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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A tolerância imunológica é um dos fenômenos pelos quais o organismo consegue tolerar autoantígenos ao invés de reagir de forma inflamatória contra eles. A tolerância oral (TO) é um mecanismo análogo à autotolerância e é definida como a supressão de respostas imunes humorais e celulares contra antígenos específicos, gerada pela administração prévia desses antígenos por via oral. A TO tem um grande potencial terapêutico para doenças inflamatórias intestinais, hipersensibilidades alimentares e doenças autoimunes, porém ainda existem algumas dificuldades para sua implementação na prática clínica tais como doses ideiais e redução da sua eficácia após a sensibilização. Para resolver essas dificuldades, é importante encontrarmos protocolos otimizados para potencializarmos a indução de TO pela ação de agentes adjuvantes como a Lactococcus lactis. O efeito adjuvante da L. lactis NCDO2118 na inibição de doenças inflamatórias tem sido estudado em alguns modelos pelo nosso grupo de pesquisa e por colaboradores, como encefalomielite autoimune experimental (EAE), artrite, colite e mesmo na inflamação induzida pela infecção por Leishmania quando esta bactéria é administrada juntamente com a proteína HSP65 e em modelo de GVHD quando ela é administrada juntamente com um aloantígeno. O objetivo do presente estudo foi avaliar os componentes da L.lactis envolvidos no efeito adjuvante da administração de L. lactis associada à ovalbumina (OVA) na indução de tolerância oral em camundongos C57BL/6. Usamos um protocolo subotimo de TO. Camundongos que ingeriram OVA associada à L. lactis NCDO2118 por via oral apresentaram níveis mais baixos de IgG1 e IgE anti-OVA no soro; frequência aumentada de células dendríticas tolerogênicas (CD11c+CD11b-CD103+), de macrófagos residentes CX3CR1+, de células Treg (CD4+LAP+) e de ILC2 na mucosa intestinal e nos linfonodos mesentéricos (MLNs) proximais. Observamos alteração no perfil da microbiota e de seus metabólitos produzidos no lumen intestinal, principalmente um aumento na produção de lactato, um ácido orgânico produzido em grande quantidade pela L. lactis. Sinergicamente houve um aumento na expressão de receptores de lactato no intestino, tais como GPR31 e principalmente GPR81 que, quando inibido por seu antagonista, gerou perda da TO. Em modelo de alergia alimentar à OVA, a L. lactis reduziu o número de eosinófilos melhorando parâmetros inflamatórios da doença. Concluímos que a L. lactis NCDO2118 desencadeou modulação da microbiota intestinal e mecanismos imunes inatos que melhoram a indução de TO a OVA, o que a torna essa bactéria um excelente adjuvante desse fenômeno.

Made available in DSpace on 2020-12-14T14:23:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 7469_15905.pdf: 334154 bytes, checksum: 52da32770b1ad7bbdfd038646ea40dc1 (MD5) Previous issue date: 2020-06-24

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O reparo de lesões na pele depende de interações entre vários tipos de células que resultam em inflamação local e ativação, migração e proliferação de queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais e leucócitos. Através da tolerância oral, fenômeno imunológico que ocorre após a ingestão de proteínas, é possível inibir a produção de anticorpos e a reduzir a inflamação. Trabalhos anteriores mostraram que uma injeção intraperitoneal de proteínas previamente ingeridas em adjuvante, minutos antes de uma lesão na pele de camundongos, reduz a inflamação e melhora a cicatrização. O objetivo deste trabalho foi avaliar se outras duas vias de aplicação - a injeção por via subcutânea (s.c.) e a aplicação tópica - de proteínas previamente ingeridas também melhoram a cicatrização de feridas. Utilizamos duas proteínas: Zeina, que está presente na ração dos camundongos; Ovalbumina, que foi adicionada à água dos camundongos e oferecida por 3 dias consecutivos, antes das lesões na pele. Duas lesões excisionais foram realizadas na pele do dorso de camundongos C57BL/6 machos, com 8 semanas de idade, utilizando um punch dermatológico de 6 mm, sob anestesia. A aplicação s.c. foi feita uma única vez na base da cauda, minutos antes das lesões na pele. O tratamento tópico foi aplicado nas feridas durante sete dias consecutivos. Grupos controle não tolerantes receberam aplicações parenterais de Ovalbumina ou veículo. A cicatrização das feridas foi analisada macroscopicamente e microscopicamente após coloração com H&E, Azul de toluidina ou Alcian Blue-Safranina, Tricrômico de Masson, Picrosirus Red e Resorcina-Fucsina de Weigert. A quantidade e distribuição de leucócitos (CD45), macrófagos (F4/80), linfócitos T (CD3), miofibroblastos (α-SMA) e Vimentina foi investigada no leito da lesão, por imunofluorescência. Análises macroscópicas mostraram menos inflamação e cicatriz mais suave nos animais que receberam aplicação de proteínas toleradas. Análises microscópicas no dia 7 após a lesão mostraram menor infiltrado inflamatório nos grupos que receberam aplicação de proteínas toleradas. Aos 40 e 60 dias após a lesão, a organização da matriz extracelular na neoderme dos grupos que receberam aplicação de proteínas toleradas estava mais semelhante à da pele intacta. Concluímos que a aplicação de proteínas toleradas diminui a inflamação e melhora a cicatrização de lesões cutâneas independentemente da via de aplicação. Skin wound healing depends on interactions between many types of cells that result in local inflammation and activation, migration and proliferation of keratinocytes, fibroblasts, endothelial cells and leukocytes. Through oral tolerance, an immunological phenomenon that occurs after protein intake, it is possible to inhibit the production of antibodies and reduce inflammation. Previous works have shown that an