cm e direita e inferior de 2 cm; para o verso, direita e superior de 3 cm e esquerda e inferior de 2 cm. Agora caso a impressão seja em folhas apenas corrija na ficha (f). 12 - A paginação deve ser sequencial, iniciando a contagem na FOLHA DE ROSTO e mostrando o número a partir da introdução, a FICHA CATALOGRÁFICA ficará após a folha de rosto, será contada caso o trabalho seja formatado em página, se for formatado como folhas não deverá ser contada, e na ficha catalográfica o número de folhas deve ser igual ao número da última folha do trabalho. 13 - Ilustrações e tabelas: a norma orienta que devem ter a descrição da fonte abaixo delas, mesmo que seja produção do autor. (ABNT NBR 14724). Sugerimos que siga as orientações do template para as correções, na página da Biblioteca, link: https://www.ibilce.unesp.br/#!/biblioteca/servicos-oferecidos/normalizacao/estrutura-do-trabalho-academico/ Lembramos que o arquivo depositado no Repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Agradecemos a compreensão. on 2021-07-27T18:55:35Z (GMT) Submitted by Ingrid Bernardes Santana Martins (ingrid.martins@unesp.br) on 2021-07-27T22:27:45Z No. of bitstreams: 1 Tese_v1 (1).pdf: 17300504 bytes, checksum: a6ae1a8ce7fef409d9c6979f11d2dd16 (MD5) Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2021-07-29T00:17:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 martins_ibs_dr_sjrp_par.pdf: 415123 bytes, checksum: 486de686c17ea3465074b33029e51c1c (MD5) Made available in DSpace on 2021-07-29T00:17:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 martins_ibs_dr_sjrp_par.pdf: 415123 bytes, checksum: 486de686c17ea3465074b33029e51c1c (MD5) Previous issue date: 2021-06-28 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) PeptÍdeos antimicrobianos (PAMs) são parte do sistema imune de muitas espécies e, devido ao seu modo de ação, dificultam o desenvolvimento de cepas de bactérias resistentes promovidas por antibióticos convencionais, sendo assim compostos que têm potencial de aplicação antibiótica. Os PAMs são, geralmente, ricos em resíduos de aminoácidos catiônicos e hidrofóbicos e agem diretamente na fase lipídica da membrana celular. O peptídeo Polybia-MP1 é um peptídeo extraído da vespa Polybia paulista e possui amplo espectro bactericida em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e não e hemolítico nem citotóxico. O H-MP1 é um análogo sintético em que as lisinas do MP1 são substituídas por histidinas, para que a carga líquida possa responder as mudanças no pH da solução. Nesse trabalho usamos técnicas biofísicas computacionais para investigar o efeito do pH da solução nas propriedades estruturais desses peptídeos e na sua interação com a bicamada lipídica que mimetiza a membrana celular de bactérias Gram-negativas. Os resultados indicam que a adsorção do H-MP1, sensível ao pH, aumenta com um ambiente acido se assemelhando ´ ao MP1, que não é influenciado pela pequena variação de pH da solução. As simulações de Dinâmica Molecular mostraram que o processo de adsorção de ambos os peptídeos se inicia pela interação do N-terminal com a bicamada, seguido por uma completa adsorção do peptídeo paralelo ao plano da bicamada, induzindo aumento no conteúdo helicoidal o que intensificou o contato do peptídeo com a fase hidrofóbica da bicamada. As simulações ainda mostraram uma desestabilização do empacotamento lipídico da bicamada caracterizada pela diminuição do parâmetro de ordem calculado para as cadeias acílicas. Simulações de Dinâmica Molecular a pH Constante, que foram realizadas a partir das estruturas dos peptídeos adsorvidos obtidas por Dinâmica Molecular convencional, foram capazes de elucidar detalhes da eletrostática envolvida no processo de adsorção. Elas mostraram que a adsorção desses peptídeos na bicamada lipídica aumenta em aproximadamente duas unidades os valores de pKa calculados para os resíduos ionizáveis. Com isso, esses peptídeos apresentam carga mais positiva quando estão na presença da bicamada do que quando estão apenas em solução aquosa. Dessa forma, a magnitude da atração eletrostática dos mesmos ´ pela bicamada aniônica é aumentada, evidenciando a seletividade que tais peptídeos possuem pela bicamada mimética de bactérias. Antimicrobial peptides (AMPs) are part of the innate immune system of many species and are compounds with potential application against the development of resistant bacterial strains promoted by conventional antibiotics. The AMPs are rich in cationic and hydrophobic residues and act directly on the lipidic phase of the cell membranes. The MP1 has a broad-spectrum bactericide activity in both Gram-negative and positive bacteria, not being hemolytic or cytotoxic. H-MP1 is a synthetic analog of MP1 with lysines replaced by histidines so that its net charge could be responsive to changes in solution pH. In the present work, we applied computational biophysics techniques in order to investigate the effect of the solution pH on the structural properties, in the adsorption and insertion of these peptides in lipid bilayers mimicking the cell membrane of Gram-negative bacteria. The results indicate that the adsorption of H-MP1 is sensitive to pH, increasing to an acidic environment, matching that of MP1, which is not influenced by solution pH. Molecular Dynamic simulations indicated that the adsorption process of both peptides started by the interaction of the N-terminus with the bilayer, followed by the complete adsorption of the peptide laying parallel to the bilayer plane, inducing an increase in the peptide’s helical content enhancing peptides contact with the bilayer hydrophobic phase. The simulations also presented a lipid packing perturbation of the bilayer characterized for a decrease of the acylic chains order parameter. Constant pH Molecular Dynamics simulations, that were performed utilizing the structures of the adsorbed peptides obtained on the conventional Molecular Dynamics simulations, were able to enlighten details of the electrostatics of the adsorption process. They demonstrated that these peptides’ adsorption into the lipid bilayer increases about two units the pKa values calculated for the titratable residues. Thereby, these peptides presented higher net charges when in presence of the bilayer than when they are only in aqueous solution. Thus, the electrostatic atraction magnitude of these peptides for the aninonic bilayer is increased, pointing out the seletivity that both peptides have for the bacteria mimetic bilayer. CAPES: 001

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Alchlorophilic algae of the genus Prototheca are disease-causing agents in humans and animals. The species Prototheca zopfii (genotype 2), with recent reclassification suggested for P. bovis, is cited by several authors as the most pathogenic species for animals, mainly in the form of bovine mastitis. Infections are difficult to control due to the high resistance capacity of the agent, causing damage to the producer and risk to human health. In the search for alternatives to control animal prototecosis, in this study several drugs of different natures were tested. In this context, the objective of this work was to determine the minimum inhibitory concentration in vitro of antibacterial and antifungal, essential oils, monoterpenes, terpenes and antimicrobial peptides, against P. zopfii (genotype 2) isolates. The testing methodology was broth microdilution, according to CLSI document M27-A3. To carry out the tests, Prototheca spp. isolates were obtained from milk samples, from rural properties in the northwest region, in the State of Rio Grande do Sul. The agent was identified by colony morphology observation technique, in culture and sporangia micromorphology, with visualization of the presence of endosporulation. For species identification, the genotype-specific PCR 18S rDNA assay was used. Thirty-two isolates of Prototheca spp. were found, based on genetic analysis, all isolates were characterized as P. zopfii (genotype 2) being a 450 bp fragment from the internal amplification control and specific amplicon of genotype 2 (165 bp), detectable for all of them. In the tests, resistance to all antibacterial drugs and essential oils, monoterpenes and terpenes with almost absent inhibitory activity, were observed. Among antifungals, amphotericin B (MIC 0,5 to 32 μg/mL; geometric mean: 4,0 μg/mL) and terbinafine (MIC 0,5 to 128 μg/mL; geometric mean: 3,1 μg/mL) were the ones that stood out as well as ketoconazole and itraconazole. Antimicrobial peptides are a new class of drugs with antimicrobial activity, where the highlights were for pexiganan with MIC range from 5,0 to 10 μg/mL, in addition to producing algaecide effect with 5,0 to 20 μg/mL. The MIC produced by h-Lf1-11 was 10 to 80 μg/mL, whereas LL-37 had MIC range from 20 to 80 μg/mL and 40 to 160 μg/mL was the MIC of cecropin B. In general, the results showed the presence of the agent in one of the most important milk-producing regions in Brazil, as well as new drug options against P. zopfii (genotype 2). Algas aclorofiladas do gênero Prototheca são agentes causadores de doenças em humanos e animais. A espécie Prototheca zopfii (genótipo 2), com recente reclassificação sugerida para P. bovis, é citada por diversos autores como a espécie mais patogênica para os animais, principalmente na forma de mastites bovinas. As infecções são de difícil controle devido à alta capacidade de resistência do agente, determinando prejuízos ao produtor e risco a saúde humana. Na busca de alternativas para o controle da prototecose animal, neste estudo foram testados diversos fármacos de diferentes naturezas. Neste contexto o objetivo deste trabalho foi determinar a concentração inibitória mínima in vitro de antibacterianos, antifúngicos, óleos essenciais, monoterpenos, terpenos e peptídeos antimicrobianos, contra isolados de P. spp. A metodologia dos testes foi a microdiluição em caldo, de acordo com o documento M27-A3 / CLSI. Para realização dos testes foram obtidos isolados de P. spp., a partir de amostras de leite, de propriedades rurais da região noroeste, do Estado do Rio Grande do Sul. A identificação do agente foi por técnica de observação de morfologia de colônia, em cultura e micromorfologia de esporângios, com a visualização da presença de endosporulação. Para identificação das espécies foi utilizada o ensaio de PCR 18S rDNA específico do genótipo. Foram encontrados 32 isolados de Prototheca spp., com base em análises genéticas, todos os isolados foram caracterizados como P. zopfii (genótipo 2) sendo fragmento de 450 pb do controle de amplificação interna e amplicon específico do genótipo 2 (165 pb), detectável para todos eles. Nos testes foram observadas resistência a todos os medicamentos antibacterianos e óleos essenciais, os monoterpenos e terpenos com atividade inibitória quase ausente. Entre os antifúngicos a anfotericina B (CIM 0,5 a 32 μg/mL; média geométrica: 4,0 μg/mL) e a terbinafina (CIM 0,5 a 128 μg/mL; média geométrica: 3,1 μg/mL) foram os que mais se destacaram assim como o cetoconazol e itraconazol. Os peptídeos antimicrobianos são uma nova classe de fármacos com atividade antimicrobiana, onde os destaques foram para o pexiganan com CIM variando de 5,0 a 10 μg/mL, além de produzir efeito algicida com 5,0 a 20 μg/mL. A CIM do h-Lf1-11 foi de 10 a 80 μg/mL, já o LL-37 teve CIM variando de 20 a 80 μg/mL, e 40 a 160 μg/mL foi o CIM do cecropin B. De maneira geral os resultados mostraram a presença do agente em uma das mais importantes regiões produtoras de leite do Brasil, assim como novas opções de fármacos contra P. zopfii (genótipo 2).

Dissertação de mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química, Uma ferida cutânea se não for devidamente tratada pode incorrer numa ferida crónica suscetível a infeções generalizadas, as quais podem resultar na morte do paciente. Atualmente, a engenharia de tecidos é descrita como um campo interdisciplinar que combina princípios de engenharia, química e biologia para gerar soluções que permitam reparar, restaurar e/ou melhorar as funções de tecidos lesados. No mesmo sentido, a área têxtil aborda soluções com base em fibras poliméricas, produzidas a partir de uma vasta gama de polímeros, que permitem gerar estruturas com uma grande área superficial, porosidade e resistência mecânica passivas de serem utilizadas como pensos bioativos que promovam uma atividade cicatrizadora e antimicrobiana eficiente. Os péptidos com atividade antimicrobiana (AMPs) têm despertado muita atenção pela possibilidade de serem uma alternativa promissora aos antibióticos, na busca de agentes mais eficazes contra as bactérias, evitando que estas desenvolvam resistência e por ser possível a sua síntese e manipulação para serem aplicados como o elemento biomédico nos pensos bioativos. Este projeto resulta da colaboração entre o Departamento de Química e o Centro de Ciência e Tecnologia Têxtil (2C2T), e visa a síntese dos AMPs Peptaibolin e Tiger 17, através de metodologias de síntese em fase sólida assistida por micro-ondas, a sua caracterização química, estrutural e antimicrobiana, e posterior imobilização em estruturas nanofibrosas poliméricas produzidas por eletrospinning. Para atingir este objetivo, técnicas como a Ressonância magnética nuclear de protão (1 HRMN) e a Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foram aplicadas na caraterização do péptido, assim como testes antimicrobianos de concentração mínima inibitória ou cinética de evolução microbiana. A técnica de eletrospinning foi utilizada para o processamento de nanofibras a partir do polímero natural, acetato de celulose (CA), e do sintético, policaprolactona (PCL). As matrizes poliméricas geradas foram caracterizadas recorrendo a técnicas como MO, SEM, ATR-FTIR, TGA, DSC, ensaios de hidratação e determinação indireta de porosidade, e medições de ângulos de contacto e, consequente, determinação da energia de superfície. Sendo possível concretizar todos os objetivos propostos para este trabalho, e fruto de uma extensa otimização de processos e investigação futura, esta inovação poderá resultar numa terapia única com vista a proteger as feridas contra infeções, e simultaneamente acelerar a cicatrização e regeneração dos tecidos., A skin wound if not properly treated can result in a chronic wound susceptible to widespread infections, which can result in the patient's death. Currently, tissue engineering is described as an interdisciplinary field that combines principles of engineering, chemistry and biology to generate solutions that allow to repair, restore and/or improve the functions of injured tissues. In the same sense, the textile area addresses solutions based on polymeric fibers, produced from a wide range of polymers, which allow the generation of structures with a large surface area, porosity and mechanical resistance that can be used as bioactive dressings that promote a healing and efficient antimicrobial activity. Antimicrobial peptides (AMPs) have attracted a lot of attention due to the possibility of being an alternative to antibiotics in the search for more effective agents against bacteria, preventing them from developing resistance. They can be applied as the biomedical element in bioactive dressings because their synthesis and manipulation are possible. This project results from the collaboration between the Department of Chemistry and the Center for Science and Textile Technology (2C2T), and aims at the synthesis of AMPs Peptaibolin and Tiger 17, through solid phase synthesis methodologies assisted by microwave, their chemical, structural and antimicrobial characterization, and subsequent immobilization on polymeric nanofiber structures produced by electrospinning. To achieve this objective, techniques such as Proton Nuclear Magnetic Resonance (1 H RMN) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) were applied to the peptide characterization, as well as antimicrobial tests with minimal inhibitory concentration or kinetics of microbial evolution. The electrospinning technique was used to process nanofibers from the natural polymer, cellulose acetate (CA), and the synthetic, polycaprolactone (PCL). The polymeric matrices generated were characterized using techniques such as MO, SEM, ATR-FTIR, TGA, DSC, hydration tests and indirect porosity determination, measurements of contact angles and, consequently, determination of surface energy. As it is possible to achieve all the objectives proposed for this work, and as a result of extensive optimization process and future research, this innovation may result in a unique therapy with a view to protecting wounds against infections, while simultaneously accelerating healing and tissue regeneration., Gostava ainda de agradecer ao Centro de Ciência e Tecnologia Têxtil (2C2T) por permitir a realização deste projeto nos seus laboratórios e ainda à Fundação da Ciência e Tecnologia (FCT) pelo financiamento do projeto onde este trabalho foi inserido, projeto PEPTEX PTDC/CTM-TEX/28074/2017 (POCI-01-0145-FEDER-028074)

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Estudos anteriores, em sistemas modelo, demonstraram que a acetilação do N-terminal resultou no aumento da atividade lítica em vesículas aniônicas (8POPC/2POPG) em comparação com o L1A, o que sugeriu perturbação do empacotamento lipídico de modo mais eficaz para o análogo que é menos carregado. Considerando que a membrana plasmática de bactérias Gram-negativas contém majoritariamente fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilglicerol (PG), o presente trabalho propôs investigar o impacto dos peptídeos L1A e acL1A em membranas modelo compostas por 3POPE/1DOPG utilizando uma variedade de técnicas experimentais. Os resultados demonstraram que ambos os peptídeos induziram segregação lipídica, sendo o análogo acetilado mais eficiente em recrutar PG e segregar PE. The synthetic peptides L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2, Q = +3e) and its acetylated analog (acL1A, Q = +2e) used in this study were designed to have some structural features similar to the peptide Polybia-MP1 extracted from the venom of the wasp Polybia paulista, in which one of the acidic residues occupies the second position on the N-terminus region and basic residues are third and/or fourth neighbors of the acidic residues. These peptides display significant bactericidal activity against Gram-negative bacteria, especially Escherichia coli, being non-hemolytic. Previous work performed in model membrane systems has shown that the N-terminal acetylation led to an increase on the lytic activity in anionic vesicles (8POPC/2POPG) compared with L1A, suggesting that the less charged peptide has higher ability to perturb the lipid-packing. Considering that the Gram-negative cell membranes contain mainly phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylglycerol (PG), the present work proposed to investigate the impact of L1A and acL1A on model membranes composed of 3POPE/1DOPG using a variety of experimental techniques. The results suggested that both peptides induced lipid segregation being the acetylated analog more efficient in recruiting PG and segregating PE. CAPES: 88882.434300/2007-01

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No. of bitstreams: 1 furlanetto_a_me_bot_par.pdf: 471249 bytes, checksum: 012681aded779d327b681278ce3f2b32 (MD5) Previous issue date: 2020-02-18 Made available in DSpace on 2020-04-24T20:19:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 furlanetto_a_me_bot_par.pdf: 471249 bytes, checksum: 012681aded779d327b681278ce3f2b32 (MD5) Previous issue date: 2020-02-18 O aumento no número de bactérias multirresistentes aos fármacos antibacterianos é preocupação de saúde pública e tem motivado pesquisas na buscsa por antimicrobianos alternativos para minimizar este problema, e na obtenção de substâncias com capacidade de matar bactérias e/ou interferir com a sua patogenicidade. O Staphylococcus aureus é uma bactéria altamente virulenta, capaz de causar inúmeras doenças, incluindo intoxicações alimentares. Esta bactéria se tornou resistente aos diversos antimicrobianos ao longo dos anos com destaque para o S. aureus meticilina-resistente (MRSA). O peptídeo antimicrobiano (AMP) nisina, bacteriocina produzida por Lactococcus lactis é um que vem sendo estudado na forma de nanoemulsões e nanopartículas. O objetivo desse estudo foi sintetizar, caracterizar e testar nanoemulsões e nanopartículas de ouro (AuNPs) de nisina, para a verificação da ação antibacteriana, através da Concentração Inibitória Mínima (CIM), atividade antibiofilme, antienterotoxina, atividade hemolítica, ação sobre a membrana bacteriana determinada pelo extravasamento de proteínas, sobre linhagens padrões ATCC de S. aureus, e teste de viabilidade celular em linhagem HCT-116 por citometria de fluxo. Os tratamentos utilizados foram nisina, cinco nanoemulsões com nisina (Nano-Nis), AuNPs com nisina (AuNPs-Nis), AuNPs com Nano-Nis (AuNPs + Nano-Nis) e AuNPs-Nis com nanoemulsão (AuNPs-Nis + Nano). De acordo com os resultados obtidos para CIM, observou-se que para a cepa ATCC 33591 de MRSA, a nanoemulsão denominada número 1, foi a mais eficiente entre as 5 testadas incluindo também a própria nisina. Por outro lado, sobre as linhagens também ATCC enterotoxigênicas, a nanoemulsão número 5 foi a mais eficiente sobre SEA e SEB com valores inferiores comparativos ao obtidos com a nisina e demais nanoemulsões. Considerando que a nanoemulsão número 1 foi a mais eficiente sobre a cepa MRSA, foi dada continuidade dos estudos utilizando combinações desta nanoemulsão juntamente com as AuNPs. Observou-se que as AuNPs-Nis, apresentaram mesma ação que a nisina isoladamente enquanto a do tratamento AuNPs + Nano-Nis apresentou menor valor. Os testes antienterotoxinas foram realizados utilizando kit SET-RPLA, entretanto, todas as cepas se mostraram fortes produtoras de enterotoxinas com uso de concentrações correspondentes a 70% do valor de CIM nos ensaios, com exceção das AuNPs-Nis que resultaram em moderada produção de SEA e SEB. O teste antibiofilme foi realizado com concentrações subinibitórias de 25% a 90% do valor de CIM dos tratamentos incubando-as por 48 horas. Todos os tratamentos apresentaram redução da produção de biofilme, em todas as concentrações testadas. A atividade hemolítica foi determinada para tratamentos com concentrações variando desde ¼ até 4 vezes o CIM. No valor de CIM, dois tratamentos apresentaram-se hemolíticos enquanto no valor de 4xCIM, quatro tratamentos apresentaram-se hemolíticos. O teste de extravasamento protéico foi realizado, tendo as concentrações protéicas determinadas de acordo com protocolo de Bradford, e utilizando concentrações de 1 e 2 vezes a CIM para MRSA. O tratamento que resultou em maior concentração de proteínas extravasadas foi a Nano-Nis. Os tratamentos, com exceção da nanoemulsão, não apresentaram efeito citotóxico sobre a linhagem HCT-116. Assim, pode-se dizer que as nanoemulsões e AuNPs, quando conjugados à nisina, foram eficazes contra S. aureus, com potencial antibacteriano superiores quando utilizando-a na forma pura. The growth in the number of multiresistant bacteria resistant to traditional antimicrobial drugs is a public health concern which has been motivated researchs worldwide, seeking new antimicrobial drugs to minimize this problem besides getting new substances able to erradicate bacteria and/or interfer with their pathogenicity. Staphylococcus aureus is a highly virulent bacteria, able to cause countless diseases including food poisoning. This bacteria got resistant to many antimicrobials within the years, highlighting the S. aureus metchilin-resistant (MRSA). The antimicrobial peptide (AMP) nisin, bacteriocin synthesized by Lactococcus lactis, is one that has been studied in nanoemulsions and nanoparticles. The objective of this study was to synthesize, characterize and evaluate nanoemulsions and gold nanoparticles (AuNPs) with nisin, to verify their antibacterial action, using the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), antibiofilm activity, antienterotoxin activity, hemolytic activity, action on bacterial membrane determined by protein leakage, on MRSA ATCC strains, and cell viability in HCT-116 strain by flow citometry. The treatments used were nisin, five nanoemulsions with nisin (Nano-Nis), AuNPs with nisin (AuNPs-Nis), AuNPs with Nano-Nis (AuNPs + Nano-Nis) and AuNPs-Nis with nanoemulsion (AuNPs-Nis + Nano). According to the results obtained for MIC, it was observed that for the MRSA strain ATCC 33591, the number 1 formulation of nanoemulsions was the more efficient between the five others, including nisin itself. However, when tested on enterotoxigenic strains, the number 5 nanoemulsion was the more efficient on SEA and SEB with lower values when compared to nisin itself and with other nanoemulsions. Whereas nanoemulsion 1 was the more efficient on MRSA strain, the study continued with this nanoemulsion, with the AuNPs. It was observed that AuNPs-Nis showed the same action than nisin itself while the AuNPs + Nano-Nis treatment showed a lower MIC. The antienterotoxin test was evaluated by SET-RPLA kit, however, all of the enterotoxigenic strains showed high enterotoxin production after the experiment with 70% of the treatments’ MICs, except for AuNPs-Nis, which resulted in moderate production of SEA and SEB. The antibiofilm test was evaluated with six subinhibitory concentrations, from 25% to 90%, incubating them for 48 hours. All treatments showed biofilm reduction in all six concentrations. The hemolytic activity was evaluated for the treatments from ¼ to 4 times the values of MICs. In the MIC value, two treatments showed hemolytic activity while in 4xMIC, four treatments showed hemolytic activity. The test for proteins leakage was evaluated following Bradford protocol, with concentrations of one and two times the MICs value for MRSA strain. The treatment that showed the higher concentration of leakaged proteins was Nano-Nis. The treatments, except for the ones with nanoemulsion, didn’t show citotoxicity on HCT-116 strain. Then, it can be concluded that the nanoemulsions and the gold nanoparticles, when conjugated with nisin, were efficient against different strains of S. aureus, with antibacterial potential higher than the potential of nisin itself.