intraperitoneal injection of orallytolerated proteins plus adjuvant, minutes before skin injuries in mice, reduces inflammation and improves wound healing. Herein we evaluated whether two other routes of application - subcutaneous injection (s.c.) and topical application - of previously ingested proteins also improve wound healing. We used two different proteins: Zein that is a regular component of mice chow; and Ovalbumin that was added in the water offered to the mice for 3 consecutive days, before skin lesions. Two excisional lesions on the dorsal skin were performed in 8-week-old male C57Bl/6 mice with a 6 mm dermatological punch, under anesthesia. One s.c. application of the previously ingested proteins, in adjuvant, was made at the base of the tail, minutes before the lesions. Topical treatment with the previously ingested proteins, without adjuvant, was applied to the wounds for seven consecutive days. Non-tolerant control groups received treatment with the previously ingested proteins or vehicle. Wound healing was analyzed macroscopically and microscopically after staining with H&E, toluidine blue, Alcian Blue-Safranin, Masson's Trichrome, Picrosirus Red and Weigert's Resorcin-Fuchsin. The amount and distribution of leukocytes (CD45), macrophages (F4 / 80), T lymphocytes (CD3), myofibroblasts (α-SMA) and Vimentin was investigated in the wound bed by immunofluorescence. Macroscopic analyzes showed less inflammation and scarless healing in animals that received application of the tolerated proteins. Microscopic analyzes on day 7 after the injuries showed reduced inflammatory infiltrate in the groups that received application of tolerated proteins. At 40 and 60 days after the injuries, the organization of the extracellular matrix in neodermis of the groups that received application of tolerated proteins was more similar to that of intact skin. We conclude that the application of tolerated proteins decreases inflammation and improves the healing of skin lesions regardless of the route of application.

Introduction: Immune activation is characterized by an inflammatory process caused by infectious pathogens, as well endotoxins such as LPS. Although, in childhood, the innate immune system is still developing, it has greater plastic capacity, because external stimuli such as pathogens, may be able to program immune responses until adulthood. The investigation of the tolerance mechanism, as a consequence of exposure to LPS in low doses in the neonatal period, becomes relevant, as it aims to understand whether or not this first immune activation may predispose to the development of late changes after a second exposure to endotoxemic as an adult. Objective: Evaluate the consequences of systemic immune activation on the central nervous system after immunological tolerance in the neonatal period. Methods: Pre-clinical study of the experimental type. 156 male and female C57BL / 6 mice were used. The animals were mated and the offspring used for this study. The collected data were inserted into a database, developed electronically, using the IBM SPSS Statistics 24.0 software. The statistical analysis of the parametric data was performed using the ANOVA test with post-hoc Tukey, and the statistical analysis of the non-parametric data was performed using the Kruskal-Wallis tests. Results: It was observed that the animals that received LPS in the neonatal phase did not present memory deficits and low levels of IL-1b. In the group that received LPS in the neonatal and adult phase, there was an increase in the MDA equivalents and protein carbonylation in an equivalent way to the group of untreated animals. Conclusion: It was found that animals that were subjected to immunological tolerance did not show changes in aversive memory and habituation as well as in IL-1β levels and oxidative damage in brain tissue after receiving an effective dose of LPS. Introdução: A ativação imune é caracterizada por um processo inflamatório ocasionado infeccioso por agentes patogênicos e também, por endotoxinas como o lipopolisacarídeo (LPS). Embora, na infância o sistema imune inato ainda esteja em desenvolvimento, possui maior capacidade plástica, pois estímulos externos como patógenos, podem ser capazes de programar respostas imunes até a idade adulta. A investigação do mecanismo de tolerância, como uma consequência à exposição ao LPS em doses baixas no período neonatal, torna-se relevante, pois visa entender se esta primeira ativação imune pode ou não pré-dispor ao desenvolvimento de alterações tardias após uma segunda exposição a endotoxêmicos quando adulto. Objetivo: Avaliar as consequências da ativação imune sistêmica sobre o sistema nervoso central após tolerância imunológica no período neonatal. Métodos: Estudo pré-clínico do tipo experimental. Utilizou-se 156 camundongos C57BL/6 machos e fêmeas. Os animais foram acasalados sendo a prole utilizada para este estudo. Os dados coletados foram inseridos em um banco de dados, desenvolvido em meio eletrônico, no software IBM SPSS Statistics 24.0. A análise estatística dos dados paramétricos realizou-se por meio do teste de ANOVA com post-hoc Tukey, e a análise estatística dos dados não paramétricos realizou-se pelos testes de Kruskal-Wallis. Resultados: Observou-se que os animais que receberam LPS na fase neonatal não apresentaram déficits de memória e níveis baixos de interleucina (IL)1β. No grupo que recebeu LPS na fase neonatal e adulta, houve aumento dos equivalentes malondialdeído (MDA) e carbonilação de proteínas de maneira equivalente ao grupo de animais não tratados. Conclusão: Verificou-se que os animais que foram submetidos a tolerância imunológica não apresentaram alteração na memória aversiva e de habituação bem como nos níveis de IL-1β e no dano oxidativo em tecido cerebral após receberam uma dose efetiva de LPS.

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune sistêmica em que a inflamação das articulações determina a sua destruição e perda da mobilidade. Não há prevenção ou cura para a artrite reumatoide, e o tratamento baseia-se em anti-inflamatórios e analgésicos, restrito ao controle dos sintomas. A perda de tolerância na doença autoimune pode ser restaurada por ingestão do antígeno. Este processo induz tolerância oral, e os seus efeitos terapêuticos são bem estabelecida em modelos experimentais e clínicos. No entanto, a ingestão contínua de antígeno purificado nem sempre é viável. A Hsp65 é uma chaperonina essencial ne dobramento de proteínas e adaptação ao estresse celular. Ela também é uma potente reguladora da resposta imune e do processo inflamatório. Para a entrega direta de Hsp65 na mucosa, nós usamos uma linhagem recombinante de Lactococcus lactis que secreta Hsp65 de Mycobacterium leprae. Demonstramos que a terapia oral com Hsp65 inibiu a Artrite Induzida por Colágeno e um modelo agudo de artrite em camundongos. Este efeito preventivo incluiu a inibição do edema da pata, a inflamação das articulações. Ele esteve também associado à redução dos níveis de citocinas inflamatórias e de anticorpos patogénicos, assim como ao aumento de linfócitos B e T reguladores Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease in which inflammation of the joints determines its destruction and loss of mobility. There is no prevention or cure for RA, and the treatment is based on conventional anti-inflammatory, analgesic drugs restricted to symptoms control. The loss of tolerance resulting in pathogenic autoimmunity can be restored by ingestion of the target antigen. This procedure induces oral tolerance, and their therapeutic effects are well established in experimental models and clinical trials. However, the continuous intake of purified antigen is not always feasible as an alternative therapy. Hsp65 is a chaperonin essential to protein folding and response to cellular stress. The Hsp65 is also a known regulator of the immune response and inflammatory process. For direct delivery of Hsp65 to the mucosa, a recombinant Lactococcus lactis was constructed in a way to produce and secret Mycobacterium leprae Hsp65. The present study has shown that the therapy with Lactococcus lactis prevented a Collagen Induced Arthritis and a model of acute arthritis in mice. This preventive effect included inhibition of paw edema and joint inflammation associated with reduced levels of inflammatory cytokines and pathogenic autoantibodies and augmented numbers of regulatory B and T lymphocytes

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior No início do século XX observou-se que cobaias que haviam se alimentado com ração contendo milho reagiam menos imunologicamente às proteínas do milho, como a zeína, quando comparadas com cobaias não alimentadas com milho. Atualmente, sabemos que a absorção de proteínas intactas ou parcialmente digeridas através da mucosa intestinal é uma ocorrência comum após as refeições. Estas proteínas interferem na atividade do sistema imune e um resultado usual destas interferências é a tolerância oral, um fenômeno que consiste na diminuição de respostas imunes para proteínas previamente contactadas por via oral. Desde os primeiros relatos sobre a influência de proteínas da dieta sobre a atividade imunológica várias proteínas vegetais e animais foram utilizadas em estudos sobre a tolerância oral, tais como a ovalbumina de galinha (OVA), a gamablobulina bovina (BGG) e hemocianina de animais marinhos (KLH). Uma vez que estas proteínas animais não fazem parte da dieta usual dos camundongos, elas são introduzidas na ração ou diluídas em água para a indução de tolerância oral. Animais que ingerem OVA antes da imunização com OVA+Al(OH)3 (um adjuvante) formam menos anticorpos para OVA do que os que não ingeriram a mesma; mas a ingestão de OVA não interfere na imunização com outra proteína. Curiosamente, se durante a imunização com esta segunda proteína for realizada também uma imunização com a proteína tolerada, a formação de anticorpos para esta proteína “não-tolerada” é também diminuída. Também, a tentativa de imunização de animais tolerantes com o antígeno tolerado em adjuvante inibe reações inflamatórias, como as desencadeadas por injeção de carragenina no coxim plantar de camundongos. Estes efeitos desencadeados pela injeção do antígeno tolerado são denominados "efeitos indiretos da tolerância oral”. Nosso grupo de pesquisa mostrou que os efeitos indiretos da injeção de OVA em camundongos tolerantes a OVA inibem a inflamação após lesões na pele de camundongos e, como resultado, forma-se uma cicatriz menor. Neste trabalho, mostramos que a injeção i.p. de zeína em adjuvante Al(OH)3 diminui o infiltrado inflamatório, reduz a área do tecido de granulação e reduz a cicatriz em lesões na pele de camundongos saudáveis e diabéticos. Os efeitos indiretos modificaram também a cicatrização em curso, quando a proteína tolerada foi injetada 6 horas após a lesão. Além disso, verificamos que os efeitos indiretos da tolerância oral pela injeção de zeína aumentaram a expressão de TGF- β3 no leito da ferida. Estes resultados indicam que a injeção parenteral de proteínas toleradas pode ser explorada como uma possibilidade de tratar lesões cutâneas em condições onde a cicatrização é mais difícil de ocorrer At the beginning of the twentieth century it was observed that animals that had been fed with animal chow that contained corn proteins did not react immunologically to zein. Today we know that the absorption of intact or partially digested proteins through intestinal mucosa is a common occurrence after meals. These proteins interfere with the activity of the immune system and a common result of these interferences is oral tolerance. The first reports on the influence of dietary proteins on the immune activity were made with plant and animal proteins but most studies on oral tolerance have been made using animal-derived proteins. Animal proteins, such as ovalbumin (OVA) is not a regular diet component of mice and, for oral tolerance induction, it has to be introduced in their drinking water. Mice that drink a solution containing OVA before