Submitted by Taisa Giordano Viegas (taisaviegas@gmail.com) on 2019-05-31T15:20:25Z No. of bitstreams: 2 tese_final_final.pdf: 11142349 bytes, checksum: 479231f85a8594c78f567157fabc2ddf (MD5) tese_final_final.pdf: 11142349 bytes, checksum: 479231f85a8594c78f567157fabc2ddf (MD5) Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) Falta a FICHA CATALOGRÁFICA (Obrigatório pela ABNT NBR14724) Você poderá elaborar a sua ficha, acessando o Sistema Gerador de Fichas Catalográficas online. Na página da Biblioteca encontrará as informações necessárias: https://www.ibilce.unesp.br/#!/biblioteca/servicos-oferecidos/normalizacao/ficha-catalografica/ Problema 02) Se você recebeu financiamento/bolsa da FAPESP, deve constar o nome dela também na folha de rosto e de aprovação com o número do processo, é norma do convênio, no seu arquivo está constando apenas no agradecimento. Problema 03) A paginação deve ser sequencial, iniciando a contagem na folha de rosto e mostrando o número a partir da introdução, a ficha catalográfica ficará após a folha de rosto e não deverá ser contada. Problema 04) A página que seria a 31 está desconfigurada, pois a figura 9 está inserida em cima do texto. Problema 05) Sugerimos que você faça adequações no sumário conforme a norma ABNT NBR 6027 e 6024, não é necessário colocar Capítulo: Ex: Sumário 1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................17 1.2 DESENVOLVIMENTO TEÓRICO...............................................................................19 1.2.1 Membranas biológicas.............................................................................................20 1.2.2 Peptídeos.................................................................................................................24 2. OBJETIVOS..............................................................…..............................…................28 3. MATERIAIS E MÉTODOS..............…..........................................................…..............29 3.1 MATERIAIS..................................................................................................................29 3.2 MÉTODOS...................................................................................................................30 3.2.1 Preparação de vesículas grandes (LUVs)................................................................30 OBS:-Estamos encaminhando e-mail o template/modelo das páginas pré-textuais para que você possa fazer as correções, sugerimos que siga este modelo pois ele contempla as normas da ABNT. Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Agradecemos a compreensão. on 2019-05-31T17:13:09Z (GMT) Submitted by Taisa Giordano Viegas (taisaviegas@gmail.com) on 2019-06-04T17:45:52Z No. of bitstreams: 1 tesefinal-com ficha.pdf: 10448706 bytes, checksum: c126c31ccb38abb2f3c038e28d1e432f (MD5) Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) Na FICHA CATALOGRÁFICA sugerimos diminuir o tamanho da fonte(8) para não ultrapassar a dimensão da ficha. Problema 02) Algumas indicações de página da lista de tabelas não confere com o texto, a tabela 4 está na página 53 e na lista está como página 54, a tabela 5 está na página 55 e na tabela indica página 56, a tabela 68 está na página 74 e na lista indica página 75, a tabela 7 está na página 76 e na lista indica página 77, a tabela 8 está na página 92 e na lista indica página 93 e a tabela 9 está na página 94 e na lista indica página 95. Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Agradecemos a compreensão. on 2019-06-05T14:05:09Z (GMT) Submitted by Taisa Giordano Viegas (taisaviegas@gmail.com) on 2019-06-06T13:00:09Z No. of bitstreams: 1 tese-060619.pdf: 6218191 bytes, checksum: 3f80ad8979102480201443b93eb23c0b (MD5) Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2019-06-06T18:18:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 viegas_tg_dr_sjrp_par.pdf: 2002725 bytes, checksum: d4a363e94ed3163cb8ca61024b2dc378 (MD5) Made available in DSpace on 2019-06-06T18:18:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 viegas_tg_dr_sjrp_par.pdf: 2002725 bytes, checksum: d4a363e94ed3163cb8ca61024b2dc378 (MD5) Previous issue date: 2019-05-20 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Peptídeos líticos com propriedades antimicrobianas são catiônicos e atuam na membrana celular desestabilizando o empacotamento lipídico levando a célula à lise. Polybia-MP1 ou MP1 (IDWKKLLDAAKQIL-NH2) é um potente bactericida, não hemolítico e não citotóxico que também inibe a proliferação de células de câncer. Ambas as atividades, bactericida e inibitória, envolvem lipídios aniônicos e pH do ambiente diferente do fisiológico. O potencial eletrostático e o pH da solução podem modular a carga do peptídeo com presença simultânea de resíduos ácidos e básicos. Neste trabalho investigamos o efeito da modulação de carga na afinidade e na eficiência lítica em vesículas lipídicas. Para esta tarefa a eficiência do MP1 em vesículas lipídicas foi comparada com a do análogo H-MP1 em que as histidinas substituíram as lisinas. Dicroísmo circular, fluorimetria, potencial zeta e microscopia óptica foram usados para investigar a ação desses peptídeos em vesículas unilamelares grandes e gigantes (LUVs e GUVs) de diferentes composições lipídicas com o pH da solução fixado em 5,5, 6,5 e 7,4. A carga do MP1 foi menos sensível ao potencial da vesícula e ao pH da solução, enquanto a carga do H-MP1 foi fortemente modulada, sendo maior em solução ácida, mas ainda menor que MP1. A modulação da carga do H-MP1 conferiu maior afinidade e desempenho lítico em solução ácida, enquanto MP1 foi melhor em pH neutro. MP1 apresentou maior atividade de permeação nas vesículas lipídicas nos três pHs investigados em comparação ao H-MP1. O vazamento induzido em GUV única foi caracterizado por um tempo de retardo da ordem de minutos seguido pela liberação do conteúdo da GUV em alguns segundos. O tempo de retardo e a permeabilidade são dependentes do pH e da concentração de peptídeo. Os resultados confirmam que a inserção desses peptídeos na fase lipídica perturba o empacotamento de lipídios, levando à formação de poros. Lytic peptides with antimicrobial properties are cationic and act on the lipid cell membrane, destabilizing the lipid-packing leading to the cell lysis. Polybia-MP1 or MP1 (IDWKKLLDAAKQIL-NH2) is a potent bactericide, non-hemolytic, and non-cytotoxic that inhibits cancer cell proliferation. Both the bactericide and the inhibitory activities involve anionic lipids and milieu pH different from the physiological one. The electrostatic potential and the solution pH can potentially modulate the net charge of a peptide with the simultaneous presence of acidic and basic residues. This thesis investigated the effect of this charge modulation on the affinity and on the lytic efficiency in anionic vesicles. For this task, the affinity to and leakage efficiency in anionic vesicles of MP1 was compared with those of its analog H-MP1 in which histidines substituted the lysines. Circular dichroism, fluorimetry, zeta potential, and optical microscopes were used to investigate the action of these peptides in anionic large and giant unilamellar vesicles (LUVs and GUVs) of different compositions and the solution pH fixed at 5.5, 6.5 and 7.4. MP1 net charge was less sensitive to the vesicle potential and solution pH, while HMP1 charge was strongly modulated being larger at acidic solution but still smaller than MP1. The HMP1 charge modulation imparted higher affinity and lytic performance at acidic solution while MP1 was better at neutral pH. MP1 showed higher permeating activity in lipid vesicles in the three pH investigated in comparison to H-MP1. The leakage induced in single GUVs was characterized by a lag-time of an order of minutes followed by the release of GUV content in a few seconds. The lag-time and permeability were dependent on the pH and peptide concentration. The results support that the insertion of these peptides into the lipid phase disturbs the lipid-packing leading to pore formation. 167069/2014-4

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2019-06-17T19:52:33Z No. of bitstreams: 1 MateusCostadeSantanaDissertacao2019.pdf: 2232746 bytes, checksum: 84c263a98db7dd98c74f01f0d17b5df9 (MD5) Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2019-06-17T19:52:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MateusCostadeSantanaDissertacao2019.pdf: 2232746 bytes, checksum: 84c263a98db7dd98c74f01f0d17b5df9 (MD5) Made available in DSpace on 2019-06-17T19:52:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MateusCostadeSantanaDissertacao2019.pdf: 2232746 bytes, checksum: 84c263a98db7dd98c74f01f0d17b5df9 (MD5) Previous issue date: 2019-04-01 Viral infections represent a significant concern for the public health and socioeconomic systems, being responsible for infectious diseases with high morbidity and mortality worldwide. Drugs used in the viral infections??? treatment usually act directly on the viruses??? multiplication cycle, and to prevent the formation of new viral particles. Nonetheless, the antiviral drugs??? limitations in the treatment, as viral resistance and their side effects, propel the research and development of molecules with biotechnological potential for new therapeutic approaches. Therefore, antiviral peptides constitute molecules with potential against viral infections of medical importance, such as human herpesvirus 1 (HHV-1), which causes cold sores with a prevalence of 60-95% worldwide. The objective of this project constituted to define the antiviral activity of different peptides as a possible biotechnological product against infections caused by HHV-1. The viral titer reduction method was used to determine the antiviral effect of the peptides against HHV-1, which were cultured in mammalian cells (Vero cell). Initially, an antiviral screening was performed using the synthetic rondonin, PaDBS1R6, ZM-AVP1 and ZM-AVP2 peptides against HHV-1 in their maximum non-toxic concentrations (MNCT). As a result of this evaluation, the ZM-AVP1 and ZM-AVP2 peptides were selected, in which they were able to inhibit the infection in 94.5% and 96.7% using 200 ??g.mL-1 per suspension, respectively. The remaining peptides showed no inhibitory effects against HHV-1. The effective concentration of 50% inhibition (EC50) of the peptides was defined by the dose-response curve in 9.2 ??g.mL-1 for ZM-AVP1, and at the 34.9 ??g.mL-1 for ZM-AVP2. Our results suggest ZM-AVP1 as an entry inhibitor of HHV-1 (85.4%), by possible interaction site with cellular receptors, and ZM-AVP2 as an intracellular inhibitor (46.8%). The peptides selectivity index was >40 for ZM-AVP1, and >11 for ZM-AVP2 when considering the CC50 of both molecules as >400 ??g.mL-1. Those results, however, need to be expanded with other tests, broadening viral strains tests to confirm the antiviral potential of the peptides ZM-AVP1 and ZM-AVP2 against HHV-1 and other viral infections of medical importance. In a first moment, nonetheless, the peptides present a biotechnological potential for the treatment of viral infections caused by HHV-1 and are promising candidates for future therapeutically protocols. Infec????es virais representam uma grande preocupa????o para o sistema de sa??de p??blica e socioecon??mica, sendo respons??veis por infec????es com alta taxa de morbidade e mortalidade na popula????o mundial. Os f??rmacos utilizados no tratamento das infec????es virais atuam diretamente no ciclo de multiplica????o dos v??rus para prevenir a forma????o de novas part??culas virais. Entretanto, esses f??rmacos possuem limita????es como resist??ncia antiviral e efeitos colaterais, os quais impulsionam a pesquisa e desenvolvimento de mol??culas com potencial biotecnol??gico para novas abordagens terap??uticas. Portanto, os pept??deos antivirais constituem mol??culas com potencial contra infec????es virais de import??ncia m??dica, a exemplo do herpesv??rus humano 1 (HHV-1), respons??vel pelo herpes labial com uma preval??ncia de 60 a 95% no mundo todo. O objetivo deste projeto consistiu em definir a atividade antiviral de diferentes pept??deos como poss??veis produtos biotecnol??gicos contra infec????es causadas pelo HHV-1. O m??todo de redu????o do t??tulo viral foi utilizado para determinar o efeito antiviral dos pept??deos contra o HHV-1 cultivado em c??lulas de mam??feros (c??lula Vero). Inicialmente ocorreu uma triagem antiviral utilizando os pept??deos sint??ticos rondonina, PaDBS1R6, ZM-AVP1 e ZM-AVP2 contra o HHV-1 em suas concentra????es m??ximas n??o t??xicas (CMNT). Como resultado desta avalia????o, foram selecionados os pept??deos ZM-AVP1 e ZM-AVP2, os quais foram capazes de inibir a infec????o viral em 94,5 e 96,7% utilizando 200 ??g.mL-1 por suspens??o. Os pept??deos restantes n??o demonstraram nenhum efeito delet??rio frente ao HHV-1. A concentra????o efetiva com 50% de inibi????o (CE50) dos pept??deos foi definida atrav??s da curva dose-resposta em 9,2 ??g.mL-1 para o ZM-AVP1, e 34,9 ??g.mL-1 para o ZM-AVP2. Nossos resultados sugerem que o ZM-AVP1 atua como um inibidor de entrada do HHV-1 (85,4%) pelo poss??vel local de intera????o com receptores celulares, e o ZM-AVP2 como inibidor intracelular (46,8%). O ??ndice de seletividade dos pept??deos foi >40 para o ZM-AVP1 e >11 para o ZM-AVP2 quando considerado a CC50 de ambas mol??culas como >400 ??g.mL-1; Esses resultados, entretanto, precisam ser expandidos com outros ensaios, ampliando os testes para confirmar o potencial antiviral dos pept??deos ZM-AVP1 e ZM-AVP2 contra o HHV-1 e outras infec????es virais de import??ncia m??dica. Em um primeiro momento, entretanto, os pept??deos apresentam um potencial biotecnol??gico para o tratamento de infec????es virias causadas pelo HHV-1 e tornam-se candidatos promissores para futuros protocolos terap??uticos.

Submitted by Letícia Rossi Malimpensa (leticia_malimpensa@hotmail.com) on 2019-04-04T13:02:47Z No. of bitstreams: 1 Isolamento e caracterização de peptídeos do gastrópode marinho Olivancillaria urceus.pdf: 8118075 bytes, checksum: bbf46425a2bf5a43d9969bc69e217b28 (MD5) Rejected by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br), reason: Boa tarde. Favor alterar: - área de concentração (na dúvida, entre em contato com o seu Orientador) - nome do arquivo com o titulo do trabalho, não está aparecendo em todos os lugares como o título da dissertação. Em alguns lugares aparece com o nome anterior. Favor inseri-lo novamente. Qualquer dúvida, entre em contato. abs. Disleide on 2019-04-04T17:29:27Z (GMT) Submitted by Letícia Rossi Malimpensa (leticia_malimpensa@hotmail.com) on 2019-04-05T13:09:44Z No. of bitstreams: 1 Isolamento e caracterização de peptídeos do gastrópode marinho Olivancillaria urceus.pdf: 8118075 bytes, checksum: bbf46425a2bf5a43d9969bc69e217b28 (MD5) Approved for entry into archive by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br) on 2019-04-05T13:51:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 malimpensa_lr_me_svic_par.pdf: 767452 bytes, checksum: a43dbbe419ce6b132f1360e954287c3d (MD5) Made available in DSpace on 2019-04-05T13:51:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 malimpensa_lr_me_svic_par.pdf: 767452 bytes, checksum: a43dbbe419ce6b132f1360e954287c3d (MD5) Previous issue date: 2019-03-13 A Olivancillaria urceus é uma das espécies de gastrópode marinho mais abundante na região subtropical da costa sudeste brasileira, frequentemente capturada na pesca de arrasto de fundo do camarão sete barbas. Nos últimos anos, a investigação química em moluscos marinhos têm revelado informações sobre uma variedade de compostos de interesse clínico, em especial os peptídeos, apresentando propriedades farmacológicas distintas, como por exemplo, ação antimicrobiana. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi o isolamento e caracterização de peptídeos que existam naturalmente nos tecidos do gastrópode marinho Olivancillaria urceus utilizando-se de um método específico de extração, seguido de fracionamento por cromatografia líquida em coluna C18, ensaio de atividade antimicrobiana contra os microorganismos: M. luteus, E. coli e C. albicans, e identificação das frações com atividade por espectrometria de massas. Nossas análises identificaram uma fração do extrato peptídico, denominada 18-M-3, com atividade antimicrobiana contra a bactéria Micrococcus luteus, apresentando uma concentração média de 2,18 mg/ml. A análise por espectrometria revelou tratar-se de uma fração complexa, constituída principalmente por um conjunto de peptídeos descritos pela primeira vez, fragmentos de proteínas citosólicas e nucleares conservados em diferentes espécies de moluscos. Estes resultados abrem novas perspectivas sobre o potencial farmacológico de extratos O. urceus. Olivancillaria urceus is one of the most abundant marine gastropod species in the subtropical region of the Brazilian southeast coast, often caught in shrimp trawling. In recent years, chemical research in marine molluscs has revealed information on a variety of compounds of clinical interest, especially peptides, exhibiting distinct pharmacological properties, such as antimicrobial action. In this context, the aim of this work was the isolation and characterization of peptides that exist naturally in the tissues of the marine gastropod O. urceus using a specific extraction method, followed by liquid chromatography fractionation on C18 column, antimicrobial activity tests against microorganisms M. luteus, E. coli e C. albicans, and identification of the fractions with activity by mass spectrometry of. Our analyzes identified a fraction of the peptide extract, designated 18-M-3, with antimicrobial activity against the bacterium Micrococus luteus, presenting an average concentration of 2.18 mg / ml of peptides. Spectrometric analysis revealed a complex fraction consisting mainly of a set peptides, fragments of cytosolic and nuclear proteins conserved in different species of mollusks. These results open new perspectives about the pharmacological potential of O. urceus extracts.

Orientador: Prof. Dr. Vani Xavier de Oliveira Junior Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, Santo André, 2019. Peptídeos antimicrobianos são moléculas biologicamente ativas produzidos por uma grande diversidade de organismos, como componente essencial da resposta imune inata. VmCT1 (Phe-Leu-Gly-Ala-Leu-Trp-Asn-Val-Ala-Lys-Ser-Val-Phe-NH2) é um peptídeo catiônico, isolado do veneno de escorpião da espécie Vaejovis mexicanus smithi, que apresenta atividade antibacteriana e tende a se estruturar em a-hélice. O presente trabalho teve como proposta a síntese de novos peptídeos antimicrobianos, a fim verificar a influência de mudanças das propriedades físico-químicas nas atividades biológicas. Os análogos foram sintetizados pelo método em fase sólida, purificados em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) e caracterizados por Espectrometria de Massas (LC/ESI-MS), além de realizados estudos conformacionais, por Dicroísmo Circular (CD) em diversos meios. Os peptídeos foram projetados e divididos em quatro grupos: com substituições simples de aminoácidos; com substituições de aminoácidos carregados positivamente; com substituições múltiplas de aminoácidos; e quiméricos. As modificações foram realizadas no intuito de analisar as possíveis alterações na atividade antimicrobiana; hemolítica; contra células de câncer mamário MCF-7 e antiplasmódica em Plasmodium gallinaceum; além de estabilidade frente a proteases. Valores mais baixos de atividade hemolítica, quando comparados com o VmCT1, foram observados em alguns peptídeos quiméricos e nos análogos com substituições simples, obtidos a partir da substituição da fenilalanina na posição 1 pela glicina, da alanina na posição 4 pelo ácido glutâmico e da valina na posição 8 por um resíduo de prolina (25 - 100 µmol L-1). Na atividade anticâncer, as substituições de asparagina na posição 7 por ácido glutâmico, alanina na posição 9 por triptofano e valina na posição 12 por tirosina levaram a diminuições nas células viáveis de MCF-7. O incremento da carga líquida por meio de substituições pelos aminoácidos lisina ou arginina, na porção hidrofílica, foi importante para o aumento da atividade antimicrobiana com valores variando entre 0,1 ¿ 12,5 µmol L-1, além disso esses peptídeos apresentaram atividade contra MCF-7, diferentemente do que observado nas substituições por lisina na porção hidrofóbica da projeção helicoidal. Quando substituída a alanina na posição 9 por lisina o análogo apresentou significativa atividade antiplasmódica na concentração de 0,8 µmol L-1, similarmente quando o mesmo resíduo foi substituído por fenilalanina. Esses resultados mostram a influência que as modificações promovem nas propriedades físico-químicas dos peptídeos na atividade biológica, fornecendo informações sobre a relação estrutura-atividade para o desenho de novos análogos com relevante atividade biológica. Antimicrobial peptides are biologically active molecules produced by a wide variety of organisms as an essential component of the innate immune response. VmCT1 (Phe-Leu-Gly-Ala-Leu-Trp-Asn-Val-Ala-Lys-Ser-Val-Phe-NH2) is a cationic peptide from the venom of Vaejovis mexicanus smithi scorpions, which presents antibacterial activity and tends to helical structures. The present work had as proposal the synthesis of new antimicrobial peptides, in order to verify the influence of changes of the physical-chemical properties on biological activities. The analogs were synthesized by the solid phase method, purified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and characterized by Mass Spectrometry (LC / ESI-MS), besides conformational studies by Circular Dichroism (CD) in several media were performed. The peptides were designed and divided into four groups: with single amino acid substitutions; with positively charged amino acid substitutions; with multiple amino acid substitutions and chimeric peptides. The modifications were carried out in order to analyze the possible alterations in activities against microorganisms, hemolyses, against MCF-7 breast cancer cells, and antiplasmodial in Plasmodium gallinaceum; besides stability to proteases were verified. Lower values of hemolytic activity, when compared with VmCT1, were observed in some chimeric peptides and in peptides with single substitutions by replace phenylalanine in position 1 by glycine, alanine in position 4 by glutamic acid and valine in position 8 with a proline residue (25 - 100 µmol L-1). In anticancer activity, substitutions of asparagine at position 7 for glutamic acid, alanine at position 9 by tryptophan and valine at position 12 by tyrosine led to decreases in viable cells of MCF-7. The increase of net positive charge by the introduction of lysine or arginine residue in positions of the hydrophilic face of the helical structure was important for the increase of the antimicrobial activity with values varying between 0.1 - 12.5 µmol L-1, in addition these peptides presented activity against MCF-7, differently from that observed in the lysine substitutions in the hydrophobic face; however, when substituting alanine in position 9 by lysine the analog showed significant antiplasmodial activity at the concentration of 0.8 µmol L-1, similarly when the same residue was replaced by phenylalanine. These results show the influence of the modifications in the physical-chemical properties of the peptides on the biological activity, providing information about the structure-activity relationship for the design of new analogs with relevant biological activity.