immunization with OVA+Al(OH)3 form less antibodies than those animals that do not receive OVA. However the ingestion of OVA does not interfere with immunization to other proteins, except when during the immunization with the second protein the tolerated protein is also given, a phenomenon named "indirect effects of oral tolerance". Indirect effects of oral tolerance to OVA also inhibit inflammatory reactions, such as those triggered by carrageenan and improves skin wound healing in mice. In here we show that, the indirect effects of oral tolerance triggered by intraperitoneal injection of zein minutes before a skin wound in both health and diabetic mice reduce the inflammatory infiltrate and improve the healing of cutaneous wound. Mice that have received i.p. injection of zein+Al(OH)3 before cutaneuos wound had reduced scar. Moreover, we show that indirect effects of oral tolerance can improve the healing of a lesion already in process or in conditions where the healing process is more difficult to occur as in diabeties. The indirect effects of oral tolerance triggered by i.p. injection of zein increased the level of TGF-β3 in the wound bed. These results indicate that parenteral injection of tolerated proteins may be explored as a possibility to treat skin ulcers in cases where cutaneous wound healing is more difficult to occur.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:13:28Z No. of bitstreams: 1 Juliana do Outeiro Santos Benfica Tese completa.pdf: 1883475 bytes, checksum: b374f1236f3848f31df0dc758350bd20 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:13:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana do Outeiro Santos Benfica Tese completa.pdf: 1883475 bytes, checksum: b374f1236f3848f31df0dc758350bd20 (MD5) Previous issue date: 2015-10-30 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The Oral Tolerance (OT) is a physiological mechanism of systemic non-inflammatory activity to a previously ingested immunogen and mediated by regulatory cells. In Bystander suppression by OT, responses to a second immunogen are regulated when it is presented along with the immunogen for which tolerance was previously established. Two strains of mice with extreme phenotypes of susceptibility (TS) and resistance (TR) to OT were developed by bidirectional genetic selection. The TS strain has a regulatory profile and, when infected with Leishmania amazonensis, develops a reduced lesion; while the TR strain develops an exacerbate lesion due to their inflammatory profile. TR mice subjected to bystander oral tolerance, that is, tolerized with ovalbumin (2mg OVA), immunized with OVA and, simultaneously infected, develop a reduced lesion. The aim of this study was to evaluate the participation of immunoregulatory cells (regulatory T lymphocytes - Tregs - and tolerogenic dendritic cells) in reducing inflammatory lesions in animals treated with oral tolerance and infected with L. amazonensis. TR mice subjected to bystander oral tolerance have increased Treg cells at the site of infection associated with reduced inflammatory lesion. Adoptive transfer of Tregs from tolerized mice (2mg OVA) to infected and immunized (OVA) TR individuals mimics the effect of bystander oral tolerance, decreasing the inflammatory lesion, suggesting the involvement of Treg cells in the bystander suppression. In addition, tolerogenic dendritic cells (DCs) were transferred from the mesenteric lymph nodes of tolerized TR or TS individuals to infected TR mice. The development of the inflammatory lesion and the percentage of Tregs (CD4+ CD25+ Foxp3+) in the infected animals were evaluated. The development of the infection was lower in TR mice that received tolerogenic DCs (from both TR as TS tolerized), compared to the ones solely infected, and being similar to the induced and infected group (bystander oral tolerance), suggesting the participation of Treg cells in bystander suppression. The tolerogenic DCs transfer also increased the percentage of Tregs in infected TR mice. Our results allow to infer that the tolerogenic DCs, possibly inducing the differentiation of Treg cells, participate in the reduction of inflammatory lesions in animals infected with L. amazonensis, as one of the mechanisms of bystander oral tolerance. A tolerância oral (TO) é um mecanismo fisiológico de resposta não-inflamatória sistêmica a um imunógeno previamente ingerido e mediado por células reguladoras. Na tolerância oral bystander, as respostas a um segundo imunógeno são reguladas quando apresentado junto ao imunógeno cuja tolerância foi previamente estabelecida. Duas linhagens de camundongos com fenótipos extremos de susceptibilidade (TS) e resistência (TR) à TO foram desenvolvidas por seleção genética bidirecional. Os animais TS têm perfil regulador e, quando infectados com Leishmania amazonensis, desenvolvem lesão reduzida; enquanto os TR, por seu perfil inflamatório, têm lesão exacerbada. Camundongos TR submetidos à tolerância oral bystander, isso é, tolerizados com ovalbumina (2 mg de OVA), imunizados com OVA e, simultaneamente infectados, têm lesão reduzida. O objetivo deste trabalho foi avaliar a participação das células imunoregulatórias (linfócitos T regulatórios Tregs - e células dendríticas tolerogênicas) na redução da lesão em animais submetidos à tolerância oral e infectados com L. amazonensis. Camundongos TR submetidos à tolerância oral bystander têm aumento das células Tregs no sítio da infecção associado à redução da lesão. A transferência de Tregs provenientes de animais tolerizados (2 mg de OVA) para TR infectados e imunizados (com OVA), mimetiza o efeito da tolerância oral bystander, diminuindo a lesão inflamatória, sugerindo a participação de células Tregs na supressão bystander. Também foram transferidas células dendríticas (DCs) tolerogênicas, provenientes dos linfonodos mesentéricos de animais TR ou TS tolerizados, para camundongos TR infectados. Foram avaliados o desenvolvimento da lesão e a proporção de células Tregs (CD4+ CD25+ Foxp3+) nos animais infectados. O desenvolvimento da infecção foi menor nos camundongos TR que receberam DCs tolerogênicas (provenientes tanto de TR quanto de TS tolerizados), comparando aos somente infectados, sendo similar aos tolerizados e infectados (tolerância oral bystander), sugerindo a participação de células Tregs na supressão bystander. A transferência de DCs tolerogênicas também aumentou a proporção de Tregs nos TR infectados. Nossos resultados permitem inferir que as DCs tolerogênicas, possivelmente induzindo a diferenciação de Tregs, participam da diminuição da lesão inflamatória em animais infectados com L. amazonensis, sendo um dos mecanismos da tolerância oral bystander.