Submitted by Danubia Batista Martins (danubiab4@hotmail.com) on 2019-01-06T20:30:56Z No. of bitstreams: 1 versão final compactada (06.01.19).pdf: 5616380 bytes, checksum: 84245c8c2ab56acedd0ee87fb3948dce (MD5) Rejected by Paula Torres Monteiro da Torres (paulatms@sjrp.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) Se você recebeu financiamento da CAPES, deve constar o nome dela também na folha de rosto e de aprovação. Ex.: Financiadora: CAPES Problema 02) Falta os agradecimentos, segundo a Portaria nº 206, de 4 de setembro de 2018, todos os trabalhos que tiveram financiamento CAPES deve constar nos agradecimentos a expressão: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Agradecemos a compreensão. Atenciosamente, Paula Torres on 2019-01-07T12:04:32Z (GMT) Submitted by Danubia Batista Martins (danubiab4@hotmail.com) on 2019-01-07T13:58:19Z No. of bitstreams: 1 versão final compactada (07.01.19).pdf: 5573059 bytes, checksum: 18c8e2627a6caf5249d2bf2022a4efe7 (MD5) Approved for entry into archive by Paula Torres Monteiro da Torres (paulatms@sjrp.unesp.br) on 2019-01-07T16:32:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 martins_db_dr_sjrp_par.pdf: 1324874 bytes, checksum: ebc759e3eb79c93651e05532fc69d467 (MD5) Made available in DSpace on 2019-01-07T16:32:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 martins_db_dr_sjrp_par.pdf: 1324874 bytes, checksum: ebc759e3eb79c93651e05532fc69d467 (MD5) Previous issue date: 2018-11-26 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) O uso de peptídeos bioativos em antibioticoterapia tem dentre suas vantagens principais a reduzida possibilidade de desenvolvimento de resistência, uma vez que o alvo são os fosfolipídios constituintes da membrana celular. Muitos desses peptídeos são de cadeia curta, com amplo espectro de atividade contra bactérias e contra fungos, e com baixa citotoxicidade. Mecanismos de seletividade na ação de peptídeos bioativos vêm sendo investigados como forma de dirigir modificações estruturais que aperfeiçoem suas ações terapêuticas, minimizando efeitos tóxicos ou indesejáveis. Por serem predominantemente catiônicos, apresentam interação preferencial com bicamadas lipídicas aniônicas. Os peptídeos estudados neste trabalho são a Jelleine-I e dois análogos (JIF2W e JIF2WR) sintetizados com algumas modificações de resíduos na sequência primária, e a Protonectin isolada e em mistura com Protonectin (1-6). Estudos preliminares por dinâmica molecular sugeriram a formação de agregados na Jelleine-I em meio aquoso e em ambientes que modelam as características físico-químicas de membranas celulares, como as micelas do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS). Informações semelhantes foram também obtidas por meios computacionais para a Protonectin. Entretanto, este peptídeo quando em mistura com Protonectin (1-6), apresenta menor tendência à agregação em meio aquoso e em SDS. Outros estudos mostraram ainda que esta mistura apresenta atividades biológicas aumentadas. Neste trabalho realizou-se uma análise biofísica desses peptídeos em relação à formação de agregados, eficiência e seletividade, avaliados na presença de ambientes de caráter zwitteriônico e aniônicos, utilizando medidas de espectroscopia de FTIR, dicroísmo circular (CD) e fluorescência além de Potencial Zeta e determinação de atividades biológicas. Mudanças estruturais em diferentes ambientes foram verificadas tanto para a família das Jelleinas como para as Protonectinas na interação com bicamadas lipídicas, assim como também variações na formação da agregação. Nestas interações os peptídeos mostraram-se seletivos e com maior afinidade por bicamadas lipídicas de caráter aniônico. Biologicamente, ambas as famílias apresentaram baixa atividade hemolítica, sendo a Jelleíne-I e o análogo JIF2WR ativos principalmente contra bactérias Gram-positivas, enquanto a Protonectin mostrando-se mais ativa contra células tumorais, com uma tendência de melhor eficiência na combinação terapêutica em mistura com a Protonectin (1-6) na proporção 1:1. The use of bioactive peptides in antibiotic therapy has among its main advantages the reduced possibility of resistance development, since the target are the phospholipids constituting the cell membrane. Many of these peptides are short chain, with broad spectrum of activity against bacteria and against fungi, and with low cytotoxicity. Mechanisms of selectivity in the action of bioactive peptides have been investigated as a way of directing structural modifications that improve their therapeutic actions, minimizing toxic or undesirable effects. Because they are predominantly cationic, they present preferential interaction with anionic lipid bilayers. The peptides studied in this work are Jelleine-I and two analogues (JIF2W and JIF2WR) synthesized with some modifications of residues in the primary sequence, and Protonectin isolated and in admixture with Protonectin (1-6). Preliminary molecular dynamics studies have suggested the formation of aggregates in Jelleine-I in aqueous media and in environments that model the physico-chemical characteristics of cell membranes, such as sodium dodecyl sulfate (SDS) surfactant micelles. Similar information was also obtained by computational means for Protonectin. However, this peptide when mixed with Protonectin (1-6), presents a lower tendency to aggregation in aqueous medium and in SDS. Other studies have also shown that this mixture has increased biological activities. In this work a biophysical analysis of these peptides was performed in relation to the formation of aggregates, efficiency and selectivity, evaluated in the presence of zwitterionic and anionic environments, using measurements of FTIR spectroscopy, circular dichroism (CD) and fluorescence in addition to Zeta Potential and determination of biological activities. Structural changes in different environments were verified for both the Jelleinas family and Protonectins in the interaction with lipid bilayers, as well as variations in aggregation formation. In these interactions the peptides were selective and with greater affinity for lipid bilayers of an anionic character. Biologically, both families had low hemolytic activity, with Jelleine-I and JIF2WR analogue being active mainly against Gram-positive bacteria, whereas Protonectin was more active against tumor cells, with a trend of better efficiency in the combination therapy with Protonectin (1-6) in the ratio 1: 1.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-11-07T17:53:28Z No. of bitstreams: 1 StellaMarisdeFreitasLimaTese2018.pdf: 12066835 bytes, checksum: 9ad384b4f040333154c3598b59852583 (MD5) Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-11-07T17:53:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 StellaMarisdeFreitasLimaTese2018.pdf: 12066835 bytes, checksum: 9ad384b4f040333154c3598b59852583 (MD5) Made available in DSpace on 2018-11-07T17:53:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 StellaMarisdeFreitasLimaTese2018.pdf: 12066835 bytes, checksum: 9ad384b4f040333154c3598b59852583 (MD5) Previous issue date: 2018-08-21 Failure of endodontic therapy is mainly based on the persistence of the microorganism inside the root canal system, perpetuating periradicular pathologies. The need for endodontic reintervention reduces the success rate and turns the development of new therapies into a necessity. Host defense peptides (HDPs) have a therapeutic potential because of its characteristics as broad spectrum antimicrobial activity, immunomodulatory capacity and repair induction. The present study aimed to demonstrate HDPs HHC-10, LL-37 and synoeca-MP activities compared to the commonly used chemical agents Ca(OH)2, NaOCl and chlorhexidine (CHX) in in vitro and in vivo environments. In vitro analysis involved (1) antimicrobial assays for MIC/MBC/MFC determination, antibiofilm and synergistic activities (against Candida albicans, Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus), (2) hemolytic assay and determination of therapeutic index, (3) immunomodulation assays (from RAW 264.7 monocytes) and (4) osteoclastogenesis assays (from mouse bone marrow cells). In vivo assays were based on periradicular lesions induced and treated in rats with subsequent analysis by radiographic, tomographic and histological examinations. Results demonstrated effective antimicrobial activity of HHC-10 (except antibiofilm activity) and synoeca-MP besides NaOCl and CHX. Higher therapeutic index was observed for peptides (HHC-10 and synoeca-MP) with low or no hemolytic activity. Synergism analysis demonstrated better interaction between synoeca-MP and CHX. Immune assays from monocyte cultures demonstrated a pro-inflammatory activity of LL-37 and synoeca-MP and a pro- and anti-inflammatory effect of HHC-10 and Ca(OH)2. However, none of the agents tested reduced osteoclastogenesis in vitro. In in vivo endodontic treatment conditions, HHC-10, synoeca-MP and Ca(OH)2 significantly reduced periapical lesions, although only peptides were able to reduce inflammation in histological analysis. Therefore, HHC-10 and synoeca-MP demonstrated in vitro and in vivo potential for application in endodontic therapy. However, further researches are needed regarding the mechanism of action of HDPs and the possible therapeutic formulations for future analysis in animal models. O insucesso da terapia endod??ntica est?? baseado na persist??ncia de microrganismos principalmente no interior do sistema de canais radiculares, perpetuando as patologias perirradiculares associadas ?? tal infec????o. A necessidade de reinterven????o endod??ntica reduz o percentual de sucesso e, portanto, o surgimento de novas terapias ?? necess??rio. Dessa forma, pept??deos de defesa do hospedeiro (PDHs) possuem potencial terap??utico associado ??s suas caracter??sticas de atividade antimicrobiana de amplo espectro, capacidade imunomodulat??ria e indu????o de reparo. O presente estudo objetivou demonstrar a atividade dos PDHs HHC-10, LL-37 e synoeca-MP comparado aos agentes qu??micos comumente utilizados Ca(OH)2, NaOCl e clorexidina (CHX) em ambientes in vitro e in vivo. Para tanto, foram realizadas an??lises in vitro envolvendo: (1) ensaios antimicrobianos com determina????o de MIC/MBC/MFC, atividade antibiofilme e atividade sin??rgica (contra Candida albicans, Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus), (2) ensaio hemol??tico e determina????o do ??ndice terap??utico, (3) ensaios de imunomodula????o (a partir de mon??citos RAW 264.7) e (4) ensaios osteoclastog??nese (a partir de c??lulas da medula ??ssea de camundongos). Os ensaios in vivo foram conduzidos a partir das les??es perirradiculares induzidas e tratadas em ratos com subsequente an??lise por exames radiogr??ficos, tomogr??ficos e histol??gicos. Assim, os resultados demonstraram efetiva atividade antimicrobiana dos pept??deos HHC-10 (exceto atividade antibiofilme) e synoeca-MP al??m do NaOCl e CHX. Observou-se maiores ??ndices terap??uticos para os pept??deos (HHC-10 e synoeca-MP) com baixa ou nenhuma atividade hemol??tica. As an??lises de intera????o demonstraram combina????o sin??rgica necessitando de menor concentra????o a partir da intera????o entre synoeca-MP e CHX. A partir da cultura de mon??citos, observou-se uma atividade pr??-inflamat??ria a partir dos pept??deos LL-37 e synoeca-MP e um efeito pr??- e anti-inflamat??rio do pept??deo HHC-10 e do Ca(OH)2. No entanto, nenhum dos agentes testados reduziram a osteoclastog??nese in vitro. J?? em condi????es de tratamento endod??ntico in vivo, os PDHs HHC-10, synoeca-MP e o Ca(OH)2 reduziram significativamente les??es periapicais, apesar de somente os pept??deos serem capazes de reduzir inflama????o em an??lises histol??gicas. Portanto, os pept??deos HHC-10 e synoeca-MP demonstraram potencial in vitro e in vivo para aplica????o na terapia endod??ntica. No entanto, faz-se necess??rio maiores investiga????es sobre o mecanismo de a????o dos mesmos e poss??veis formula????es terap??uticas para futuros testes em modelos animais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Leishmaniasis is an infection caused by Leishmania gender protozoa. The treatment of the disease is generally problematic, as the drugs used on clinical practice are toxic. One of the paths in the search for new therapeutic targets is the study of endophytic microorganisms-produced substances. In this study, the Total Lyophilized Extract (TLE) of the endophytic Paenibacillus polymyxa RNC-D was used, which was isolated from the Cerrado of São Carlos, Brazil. The TLE was assessed in terms of citotoxicity, ON production and citokynes production on BALB/3T3 fibroblasts, J774A.1 macrophages, RAW 264.7 macrophages, as well as directly on promastigote and amastigote stages of Leishmania (L) amazonensis. Our results have shown that the mortality rate of 50% (EC50) of fibroblasts (BALB/3T3) was of 1,171 mg/mL and 0,956 mg/mL after 48 and 72 hours, respectively. For macrophages (J774A.1) the mortality rate of 50% took place on doses of 0,994 mg/mL and 0,945 mg/mL after 48 and 72 hours, respectively. Regarding cellular death, at the period of 24 hours, the extract induced apoptosis and necrosis from the concentration of 5mg/mL in fibroblast (BALB/3T3) and from ≈1 mg/mL in macrophage (J774A.1). The threatment with ≈1 mg/mL concentration of the ETL induced TNF-α, IFN-γ and IL-10 cytokine production at the 24 hours period. The IL-10 had its production detected up to the 48 hours period, whereas the IL-12 was detected only at this period. For the toxicity essay on L. amazonensis promastigotes, the values of EC50 obtained at the 24 and 48 hours period were of 0,624 mg/mL and 0,547 mg/mL, respectively. Regarding promastigotes death percentage, our result have shown that the 0,5 mg/mL concentration induced death of 31% at the 24 hours period and 35% at 48 hours. As for the concentration of 1mg/mL of the extract, the death percentage was of 59% and 62% at the periods of 24 and 48 hours, respectively. For the parasitary load essay, it was observed a percentage of 25% of infected cells with na average of 3 amastigotes/cell for the groups treated with 0,1; 0,5 and 1 mg/mL of the TLE at both periods. Regarding cytokine production on RAW 264.7 macrophage that were infected/treated with the extract, a significant increase of TNF-α was observed at both periods for all tested concentrations. Concerning IFN-γ cytokine, its significant production was only observed at the 48 hours period in the 1mg/mL concentration, whereas the IL-12 production was only significant in the 0,5 mg/mL at the same period. A significant decrease of IL-4 was observed in all treated groups with the TLE at the 24 hours period. The significant ON production by RAW 264.7 macrophages was observed in the groups treated with 0.5 mg/mL and 1 mg/mL of the extract on both periods of 48 and 72 hours. Due to its modulatory action of the immunological activity, it is suggested that the TLE of P. Polymyxa RNC-D is a promising target for the development of new immunotherapeutical drugs for the treatment of several diseases, including, but not limited to, leishmaniasis. A leishmaniose é uma infecção causada por protozoários do gênero Leishmania. O tratamento desta doença é usualmente problemático, uma vez que os medicamentos utilizados na prática clínica são tóxicos. Um dos caminhos na busca por novos alvos terapêuticos é o estudo de moléculas produzidas por microrganismos endofíticos. Neste estudo, utilizou-se o Extrato Total Liofilizado (ETL) do endofítico Paenibacillus polymyxa RNC-D, isolado do Cerrado de São Carlos - Brasil. O extrato foi avaliado em fibroblasto BALB/3T3, macrófago J774A.1, macrófago RAW 264.7 e direto em formas promastigota e amastigota de Leishmania (L) amazonensis. Dessa forma, foi avaliado nestas células a citotoxicidade, produção de óxido nítrico (NO) e produção de citocinas. Nossos resultados mostraram que a taxa de mortalidade de 50% (EC50) de fibroblasto (BALB/3T3) foi observada em 1,171 mg/mL e 0,956 mg/mL após 48 e 72 horas, respectivamente. Em macrófago (J774A.1) a EC50 foi de de 0,994 mg/mL e 0,945 mg/mL após 48 e 72 horas, respectivamente. Em relação à morte celular no período de 24 horas, o extrato induziu apoptose e necrose a partir da concentração de 5 mg/mL em fibroblasto (BALB/3T3) e de ≈1 mg/mL em macrófago (J774A.1). O tratamento com ≈1 mg/mL da concentração do extrato induziu a produção das citocinas TNF-α, IFN-γ e IL-10, em 24 horas. A IL-10 teve sua produção detectada até 48 horas e IL-12 foi detectada a partir deste período. Para o ensaio de toxicidade em promastigotas de L. amazonensis, os valores da EC50 obtidos nos períodos de 24 horas e de 48 horas foram de 0,624 mg/mL e de 0,547 mg/mL, respectivamente. Em relação à porcentagem de morte das promastigotas, nossos resultados mostraram que na concentração de 1 mg/mL do extrato, a porcentagem de morte no período de 24 horas foi de 59% e de 62% no período de 48 horas. Para o ensaio da carga parasitária, todos os grupos tratados (0,1; 0,5 e 1 mg/mL) do extrato apresentaram uma porcentagem de aproximadamente 25 % de células infectadas com média de 3 amastigotas/célula para ambos os períodos. Em relação à produção de citocinas em macrófagos RAW 264.7 infectados/tratados com o extrato, observou-se um aumento significativo de TNF-α, nos períodos de 24 e 48 horas, em todos os grupos tratados com o extrato. Quanto à citocina IFN-γ, só foi observada a sua produção significativa no período de 48 horas na concentração de 1 mg/mL, assim como a produção de IL-12, só foi significativa na concentração de 0,5 mg/mL no mesmo período. Observou-se uma diminuição significativa de IL-4 em todos os grupos tratados com o extrato no período de 24 horas. A produção significativa de NO por macrófago RAW 264.7 no período de 48 e 72 horas foi observada nos grupos tratados com 0,5 mg/mL e 1 mg/mL do extrato. Devido à sua ação modulatória da atividade imunológica, sugere-se que o extrato em questão seja um alvo promissor para o desenvolvimento de novos medicamentos imunoterapêuticos para o tratamento de diversas doenças, incluindo, mas não limitado a, a leishmaniose.

Submitted by MILENA BARBOSA DA CONCEIÇÃO null (milenabarbosa.uni@gmail.com) on 2018-04-02T20:02:50Z No. of bitstreams: 1 dissertação de mestrado milena.pdf: 2923724 bytes, checksum: 1fa7636807855b95d16ce9cced55c3d7 (MD5) Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-04-03T17:33:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 conceicao_mb_me_araiq_par.pdf: 1658367 bytes, checksum: de1130869340ffc41c2397214824438c (MD5) Made available in DSpace on 2018-04-03T17:33:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 conceicao_mb_me_araiq_par.pdf: 1658367 bytes, checksum: de1130869340ffc41c2397214824438c (MD5) Previous issue date: 2018-03-09 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) O peptídeo antimicrobiano Pantinina-3 (P3) possui 13 resíduos e é derivado do veneno do escorpião africano Pandinus imperator. Ele apresenta alta atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas, principalmente Enterococcus resistente à vancomicina (VRE-S13) in vitro. Entretanto, este peptídeo também possui atividade hemolítica. Neste contexto, foram desenhados e sintetizados cinco análogos de P3 a partir de substituições pontuais de resíduos específicos por um resíduo de lisina, os quais foram denominados L2K, I5K, N7K, I9K e L13K. O objetivo da criação destes análogos foi estudar a relação de estrutura e atividade do peptídeo P3, a fim de investigar o efeito da modificação de suas características biofísicas em sua atividade biológica. Para isso, os peptídeos foram sintetizados por meio da técnica de síntese em fase sólida (SPFS), purificados por cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa (CLAE-FR) e identificados por espectrometria de massas (SM). Os peptídeos purificados foram testados quanto à sua atividade biológica e foi verificado que o análogo L2K apresentou atividade somente para a bactéria Gram-negativa testada, o análogo N7K mostrou ser mais ativo que P3 tanto para Gram-positivas quanto para Gram-negativas e os outros análogos não apresentaram atividade antimicrobiana. Foi avaliada também a atividade hemolítica dos peptídeos, e foi verificado que o único análogo que apresentou atividade contra eritrócitos foi N7K. A hidrofobicidade dos peptídeos foi analisada por meio do tempo de retenção obtido por CLAE-FR e foi verificado que o peptídeo P3 se mostrou mais hidrofóbico que todos os análogos criados. Dentre os análogos, N7K foi o que apresentou maior tempo de retenção seguido de L2K que mostrou ter hidrofobicidade intermediária. Foram estudados quanto a capacidade de adotar estrutura secundária regular utilizando a técnica da espectroscopia de dicroísmo circular (DC) frente a miméticos de membrana e foi verificado que P3 e N7K foram os que mais adotaram estrutura em α-hélice na presença de miméticos de membrana tanto de bactérias quanto de eucariotos. Com o objetivo de verificar a capacidade dos peptídeos em atuarem nas membranas, foram realizados estudos utilizando a técnica da espectroscopia de fluorescência em experimentos conduzidos na ausência e na presença de miméticos de membranas e foi verificado que P3 e N7K demonstraram maior interação e capacidade de permeabilização de miméticos de membrana tanto de bactérias quanto de eucariotos. Todos os outros análogos mostraram maior interação e permeabilização de miméticos de membrana de bactérias, porém em níveis diferentes, sendo que L2K foi o mais ativo. Concluiu-se então que, por meio de substituições pontuais, foi possível alterar algumas propriedades do peptídeo P3, bem como sua atividade biológica. The antimicrobial peptide Pantinin-3 (P3) has 13 residues and is derived from the venom of the African scorpion Pandinus imperator. It has high antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, mainly vancomycin-resistant Enterococcus (VRE-S13) in vitro. However, this peptide also has hemolytic activity. In this context, five P3 analogs were designed and synthesized from point substitutions of specific residues by a lysine residue, which were named L2K, I5K, N7K, I9K and L13K. The objective of the creation of these analogues was to study the structure and activity relationship of the P3 peptide in order to investigate the effect of the modification of its biophysical characteristics on its biological activity. For this, the peptides were synthesized using the solid-phase peptide synthesis technique (SPPS), purified by high performance liquid chromatography on a reverse phase column (HPLC-RF) and identified by mass spectrometry (MS). The purified peptides were tested for their biological activity and it was found that the L2K analog showed activity only for the Gram-negative bacteria tested, the N7K analog showed to be more active than P3 for both Gram-positive and Gram-negative and the others did not present antimicrobial activity. The hemolytic activity of the peptides was also evaluated, and it was verified that the only analog that showed activity against erythrocytes was N7K. The hydrophobicity of the peptides was analyzed by the retention time obtained by HPLC-RF and it was verified that the peptide P3 proved to be more hydrophobic than all analogues created. Among the analogues, N7K showed the highest retention time followed by L2K which showed intermediate hydrophobicity. It was studied the ability to adopt regular secondary structure using the circular dichroism (CD) spectroscopy technique against membrane mimetics and it was verified that P3 and N7K were the ones that most adopted α-helix structure in the presence of membrane mimetics both bacteria and eukaryotes. In order to verify the ability of the peptides to act on the membranes, studies were carried out using the fluorescence spectroscopy technique in experiments conducted in the absence and presence of membrane mimetics, and it was verified that P3 and N7K demonstrated greater interaction and permeabilization capacity membrane mimetics of both bacteria and eukaryotes. All other analogues showed higher interaction and permeabilization of bacterial membrane mimetics, however at different levels, with L2K being the most active of these. It was then concluded that, by means of point substitutions, it was possible to alter some properties of the P3 peptide, as well as its biological activity.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2018-05-24T20:32:41Z No. of bitstreams: 2 Charles Seuchuco.pdf: 1461597 bytes, checksum: d1fe07c8c4b16541956c362cc1acb19c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Made available in DSpace on 2018-05-24T20:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Charles Seuchuco.pdf: 1461597 bytes, checksum: d1fe07c8c4b16541956c362cc1acb19c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-05 Diatraea saccharalis, known as a sugarcane borer, is a moth of the Lepidoptera order, being one of the main pests on sugarcane, responsible for damage to the sugar and alcohol industries. The fat body is the organ responsible for several functions during the larval phase of insects, mainly in charge of synthesizing molecules with metabolic actions. The success in insects’ adaptation is due to its efficient defense system, in which the fat body is able to synthesize antimicrobial peptides (AMP’s) and secrete them in the hemolymph, where they act as a defense mechanism against pathogens. AMP’s has a cationic character and present the capacity to interact with negative charge molecules of the bacteria, leading to the disintegration of their membranes. Considering the concerns regarding bacterial resistance to antibiotics and antimicrobial properties of AMP’s, such as fast-acting, varied mechanisms of action and wide range against Gram-positive and Gram-negative bacteria; it has become appropriate to carry out studies to use AMP’s as alternative or complementary antibiotic. In D. saccharalis, AMP’s with antimicrobial action have been reported in recently published papers using proteomic methodology. Thereby, this study aimed to perform the differential analysis of the proteins and peptides of the fat body in the 5th instar of larvae challenged with Escherichia coli, Bacillus subtilis and Beauveria bassiana; using the two-dimensional electrophoresis technique (2-DE), with 12.5% SDS-PAGE tricine gels, MALDI-TOF type mass spectrometry and the research in protein databases (Mascot and TagIdent). After analysis, six defense proteins of the innate immune system were found using the TagIdent identification tool: apolipophorin-3, attacin, attacin-F, Peptidoglycan recognition protein (PGRPs), putative defense protein 1 and putative defense protein 3. The AMP attacin presented a positive regulation in relation to the control gel indicating that the B. bassiana septic challenge stimulated the immune system of D. saccharalis. This study provides the first reports of proteins of the immune system produced by the adipose tissue of D. saccharalis. A Diatraea saccharalis, conhecida como broca-da-cana, é uma mariposa da ordem Lepidoptera, tratando-se de uma das principais pragas da cana-de-açúcar, responsável por prejuízos à indústria de açúcar e de álcool. O corpo gorduroso é o órgão responsável por várias funções durante a fase larval dos insetos, principalmente encarregado de sintetizar moléculas com ações metabólicas. O sucesso na adaptação dos insetos se deve ao seu eficiente sistema de defesa, no qual o tecido gorduroso é capaz de sintetizar peptídeos antimicrobianos (PAM’s) e secretá-los na hemolinfa, onde atuam como mecanismo de defesa contra patógenos. Os PAM’s têm caráter catiônico e apresentam capacidade de interagir com as moléculas de carga negativas das bactérias, levando a desintegração de suas membranas. Considerando as preocupações em relação à resistência bacteriana a antibióticos e às propriedades antimicrobianas dos PAM’s como ação rápida, mecanismos de ação variados e amplo espectro contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, têm se tornado atrativo para a realização de estudos para utilização de PAM’s como antibiótico alternativo ou complementar. Em D. saccharalis já foram relatados PAM’s com ação antimicrobiana em artigos recentemente publicados empregando metodologia proteômica. Desta forma, este trabalho teve como objetivo realizar a análise diferencial das proteínas e peptídeos do corpo gorduroso no 5° instar de larvas controles e desafiadas com Escherichia coli, Bacillus subtilis e Beauveria bassiana, utilizando eletroforese bidimensional (2-DE) com géis tricina SDS-PAGE 12,5%, espectrometria de massas do tipo MALDI-ToF e a pesquisa em bancos de dados de proteínas (Mascot e TagIdent). Após análise, foram encontradas seis proteínas de defesa do sistema imune inato utilizando a ferramenta de identificação TagIdent, sendo elas Apolipophorin-3, Atacina, Atacina-F, Proteína de reconhecimento de peptidoglicano (PGRPs), Provável proteína de defesa 1 e Provável proteína de defesa 3. O PAM Atacina apresentou regulação positiva em relação ao gel controle, indicando que o desafio séptico por B. bassiana estimulou o sistema imune da D. saccharalis. Este trabalho fornece os primeiros relatos de proteínas do sistema imune produzidas pelo corpo gorduroso de D. saccharalis.

Tese apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia Alimentar ABSTRACT: The antagonistic effect exerted by Saccharomyces cerevisiae against other microbial species during wine fermentations was recently ascribed to its capacity to secrete antimicrobial peptides (AMPs). The main goal of the present work was to purify, identify and characterize those AMPs. Firstly, the AMPs were purified by means of chromatographic techniques (size-exclusion and ion-exchange) and then characterized regarding their amino acid sequence, codifying genes and antimicrobial/biochemical properties. Analysis of the purified AMPs by mass spectrometry revealed that the natural biocide is mainly composed by two peptides (AMP1 and AMP2/3) derived from the isoenzymes of the glycolytic protein glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). The spectrum of action of the naturally-excreted AMPs, which we named saccharomycin, is wide and includes several wine-related non-Saccharomyces yeasts, such as Hanseniaspora guilliermondii, Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans and Dekkera bruxellensis, as well as bacteria such as Oenococcus oeni. The antimicrobial effect of saccharomycin is significantly higher than that of synthetic analogues (AMP1 and AMP2/3) and depends on their complementary action and relative proportion. The mode of action of the AMPs was evaluated against sensitive yeast cells. The AMPs induce cell membrane permeabilization, loss of pH homeostasis and increase/decrease of H+-influx/-efflux. They also induce cell molecular markers typical of death by apoptosis in H. guilliermondii. Our work also revealed the accumulation of these GAPDH-derived peptides on the surface of stationary-grown (48 h) cells of S. cerevisiae, which induce death of non-Saccharomyces yeasts (H. guilliermondii and L. thermotolerans) by direct cell-cell contact. Finally, S. cerevisiae strains over-expressing these AMPs prevented growth of D. bruxellensis in co-fermentations, decreasing the levels of sulphur dioxide needed to control wine spoilage. Thus, the potential of these AMPs to be used as biopreservative in wine seems promising. RESUMO: O efeito antagónico de Saccharomyces cerevisiae contra outras espécies microbianas durante fermentações vínicas foi recentemente atribuído à sua capacidade de excretar péptidos antimicrobianos (PAMs). O principal objetivo do presente estudo foi purificar, identificar e caracterizar estes PAMs. Primeiramente, os PAMs foram purificados por técnicas cromatográficas (exclusão molecular e permuta iónica) e posteriormente caracterizados quanto à sua sequência de aminoácidos, aos genes que os codificam e às suas propriedades antimicrobianas/bioquímicas. Os PAMs purificados foram, em seguida, analisados por espectrometria de massa, revelando que o biocida natural é composto maioritariamente por dois PAMs (PAM1 e PAM2/3) originários das três isoenzimas da proteína glicolítica gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. O espectro de ação dos PAMs naturais, os quais designámos por saccharomycin, é amplo e inclui várias leveduras vínicas, tais como Hanseniaspora guilliermondii, Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans e Dekkera bruxellensis, assim como a bactéria vínica Oenococcus oeni. O efeito antimicrobiano de saccharomycin é bastante mais acentuado do que o efeito dos análogos quimicamente sintetizados (PAM1 e PAM2/3) e depende da sua ação complementar, assim como da sua proporção relativa. O modo de ação dos PAMs foi analisado em leveduras sensíveis, verificando-se que estes induzem permeabilização da membrana celular, perda da homeostase do pH e aumento/decréscimo do influxo/efluxo de H+. Verificou-se igualmente, que os PAMs induzem morte por apoptose em H. guilliermondii. Descobrimos, ainda, que estes PAMs se acumulam na superfície de células estacionárias (48 h) de S. cerevisiae, as quais são capazes de induzir a morte de leveduras não-Saccharomyces (H. guilliermondii e L. thermotolerans) por contacto celular direto. Por fim, uma estirpe laboratorial de S. cerevisiae foi manipulada geneticamente de forma a sobre-expressar cada um dos PAMs, verificando-se que as estirpes manipuladas apresentaram um elevado efeito antimicrobiano contra D. bruxellensis, o que permitiu reduzir os níveis de dióxido de enxofre normalmente aplicados em vinhos. Assim, a utilização destes PAMs como um bioconservante alternativo no vinho parece promissora. N/A

Orientadora: Profa. Dra. Vani Xavier de Oliveira Junior Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, Santo André, 2018. A resistência de micro-organismos a antibióticos está se tornando um problema cada vez mais relevante, sendo o uso indiscriminado de medicamentos um dos principais catalisadores desse problema. Portanto, são necessárias alternativas para o tratamento de infecções, causadas por micro-organismos resistentes, ou que inibam seu crescimento não conferindo resistência facilmente. Peptídeos antimicrobianos (PAMs) são uma alternativa promissora, devido ao seu amplo espectro de atuação e à versatilidade de seu espaço sequencial, que faz com que eles possam ser explorados para vários fins terapêuticos. No presente trabalho, foram realizados estudos sistemáticos de substituições pontuais para que fossem avaliados pequenos peptídeos catiônicos e anfipáticos, provenientes de veneno de vespas, quanto à sua propensão antimicrobiana. Esse estudo tinha como maior finalidade propor, de forma acessível e simples, uma metodologia para análise direcionada e efetiva das principais propriedades físico-químicas, que são facilmente extraídas desse tipo de moléculas, como características relacionadas à hidrofobicidade, propensão helicoidal e carga líquida positiva, para que fossem definidos condições ótimos para o desenho de análogos com maior atividade antimicrobiana e menor toxicidade. Os peptídeos utilizados nesse trabalho foram sintetizados pelo método da fase sólida, nas estratégias t-Boc e Fmoc, purificados por HPLC e caracterizados por LC/ESI-MS. Para os estudos conformacionais, foi empregada a técnica de CD e, em alguns casos, dinâmica molecular. Os testes biológicos contaram com experimentos de inibição de bactérias, fungos, Plasmodium e células cancerígenas. Além disso, foram realizados ensaios no intuito de avaliar a toxicidade dos peptídeos contra células de mamíferos sadias. Os resultados mostraram que, dependendo da família dos peptídeos avaliados nesse trabalho, determinadas propriedades físico-químicas se destacam e podem ser exploradas a fundo, sendo relevantes não só para a atividade antimicrobiana in vitro e in vivo, como também influenciando na atividade antiplasmodial e anticâncer. A técnica obteve sua validade confirmada quando utilizada em um problema real, sendo tão efetiva quanto técnicas dispendiosas como a de high throuput screening ou geração de bibliotecas de peptídeos, que além de demoradas são custosas; na modulação das principais bactérias comensais do microbioma humano, mostrando até que podem ser encontrados PAMs; além de seletivos e específicos contra determinados gêneros ou espécies de bactérias. Além disso, foi abordado o maior obstáculo para a transição de potenciais moléculas ao mercado, a produção em larga escala. Foi utilizada a expressão recombinante por meio do fungo P. pastoris e, como prevenção à degradação dos PAMs por proteases, foi utilizada a técnica de proteína de fusão. Essa metodologia se mostrou mais eficiente do que as comumente utilizadas para expressão recombinante, como a bactéria E. coli, sendo então uma alternativa promissora para a produção de PAMs em larga escala. Esse tipo de abordagem auxilia no entendimento da contribuição efetiva de determinadas propriedades físico-químicas nas atividades biológicas de PAMs e na sua manipulação direta, para que um dia essa classe tão promissora de moléculas seja, de fato, utilizada como quimioterápicos, tanto em dispositivos quanto diretamente, abrindo novas perspectivas para o tratamento de infecções causadas por micro-organismos. Antimicrobial resistance to antibiotics is becoming serious global health problem and the indiscriminate use of the available drugs contributes to the development of resistance by microorganisms. Therefore, alternatives are needed for the treatment of infections caused by these resistant microorganisms or that inhibit their growth and do not confer resistance easily. Antimicrobial peptides (AMPs) are a promising alternative to combat antimicrobial resistance due to their broad-spectrum and the versatility of their sequence space, which makes them be exploitable for several different purposes as antimicrobials. In the present work, systematic mutagenesis studies were carried out in order to evaluate small cationic and amphipathic peptides from wasp venom as antimicrobial compounds. The aim of this study was to propose, in an accessible and simple way, a methodology for direct and effective analysis of the main physicochemical properties that are readily extracted from this type of molecules, such as characteristics related to hydrophobicity, helical propensity and positive net charge. Thus, making it possible to define optimal ranges of these determinants for the design of analogs with higher antimicrobial activity and lower toxicity. The peptides used here were synthesized by the solid phase method using t-Boc and Fmoc strategies, purified by HPLC and characterized by LC/ESI-MS. For the conformational studies, the CD technique and, in some cases, molecular dynamics were used. Biological tests relied on experiments to inhibit bacteria, fungi, Plasmodium and cancer cells. In addition, assays were made to assess peptides toxicity against healthy mammalian cells. The results showed that, depending on the family of peptides evaluated, certain physicochemical properties are highlighted and can be explored deeply, affecting not only the antimicrobial activity in vitro and in vivo of AMPs, but also influencing on the antiplasmodial and anticancer activities. The validity of this methodology was confirmed against a real problem, being as effective as expensive techniques, such as high throughput screening, in the modulation of the most relevant commensal bacteria from the human gut microbioma. Thus, showing, besides AMPs selectivity, specificity towards certain genera or species of bacteria. In addition, we addressed the most substantial obstacle to the translation of these molecules commercially, the large-scale production. Recombinant expression in P. pastoris was combined with the fusion protein technique for preventing the AMPs degradation by proteases. This methodology proved to be more efficient than those commonly used for recombinant expression, such as the E. coli, and presented itself a promising alternative for the large-scale production of PAMs. This approach helps in understanding the effective contribution of physicochemical properties as determinants in the biological activities of PAMs, and their direct manipulation might lead them to be used as chemotherapeutics, both in devices and directly, opening new perspectives for the treatment of infections caused by resistant microorganisms.

O câncer é uma doença heterogênea e novas terapias são necessárias para evadir a quimioresistência. Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são moléculas de defesa encontradas em diferentes organismos, com atividade antimicrobiana, e possível capacidade antitumoral. Embora estes PAMs possuam homologia em sua sequência e estrutura, as atividades biológicas divergem de acordo com o peptídeo e tipo celular. Neste estudo, dividiram-se os resultados em três trabalhos: no primeiro, demonstrou-se a capacidade imunomodulatória do peptídeo gomesina, que levou ao aumento das célulastronco hematopoéticas com diminuição de progenitores mielóides, ativação de macrófagos e aumento de interleucina 6 e da proteína quimiotática de monócito. No segundo trabalho, demonstrou-se a capacidade citotóxica de diferentes PAMs (gomesina, taquiplesina protegrina, polifemusina) em células leucêmicas, sendo a linhagem KG-1 a mais resistente devido à maior atividade das bombas de efluxo, que conferem resistência a drogas, maior expressão de genes autofágicos e menor expressão de genes próapoptóticos constitutivos. No terceiro trabalho avaliaram-se os diferentes mecanismos de morte celular desencadeados pelos PAMs (gomesina, taquiplesina protegrina e polifemusina) na linhagem tumoral Hela. Verificouse que todos os PAMs testados promoveram ativação de caspases, porém pouca ativação de genes associados com a morte celular foi observada. O mecanismo de morte celular dos PAMs envolve características apoptóticas com redução do potencial de membrana mitocondrial e com inchamento mitocondrial, envolvendo o íon Ca2+. Além disso, o balanço entre a ativação e inibição de proteínas pró-apoptóticas, autofágicas, de sobrevida e proliferação ajudam a definir a potencia dos peptídeos. Este trabalho elucida a importância do estudo dos PAMs contra o câncer, pois podem modular o sistema imune além de promover morte celular. Estes resultados podem num futuro servir de base para a síntese de quimioterápicos potentes contra esta doença. Cancer is a heterogeneous disease and new therapies are necessaries to evade chemoresistance. Antimicrobial peptides (AMPs) are defense molecules found in different organisms, with antimicrobial activity, and possible antitumor capacity. Although these AMPs have homology in their sequence and structure, the biological activities are different according to the concentration and cell type. In this study, the results were divided into three sections: the first one demonstrated the immunomodulatory capacity of the gomesin peptide, which led to the increase of hematopoietic stem cells, decreased of myeloid progenitors, activation of macrophages, increase of interleukin 6 and monocyte chemotactic protein. In the second study, the cytotoxic capacity of different AMPs (gomesin, tachyplesin protegrin and polyphemusin) was demonstrated in leukemic cells; KG-1 lineage was the most resistant cell line due to the greater activity of multi drug resistance pumps, higher expression of autophagic genes and lower pro-apoptotic constitutive gene expression. In the third section, we evaluated the different mechanisms of cell death triggered by the AMPs (gomesin, tachyplesin protegrin and polyphemusin) in Hela lineage. Caspases activation occurred by all AMPs tested, but little activation of genes, associated with cell death, was observed. The mechanism of cell death of AMPs involves apoptotic characteristics, with reduction of the mitochondrial membrane potential and mitochondrial swelling with involvement of Ca2+ ion. Additionally, the balance between the activation and inhibition of pro-apoptotic, autophagic, survival and proliferation proteins helped to define the peptide potency. This work elucidates the importance of AMPs studies against cancer because they can modulate the immune system, besides promote cell death. These results can be used as base for development a new potent drug against this disease. Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2017)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Microrganismos patogênicos são responsáveis pelo desenvolvimento de diversas infecções, e em ambientes hospitalares, levam muitos pacientes ao óbito. Modificar esse quadro é necessário, todavia as bactérias apresentam distintos mecanismos de resistência após mutações em seu DNA. Além disso, o uso indiscriminado de antibióticos gera continuamente a seleção natural e propagação de cepas mais resistentes fazendo com que os antibióticos percam sua eficácia com o passar dos anos. Diante desse panorama, a elaboração de um nanocarreador contendo peptídeos antimicrobianos (PAMs ou AMPs do inglês Antimicrobial Peptides) tornase uma interessante alternativa contra bactérias patogênicas. O objetivo deste trabalho foi sintetizar nanoesferas de alginato de sódio pelo método de Gelificação Ionotrópica para a entrega de AMPs Lrot3 às células bacterianas de Escherichia Coli 25922 e Staphylococcus epidermidis 12228. A atividade antimicrobiana dos peptídeos livres e nanoestruturados (128, 64, 32, 16, 8 e 4µg/mL), foi avaliada por meio da concentração mínima inibitória (MIC), e o potencial citotóxico investigado em células HEK 293 humanas utilizando o ensaio de MTT (Tetrazólio de azul de tiazolilo). Os dados foram avaliados por ANOVA e as médias comparada pelo teste de Tukey. Para a bactéria E. coli 25922, o peptídeo livre na concentração de 64 µg/mL destacou-se por ser a única concentração com atividade antimicrobiana significativa (P˂0,01), apresentando ação similar ao do cloranfenicol (128 µg/mL e 64 µg/mL). As nanopartículas contendo AMPs, por sua vez, mostraram-se eficazes em todas as concentrações (P˂0,01). Diferentemente se deu no S. epidermidis 12228, onde observou-se maior resistência da bactéria a todos tratamentos. Os resultados do MTT sugerem que as nanopartículas de alginato não apresentam citotoxicidade in vitro, motivando a continuidade deste estudo. Concluindo, os AMPs nanoestruturados tem potencial para serem utilizados no combate a infecções ocasionadas por E. coli. Pathogenic microorganisms are responsible for the development of various infections, particularly in hospital environment, leading to death in many patients. It is therefore necessary to change this scenario, it is difficult, however, because the bacteria have very distinct resistance mechanisms after mutations in their DNA. Furthermore, the indiscriminate use of antibiotics continuously generates the selection and propagation of more resistant strains, causing loss of effectiveness of antibiotics over the years. In this case, the development of a nanocarrier containing Antimicrobial Peptides (AMPs) becomes an interesting alternative against pathogenic bacteria. This paper aims to synthesize the delivery of AMPs to bacterial cells of Escherichia coli 25922 and Staphylococcus epidermidis 12228 through the use of nanospheres of sodium alginate by ionotropic gelation method. Alginate stands out for being a polyanionic, biodegradable and biocompatible polymer, which show interaction with Lrot3 cationic AMP. The antimicrobial activity of free and nanostructured peptides (128, 64, 32, 16, 8 e 4 µg/mL) was evaluated by the minimum inhibitory concentration (MIC) and the cytotoxic potential investigated in human HEK 293 cells using the MTT Assay (Tetrazolium thiazolyl blue). The data were evaluated by ANOVA and the means compared by Tukey test. For Gramnegative E. coli 25922 bacteria, the free peptide at concentration of 64 µg/mL stood out for being the only concentration with significant antimicrobial activity (P˂0,01), showing similar action to the chloramphenicol, at concentrations of 128 µg/mL and 64 µg/mL, respectively. NPs, in turn, showed inhibitory activity at all concentrations (P˂0,01). Unlike occurred in S. epidermidis 12228, which was observed more bacterial resistance to all treatments. The MTT data suggest that alginate nanoparticles do not exhibit in vitro cytotoxicity, encouraging the continuation of this study. In conclusion, the nanostructured AMPs has the potential to be used to fight infections caused by E. coli.