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. Após um episódio de infarto do miocárdio, cardiomiócitos necrosados liberam componentes intracelulares os quais se configuram como antígenos, e desencadeiam assim, uma resposta autoimune contra o tecido cardíaco. Em um trabalho prévio realizado por nosso grupo encontramos que a tolerância imunológica aos antígenos cardíacos pode ser reforçada por meio do tratamento oral com proteínas cardíacas, e parece ser benéfica ao processo de reparo tecidual e função cardíaca após a indução de isquemia. Desta forma, o principal objetivo deste trabalho foi estudar em maiores detalhes estas observações e ainda, caracterizar o fenótipo dos leucócitos presentes no infiltrado celular inflamatório. Lesões cardíacas semelhantes ao infarto foram induzidas em ratos Wistar machos (grupo ISO) através da injeção de altas doses de isoproterenol (150 mg/Kg, em dois dias consecutivos). A tolerância imunológica aos antígenos cardíacos foi desenvolvida por meio da exposição oral aos componentes do coração 7 dias antes da indução da lesão miocárdica (grupo TOL+ISO). Animais naïve foram usados como controles não-infartados (grupo CTR). Com a finalidade de se acessar a função cardíaca e o processo inflamatório que tomou parte após a indução da lesão isquêmica, foram realizadas avaliação hemodinâmica e análise imunohistoquímica. Observamos que, enquanto os animais do grupo ISO apresentaram um proeminente dano sistólico e diastólico cardíaco, os animais do grupo TOL+ISO apresentaram fração de ejeção preservada tanto 3 dias após a indução da lesão miocárdica isquêmica (CTR 73,4 ± 2,8; ISO 44,6 ± 6,3; TOL+ISO 74,3 ± 4,4; P < 0,05 entre o grupo CTR e o grupo ISO), quanto 15 dias após (CTR 73,4 ± 2,8; ISO 53,6 ± 8.,8; TOL+ISO 66,6 ± 4,1; P < 0,05 entre grupo CTR e grupo ISO). A análise imunohistoquímica dos níveis de expressão de IL-10, arginase-1, NOS-2 e fosfo-p65 revelou que os animais tornados tolerantes aos antígenos cardíacos (TOL+ISO) são capazes de mobilizar a resposta anti-inflamatória de forma antecipada e mais pronunciada, quando comparado aos animais do grupo ISO. Em conjunto, nossos dados sugerem que a tolerância oral aos antígenos cardíacos pode ser capaz de melhorar o processo de reparo tecidual após lesão isquêmica, uma vez que acelerou o processo de resolução da inflamação, e que isso se correlacionou com o melhor desempenho cardíaco global. Abstract : After a myocardial infarction episode, necrotic cardiomyocytes can release antigens that trigger autoimmunity phenomena against the cardiac tissue. In a previous work we found that the reinforcing immunological tolerance to such cardiac antigens might benefits myocardial healing and function after isoproterenol-induced damage. Thus, the main objective of the present study was to further address those observations, and characterize the phenotype of infiltrating leukocytes. Infarction-like myocardial lesions were induced in male Wistar rats (ISO group) through the injection of high doses of isoproterenol (150 mg/kg, two consecutive days). Immunological tolerance to cardiac antigens was developed by means of oral exposure to cardiac antigens 7 days before isoproterenol-induced myocardial lesions (TOL+ISO group). Naïve animals were used as non-infarcted control (CTR group). Hemodynamics and immunohistochemistry analysis were performed do asses myocardial function and inflammation. We found that while ISO-treated animals presented systolic and diastolic impairment, TOL+ISO animals presented preserved ejection fraction at 3 d (CTRL 73.4 ± 2.8; ISO 44.6 ± 6.3; TOL+ISO 74.3 ± 4.4; P < 0.05 between CTRL and ISO) and 15 d (CTRL 73.4 ± 2.8; ISO 53.6 ± 8.8; TOL+ISO 66.6 ± 4.1; P

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:14Z : No. of bitstreams: 1 000826959_20150730.pdf: 4030174 bytes, checksum: f38556cf39a6216769a4090df5ef6aaf (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:21:14Z: 000826959_20150730.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:26Z : No. of bitstreams: 1 000826959.pdf: 12698179 bytes, checksum: 8cb2268647197309feff08e38a458970 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune que compromete as articulações. A maioria das terapias utilizadas para o seu tratamento é baseada na inibição global da resposta imune, podendo aumentar a susceptibilidade a agentes infecciosos. O objetivo geral deste projeto foi definir estratégias tolerogênicas específicas para profilaxia ou terapia da AR. Para isso, em uma primeira etapa, estabelecemos um modelo de artrite induzida por proteoglicano (PG) bovino. Camundongos BALB/c fêmeas retired breeders imunizados com PG bovino associado ao adjuvante brometo de dimetil dioctadecil amônio apresentaram os sinais clínicos característicos da artrite, como eritema e edema decorrentes da inflamação articular de uma ou mais patas. A análise histopatológica mostrou a presença de hiperplasia sinovial, infiltrado inflamatório (formação de pannus), destruição da cartilagem e erosão óssea. A incidência da doença foi de 100% e os animais artríticos produziram níveis significativos de citocinas pró e anti-inflamatórias e anticorpos IgG1 e IgG2a anti-PG. Em uma segunda etapa, testamos o potencial profilático do PG. A inoculação de três doses de 50 μg de PG determinou um efeito profilático caracterizado pela diminuição significativa da incidência da artrite e do escore clínico dos animais. A diminuição da produção de IFN-g e IL-17, bem como o aumento da produção de IL-4 e IL-10 por células esplênicas estimuladas com PG, podem estar contribuindo para o efeito profilático observado neste grupo. Em uma terceira etapa, avaliamos o potencial terapêutico da associação da vitamina D ativa (VitD3) com o PG. A associação VitD3+PG determinou um efeito terapêutico na artrite experimental caracterizado por diminuição significativa do escore clínico. Este feito foi confirmado pela análise histopatológica que revelou que a maioria das patas do grupo tratado apresentou estrutura articular bem preservada, ... Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease that affects the joints. Most of the therapies used for RA treatment are based on general suppression of immune response, which may increase the susceptibility to infectious agents. The main objective of this work was to establish specific tolerogenic strategies for prophylaxis or therapy of RA. For this purpose, we first established a model of arthritis induced by bovine proteoglycan (PG). Female BALB/c retired breeder mice immunized with bovine PG associated with dimethyl-dioctadecyl ammonium bromide adjuvant developed a typical arthritis characterized by erythema and edema resulting from joint inflammation of one or more paws. Histopathological analysis showed the presence of synovial membrane hyperplasia, inflammatory infiltrates (pannus formation), cartilage destruction and bone erosion. Disease incidence was 100% and the arthritic mice produced significant levels of pro and anti-inflammatory cytokines and IgG1 and IgG2a anti-PG antibodies. Further, we tested the prophylactic potential of PG. Three doses of 50 μg of PG determined a prophylactic effect characterized by a significant decrease in both, arthritis incidence and clinical scores. The decrease in IFN-g and IL-17, as well as the increase in IL-5 and IL-10 production by spleen cells stimulated with PG may be contributing to the prophylactic effect observed in this group. Lastly, we evaluated the therapeutic potential of the combination of active vitamin D (VitD3) with PG. The VitD3+PG association determined a therapeutic effect in experimental arthritis. There was a significant decrease in the clinical scores after VitD3+PG treatment that was confirmed by the histopathological analysis. Most mice paws from the treated group presented well preserved joint structures that were similar to the ones present in healthy animals. Both pro and anti-inflammatory cytokines were decreased after this treatment. No differences were ...

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-11. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:59Z : No. of bitstreams: 1 000854046.pdf: 1970431 bytes, checksum: a29a47eeb44d6d6a90258f9d36ebbdf4 (MD5) Uma das aplicações da terapia imunossupressora é evitar que ocorra rejeição em situações de transplante de órgãos e auxiliar na sobrevida dos indivíduos. O ácido micofenólico (A.M.) é um imunossupressor de caráter anti-proliferativo, inibidor da inosina 5-monofosfato desidrogenase, porém, apresenta baixa biodisponibilidade oral e por isso na terapêutica utiliza-se o seu pró-fármaco: micofenolato de mofetila. Este trabalho teve como objetivo a síntese de pró-fármacos mútuos do ácido micofenólico ligados a derivados ftalimídicos a fim de garantir-lhe melhorias farmacocinéticas e farmacodinâmicas. Os derivados ftalimídicos encontrados na estrutura de compostos, por exemplo, na talidomida, utilizada em doenças auto-imunes, agem como imunossupressores por inibição de citocinas pró-inflamatórias. Os pró-fármacos foram obtidos com rendimentos que variaram entre 40-53%. As novas moléculas foram caracterizadas utilizando métodos analíticos como ressonância magnética nuclear (RMN), espectrometria na região de infravermelho e espectrometria de massas. Além disso, o coeficiente de partição (log P) foi determinado pelo método de HPLC e usando os programas de Chem Draw® Ultra e AlogPS®.O log P experimental dos derivados apresentou valores entre 2,29 e 4,09. Avaliou-se a citotoxicidade, liberação óxido nítrico (NO) e de citocinas (IL-1β e TNF-α) usando linhagens celulares de macrófagos murinos. A genotoxicidade in vivo foi avaliada usando o teste de micronúcleo. Todos os compostos apresentaram viabilidade celular superior a 70% nas concentrações usadas. O pró-fármaco (E)-2-(1,3-dioxoisoindolin-2-il) etil6-(4-hidroxi-6-metóxi-7-metil-3-oxo-1,3-dihidroisobenzofuran-5-il)-4-metilhex-4-enoato (3a) apresentou valores de IC50 de 200 μM. Na avaliação da inibição de TNF-α todos os pró-fármacos apresentam atividade nas concentrações utilizadas... One of the applications is immunosuppressive therapy to prevent rejection occurs in situations of organ transplantation and assist in the survival of individuals. Mycophenolic acid (MA) is an immunosuppressive anti -proliferative character inhibitor of inosine 5 -monophosphate dehydrogenase but has a low oral bioavailability and therefore therapeutic uses is the prodrug thereof: mycophenolate mofetil. This work aimed at the synthesis of mutual prodrugs of mycophenolic acid derivatives linked to ftalimidic to ensure you Pharmacokinetic and pharmacodynamic improvements. The ftalimdic derived from compounds found in the structure, for example in thalidomide used in autoimmune diseases, they act as immunosuppressants by inhibiting pro-inflammatory cytokines. The prodrugs were obtained with yields ranging from 40-53 %. The new molecules were characterized using analytical methods such as nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in the infrared region and mass spectrometry. In addition, the partition coefficient (log P) was determined by HPLC method using programs Chem Draw Ultra ® and AlogPS ®. Experimental log P of the derivatives showed values between 2.29 and 4.09. Cytotoxicity was assessed, the release nitric oxide (NO) and cytokines (IL- 1β and TNF- α) using murine macrophage cell lines. The in vivo genotoxicity was assessed using the micronucleus test. All compounds showed cell viability above 70 % in the concentrations used. The prodrug (E) -2 - (1,3- dioxoisoindolin -2- yl) etil 6 -(4 -hydroxy- 6-methoxy -7-methyl -3-oxo -1,3- dihydroisobenzofuran -5- yl) 4- methylhex -4- enoate ( 3a ) showed IC50 values of 200 mM . In evaluating the inhibition of TNF- α all prodrugs exhibit activity at the concentrations used were the most active, and 3a (E) - (1,3- dioxoisoindolin -2- yl) methyl 6 - (4 -hydroxy -6- methoxy -7-methyl -3-oxo -1,3- dihydroisobenzofuran -5-yl )-4 -methylhex- 4-enoate (3c) with IC50 values of 18.75 mM . In ...