Peptídeos antimicrobianos são um grupo diverso de moléculas bioativas produzidas naturalmente por uma variedade de organismos procariotos e eucariotos, e que tem atividade antimicrobiana. Tendo em vista que o Brasil representa o país de maior incidência de leishmaniose no continente americano e a inexistência de peptídeos bacterianos com atividade neste parasito, o objetivo desde trabalho foi a prospecção de peptídeos produzidos por bactérias com ênfase na atividade anti-Leishmania. Foram utilizadas 466 amostras bacterianas para a obtenção de extratos brutos extracelulares, investigados quanto a atividade antimicrobiana total, utilizando como células-alvo culturas de bactérias (Grampositivas e negativas), leveduras (Candida sp) e Leishmania sp. Esta avaliação da atividade antimicrobiana total permitiu definir as amostras produtoras de substâncias bioativas, bem como a caracterização do espectro de ação da substância antimicrobiana. E somente os extratos que tiveram atividade anti- Leishmania foram submetidos a precipitação protéica para avaliação da produção de peptídeos antimicrobianos. Quanto à caracterização da amostra produtora, foram realizados testes morfo-tintoriais, genéticos e metabólicos para garantia da pureza da cultura e determinação do melhor momento fisiológico de produção da substância antimicrobiana. Em relação ao espectro de ação, 222 extratos tiveram atividade antagônica ao crescimento bacteriano; 05 extratos tiveram atividade antagônica à Candida sp.; e 20 extratos tiveram atividade antagônica ao crescimento de Leishmania sp., totalizando 51 % de amostras positivas para produção de substâncias antimicrobianas. Quanto à atividade anti-Leishmania, os valores médios de inibição de extratos a 20 mg/mL em formas promastigotas do parasito pelo método do MTT foi de 33 % em L. braziliensis e L. chagasi, 30,7 % em L. major e 29 % em L. amazonensis. A redução da viabilidade de formas amastigotas também foi observada para o extrato bruto a 40 mg/mL de Staphylococcus edpidermidis (CGP360), com valor de 60 %. E esse mesmo extrato não apresentou toxicidade para macrófagos peritoneais, resultado importante para novas drogas de uso sistêmico. Quanto à caracterização da amostra produtora, observou-se que a produção da substância antagonista com maior atividade anti- Leishmania ocorreu em extratos advindos de culturas crescidas em meios TSB e BHI e provenientes da fase estacionária de crescimento. Estudos adicionais devem ser realizados para uma melhor compreensão da interação dos extratos bacterianos em espécies de Leishmania, mas os resultados descritos neste trabalho são promissores e inéditos na literatura científica. Antimicrobial peptides are a diverse group of bioactive molecules naturally produced by a variety of prokaryotic and eukaryotic organisms with antimicrobial activity. Brazil represents the highest incidence country of leishmaniasis in the American continent, so the objective of this work was prospect bacteria peptides with anti-Leishmania activity. A total of 466 bacterial samples were used to produce extracellular crude extracts to evaluate antimicrobial activity against bacterial cells (Gram-positive and negative bacteria), yeast (Candida sp) and Leishmania sp. and characterize antimicrobial spectrum of action. Only Leishmania activity extracts were submitted to protein precipitation and tested to peptides production. The producing sample were characterized by genetic, morphologic and metabolic tests, and the best physiological moment of peptides production was determinate. The results showed that 222 extracts had bacterial activity, 05 extracts had Candida activity, and 20 extracts had Leishmania activity, summarizing 51 % of positive samples to antimicrobial substances production. For promastigote Leishmania activity, 20 mg/ mL extracts showed inhibition values by MTT method of 33 % in L. braziliensis and L. chagasi, 30.7 % in L. major and 29 % in L. amazonensis. The amastigote forms viability was observed for 40 mg/mL crude extract of Staphylococcus edpidermidis (CGP360), with a reduction value of 60 %. And this same extract did not have toxicity to peritoneal macrophages, an important result for new drugs of systemic use. Concerning the characterization of the producing sample, it was observed that the production of the antagonistic substance with the highest anti-Leishmania activity occurred in TSB and BHI media extracts coming from stationary phase. Additional studies should be performed to better understand the interaction of bacterial extracts in Leishmania species, but the results described in this paper are promising and unpublished in the scientific literature.

Antimicrobial peptides (AMPs) have been considered as a potential novel class of antimicrobial compounds. In order to generate new potent and non-toxic antimicrobial agents, rational design strategies may be employed. In this view, we used a computational method to design three synthetic AMPs ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 and PaDBS1R1). By determining the minimum inhibitory concentration, we found that all the peptides were active against Gram-negative and -positive bacteria. Only [I5, R8] MP was found to display antifungal activity. The determination of the peptide concentration producing 50% of cell lysis revealed low or no hemolytic activity, with no cytotoxicity towards human embryonic kidney cells HEK-293. During time-kill assays more rapid bactericidal effects were observed for PaDBS1R1 and [I5, R8] MP against E. coli compared to S. aureus. For the peptide EcDBS1R6, identical killing curves were obtained for both bacterial strains. Membrane permeabilization and depolarization studies combined with field emission gun scanning electron microscopy (SEM-FEG) revealed that a membranolytic mechanism occurs for these peptides. When analyzed by circular dichroism and nuclear magnetic resonance microscopy or by molecular dynamics simulations during interaction with a membrane model, peptides were shown to adopt an amphipathic alpha-helical conformation. In conclusion, our results indicate that the structural and functional evaluation of rationally designed synthetic AMPs represents a promising strategy for the development of potent novel antimicrobial agents., Les peptides antimicrobiens sont considérés comme une nouvelle classe prometteuse d'agents anti-infectieux. Afin de développer de nouveaux agents efficaces et non toxiques, des stratégies de conception rationnelle peuvent être utilisées. Dans cette perspective, nous avons utilisé une approche computationnelle pour concevoir trois peptides synthétiques ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 et PaDBS1R1). En déterminant la concentration minimale inhibitrice, nous avons montré que tous les peptides sont actifs contre les bactéries Gram-négatif et -positif. Seul [I5, R8] MP a montré une activité antifongique. La mesure de la concentration de peptide provoquant 50 % de mortalité cellulaire a permis de montrer que les peptides étaient faiblement ou non hémolytiques, sans toxicité vis-à-vis des cellules embryonnaires rénales humaines HEK-293. La cinétique bactéricide a révélé que PaDBS1R1 et [I5, R8] MP tuent rapidement E. coli en comparaison à S. aureus et que EcDBS1R6 élimine rapidement les deux souches. Des études de perméabilisation et de dépolarisation combinées à de la microscopie électronique à haute résolution (FEG-SEM) ont montré un mécanisme membranolytique des peptides. L'analyse de la structure des peptides par spectroscopie de dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire, ainsi que par modélisation moléculaire lors de leur interaction avec une membrane modèle, révèle une conformation en hélice alpha amphipatique. En conclusion, notre étude indique que l'évaluation structurale et fonctionnelle de peptides antimicrobiens synthétiques conçus de manière rationnelle représente une stratégie prometteuse pour le développement de nouveaux agents antimicrobiens.

Defensinas são peptídeos antimicrobianos (AMPs) que apresentam atividade contra diversos microrganismos patogênicos, em especial fungos. Embora não totalmente elucidados, há diversos mecanismos de ação propostos para as defensinas, que incluem permeabilização seletiva ou ruptura da membrana plasmática de microorganismos, ação direta em alvos intracelulares, ativação de cascatas de sinalização e aumento da produção de espécies reativas de oxigênio. Desde a sua descoberta e, tendo em vista sua ampla atividade biológica, o uso de defensinas no melhoramento de plantas cultivadas, bem como na produção de novos medicamentos tem sido proposto. Estudos de atividade biológica e possível aplicação biotecnológica das defensinas demandam uma grande quantidade dessas proteínas. Entretanto, o processo de extração da mesma é laborioso, dispendioso e, de acordo com a população ou disponibilidades da espécie vegetal escolhida, não sustentável ecologicamente. Portanto, a utilização de sistemas heterólogos de expressão é uma importante ferramenta para obtenção de defensinas recombinantes em escala industrial. Nesse estudo, um gene de defensina “DeHys”, isolado da Euphorbia hyssopifolia, foi inserido no plasmídeo pET102/D-TOPO e células da linhagem BL21(DE3) de Escherichia coli foram transformada com essa construção. Foi produzida a defensina recombinante Dehys com tamanho aproximado de 24 kDa. Sua identidade foi confirmada por western blot e pela análise do padrão de digestão com proteases. Defensins are antimicrobial peptides (AMPs) , which present activity against a variety of pathogenic microorganism, especially funghi. Although not completely elucidated, there are a variety of proposed mechanisms of action for defensins, which includes selective microorganisms plasmatic membrane permeabilization or rupture, straight action agains intracellular targets, activation of signaling cascades and the burst of reactive oxygen species. Since it’s discovery and due to it’s wide biological activities, it’s use in crop enhancing, as well as its use in the development of new drugs have been proposed. Defensin’s biological activity and biotecnological application studies demand a reasonable amount of purified protein. However, the extraction processes is laborious, expensive, time consuming and depending on the population or the chosen plant species supply, not ecologically sustainable. So, the use of heterologous expression sytems is an importante tool to obtain purified proteins in industrial scale. In this study, a defensing gene (Dehys) isolated from Euphorbia hyssopifolia was inserted in a p pET102/D-TOPO vector and trasnformed into BL21(DE3) Escherichia coli strains. A recombinat Dehys defensin of approximately 24 kDa was obtained. It’s identity was double-checked using by Western blot and protease digestion pattern analyses.

Submitted by Rafaela Magalhães Tavares null (rafaelarmt@yahoo.com.br) on 2016-04-19T11:40:30Z No. of bitstreams: 1 RAFAELA MAGALHAES TAVARES - DISSERTAÇÃO.pdf: 2642568 bytes, checksum: d735adb9c5a571ebaf0a5f7274658a8b (MD5) Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-04-26T12:34:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tavares_rm_me_sjrp.pdf: 2642568 bytes, checksum: d735adb9c5a571ebaf0a5f7274658a8b (MD5) Made available in DSpace on 2016-04-26T12:34:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tavares_rm_me_sjrp.pdf: 2642568 bytes, checksum: d735adb9c5a571ebaf0a5f7274658a8b (MD5) Previous issue date: 2016-03-01 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Nos últimos anos, o interesse por estudar peptídeos com atividade antimicrobiana e anticâncer tem aumentado consideravelmente. Neste trabalho, direcionamos nossos estudos para os peptídeos antimicrobianos da classe dos matoparanos extraídos do veneno da vespa social Polybia paulista: o Polybia-MP III (MP-III), Polybia-MP I (MP-I) e seu sintético análogo, o Asn2-Polybia-MP I (NMP-I). Com o objetivo de estudar a interação desses peptídeos com um modelo de membrana composta por lipídeos do tipo POPC (Palmitoil-Oleil-Fosfatidil-Colina) em solução aquosa, realizamos dois tipos de simulações de Dinâmica Molecular (DM). Primeiramente, foram realizadas simulações no equilíbrio com a finalidade de amostrar o comportamento geral do sistema. Em seguida, para investigarmos especificamente o processo de adsorção do peptídeo à bicamada, realizamos simulações de DM com a utilização do método Adaptive Biasing Force (ABF), o que nos permitiu calcular o perfil de energia livre desse processo. Dentre os três peptídeos estudados, o que mais se destacou com relação a sua interação com o modelo de membrana, na simulação no equilíbrio, foi o peptídeo MP-I, por ser o único a se adsorver na bicamada com 200ns de simulação. Com a utilização do método ABF, verificamos que a posição mais estável para cada peptídeo é a posição na qual estes estão paralelos à face da bicamada, com a face hidrofóbica de cada peptídeo voltada para o interior da membrana, e a face hidrofílica voltada para o meio aquoso. Além disso, os resíduos hidrofílicos estão em contato com o grupo polar dos fosfolipídeos e com a água, e o resíduo de triptofano encontra-se posicionado na interface hidrofóbica/hidrofílica. Os resultados obtidos na simulação no equilíbrio para o peptídeo MP-I, que foi o único a se adsorver na bicamada, estão de acordo com os resultados obtidos pelo método ABF, e ambos concordam com resultados experimentais da literatura. In recent years, interest in studying peptides with antimicrobial and anti-cancer activity has increased considerably. In this study, we focus our studies on antimicrobial peptides of the mastoparans class extracted from the venom of the social wasp Polybia paulista: the Polybia-MP III (MP III), Polybia-MP I (MP-I) and its synthetic analogue, the Asn2-Polybia-MP I (NMP-I). In order to study the interaction of these peptides with a model of membrane composed of POPC (Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidyl-Choline) lipids type in aqueous solution, we conducted two types of molecular dynamics simulations (MD). At first, a balance system simulation was performed in order to get a sampling of the general behavior of the system. Then, to investigate the adsorption of the peptide to the bilayer, MD simulations using Adaptive Biasing Force (ABF) method was performed, which allowed us to calculate the free energy profile of this process. Among the three studied peptides, the MP-I peptide was the one that stood out related to its interaction with the membrane model, in the simulation on balance, for being the one to adsorb the bilayer with simulation of 200ns. Using the ABF method, we verified that the most stable position for each peptide is the position in which they are parallel to the surface of the bilayer with the hydrophobic side of each peptide facing into the membrane, and the hydrophilic side facing the aqueous solution. In addition, the hydrophilic residues are in contact with the polar group of the phospholipid and water, and the tryptophan residue is positioned on the hydrophobic/hydrophilic interface. The results of the simulation in balance for the MP-I peptide, which was the only adsorbed in the bilayer, are in agreement with the results obtained by the method ABF, and both agree with experimental results in the literature.

Orientadora: Prof. Dra. Fernanda Dias da Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. A microplusina e um peptideo antimicrobiano, quelante de Cu2+ e Fe2+, isolado do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Estudos com macrofagos murinos, derivados de camundongos C57BL/6, demonstraram que a microplusina induziu a producao de TNF- ¿¿ e IL-6, independente da adicao de mediadores do sistema imune como o LPS e IFN-¿Á e potencializou a atividade dos macrofagos estimulados com IFN-¿Á, aumentando a sintese de NO e TNF-¿¿, o que sugere uma possivel atividade pro-inflamatoria da microplusina. Porem, estudos adicionais eram necessarios a fim de se elucidar sua atividade imunomoduladora. Sendo assim, este projeto teve como objetivo investigar a capacidade da microplusina induzir respostas anti-inflamatorias, atraves da sintese da enzima arginase I, ou pro-inflamatorias, atraves da sintese de oxido nitrico (NO), em macrofagos J774, derivados de camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que a microplusina recombinante (25¿Êg/mL) induziu a producao de arginase I, com 6 horas de estimulo, com igual eficacia ao controle positivo estimulado pelo extrato de Bordetella parapertussis (30¿Êg/mL), porem nao foi capaz de induzir a sintese de NO, independente da dose do peptideo (5, 25 e 50 ¿Êg/mL), do tempo de estimulo da cultura (24h ou 72h) ou mesmo da adicao de IFN-¿Á (500 pg/mL), o que indica um efeito anti-inflamatorio da microplusina sobre essas celulas. Essa divergencia de resultado entre as duas linhagens pode ser devido a um perfil de respostas imune distinto entre as mesmas. Macrofagos derivados de camundongos BALB/c sao menos sensiveis ao estimulo com IFN-¿Á do que macrofagos derivados de C57BL/6, consequentemente produzindo menos NO. Por outro lado, a linhagem J774 tambem tende a produzir respostas anti-inflamatorias, como por exemplo, a arginase I, em resposta ao LPS. Os dados obtidos mostram que o efeito imunomodulador da microplusina pode variar de uma linhagem celular para outra, sendo necessarios mais estudos a fim de elucidar melhor seu potencial imunomodulador, para que futuramente possa ser estudada em modelos de infeccao. The microplusin is an antimicrobial peptide, chelating of Cu2+ and Fe2+, isolated from the wood tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Studies with murine macrophages, extracted from C57BL/6 mouse, demonstrated that the microplusin induced the production of TNF-á and IL-6 by these cells, regardless of the addition of mediators of the immune system such as the LPS and IFN-ã, and it also enhanced the macrophages activity stimulated by IFN-ã, increasing the synthesis of NO and TNF-á, suggesting a potential post inflammatory microplusin activity. However, further studies were necessary to elucidate its immunomodulatory effect. Therefore, this project aimed to investigate the ability of microplusin to induce anti-inflammatory responses through the production of the arginase I enzyme, or proinflammatories, through the production of nitric oxide (NO) in the J774 macrophages lineage, derived from BALB/c mouse strain. The results show that recombinant microplusin (25ìg/ml) induced the production of arginase I, within 6 hours of stimulation, having equal efficacy as the positive control stimulated by the extract Bordetella parapertussis (30ìg/ml), but it was not able to induce the production of NO, independently of the peptide dosage (5, 25 e 50 ìg/mL), culture stimulus time (24h or 72h), or even adding IFN-ã (500 pg/mL), indicating a microplusin anti-inflammatory effect on these cells. This divergence of results between these two lineages might be due a distinct immune response profile among themselves. Macrophages derived from BALB/c mouse strain are less sensitive to IFN-ã stimulation than macrophages derived from C57BL/6 mouse strain, thus producing less NO. Moreover, the J774 strain also tends to produce anti-inflammatory responses, such as arginase I in response to LPS. The data show that the immunomodulating effect of microplusin may vary from one cell line to another, requiring further studies to better elucidate immunomodulating potential, so that hereafter, it can be studied in infection models.

Orientador: Prof. Dr. Vani Xavier de Oliveira Junior Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2016. Apos a descoberta da penicilina por Alexander Fleming - em 1940, muitos outros compostos antimicrobianos foram relatados, oriundos de uma ampla variedade de invertebrados, plantas e especies de animais - os antimicrobianos, como: tirocidina, gramidicina, bombinina, melitina, surgindo assim a gera antibioticah. Em seguida, no intuito de obter candidatos para a geracao de novas drogas, particularmente no combate aos virus, fungos e bacterias, o foco na obtencao de peptideos antimicrobianos tambem passou a serem bacterias, fungos, insetos, aracnideos, crustaceos, anfibios, peixes e plantas. Nesse contexto, um peptideo antimicrobiano, denominado IsCT foi isolado em 2001, em Isalo-Madagascar, durante a analise do veneno do escorpiao Opisthacanthus madagascariensis, o qual apresentou atividade hemolitica e antimicrobiana. No intuito de obter-se melhores resultados biologicos contra os agentes patogenicos e uma baixa toxicidade, esse trabalho propoe o desenho de novos analogos do IsCT, com a substituicao de alguns residuos de aminoacidos da sua sequencia, levando-se em consideracao o balanco hidrofobico, carga e sua anfipaticidade. Todos os peptideos foram sintetizados em fase solida, pela estrategia Fmoc, purificados em Cromatografia Liquida de Alta Eficiencia (HPLC) e caracterizados por Espectrometria de Massas (LC/ESI-MS); alem disso, foram realizados estudos conformacionais por Dicroismo Circular (CD).Os ensaios biologicos foram realizados em bacteria gram-negativa Escherichia coli (SBS 363), bacteria gram-positiva, Micrococcus luteus (A270) e a levedura Candida albicans (MDM8). Alem disso, foram realizados ensaios hemoliticos e de degradacao enzimatica. Os resultados demonstraram que o analogo 6foi duas vezes mais ativo que o IsCT nativo, nos tres micro-organismos testados, enquanto que os analogos 1, 5 e 8 mostraram-se menos ativos. Em contrapartida, os analogos 2, 3, 6, 7 e 9 apresentaram um aumento na atividade hemolitica. Todos os analogos apresentaram uma rapida cinetica de degradacao, contudo verifica-se que as substituicoes na posicao 8 (analogo 3 e 4) propiciaram analogos um pouco mais resistentes as proteases. Nos Estudos de CD observa-se que a maioria dos analogos apresenta uma propensao a ¿¿-helice em meios com 50% de TFE e 10 ¿ÊM de SDS, como relatado para o IsCT nativo. De forma geral, com os resultados obtidos dos dez peptideos sintetizados neste trabalho foi possivel obter dois peptideos - [Lys]3-IsCT e [Ala]1[Phe]5[Lys]8-IsCT - os quais mostraram uma reducao do 50% na inibicao dos micro-organismos testados, uma menor atividade hemolitica, em comparacao com o IsCT (peptideo nativo), alem de serem mais resistentes a degradacao proteolitica, indicando que as alteracoes pontuais no IsCT afetam significativamente a sua atividade biologica, hemolitica e a sua estruturacao, tornando-os possiveis candidatos a novas drogas. After the discovery of penicillin by Alexander Fleming in 1940, many other antimicrobial compounds (as tyrocidine, gramicidin, bombin and melittin) were described from a wide variety of plants, invertebrates and other animal species, providing the Antibiotic Era. Then, in order to obtain candidates for the generation of new drugs, particularly in the fight against viruses, fungi and bacteria, focus on obtaining antimicrobial peptides also came to be bacteria, fungi, insects, arachnids, crustaceans, amphibians, fishes and plants. In this sense, an antimicrobial peptide called IsCT was isolated in 2001 in Isalo Madagascar, while analyzing the venom of the scorpion Opisthacanthus madagascariensis that showed hemolytic and antimicrobial activity. In the attempt to obtain better biological outcomes against pathogens and a low toxicity, this study proposes the design of new IsCT analogues, with the replacement of some amino acids of its original sequence, considering its hydrophobic balance, charge and amphipathicity. All peptides were synthesized on solid phase, by Fmoc strategy, purified by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterized by mass spectrometry (LC / ESI-MS); furthermore, were performed conformational studies by circular dichroism (CD). The biological tests were carried out on gram-negative bacteria Escherichia coli (SBS 363), gram-positive bacteria Micrococcus luteus (A270) and Candida albicans (MDM8). In addition, enzymatic degradation and hemolytic assays were performed. The results showed that the analog 6 was twice more active than native IsCT in three micro-organisms tested, whereas the analogs 1, 5 and 8 were less active. In contrast, the analogous 2, 3, 6, 7 and 9 exhibited an increase in hemolytic activity. All analogs exhibited rapid degradation kinetics, however, it is seen that substitutions at positions 8 (analogous 3 and 4) analogs provided a little more resistant to proteases. In the CD studies, was observed that most analogs presents a propensity for á-helix in solutions with 50% TFE and 10 ìM of SDS, as has been reported for the native IsCT. In general, the results obtained from the ten peptides synthesized in this work it was possible to obtain two peptides to [Lys]3-IsCT and [Ala]1[Phe]5[Lys]8-IsCT which showed a reduction of 50% in inhibition of tested microorganisms, a lower hemolytic activity compared with the IsCT (native peptide) plus were more resistant to protease degradation, indicating that specific changes in IsCT significantly affect its biological activity, hemolytic and their structure, making the possible candidates for new drugs.

Housefly, Musca domestica, has a complicated immune system. However, its underlying operating mechanism remains elusive. Candida albicans is a major pathogen affecting humans by causing deep infection fungous disease, but it is non-symbiotic in houseflies. To investigate the C. albicans infection process in housefly, the changes in morphological and histological and expression patterns of antimicrobial peptide were monitored to indicate the insect's response to fungal infection. The results showed that scattered brown spots were comprising melanized encapsulation and encapsulated fungal cells were initially observed at the inner side of larvae's body wall 3 h post-infection (PI). Between 6 and 36 h PI, the whole body of larvae was densely covered with the brown spots, which then gradually disappeared. The majority had disappeared at 48 h PI. Some fungi colonized in the gaps between the body wall and the muscle layer, as well as among muscle fibers of the muscle layer at 12 h PI and hyphal was observed at 18 h PI. These fungi colonized distribution changed from a continuous line to scattered spots at 24 h PI and virtually disappeared at 48 h. The results of quantitative PCR analysis revealed that in coordination with the variation during the infection, the expression levels of four antimicrobial peptides were up-regulated. In conclusion, C. albicans infection in M. domestica larvae involved the following stages: injection, infection, immune response and elimination of the pathogen. The rapid response of antimicrobial peptides, melanized encapsulation and agglutination played a vital role against the pathogenic invasion.

Data de aprova??o ausente. Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2016-12-21T16:01:47Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) isabela_pereira_gomes.pdf: 4600043 bytes, checksum: 3419d89b2ca19457442da4e144781e1b (MD5) Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2017-01-21T11:24:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 9 bytes, checksum: 42dd12a06de379d3ffa39b67dc9c7aff (MD5) isabela_pereira_gomes.pdf: 4600043 bytes, checksum: 3419d89b2ca19457442da4e144781e1b (MD5) Made available in DSpace on 2017-01-21T11:24:06Z (GMT). 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Para prote??o contra os micro-organismos presentes em seu habitat, a pele de anuros apresenta um verdadeiro arsenal qu?mico, constitu?do, em sua maioria, de diferentes classes de pept?deos. Dentre esses, os antimicrobianos s?o considerados os mais avan?ados participantes do sistema imunol?gico. V?rios estudos sugerem que os pept?deos antimicrobianos podem atuar por diferentes mecanismo como miceliza??o, forma??o de poros na superf?cie da membrana ou, ainda, pelo ataque a algum alvo intracelular. Embora a maioria dos modelos existentes proponham que pept?deos antimicrobianos exercem suas atividades biol?gicas por meio da intera??o com a membrana bacteriana, o mecanismo de a??o dessas mol?culas ainda n?o ? completamente compreendido. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo obter informa??es estruturais, conformacionais e de intera??o em ambientes que mimetizam membranas biol?gicas, do pept?deo Hylaseptina P1 (HSP-1), composto por 14 res?duos de amino?cidos e isolado do anuro da esp?cie Hyla punctata visando o entendimento do seu mecanismo de a??o. Neste trabalho, o pept?deo HSP-1 foi sintetizado manualmente atrav?s da s?ntese de pept?deos em fase s?lida via estrat?gia Fmoc. As prefer?ncias conformacionais do pept?deo em meios micelares de dodecilsulfato de s?dio (SDS), dodecilfosfocolina (DPC) e ves?culas fosfolip?dicas de 1-palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (PC) e 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol (PG) foram avaliadas por Dicro?smo Circular. Observou-se que em meio aquoso HSP-1 adota estrutura desenovelada, enquanto que, em meios micelares e ves?culas fosfolip?dicas, apresentou conforma??o ?-h?lice. A estrutura tridimensional foi estudada na presen?a de micelas de SDS e DPC por Espectroscopia de Resson?ncia Magn?tica Nuclear em solu??o, revelando que, em micelas de SDS o pept?deo HSP-1 exibe conforma??o helicoidal mais prolongada do que em micelas de DPC, no qual foi poss?vel verificar pequena dobra da h?lice na regi?o N-terminal da cadeia pept?dica, sugerindo maior inser??o do pept?deo em micelas zwiteri?nicas. O efeito da adi??o de pept?deo no tamanho e na carga superficial de ves?culas fosfolip?dicas de PC e PC:PG (3:1) foi investigado por medidas de espalhamento de luz din?mica e Potencial Zeta. Verificou-se que a adi??o de HSP-1 resulta no aumento do di?metro hidrodin?mico (?Dh ? 20 nm) e aumento do potencial Zeta (?? ? 15 mV) de ves?culas unilamelares (LUV?s) de PC:PG, indicando intera??o eletrost?tica com a superf?cie das ves?culas. Quando ves?culas de PC foram tituladas com HSP-1, foi observada maior altera??o no di?metro hidrodin?mico das LUVs (?Dh ? 22 nm), enquanto que n?o se observaram altera??es significativas nos valores de potencial Zeta (?? ? 0 mV), sendo indicativo de uma maior inser??o do pept?deo em membranas zwiteri?nicas. Conforme observado nos resultados de Calorimetria de Titula??o Isot?rmica, a intera??o com ves?culas zwiteri?nicas foi da ordem de 102 maior do que o valor encontrado para intera??o com ves?culas negativas. Contudo, os dados termodin?micos revelaram a predomin?ncia de intera??es eletrost?ticas de HSP-1 com ves?culas de PC:PG e hidrof?bicas com ves?culas de PG. Finalmente, a capacidade de forma??o de poros de HSP-1 foi examinada por meio de medidas de extravasamento de carboxifluoresce?na (CF) em ves?culas de PC e PC:PG. Em PC-LUVs observou-se uma maior intensidade de fluoresc?ncia em compara??o com PC:PG-LUVs, sugerindo uma maior atividade l?tica do pept?deo em ves?culas zwiteri?nicas. A porcentagem m?xima de CF liberada foi superior em LUVs-PC (65%) quando comparado a LUVs de PC:PG (50%), confirmando que HSP-1 tem maior capacidade de permeabiliza??o em meio zwiteri?nico. Os dados de extravasamento demostraram tamb?m menor cin?tica de libera??o de CF em PC-LUVs, condizente com um mecanismo no qual h? maior inser??o do pept?deo na interface da bicamada lip?dica, e maior cin?tica de libera??o de CF em PC:PG-LUVs, de acordo com um mecanismo tipo carpete, o qual envolve apenas intera??o superficial do pept?deo com a membrana. Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2016. The resistance of microorganisms to antibiotics have reached high levels in recent years, exacerbating public health and economic problems. The impact of bacterial resistance on the global society has mobilized the research community for the development and new drugs discovery. In this context, antimicrobial peptides appear as an alternative antibiotics class, which are effector molecules of the innate immune system in almost every living beings. In order to protect against microorganisms present in their habitat the skin of frogs presents a real chemical arsenal consisting mostly of different peptides classes, which are considered the most advanced participants of the immune system. Several studies suggest that antimicrobial peptides may act by different models such as micellization, pore formation in membrane surface or also intracellular target attack. Although most of models propose that antimicrobial peptides exert their biological activities by interacting with the bacterial membrane, the mechanism of action is not still fully understood. In order to study the action mechanism of antimicrobial peptide Hylaseptina P1 (HSP-1), composed of 14 amino acid residues and isolated from Hyla punctate species, this work presents conformational and thermodynamic analysis of peptide-membrane interaction in biomimetic environments. In this work, the HSP-1 peptide was synthesized manually by solid phase peptide synthesis using Fmoc strategy. The conformational preferences of peptide were evaluated by Circular dichroism in sodium dodecylsulfate (SDS) and dodecilfosfocolina (DPC) micellar media or 1-palmitoyl-2-oleilfosfatidilcolina (PC) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol (PG) phospholipid vesicles. A random conformation was observed to HSP-1 in aqueous medium while in micellar or phospholipid vesicles media HSP-1 showed a predominant ?-helix conformation. The three dimensional structure were obtained by solution Nuclear Magnetic Resonance in the presence of SDS and DPC micelles, revealing that HSP-1 exhibits a longer helical conformation in SDS than DPC micelles. In zwiterionic medium could be verified a subtle bend at the N-terminus, suggesting a partial insertion of the peptide in DPC micelles. The effects of adding peptide in size or surface charge of PC and PC:PG phospholipid vesicles were investigated by Dynamic Light Scattering and Zeta Potential measurements. The addition of HSP-1 to PC:PG-LUVs results in increasing of both hydrodynamic diameter (?Dh ? 20 nm) and zeta potential (?? ? 15 mV), indicating an electrostatic interaction with the surface vesicles. On the other hand, when PC-LUVs were titrated with HSP-1 a greater change in hydrodynamic diameter (?Dh ? 22 nm), no significant variations were observed in superficial charge, indicating a partial insertion of the peptide in zwitterionic PC membranes. In addition, the thermodynamic studies carried out by isothermal titration calorimetry showed a peptide-membrane interaction approximately 102 higher with PC-LUVs when compared to negative PC:PG-LUVs. Nevertheless, whereas the greater enthalpic contribution in PC:PG-LUVs revealed the predominance of electrostatic interactions with HSP-1, in PC vesicles predominate hydrophobic interactions. Finally, the ability of poring formation of HSP-1 was examined by carboxyfluorescein (CF) release from PC and PC:PG vesicles. It was observed a higher fluorescence intensity in PC-LUVs compared to PC:PG-LUVs, suggesting a greater lytic activity of the peptide in zwiterionic vesicles. The maximum percentage of CF released was approximately 65% to PC-LUVs and 50% to PC:PG-LUVs, confirming a greater membrane permeabilization in zwiterionic medium. Furthermore, this study has also demonstrated a lesser kinetics of CF leakage in PC-LUVs, consistent with a mechanism in which there is greater insertion of the peptide in the lipid bilayer interface. On the other hand, the higher kinetics of CF leakage in PC:PG?LUVs is in accordance with a carpet-like mechanism, which involve only superficial interaction between peptide and membrane.

Resumo Bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos sintetizados nos ribossomos, tendo sido descrita uma grande diversidade de bacteriocinas, as quais diferem entre si quanto a composição de aminoácidos, biossíntese, transporte e modo de ação. Nos alimentos, as bacteriocinas podem ser encontradas naturalmente como produtos da microbiota normal ou introduzida (cultura starter ou probióticos). Devido às suas aplicabilidades frente a organismos patogênicos contaminantes em alimentos, vários estudos têm sido publicados, tornando o uso destes peptídeos uma alternativa aos conservantes químicos tradicionais. Considerando-se as propriedades das bacteriocinas e sua potencial aplicação como bioconservadores de alimentos e alternativa aos antibióticos, o presente estudo busca acercar-se de uma visão geral das bacteriocinas quanto aos aspectos históricos, sistemas de classificação, biossíntese e transporte, modo de ação, abordando também algumas de suas aplicações na indústria de alimentos. Summary Bacteriocins are antimicrobial peptides synthesized in the ribosomes. A wide variety of bacteriocins have been described, which differ in their amino acid composition, biosynthesis, transport and mode of action. Bacteriocins can be found naturally in foods as products of normal or added (starters or probiotics) microbiota in several preparations. Due to their applicability against pathogenic contaminants in food, various studies have been published making the use of these peptides an alternative to traditional chemical preservatives. Considering the properties of bacteriocins and their potential application as bio-preservatives in foods and alternatives to antibiotics, this study presents an overview of bacteriocins with respect to their historical aspects, classification systems, biosynthesis and transport and mode of action, also presenting some applications in food industries.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O uso incorreto de antibióticos vem se tornando, nos últimos anos, um grande problema de acordo Organização Mundial da Saúde, uma vez que tem aumentado o número de microrganismos resistentes aos medicamentos mais frequentemente utilizados. Em contrapartida a este problema de saúde pública, novos antibióticos com diferentes vias de ação têm sido pesquisados. Muitos destes antimicrobianos têm sido descobertos a partir da primeira linha de defesa de vegetais e de animais. Estas moléculas são denominadas Peptídeos Antimicrobianos (AMPs). No intuito de encontrar novos compostos com atividade antimicrobiana foram desenvolvidos 3 peptídeos com ação bactericida a partir do transcriptoma de Lippia rotundifolia e L. alba. O RNA normalizado foi sequenciado utilizando-se a plataforma 454 GS e a partir do mesmo foram gerados e modelados in silico peptídeos com estrutura e ação semelhantes a AMPs. Em seguida os peptídeos foram sintetizados e sua atividade validada por testes antimicrobianos. Os peptídeos Lalb1 e Lrot3 apresentaram resultados promissores e foram remodelados a partir de um desenho racional visando obter a melhor estrutura e atividade dos mesmos. Os peptídeos L.rot3.5 e L.rot3.6 apresentaram os resultados mais promissores contra os patógenos testados. Os resultados aqui demonstrados sugerem que o uso de transcriptomas é uma importante ferramenta para a descoberta de novos AMPs com ação contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Misuse of antibiotics has become, in recent years, worldwide problem according to the World Health Organization, since the number of resistant microorganisms for most commonly used drugs has increased. In contrast to this public health problem, new antibiotics with different courses of action have been researched. Many of these antibiotics have been discovered from the first line of plant and animal defense. This is a group of molecules called Antimicrobial Peptides (AMPs). In the present work three antimicrobial peptides showing bactericidal activity were developed from the transcriptome of Lippia rotundifolia and L. alba. The normalized RNA was sequenced in 454 GS platform and the RNA library was used for in silico searching and modeling peptides showing similar structure and action to AMP. The peptides were synthesized and their activity was validated by antimicrobial tests. The L.alb1 and L.rot3 peptides showed promising results and were modelled again by the use of rational design methodology to inbreed structure and activity. The L.rot3.5 and L.rot3.6 peptides showed the most promising results against the tested pathogens. The results reported here demonstrated that the discovery of new AMPs from transcriptome against Gram-positive and Gram-negative bacteria is an important tool for this purpose.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Com o aumento na incidência de infecções resistentes a múltiplos antibióticos, existe hoje um grande interesse pelos peptídeos antimicrobianos (PAMs) como modelos para a produção de novos antibióticos. Os PAMs são mediadores multifuncionais da resposta imune inata, com atividade antibacteriana direta. O uso de PAMs como agentes terapêuticos tem algumas limitações, como a estabilidade, a toxicidade e alta massa molecular. Apesar dessas limitações, eles apresentam propriedades compensatórias, como imunomodulatória e antitumoral bem como a capacidade de inibir β-lactamases. O desenho racional de PAMs tem sido usado para gerar análogos com atividade melhorada. No presente trabalho avaliamos a atividade antibacteriana in vitro e in vivo da clavanina A e através da modificação incremental criamos dois análogos dos peptídeos mostoparano-L e clavanina A (clavanina-MO e mastoparanoMO),além disso, utilizamos o desenho racional de peptídeos para a criação de dois inibidores de β-lactamase (dBLIPs 1 e 2). A clavanina A mostrou se eficiente na eliminação de S. aureus em um modelo de infecção de ferida e impediu o início da sepse e, assim, reduziu a mortalidade de camundongos infectados em um modelo de infecção bacteriana sistêmica. A clavanina-MO e mastoparano-MO impediram o crescimento de bactérias planctônicas e levaram à erradicação de biofilmes bacterianos maduros. Os peptídeos modificados mostram-se promissores como agentes terapêuticos contra infecções bacterianas sistêmicas e biofilmes causadas por uma variedade de bactérias. dBLIP-1 e dBLIP-2 em combinação com antibióticos convencionais foram eficazes na eliminação de Escherichia coli e Staphylococcus aureus que expressam β-lactamases em um modelo murino de infecção sistêmica. dBLIPs 1 e 2 fornecem pistas para superar a resistência à base de β-lactamase. With the increased incidence of multiple antibiotic resistant infections, there is huge interesting in antimicrobial peptides (AMPs) as templates to produce novel antibiotics. The AMPs are multifunctional mediators of innate immune response with direct antibacterial activities. Nevertheless, the use of AMPs as therapeutic agents has certain limitations such as stability, toxicity and high molecular mass. Despite such limitations, they show additional properties such as antitumor and immunomodulatory as well as the ability to inhibit β-lactamases. Furthermore, the rational AMPs design has been used to produce analogues with improved activity. In the present study, we utilized the rational AMPs design for generation of two β-lactamase inhibitors (dBLIPs 1 and 2) and through two incremental modification created analogues of clavanin A and mostoparan-L (clavanin-MO and mastoparan-MO respectively) peptides. Both inhibitors in combination with conventional antibiotics were effective for control of Staphylococcus aureus and Escherichia coli expressing β-lactamase in a murine model of systemic infection. dBLIPs 1 and 2 provide clues to overcome resistance to β-lactamase base. The clavanin-MO and mastoparan-MO prevented the growth of planktonic bacteria, leading to the mature biofilm eradication of pathogenic Gram-negative and -positive. The clavanina-MO and mastoparan-MO are promising therapeutic agents against systemic infections and bacterial biofilms caused by a wide bacterial variety.

rea de concentra??o: Qu?mica org?nica. Submitted by Alexandre Soares (alexandredesoares@yahoo.com.br) on 2016-08-25T12:50:30Z No. of bitstreams: 1 eduardo_ferreira_coelho_junior.pdf: 3071757 bytes, checksum: e9deb6aa475b6a67aeab117cf2df4603 (MD5) Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2016-09-08T17:54:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 eduardo_ferreira_coelho_junior.pdf: 3071757 bytes, checksum: e9deb6aa475b6a67aeab117cf2df4603 (MD5) Made available in DSpace on 2016-09-08T17:54:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 eduardo_ferreira_coelho_junior.pdf: 3071757 bytes, checksum: e9deb6aa475b6a67aeab117cf2df4603 (MD5) Previous issue date: 2015 O presente trabalho prop?e a glicosila??o do pept?deo antimicrobiano HSP-1, composto por 14 res?duos de amino?cidos e isolado originalmente da esp?cie Hyla punctata (PRATES et al., 2004) empregando-se a s?ntese de pept?deos em fase s?lida associada a rea??o de cicloadi??o catalisada por cobre (SHARPLESS et al., 2002). Para isto, foi realizada a s?ntese do pept?deo HSP-1 propargilado ([PAG1]HSP-1) atrav?s da metodologia de s?ntese de pept?deo em fase s?lida (SPFS) via estrat?gia Fmoc. Ap?s a confirma??o da obten??o do [PAG1]HSP-1 por espectrometria de massa (MALDI-ToF), foi realizada a glicosila??o com as inser??es dos derivados azido acetilado de glicose e N-acetilglicosamina na presen?a de sulfato de cobre penta hidratado (CuSO4.5H2O) e de ascorbato de s?dio como agente redutor para obten??o dos glicopept?deo-triaz?is [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1. Os produtos das s?nteses foram purificados por cromatografia l?quida de alta efici?ncia de fase reversa (CLAE-FR) e tamb?m caracterizados por espectrometria de massa (MALDI-ToF), confirmando a forma??o regiosseletiva dos glicopept?deo-triaz?is sem produ??o de subprodutos da glicosila??o. Os estudos biol?gicos comparativos entre o pept?deo HSP-1 e de suas formas glicosiladas revelaram que as modifica??es qu?micas n?o alteraram significativamente a efic?cia do HSP-1 contra agentes bacterianos. Entretanto, os testes antif?ngicos demonstraram melhor atividade fungicida para os glicopept?deos quando comparado ao pept?deo HSP-1. Foram ainda realizados estudos conformacionais e de intera??o entre o pept?deo e os glicopept?deos com ves?culas fosfolip?dicas de car?ter zwitteri?nico (POPC) e ani?nico (POPC/POPG). Os estudos conformacionais empregando-se a t?cnica de Dicro?smo Circular (CD) revelaram menor teor de helicidade tanto em LUV?s de POPC quanto de POPC/POPG para os glicopept?deos em rela??o a HSP-1. Os estudos de intera??o foram realizados empregando-se as t?cnicas de espalhamento de luz din?mico (DLS), potencial zeta (?) e extravasamento de carboxifluoresce?na (CF). De uma maneira geral, verifica-se que a varia??o no di?metro hidrodin?mico (?Dh) para ves?culas ii zwitteri?nicas POPC e ani?nicas POPC/POPG ? maior para os glicopept?deos [Glc-trz-G14]HSP-1e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 em rela??o ao HSP-1. Por outro lado, a varia??o do potencial zeta tanto em ves?culas zwitteri?nicas quanto em ves?culas predominantemente negativas causada por HSP-1 foi maior em compara??o ao efeito causado pelas formas glicosiladas. E por fim, os resultados de extravasamento de carboxifluoresce?na induzida por cada esp?cie (HSP-1, [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1) mostrou que a capacidade l?tica dos glicopept?deos ? ligeiramente maior em ambos os meios biomim?ticos quando comparados com o pept?deo HSP-1. Assim sendo, este trabalho mostrou que a presen?a do anel triaz?lico pode ser respons?vel pela maior atividade antif?ngica dos glicopept?deos [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 em rela??o ao pept?deo HSP-1. Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2015. ABSTRACT This work proposes the glycosylation of the antimicrobial peptide HSP-1, containing 14 amino acid residues and originally isolated from Hyla punctata species (PRATES et al., 2004) by solid phase peptides synthesis associated with cycloaddition reaction copper catalyzed (SHARPLESS et al., 2002). The synthesis of propargylated HSP-1 ([PAG1] HSP-1) was carried out by solid phase peptide synthesis using Fmoc strategy and characterized by mass spectrometry (MALDI-ToF). In order to obtain the glycopeptide triazoles [Glc-trz-G14]HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14]HSP-1, azide derivatives acetylated glucose and N-acetylglucosamine were used in the presence of copper sulfate pentahydrate (CuSO4. 5H2O) and sodium ascorbate as a reducing agent. The products were purified by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and characterized by mass spectrometry (MALDI-ToF), confirming the regioselective reaction without glycosylation secondary products. Comparative studies among HSP-1 peptide and their glycosylated forms don?t show significant changes in antibacterial assays. However, the antifungal tests have shown a significant increase in fungicidal activity for glycopeptides when compared to HSP-1 peptide. Furthermore, it were carried out conformational and interaction studies among the peptide and glycopeptides with zwitterionic (POPC) and anionic (POPC/POPG) phospholipid vesicles. The circular dichroism (CD) spectra have revealed lower helicity to glycopeptides relative HSP-1 in both zwitterionic and anionic LUV's. Interaction studies were performed employing the dynamic light scattering (DLS), zeta potential and leakage carboxyfluorescein (CF) techniques. Summing up, the hydrodynamic diameter variation (?Dh) for zwitterionic and anionic vesicles is greater for glycopeptides [Glc-trz-G14]HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 when compared with HSP-1. On the other hand, the zeta potential variation in zwitterionic or negative vesicles caused by HSP-1 was higher compared to the effect caused by glycosylated forms. Finally, the results of carboxyfluorescein leakage induced by each species (HSP- iv 1 [Glc-trz-G14] HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14] HSP-1) showed a higher lytic capacity of glycopeptides in both media in relation to the HSP-1 peptide. Thus, it showed that the presence of triazole rings may be responsible for the higher antifungal activity of derivatives [Glc-trz-G14] HSP-1 and [GlcNAc trz-G14] HSP-1.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_debora_scopel.pdf: 765310 bytes, checksum: dc0bea20bd4a62c37e4145ef858b7894 (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 The development and use of drugs with the ability to prevent or strike an infection are indispensable for human and animal health. However, the antiviral drug arsenal is still small and has serious use restrictions, like small activity range, limited therapeutic usage and several degrees of cytotoxicity. The objective of this work was to evaluate the antiviral activity of an antibacterial peptide isolated from the intestinal contents of the fish Piau-com-pinta (Leporinus sp.), named P34. Its cytotoxicity was analyzed in different cell lineages, in order to evaluate its antiviral activity. This study was performed against viruses with different phenotypical and genotypical features like: canine adenovirus type 2 (CAV-2), canine coronavirus (CCoV), canine distemper virus (CDV), canine parvovirus type 2 (CPV-2), equine arteritis virus (EAV), equine influenza virus (EIV), feline calicivirus (FCV) and feline herpesvirus type 1 (FHV-1). It was observed antiviral activity, in vitro, against EAV and FHV-1, both enveloped viruses, with RNA e DNA genomes, respectively. A virucidal effect was observed when P34 was incubated for different periods of time with EAV at 37 °C. Transmission electronic microscopy analysis suggests that the peptide P34 binds and promotes lesions to the viral envelope. The peptide P34 does not have virucidal activity against FHV-1 and although its mechanism of action is not completely elucidated, it is possible to suppose that P34 interferes in the adsorption process of FHV-1. Thus, the peptide P34 may represent an antimicrobial substance with potential application in the prevention and treatment of viral infections caused by FHV-1 and EAV. O desenvolvimento e o uso de fármacos antivirais capazes de prevenir ou combater uma infecção são imprescindíveis para a saúde do homem e dos animais. Entretanto, o arsenal de fármacos antivirais permanece pequeno e apresenta graves restrições de uso, tais como reduzido espectro de atividade, utilidade terapêutica limitada e vários graus de toxicidade. O objetivo desse trabalho foi avaliar atividade antiviral de um peptídeo antibacteriano isolado do conteúdo intestinal do peixe Piau-com-pinta (Leporinus sp.), denominado P34. Sua citotoxicidade foi determinada em diferentes linhagens celulares, visando posterior avaliação da atividade antiviral. Foram realizados ensaios antivirais frente a vírus com diferentes características genotípicas e fenotípicas: adenovírus canino tipo 2 (CAV-2), coronavírus canino (CCoV), vírus da cinomose canina (CDV), parvovírus canino tipo 2 (CPV-2), vírus da arterite equina (EAV), vírus da influenza equina (EIV), calicivírus felino (FCV) e herpesvírus felino tipo 1 (FHV-1). Foi observada ação antiviral, in vitro, contra EAV e FHV-1, ambos vírus envelopados, com genomas RNA e DNA, respectivamente. Foi observado efeito virucida, contra o EAV, quando o P34 foi incubado por diferentes períodos a 37 °C. A análise por microscopia eletrônica de transmissão sugere que o peptídeo P34 faz ligação e promove lesão do envelope viral. O P34 não possui atividade virucida contra o FHV-1 e embora o mecanismo de ação não tenha sido completamente elucidado, é possível supor que o P34 interfira no processo de adsorção do FHV-1. Dessa maneira, o peptídeo P34 pode representar uma substância com potencial aplicação na prevenção e tratamento das infecções pelo FHV-1 e pelo EAV.