Made available in DSpace on 2017-07-21T20:00:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Murilo Delgobo.pdf: 2288840 bytes, checksum: d9ce3a086e9ee92b92ac76ac76264e04 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 Brown-Spider’s venom (Loxosceles sp.) is presented as a complex mixture of toxins, able to induce skin necrosis with gravitational spreading, intense inflammatory response, edema induction and increase in vascular permeability in vivo. Recently, the biotechnological potential of the toxins was explored by its use in clinical test, in the study of inflammatory response, as a research tool in cell biology, as a biopesticide and in immunotherapy, through the production of antiserum. In this context, immunotherapy is broadly spread through the production of vaccines, available for the treatment of deleterious reactions developed in accidents. In the present work, we investigated if immunological tolerance induction to dermonecrotic recombinant toxin (LiRecDT1) and its mutated form (LiRecDT1 H12A), through its oral administration, could modulate inflammatory and deleterious responses triggered by dermonecrotic toxin. For this purpose, an oral tolerance protocol was designed, consisting in the administration of 10 μg of LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A three times in a week, for three weeks. Adult Swiss mice were further immunized, and oral tolerance induction was observed by reduction in serum levels of IgG antibody anti-toxin when compared with control group. It was observed that mice tolerant to LiRecDT1 H12A present a reduction in paw edema, caused by the injection of 6 μg of dermonecrotic toxin in plantar surface hind paw. Mice tolerized with LiRecDT1 and challenged with 50 μg of dermonecrotic toxin, exhibited higher survival, when compared to control group. This effect was not observed in mice tolerized to LiRecDT1 H12A. The present findings suggested that oral tolerance induction to LiRecDT1 H12A was able to alleviate inflammatory responses triggered by dermonecrotic toxin in paw edema and oral tolerance to LiRecDT1 increase survivability in challenge. The results shown that LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A can be explored as a tool in the induction and study of oral tolerance phenomena. The generation of T regulatory cells (Tregs) and following involvement of immunosuppressive cytokines might take part in the modulation of immune response. O veneno de aranha-marrom (Loxosceles sp.) apresenta-se como uma mistura complexa de toxina, capazes de causar necrose com espalhamento local, intensa resposta inflamatória, indução de edema e aumento da permeabilidade vascular in vivo. Recentemente, o potencial biotecnológico das toxinas foi explorado através de seu uso em análises clínicas, no estudo da resposta inflamatória, como ferramenta de pesquisa na biologia celular, como biopesticidas e na imunoterapia, através da produção de anti-soro. No presente trabalho, foi investigado se a indução de tolerância imunológica à toxina dermonecrótica recombinante (LiRecDT1) e sua forma mutada (LiRecDT1 H12A), através de sua administração oral, poderia modular as respostas inflamatórias e deletérias causadas pela toxina dermonecrótica. Para tal, foi desenvolvido um protocolo para indução de tolerância oral, consistindo na administração de 10 μg de LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A três vezes por semana, durante três semanas. Camundongos Swiss fêmeas adultas foram posteriormente imunizadas, e a indução de tolerância foi confirmada pela diminuição nos níveis de anticorpos IgG anti-toxina em relação ao grupo controle, resultado que aponta a obtenção de sucesso na indução de tolerância imunológica. Observou-se que animais tolerantes a LiRecDT1 H12A apresentaram uma diminuição no edema desenvolvida na pata, causado pela aplicação de 6 μg de LiRecDT1 na superfície plantar traseira. Animais tolerizados com LiRecDT1 e desafiados com 50 μg intraperitoneal de toxina dermonecrótica apresentaram maior índice de sobrevivência, quando comparados ao grupo controle. Esse efeito não foi observado em animais tolerizados com LiRecDT1 H12A. Os dados obtidos no presente trabalho sugerem que a indução de tolerância oral à LiRecDT1 H12A é capaz de atenuar o desenvolvimento da resposta inflamatória no edema de pata, enquanto a tolerância oral a LiRecDT1 foi capaz de aumentar a sobrevivência em animais desafiados com LiRecDT1. Os resultados demonstram que as toxinas LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A podem ser exploradas como ferramenta na indução e estudo da tolerância oral. A geração de células T regulatórias (Tregs) e subsequente participação de citocinas imunossupressoras devem estar envolvidas na modulação da resposta imune.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-01-21Bitstream added on 2015-04-09T12:48:05Z : No. of bitstreams: 1 000814238.pdf: 438890 bytes, checksum: f7cc8219db858e87f195b5d08dbb8b04 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) itochondrial dysfunction is associated with the manifestation and origin of diseases and disorders. The new paradigm complements the current mitochondrial dogma, whereby molecules present on or inside the mitochondria may act as immune regulators in response to stress or pathogens. Canine distemper virus infection (CDV) is responsible to immunosuppressive stage when the virus replicates among immune cells. For this purpose, canine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) collected from healthy dogs were cultured and infected by CDV vaccine strain (Onderstepoort) and after 24 h post-infection (p.i.) superoxide dismutase (SOD1), antioxidant like protein 1 (AOP-1) and heat shock protein 70 (Hsp-70) enzymes were search in PBMC by immunofluorescence. The expression of mRNA of respective genes was performed in infected and uninfected canine PBMC at 24 h post-infection by real time polymerase chain reaction. Mitochondrial dysfunction was evaluated by the use of MitoTracker™Green and JC-1 probes at the same post-infection time. The vaccine strain induced loss of PBMC viability in more than 80% of infected cells in comparison to control group (p