Extratos aquosos da planta medicinal Achillea millefolium contêm macromoléculas de interesse para desenvolver fitodefensivos para a agricultura. Duas frações de mil folhas foram obtidas por ultrafiltração, E1 (contendo moléculas maiores que 30 kDa), e E3 (peptídeos entre 1 e 10 kDa) que inibiram o crescimento das bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum, gram-negativa, e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, gram-positiva, com dependência de concentração. Os valores de concentração inibitória mínima (CIM) para ambos os extratos e bactérias foram baixos, entre 20 e 80µM. A CIM relativa à proteína total evidenciou a presença de macromoléculas muito ativas em E3, embora com baixa concentração proteica. E3 se aplica à prospecção de peptídeos antimicrobianos. Estimar a CIM relativa à quantidade de amostra vegetal valorizou o potencial antimicrobiano natural de E1, que contém alta concentração proteica. E1e E3 se aplicam ao desenvolvimento de fitodefensivos para uso biotecnológico. A ultrafiltração fracionou as amostras de forma nativa, rápida, e com baixo custo; além de dessalinizar, clarificar, purificar, e concentrar E1 e E3. Esse estudo inédito sobre a separômica e a ação antimicrobiana de extratos macromoleculares aquosos de mil folhas sugere que plantas cicatrizantes podem apresentar grande potencial para desenvolver fitodefensivos agrícolas naturais não danosos, à semelhança de medicamentos fitoterápicos. Aqueous extracts from the medicinal plant Achillea millefolium contain macromolecules of interest to develop agrochemicals for agriculture. Two fractions of "mil folhas" were obtained by ultrafiltration, E1 (containing molecules larger than 30 kDa) and E3 (peptides between 1 and 10 kDa), which inhibited the growth of phytopathogenic bacteria Ralstonia solanacearum, gram-negative, and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, gram-positive, concentration-dependent. The values of minimum inhibitory concentration (MIC) for both extracts and both bacteria were low, ranging from 20 to 80µM. The MIC relative to total protein evidenced the presence of very active macromolecules in E3, although showing low protein concentration. E3 applies to the prospection of antimicrobial peptides. The estimated MIC relative to the amount of plant sample valued the natural antimicrobial potential of E1, which contains high protein concentration. E1 and E3 can be used in the development of agrochemicals for biotechnological purposes. The ultrafiltration procedure fractionated the samples in a rapid and native way and at a low cost; it also desalted, clarified, concentrated and purified both E1 and E3. This pioneering study on the separomics and on the antimicrobial activity of macromolecular aqueous extracts from "mil folhas" suggests that healing plants have great potential to develop non-harmful agricultural natural agrochemicals, similarly to the available phytotherapic drugs.

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas Submitted by azevedo@ufp.pt (azevedo@ufp.pt) on 2013-10-25T14:55:41Z No. of bitstreams: 1 TCC Flávio Pinto 19609.pdf: 3522142 bytes, checksum: a0986b2ce23002ea77fd43a514246960 (MD5) Approved for entry into archive by csousa@ufp.pt (csousa@ufp.pt) on 2013-10-30T15:03:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TCC Flávio Pinto 19609.pdf: 3522142 bytes, checksum: a0986b2ce23002ea77fd43a514246960 (MD5) Made available in DSpace on 2013-10-30T15:03:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TCC Flávio Pinto 19609.pdf: 3522142 bytes, checksum: a0986b2ce23002ea77fd43a514246960 (MD5) Previous issue date: 2013

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas Com a fácil transferência das bactérias quer nos cuidados hospitalares, quer a nível comunitário, com o aumento do número de pessoas a necessitar de cuidados de saúde provocado pelo envelhecimento populacional, com o aumento do número de infeções associadas aos cuidados de saúde, com as viagens internacionais ao dispor de qualquer cidadão, com o uso irracional e exagerado dos antibióticos por parte da população e em explorações animais, a resistência aos antibióticos atingiu um nível tão elevado que coloca em risco a saúde pública mundial. Presentemente torna-se indispensável a adoção de estratégias alternativas que promovam a eliminação destas estirpes resistentes do meio ambiente. Nesta dissertação serão abordadas e analisadas diversas estratégias terapêuticas alternativas aos antibióticos. A terapia fágica é uma delas, e esta recorre à utilização de bacteriófagos estritamente líticos, como alternativa, ou complemento, no tratamento de infeções bacterianas, tendo-se revelado um método seguro pelo facto destas entidades biológicas não possuírem qualquer afinidade para as células eucarióticas. Já a terapia com lisinas estabelece-se como outra opção terapêutica inovadora, sendo que a administração tópica de preparações contendo lisinas recombinantes purificadas, numa concentração na ordem dos nanogramas, em bactérias Gram-positivo, demonstraram elevada capacidade terapêutica, provocando rapidamente a lise da bactéria alvo. Adicionalmente, esta terapia evidencia sinergismo quando combinado com determinados antibióticos já disponíveis no mercado. Outra alternativa terapêutica baseia-se na utilização dos tubos peptídicos formadores de poros. Estes são polipéptidos anfifílicos que provocam disrupção da membrana celular, podendo ser utilizados no combate de infeções bacterianas, fúngicas e víricas, na prevenção de biofilmes e como antitumorais. Curiosamente, as bacteriocinas estabelecem-se como uma estratégia de defesa comum das bactérias contra outros agentes bacterianos, eliminando potenciais oponentes e aumentando o número de nutrientes disponíveis no meio ambiente para o seu próprio crescimento, podendo ser aplicadas na indústria alimentar, como probióticos, e no combate bactérias multirresistentes. A utilização de anticorpos antibacterianos promete ser segura e extremamente eficaz. Já a vacinação estabelece-se como uma das estratégias mais promissoras a nível preventivo. With the easy transfer of bacteria on hospital care and at community level, with the increasing number of people needing health care caused by the aging of population, with the increasing number of infections associated with health care, with international travel available to any citizen, with exaggerated and irrational use of antibiotics by the population and in farm animals, antibiotic resistance has reached such a high level that endangers world public health. Presently it’s essential the adoption of alternative strategies that promote the elimination of these resistant strains from the environment. In this dissertation it will be discussed and analysed several alternative strategies to antibiotics. Phage therapy makes use of lytic bacteriophages as an alternative, or a complement, in the treatment of bacterial infections. It is a safe method because these biological entities don’t possess any affinity to eukaryotic cells. Lysins therapy is recognized as novel therapeutic option, because the topical administration of preparations containing purified recombinant lysins at a concentration in the order of nanograms, in Gram-positive bacteria demonstrated a high potential therapeutic causing immediate lysis of the target bacteria. Additionally, this therapy shows synergism when combined with certain antibiotics already available on the market. Another alternative therapy is based on the use of antimicrobial peptides. These are amphiphilic polypeptides that causes disruption of the bacterial membrane and can be used in treatment of bacterial, fungic and viral infections, in prevention of biofilms formation and as antitumor agents. Interestingly, bacteriocins are a common strategy defence of bacteria against other bacterial agents that eliminates potential opponents and increases the number of available nutrients in the environment for their own growth and can be applied in the food industry, as food preservative, as probiotics and in fighting of multi-resistant bacterial strains. The use of antibacterial antibodies promises to be extremely safe and effective. The vaccination is the most promising preventive strategy.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A melhoria da qualidade da alimentação pode desempenhar efeitos fisiológicos benéficos e reduzir o risco a certas doenças. O leite contribui para a ingestão recomendada de nutrientes e promove a saúde através de seus componentes biologicamente ativos que a ele agregam inúmeras funcionalidades além da nutrição. A busca por novos antibióticos de amplo espectro de ação tem aumentado nas últimas décadas devido ao número crescente de bactérias resistentes aos antibióticos convencionais. Neste sentido, as proteínas do leite bovino, após fragmentação, podem ser promissoras fontes de peptídeos antimicrobianos (PAMs), que ficam inativos quando internalizados em uma sequência protéica maior e podem ser liberados a partir de enzimas digestivas durante o trânsito gastrointestinal. Neste trabalho, sequências protéicas provenientes do leite foram obtidas em banco de dados e sumariamente clivadas in silico por enzimas gastrointestinais (pepsina, tripsina e quimotripsina). Esta clivagem virtual disponibilizou inúmeros peptídeos que foram analisados e selecionados com relação a inúmeras características inerentes à AMPs, tais como tamanho, carga, composição, hidrofobicidade, momento hidrofóbico e estruturação. Cinco peptídeos (lactof01, lactof02, A_lacto01, serumA01 e serumA02) foram selecionados e tiveram sua estrutura tridimensional construída teoricamente por meio de modelagem molecular por homologia sendo estas validadas através de servidores web. Estes peptídeos foram sintetizados manualmente e testados in vitro contra microrganismos Gram-positivos (Staphylococcus aureus) e Gram-negativos (Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae). Os peptídeos exibiram baixa atividade antimicrobiana. Entretanto foi verificado que lactof02 foi o mais ativo contra Gram-negativas e A_lact01 foi o mais ativo contra Gram-positivas. Os ensaios hemolíticos indicaram que os peptídeos apresentaram atividade hemolítica variável. Através da análise dos testes in vitro foi possível verificar que a hidrofobicidade global e intrínseca dos peptídeos pode ter sido determinante na modulação da atividade antimicrobiana e hemolítica. The nutrition quality improvement may play beneficial physiological effects and also reduce the risk of certain diseases. Milk contributes to the recommended nutrients intake and could promote health through its biologically active components, adding many features to nutrition. Otherwise, the search for a new broad-spectrum antibiotic action has increased in last decades due to to the increased number of bacteria resistant to conventional antibiotics. In this view, bovine milk proteins are promising antimicrobial peptides (AMPs) sources, which are inactive when are located inside of a large protein sequence and could be released by digestive enzymes during gastrointestinal transit. Here, those peptide sequences were obtained from free databases and summarily cleaved by gastrointestinal enzymes (pepsin, trypsin and chymotrypsin). This virtual cleavage provided a wide number of peptides that were analyzed and selected according to the inherent AMPs properties, such as size, charge, composition, hydrophobicity, hydrophobic moment and structuring. Five peptides (lactof01, lactof02, A_lacto01, serumA01 e serumA02) were selected, being their three-dimensional struture construted by homology modeling and validated through web servers. These peptides were synthesized and in vitro tested against Gram-positives (Staphylococcus aureus) and Gram-negatives (Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae) microorganims. The peptides exhibited low antimicrobial activity. Nevertheless it was found that lactof02 was the most active against Gramnegatives and A_lact01 was the most active against Gram-positives. The hemolytic assays indicated that the peptides showed variable hemolytic activity. Through in vitro analisys of tests it was possible to verify that global and intrinsic peptides hydrophobicity seems to be crucial for modulation of antimicrobial and hemolytic activities.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2020-04-08T17:31:42Z No. of bitstreams: 1 2011 - Isabele da Costa Angelo.pdf: 4139906 bytes, checksum: a157ecf71f0f53ddd440bb7a4cc46a0a (MD5) Made available in DSpace on 2020-04-08T17:31:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011 - Isabele da Costa Angelo.pdf: 4139906 bytes, checksum: a157ecf71f0f53ddd440bb7a4cc46a0a (MD5) Previous issue date: 2011-03-03 CAPES The study evaluated the protein and lipid profiles of Rhipicephalus microplus engorged females after infection by Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana and Fusarium oxysporum. The treatments were immersion or inoculation of conidial suspension in R. microplus. The hemolymph was collected 24 and 48 hours after treatment. The cell-free hemolymph was separated of hemocytes by centrifugation and hemocytes resuspended in phosphate buffer pH 7.2. The amount of total protein was determined in both fractions ofhemolymph and hemocytes were quantified. The cell-free hemolymph was filtered through a 100 kDa and 10 kDa membranes, and analyzed by electrophoresis and liquid chromatography (HPLC). The proteome of cell-free hemolymph (treatment by injection) was evaluated by 2DPAGE. Changes were observed in amount total protein and the amount of hemocytes, but no difference was observed in the electrophoretic profile (1D-PAGE) of the cell-free hemolymph. In haemocytes, the entomopathogens reduced the amount of serpins, while F. oxysporum caused increased. In 2D-PAGE variations were observed in both expression and presence/absence of protein between the groups. The cell-free hemolymph antimicrobial activity was tested against Escherichia coli and Staphylococcus aureus and against the fungus used in the treatment of engorged ticks. The hemolymph collected 48 hours after the immersion treatment with B. bassiana apresented activity anti-B. bassiana with 48 hours of evaluation. This hemolymph was subjected to Superose column to HPLC and peak was collected and analyzed on the analytical column C18. The fractions were collected from the C18 and its apresented activity anti-B. bassiana, but showed no activity against Candida albicans. These fractions were analyzed by Maldi-Tof and most of them had in common an ion with m/z 1,119.5; however, other ions may be involved with this activity antimicrobial. The lipids present in cell-free hemolymph, in the hemocyte and fat body were extracted and analyzed by thin layer chromatography (TLC) or HPTLC for neutral lipids and phospholipids. The classes of neutral lipids in the cell-free hemolymph were cholesterol ester, cholesterol (CHO) and fatty acids (FA), which have varied depending on the fungus used, type of treatment and observation time. Phospholipids found were phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine, its were not significantly altered after the fungal infection. In hemocytes, the same classes of lipids were found and B. bassiana modified phospholipids, while M. anisopliae s.l. altered FA and CHO. The fat body showed, in addition to these classes of neutral lipids, the triglycerides, which increased significantly 48 hours after inoculation with M. anisopliae s.l. The lipase activity in fat body was measured and it was demonstrated that increased activity 48 hours after inoculation, mainly in the group inoculated with Metarhizium. Therefore, the results showed alterations related to the proteins expression in the hemocytes and the cell-free hemolymph after inoculation with fungi, immunosuppression of hemocytes and antimicrobial peptides induction after infection with B. bassiana, besides changes in the lipid profile of R. microplus after infection. However, further studies are necessary to understand these changes. O trabalho avaliou os perfis prot?ico e lip?dico de f?meas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus ap?s infec??o com Metarhizium anisopliae s.l., Beauveria bassiana ou Fusarium oxysporum. Os tratamentos foram imers?o ou inocula??o da suspens?o conidial em R. microplus. A hemolinfa foi coletada 24 e 48 horas ap?s os tratamentos. O plasma foi separado dos hem?citos por centrifuga??o e os hem?citos resuspensos em tamp?o fosfato pH 7,2. A concentra??o de prote?na total foi determinada em ambas as fra??es da hemolinfa e os hem?citos quantificados. O plasma da hemolinfa foi filtrado em membrana de 100 kDa e 10 kDa, sendo analisados por eletroforese e cromatografia l?quida de alta efici?ncia (CLAE). O proteoma do plasma da hemolinfa (tratamento por inocula??o) foi avaliado por gel 2D. Foram observadas varia??es na quantidade de prote?na total de ambas as fra??es da hemolinfa, na quantidade de hem?citos bem como na intensidade de prote?nas/pept?deos expressos no plasma da hemolinfa. Nos hem?citos, os entomopat?genos reduziram a quantidade de serpinas, enquanto F. oxysporum causou aumento. No gel 2D foram observadas varia??es na express?o bem como na aus?ncia/presen?a de prote?nas entre os grupos. O plasma da hemolinfa teve sua atividade antimicrobiana testada contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus e contra o fungo utilizado no tratamento das f?meas ingurgitadas. A hemolinfa coletada 48 horas ap?s o tratamento por imers?o com B. bassiana apresentou atividade anti-B. bassiana com 48 horas de avalia??o. Esta hemolinfa foi submetida ? coluna Superose de CLAE e o pico coletado analisado na coluna anal?tica C18. As fra??es coletadas da C18 apresentaram atividade anti-B. bassiana, por?m n?o apresentaram atividade contra Candida albicans. Essas fra??es foram analisadas por Maldi-Tof e a maioria delas apresentou um ?on com raz?o m/z 1.119,5; no entanto, outros ?ons podem estar envolvidos com essa atividade antimicrobiana. Os lip?deos presentes no plasma da hemolinfa, nos hem?citos e no corpo gorduroso foram extra?dos e analisados por cromatografia em camada delgada (CCD) ou CCD de alta performance para lip?deos neutros e fosfolip?deos. As classes de lip?deos neutros encontradas no plasma da hemolinfa foram colesterol-?ster, colesterol (CHO) e ?cidos graxos (AG), que sofreram altera??es em fun??o do fungo utilizado, tipo de tratamento e tempo de observa??o. Os fosfolip?deos encontrados foram fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina, que n?o foram significativamente alterados ap?s a infec??o f?ngica. Nos hem?citos, as mesmas classes de lip?deos foram encontradas e B. bassiana alterou os fosfolip?deos, enquanto M. anisopliae s.l. alterou os AG e CHO. O corpo gorduroso apresentou, al?m destas classes de lip?deos neutros, o triacilglicerol, que aumentou significativamente 48 horas ap?s a inocula??o com M. anisopliae s.l. A atividade lipase no corpo gorduroso foi mensurada, sendo evidenciado um aumento 48 horas ap?s a inocula??o, principalmente no grupo inoculado com Metarhizium. Portanto, os resultados demonstraram altera??es na express?o de prote?nas no plasma da hemolinfa e nos hem?citos ap?s inocula??o com os fungos, imunossupress?o dos hem?citos, indu??o de pept?deos com atividade antimicrobiana ap?s infec??o com B. bassiana, al?m de altera??es no perfil lip?dico de R. microplus ap?s infec??o. No entanto, maiores estudos s?o necess?rios para o entendimento dessas altera??es.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As infecções relacionadas à assistência à saúde (IrAS), são uma das principais causas de mortalidade e aumento dos custos hospitalares em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Nos casos em que um paciente adquire uma IrA e esta não é tratada adequadamente, a mesma pode evoluir para um quadro mais grave, podendo levar a sepse e consequentemente na maioria dos casos a morte. A sepse representa um importante problema de saúde pública, entretanto, um tratamento eficaz para esta síndrome ainda não foi encontrado. Peptídeos antimicrobianos foram relatados para modular a resposta à infecção bacteriana na sepse, independente dos mecanismos de resistência conhecidos para os antibióticos. Desta forma, procurou-se investigar a atividade imunomodulatória de duas formas de clavaninas sobre monócitos RAW 264.7, bem como a atividade antimicrobiana e a citotoxicidade in vitro. Em ensaios in vivo a genotoxicidade, a ação das clavaninas sobre a migração de neutrófilos e a eficácia do tratamento com as clavaninas em um modelo de infecção de ferida operatória por S. aureus e sepse polimicrobiana grave também foram avaliadas. Os estudos in vitro demostraram que as clavaninas inibiram completamente o crescimento de E. coli, K. pneumoniae e S. aureus, preveniram a secreção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-12) e NO, e aumentaram a secreção de IL-10. Além disso, as clavaninas não apresentaram atividade citotóxica sobre as células RAW 264.7. Nos experimentos in vivo, as clavaninas não apresentaram genotoxicidade, além de apresentarem-se quimoatraentes para neutrófilos. As clavaninas, também, reduziram significativamente as unidades formadoras de colônias de S. aureus no modelo experimental de ferida operatória, e reduziram a mortalidade dos animais sépticos em mais de 50%, quando comparados com animais controle. Devido à sua ação direta sobre células do sistema imune e microorganismos, as clavaninas aparentam ser compostos potenciais para o tratamento de infecções bacterianas graves como a sepse, demonstrando alto valor biotecnológico. Healthcare-associated infections (HAIs) are a major cause of mortality, also increasing hospital costs in developed and developing countries. When a patient acquires HAIs and this is not properly handled, disease may clearly worst, leading to sepsis and consequently in major to death. Despite of sepsis represents an important public health problem, any effective treatment for this syndrome was obtained until now. In this view, antimicrobial peptides have been reported as modulators of immune response to bacterial infection in sepsis, with independent activity of mechanisms that lead to antibiotic. Thus, the immunomodulatory activity of two different forms of clavanins over RAW 264.7 monocytes, as well the in vitro antimicrobial and cytotoxic activities were here investigated. Furthermore, in vivo genotoxicity assays, the evaluation of clavanins activity on neutrophil migration and also the efficacy of treatment with clavanins in a wound S. aureus infection model and severe polymicrobial sepsis were also evaluated. Moreover, in vitro studies demonstrated that clavanins are able of inhibit the growth of E. coli, K. pneumoniae and S. aureus. Clavanins also prevented the secretion of proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-12) and NO, and increased the IL-10secretion. In addition, clavanins showed none cytotoxicity on RAW 264.7 cells. During in vivo experiments, the clavanins showed no genotoxicity, showing however, a clear chemotactic effect for neutrophils. Clavanins also significantly reduced the colony-forming units of S. aureus in an experimental model of surgical wound infection and reduced the mortality of septic animals in more than 50 %, when compared to control group. Due to their direct activities over immune cells and microorganisms, clavanins are potential compounds for the treatment of serious bacterial infections such as sepsis, showing an enormous and remarkable biotechnological value.

FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais Um dos principais problemas mundiais na agricultura está diretamente relacionado às enormes perdas na produção causada por fungos fitopatogenicos, onde sua infecção nas culturas se dá desde o plantio até a pós- colheita. O fungo Botrytis cinerea, causador do mofo cinzento em mais de 200 espécies de plantas é um grande problema no agronegócio em todo o mundo. O uso de fungicidas é o principal método de controle em plantas, enquanto os resultados obtidos de imediato e a facilidade de aplicação justificam o seu uso. No entanto, o uso contínuo de fungicidas pode promover a seleção de fungos resistentes além de causar a contaminação de ecossistemas. Com o objetivo de encontrar uma solução para esse problema, diversos estudos tem se concentrado na busca de novas alternativas de controle, como por exemplo, as proteínas de plantas com atividades antifúngicas (AFPs). Nesse sentido, uma seleção de peptídeos antimicrobianos de flores, folhas e sementes de espécies do gênero Lippia bem como o isolamento de peptídeos antifúngicos de flores de Lippia sidoides foi o objetivo desse trabalho. Neste trabalho, a purificação e identificação de dois novos peptídeos de aproximadamente 10 kDa e 15 kDa de flores de Alecrim-pimenta (Lippia sidoides) foi descrito. As flores de L. sidoides, depois de secadas em estufa a 25o por cinco dias, foram submetidas à extração de proteínas com solução de HCl 0,1% e NaCl 0,6M, seguido por precipitação com sulfato de amônia (100%). Após a precipitação, o extrato foi dialisado contra água destilada (cut off 1,0 kDa) e liofilizado. A fração rica foi aplicada em cromatografia hidrofóbica Octyl-sepharose, seguida por cromatografia de fase-reversa de HPLC (Vydac C18-TP). Bioensaios com EB, e fração PR in vitro indicaram a inibição do crescimento do fungo Botrytis cinerea. As sequências N-terminal, obtidas por degradação de Edman, seguidas por alinhamento indicam que esses dois peptídeos podem ser classificados com proteínas R NBS-LRR. Esta descoberta pode contribuir, futuramente, para o desenvolvimento de produtos biotecnológicos como drogas antifúngicas e plantas transgênicas com resistência elevada a fungos patogênicos. One of the major global issues in agriculture could be directly related to the severe production crop losses caused by phytopathogenic fungi, especially when infection affects post-harvest cultures. In this view, the fungus Botrytis cinerea is able to cause gray mold in more than 200 species of plants, being considered a major problem for the agribusiness. The use of fungicides is a primary fungi control method in plants, due to velocity and facility of application. However, the continuous use of fungicides may promote the selection of resistant fungi and also the ecosystems contamination. Aiming to find different solutions to this problem, several studies have focused on the search for new alternatives to fungi control, such as plant proteins with antifungal activities (AFPs). In this view, a selection of antimicrobial peptides from flowers, leaves and seeds from Lippia genus and further isolation of antifungal peptides from Lippia sidoides flowers was focused in this work. In this work, the purification and identification of two novel peptides of approximately 10 kDa and 15 kDa from flowers of rosemary-pepper (L. sidoides) was described. L. sidoides flowers were oven dried at 25 oC for 5 days, following protein extraction with a solution containing 0.1% HCl 0.6 M NaCl, and further ammonium sulfate precipitation (100%). After precipitation the extract was dialyzed against distilled water (cut off 1.0 kDa) and lyophilized. The rich fraction was applied onto an Octyl-Sepharose hydrophobic chromatography, followed by HPLC reversed-phase chromatography (Vydac C18-TP). Bioassays using crude extract and in vitro PR fraction indicated the inhibition of Botrytis cinerea growth. N-termini sequences, obtained by the Edman degradation, followed by alignment indicate that these two peptides can be classified as NBS-LRR R proteins. This discovery may help in a near future to the development of biotechnology products such as antifungal drugs and transgenic plants with enhanced resistance to fungal pathogens.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The techniques based on the separation by two-dimensional liquid chromatography (TDLC) or multi-dimensional (MDLC), coupled with mass spectrometry analysis, have been used in separation of proteins and peptides for bioprospection of antimicrobial activities. This work aimed to bioprospect antimicrobial peptides (AMPs) of soybean (Glycine max) by using proteomics tools. Peptides from non- germinated (NGSS) and germinated for 48 hours (GSS48) soybean seeds were extracted and fractionated by salt and heating, followed by dialysis, anion-exchange (AEC) and reversed phase (C18 RPHPLC) chromatographic steps, and mass spectrometry analysis (MS). The comparisons of the chromatographic profiles (AEC and RP-HPLC) from NGSS and GSS48 suggested that different peptides are synthesized, showing molecular weight (MW) lower than 10 kDa by MS analysis. A biorrevelation-assay that used the cationic fraction obtained from SGS48 showed that compounds with MW lower than 14-kDa were able to inhibit the bacterium Ralstonia solanacearum growth. Thus, to improve knowledge about GSS48AMPS´s characteristics, different techniques for clearance and purification of the extracts were evaluated, and a new protocol to bioprospect the peptides was proposed, composed by the following steps: extraction, ammonium sulfate fractionation (35-75% sat.), ultrafiltration (membrane of 30 and 1 kDa cut-off) and TDLC (molecular exclusion chromatography - MEC and C18 RP- HPLC). The fractions obtained after the C18 RP-HPLC were heated by two hours for solvent removal, and the recovered fractions were used for antimicrobial assays, SDS-Tricine- PAGE and MS analysis. Various fractions, obtained after the C18 RP-HPLC after heating were active against five plant-pathogens. Molecules with MW below 10-kDa were present in these fractions The comparison of the differential synthesis of AMPs in NGSS and in GSS48 showed that the germinated seeds present a potential for the identification of peptides with great functional importance, that are probably involved in the defense processes in plants. The adjustment of this protocol allowed an enrichment of AMPs in the SSG48 samples, which are resistant to high temperature and to the contact with acetonitrile and TFA, that were not yet described in the literature. These characteristics could be exploited for biotechnological application in agribusiness. Simultaneously, by using bioinformatic tools, searches were conducted in the database NCBI in order to identify DNA sequences coding for AMPS in soybean. A sequence of a putative defensin was recovered and used as a template for cloning in Escherichia coli. The obtained plasmid of expression (pPIC 9) was linearized and used for the transformation of Pichia pastoris. A His+ (P. pastoris) transformed colony was used for evaluation of the defensin expression and for SDS-Tricine-PAGE, in order to check their expression. The assessment by SDS-Tricine-PAGE failed to confirm the expression of defensin so far, under the conditions used. The identification of a putative defensin and the cloning procedure were carried-out successfully, and its expression is being evaluated aiming to develop various characterizations, which probably will provide different biotechnological applications for the peptides. Técnicas baseadas em separações por cromatografia líquida bidimensional (TDLC) ou multidimensional (MDLC), acopladas à espectrometria de massa (MS), têm sido utilizadas nas separações de proteínas e de peptídeos para estudos de bioprospecção de atividade antimicrobiana. O objetivo deste trabalho foi a prospecção de peptídeos antimicrobianos (AMPs) de soja (Glycine max) utilizando ferramentas proteômicas. Extratos de sementes de soja não germinadas (SSNG) e de sementes de soja germinadas por 48 horas (SSG48) foram submetidos ao fracionamento salino, aquecimento seletivo, diálise, cromatografia de troca aniônica (CTI) e de fase reversa (C18 RP-HPLC), seguindo-se análises de MS. Comparações dos perfis cromatográficos (CTI e RP- HPLC) de SSNG e SSG48 sugeriram que diferentes peptídeos estão sendo sintetizados, já que massas moleculares (MM) menores que 10 kDa foram identificadas por MS. Ensaio de biorrevelação com a fração catiônica das SSG48 mostrou que compostos com MM abaixo de 14 kDa foram capazes de inibir o crescimento da bactéria fitopatogênica Ralstonia solanacearum. Assim, objetivando conhecer melhor as características do conjunto de AMPs de SSG48, foram avaliadas diferentes metodologias utilizando diferentes técnicas de clareamento e de purificação, e um novo protocolo para a prospecção de peptídeos foi proposto, contendo as seguintes etapas: extração, fracionamento com sulfato de amônio (35-75% sat.), ultrafiltração (membranas com volume de exclusão de 30 e 1 kDa), TDLC (cromatografia de exclusão molecular - CEM e C18 RP-HPLC). As frações obtidas após a C18 RP-HPLC foram aquecidas à ebulição para a remoção dos solventes e utilizadas para ensaios de atividade antimicrobiana, SDSTricina- PAGE e MS. Diferentes frações eluídas da C18 RP-HPLC, após o aquecimento, foram ativas contra cinco bactérias fitopatogênicas, tendo sido identificadas MM inferiores a 10 kDa nessas frações. A avaliação da síntese ou da expressão diferencial de AMPs em SSNG e SSG48 evidenciou que SSG48 apresenta um potencial para a identificação de peptídeos de grande importância funcional, possivelmente envolvidos nos processos de defesa. O ajuste de protocolo permitiu um enriquecimento das amostras em AMPs em SSG48, resistentes à alta temperatura e ao contato com acetonitrila e TFA, ainda não descritos, podendo essas características ser exploradas para aplicação biotecnológica na agroindústria. Paralelamente, utilizando ferramentas de bioinformática, foram realizadas buscas em banco de dados (NCBI) visando à identificação de seqüências de DNA que codificam para AMPs em soja. Uma seqüência de uma provável defensina foi obtida e clonada em Escherichia coli. O plasmídeo de expressão (pPIC 9) contendo a defensina foi linearizado e utilizado para a transformação de Pichia pastoris, um transformante His+ foi utilizado para avaliar a expressão da defensina recombinante, e SDS-Tricina-PAGE para verificar a expressão. A avaliação por SDS-Tricina-PAGE não permitiu confirmar a expressão da defensina até o momento, sob as condições utilizadas. A identificação e clonagem de uma possível defensina foram realizadas com sucesso, e sua expressão vem sendo buscada, o que provavelmente possibilitará sua caracterização para aplicações biotecnológicas diversas.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias Xyloglucan (XG) is the major plant cell wall hemicellulose. Biochemical and structural studies on a xyloglucanase, Xgh74A, from Clostridium thermocellum are presented here. In addition, the carbohydrate-binding modules (CBMs) from C. thermocellum Cel9D-Cel44A, CtCBM30 and CtCBM44, which recognize XG, are characterized in this work. CtCel9D-Cel44A’s C-terminal module of unknown function is a CBM, constituting the founder member of family 44. Structural studies revealed that both CtCBM30 and CtCBM44 present Type B binding site topologies where tryptophans play an important role in ligand recognition. Cel44A is an endoglucanase domain displaying some xylanase activity, which action is potentiated by CtCBM44 through a targeting effect. Biochemical and structural studies on CtLic26A-Cel5E are also described here. CtLic26A is a mixed b-1,4-b-1,3-glucanase and Cel5E an endo-b-1,4- glucanase. The three-dimensional structure of CtLic26A provides insights in the mechanism of lichenan recognition by family 26 glycoside hydrolases. Finally, novel biotechnological applications for CBMs were investigated. An experiment was conducted where a barley-based diet for broilers was supplemented with CtLic26ACel5 derivatives, with or without CtCBM11, and with a commercial enzyme. The fusion of four antimicrobial peptides with CipA from CtCBM3 originated recombinants with high affinity for crystalline cellulose, indicating CBMs could fix bioactive molecules to cellulose. RESUMO: O xiloglucano é a principal hemicelulose das paredes celulares vegetais. Neste trabalho apresentam-se estudos bioquímicos e estruturais sobre a xiloglucanase Xgh74A do Clostridium thermocellum. São também estudados módulos de ligação a carbohidratos (CBMs) com afinidade para o xiloglucano, o CtCBM30 e o CtCBM44 da CtCel9DCel44A. O módulo C-terminal revelou-se um CBM, sendo o membro fundador da família 44. As estruturas cristalográficas desses CBMs mostram locais de ligação aos polissacáridos com topologia do Tipo B, nos quais os triptofanos representam um papel importante no reconhecimento dos ligandos. A Cel44A é uma endoglucanase com actividade xilanásica, cuja acção é potenciada pelo CtCBM44. Estudos bioquímicos e estruturais sobre a CtLic26A-Cel5E são também apresentados, sendo a CtLic26A uma b-1,4-b-1,3-glucanase e a Cel5E uma endo-b-1,4-glucanase. A estrutura tridimensional da CtLic26A revelou os mecanismos estruturais que modulam a especificidade da enzima. Neste trabalho são pesquisadas novas aplicações biotecnológicas para os CBMs. Efectuou-se um ensaio com frangos de carne, suplementando dietas à base de cevada com derivados recombinantes da CtLic26A-Cel5, com e sem CtCBM11, e com uma enzima comercial. A fusão de quatro péptidos antimicrobianos com a CipA do CtCBM3 originou recombinantes com elevada afinidade para celulose cristalina, indicando que os CBMs poderão fixar moléculas bioactivas a materiais celulósicos. This work was funded by Fundação para a Ciência e a Tecnologia, grant SFRH/BD/16731/2004, and co-funded by POCI 2010 and FSE from Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias Submitted by Maria São José Lalanda Ribeiro (mlalanda@fmv.utl.pt) on 2008-12-02T18:12:33Z No. of bitstreams: 2 Resumos_Tese Doutoramento_Catarina Guerreiro.pdf: 22507 bytes, checksum: 7be4a43c0ad9e475f867683c5b2e718f (MD5) Tese Doutoramento_Catarina Guerreiro_Setembro 2008.pdf: 11286475 bytes, checksum: b188ff846c082bc26e63d0d39b7dd4e8 (MD5) Made available in DSpace on 2008-12-02T18:12:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Resumos_Tese Doutoramento_Catarina Guerreiro.pdf: 22507 bytes, checksum: 7be4a43c0ad9e475f867683c5b2e718f (MD5) Tese Doutoramento_Catarina Guerreiro_Setembro 2008.pdf: 11286475 bytes, checksum: b188ff846c082bc26e63d0d39b7dd4e8 (MD5) Previous issue date: 2008-09-09 This work was funded by Fundação para a Ciência e a Tecnologia, grant SFRH/BD/16731/2004, and co-funded by POCI 2010 and FSE from Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-22Bitstream added on 2014-06-13T18:49:56Z : No. of bitstreams: 1 lopesfilho_fc_me_sjrp.pdf: 770782 bytes, checksum: 9373005f0d61b57eee8eaf4f430acc27 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Mastoparanos são peptídeos helicoidais, anfipáticos e catiônicos que apresentam diversas funções biológicas, entre elas temos a ação antimicrobiana, que está relacionada à sua afinidade por membranas aniônicas de bactérias e sua capacidade lítica. Recentes estudos têm mostrado que a formação de poros em membranas é facilitada pela agregação de peptídeos carregados. Esta situação favoreceria a hipótese de que a formação de poro é essencialmente similar a eletroporação molecular. Neste trabalho investigamos a estabilidade de um dímero do Eumenine Mastoparan-AF, um membro catiônico (+4) da família dos mastoparanos, em água e mistura TFE-água, mimetizando meio aquoso e meio membranar, respectivamente. Particular atenção foi colocada nas interações eletrostáticas de grupos carregados e polares, principalmente naqueles que participam de ligações de hidrogênio entre os dois peptídeos e na hidratação da cadeia principal e cadeias laterais apolares. Uma estrutura dimérica representativa foi inicialmente obtida por um método de docking rígido e submetida às simulações de dinâmica molecular usando o pacote GROMACS. Resultados de 50 ns de simulação em água mostram uma perda parcial do conteúdo helicoidal dos peptídeos e a estrutura dimérica se desestrutura devido às interações desfavoráveis dos resíduos hidrofóbicos com a água. Por outro lado, simulações em mistura TFE-água mostram que o dímero é estável durante o tempo observado, porque as moléculas de TFE se agrupam ao redor de resíduos hidrofóbicos criando um meio apropriado que protege as ligações de hidrogênio intra- e inter-peptídeos. Surpreendentemente, parece que a repulsão eletrostática não é a principal razão para a desagregação do dímero, o que reforça a importância da. Mastoparans are helical, amphipathic and cationic peptides that display many biological functions, among which is the antimicrobial activity, which is related to its affinity for anionic membranes of bacteria and its lytic capacity. Recent studies have shown that pore formation on membranes is facilitated by the aggregation of charged peptides. This situation would favor the hypothesis that pore formation is essentially similar to the molecular electroporation. In this work, we investigate the stability of a dimer of the Eumenine Mastoparan-AF, a cationic (+4) member of the Mastoparan family, in water and TFE-water mixture, mimicking aqueous and membrane environments, respectively. Particular attention have been put on the electrostatic interactions of charged and polar groups, mainly those participating of hydrogen bonds between the two peptides and on the hydration of the backbone and apolar side chains. A representative dimer conformation was initially obtained by a rigid docking procedure and submitted to molecular dynamics simulations using the GROMACS package. Results of 50 ns of simulation in water show a partial loose of the helical content of the peptides and the dimer structure breaks down due to unfavorable interactions of hydrophobic residues with water. On the other hand, simulations in TFE-water mixture show the dimer is stable in the running time, because TFE molecules assemble around hydrophobic residues creating a suitable environment that protect the intra- and inter-peptides hydrogen bonds. Surprisingly, it seems that electrostatic repulsion is not the main reason for disaggregation of the dimer what reinforces both the importance of aggregation and the molecular electroporation mechanism for pore formation.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The antimicrobial peptides (AMPs) are produced by animals, plants, insects and others organisms as an efficient, flexible and economical strategy of defense, consuming low energy and biomass, since they are small molecules. In plants, ten families of AMPs were identified, that are involved in the constitutive barrier of the plant defense, with molecular mass from 2 to 9 kDa. Based on the known importance of the AMPs as possible active molecules to be used for the development of defense agents for pharmaceutical applications or to the development of new classes of agriculture defensives, the goal of this project was to detect, extract and purify AMPs forms, that are present in young plants and in fully-expanded leaves of eggplants, and to evaluate the action of these peptides in vitro e in vivo against plant pathogens with commercial interest. Afterthat, this work aims the cloning and the heterolog expression in order to characterize the molecular structure of the AMPs. This project also have the goal to prospect the antimicrobial potencial of parcial-purified extracts from young plants and from fully-expanded leaves of eggplant, aiming possible biotechnological applications to control plant-pathogens growth. Leaves from 60-days plants and young plants (5 or 15 cm) of eggplants were triturated and macerated (Tris-HCl buffer, EDTA, PMSF, benzamidine and thiourea), the extract was centrifuged and the supernatant corresponded to the Soluble Extract (SE). The precipitate was washed (water), extracted with LiCl (EDTA, PMSF, benzamidina and thiourea), the homogenate was centrifuged and the supernatant corresponded to the Cell-Wall Extract (CWE). SE e CWE from the three development states were fractionated (ammonium sulfate and heating), desalted, lyophilized and separated by anionic-exchange chromatography (DEAE-Sepharose-FPLC). They were obtained two cationic (CP1 e CP2) and one anionic (AP) peaks to each evaluated-stage, that were submitted to growth-inhibition tests of the two plant pathogenic bacteria Ralstonia solanacearum and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis growth. The results indicated a best inhibition rate by CWE of young plants (5 cm), while the SE from mature plants (15 cm and leaf) was more effective. SE from expanded-leaves were submitted to an anionic-exchange chromatography in Q-Sepharose-FPLC and the five obtained pools were submitted to antibacterial tests, and PC1 was submitted to an inativation- or death-tests of plant nematodes. PC1 were selected as a promise to AMPs bioprospection, because it shown an antimicrobial effect against the two evaluated bacteria, and a nematicide effect against the nematode Meloidogyne incognita, and it was then separated by a C18-RP-HPLC. From all collected peaks, twelve were analyzed by mass spectrometry and two of them (peaks 18 and 24) presented peptides with mass from 2 and 9 kDa. The remaining-ES and -EP of expanded-leaves were separated in a Sephadex G-10 column. They were obtained four pools for each ES- and EP-separations, that were submitted to antimicrobial tests in vitro against the two plant pathogenic bacteria above mentioned, and in vivo against Ralstonia solanacearum infection in tomato plant. Some pools showed as a promise, especially the ES-pool 1 obtained by the separation in the Sephadex G-10 column, from that two fractions were separated in a C18-RP-HPLC column, and the recovered peaks were submitted to develop mass spectrometry analysis. They were found molecules with molecular mass in the peptide range. The amino acidic sequences of the peptides present in the fractions corresponding to the peaks 9 and 14 were determinated, and they need to be confirmed. The others peptide peaks will be submitted to mass spectrometry analysis,amino acidic sequenting, and antimicrobial tests, aiming to select effective peptides against plant pathogens that are of interest in the agribusiness. Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são produzidos por animais, plantas, insetos e outros organismos como estratégia de defesa eficiente, flexível e com um baixo consumo de energia e biomassa, em função de seu pequeno tamanho. Em vegetais, foram identificadas dez famílias de AMPs que participam da barreira constitutiva de defesa da planta, com massas moleculares que variam de 2 a 9 kDa. Considerando a importância dos AMPs como possíveis princípios ativos para o desenvolvimento de agentes de defesa, tanto com aplicações farmacêuticas quanto para o desenvolvimento de novas classes de defensivos para a agroindústria, o objetivo desse trabalho foi detectar, extrair e purificar formas de AMPs presentes em plantas jovens e folhas totalmente expandidas de berinjela, e avaliar a ação desses peptídeos in vitro e in vivo contra fitopatógenos de interesse comercial, visando posterior clonagem e expressão heteróloga para caracterização estrutural das moléculas. O trabalho teve ainda o objetivo de explorar o potencial antimicrobiano dos extratos parcialmente purificados, obtidos de plantas jovens e folhas totalmente expandidas de berinjela, visando possível aplicação biotecnológica no controle de fitopatógenos. Folhas de plantas com 60 dias e plântulas inteiras de berinjela (5 ou 15 cm) foram trituradas, maceradas (tampão Tris-HCl, EDTA, PMSF, benzamidina e tiouréia), o extrato foi centrifugado e o sobrenadante correspondeu ao Extrato Solúvel (ES). O precipitado foi lavado (água), extraído em LiCl (EDTA, PMSF, benzamidina e tiouréia), o homogenato foi centrifugado e o sobrenadante correspondeu ao Extrato de Parede Celular (EP). EP e ES dos três estádios de desenvolvimento foram fracionados (por sulfato de amônio e aquecimento), dessalinizados, liofilizados e separados por troca aniônica em DEAE-Sepharose-FPLC. Foram obtidos dois picos catiônicos (PC1 e PC2) e um aniônico (PA) para cada estádio, que foram submetidos a testes de inibição do crescimento das bactérias Ralstonia solanacearum e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Resultados indicaram maior inibição pelos EP obtidos das plantas mais jovens (5 cm), enquanto que para as plantas maduras (15 cm e folhas), ES foi mais ativo. ES de folhas maduras foi também submetido à cromatografia de troca aniônica em coluna Q-Sepharose-FPLC e os cinco pools obtidos foram submetidos a testes antibacterianos, e PC1 foi submetido a teste de inativação ou morte de fitonematóides. PC1 mostrou-se promissor para a bioprospecção de AMPs, por apresentar tanto atividade antibacteriana quanto nematicida contra Meloidogyne incognita, e foi então separado em C18- RP-HPLC. Dos picos coletados, doze foram analisados por espectrometria de massa e dois deles (picos 18 e 24) apresentaram peptídeos com massas entre 2 e 9 kDa. O restante de ES e EP de folhas maduras foi separado em Sephadex G-10, quando foram obtidos quatro pools, tanto para ES quanto para EP, que foram submetidos a testes antibacterianos, tanto in vitro para as duas bactérias fitopatogênicas acima citadas, quanto in vivo para Ralstonia solanacearum em tomateiros. Alguns pools mostraram-se promissores, principalmente o ES-pool 1 obtido após a separação em Sephadex G-10, do qual duas frações foram separadas em C18-RP-HPLC e os picos submetidos à espectrometria de massa. Foram identificadas moléculas com massa molecular na região peptídica de interesse. Os peptídios presentes nas frações dos picos 9 e 14 tiveram suas seqüências aminoacídicas determinadas, que precisam ser confirmadas. Outros picos peptídicos serão submetidos a análises de espectrometria de massa, seqüenciamento e testes antimicrobianos, visando selecionar peptídeos efetivos contra fitopatógenos de interesse.