Resumo: A infecção pelo Papilomavírus humano (HPV), que tem tropismo por mucosas e que se aloja no epitélio escamoso pluriestratificado que reveste o colo do útero, pode induzir o desenvolvimento de lesões intra-epiteliais de alto grau (NIC II e NIC III). Quando não tratadas, essas lesões podem progredir ao Câncer Cervical (CC). O câncer do colo do útero é o segundo tipo de câncer mais comum, e a maior causa de mortalidade em mulheres no mundo. Genes HLA não clássicos, em especial o gene HLA-G, por seu papel na imunotolerância, tem sido investigados quanto à proteção e/ou susceptibilidade a uma série de doenças causadas por vírus, câncer, entre outras. De acordo com evidências recentes, a expressão de HLA-G, na superfície da célula tumoral, teria efeito imunomodulador sobre as células Natural Killer, linfócitos T, além de inibir a resposta imune. O objetivo desse estudo de associação caso-controle, foi investigar a influência dos SNPs localizados na região promotora do gene HLA-G em mulheres com lesões intraepitelias cervicais de Grau II e Grau III e mulheres controle. As configurações haplotíplicas para os 8 SNPs (-1306, -1179, -1155, -1140, -1138, -1121, -990, -964) investigados na região promotora de HLA-G foram comparadas entre os grupos "pacientes” e "controles”. O estudo foi conduzido numa amostra constituída por 194 mulheres, sendo que 70 apresentavam NIC II e 51 apresentavam NIC III ambas HPV positivas. O grupo controle foi constituído por 73 mulheres sem lesão epitelial cervical e sem a presença do vírus HPV. O DNA foi extraído de amostras do sangue periférico pela técnica de Salting out, e a genotipagem foi realizada por seqüenciamento com ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems, CA, USA). Para as análises estatísticas utilizou-se o software BioEstat v.5.0. Aplicou-se o teste exato de Fisher em tabelas 2x2, considerando-se significância estatística quando p=0,05. A estimativa das frequências haplotípicas foi executada com o software Phase 2.1. Notou-se uma maior freqüência, do Haplótipo LCR H1.1 (GAGAACGG) em mulheres controles (CLS) tanto na comparação estratificada NIC III x CLS (p=0,0130; OR=1,87; IC=1,10-3,17) quanto na comparação entre grupos CLS x PAC (NIC II + NIC III;p=0,0471; OR=1,5; IC=0,98-2,27). Agrupando-se as principais configurações haplotípicas dos grupos H1 e H2, observou-se um aumento significativo na freqüência dos haplótipos agrupados em H2, nas comparações NIC III x CLS (p=0,0281; OR=1,7; IC=1,01-2,84) e CLS x PAC (NIC II + NIC III; p=0,0192; OR=1,5; IC=1,04-2,42).Esses resultados são sugestivos de uma provável participação da Região Controladora de Locus (LCR) com o desenvolvimento do CC, tornando o HLA-G um gene candidato a ser melhor investigado como biomarcador de resistência (Haplótipo H1.1) e susceptibilidade (Haplótipo H2) na progressão das lesões intraepiteliais cervicais e o desenvolvimento do CC.

Introdução: Desde a década de 1970, quando se observou que a transfusão pré-transplante renal diminuía a rejeição ao enxerto, o efeito transfusion-related immunomodulation (TRIM) vem sendo estudado, não havendo, ainda, um entendimento completo de seu mecanismo. Recentemente, a descrição das células T reguladoras (TREG) trouxe novas possibilidades de compreensão desse fenômeno, com grande implicação terapêutica. Objetivos: Avaliar a proporção de células TREG antes e após a transfusão de concentrado de hemácias em uma amostra de pacientes clínicos não imunossuprimidos e correlacionar os resultados com o volume transfundido e o tempo de estocagem do sangue. Métodos: Pacientes com diversas patologias clínicas e com indicação de transfusão de concentrado de hemácias foram recrutados consecutivamente. Após assinatura do consentimento informado, o número de células TREG pré e pós-transfusão foi avaliado, bem como sua correlação com o número de unidades transfundidas e o tempo de estocagem. Resultados: Observou-se um aumento estatisticamente significativo na proporção de células TREG (CD4+, CD25+, FOXP3+) 72 horas após a transfusão (p=0,003). Tal aumento mostrou correlação com o número de unidades transfundidas, mas não com o tempo de estocagem (p=0,017 e 0,49, respectivamente). Conclusão: O aumento do numero de células TREG parece estar presente após transfusão de hemácias não leucodepletadas mesmo em uma amostra heterogênea, o que reforça sua importância clínica. A influência do número de unidades mas não do tempo de estocagem corrobora estudos anteriores. O mecanismo molecular do efeito TRIM, bem como seu impacto clínico em um cenário real, ainda precisam ser melhor avaliados. Background: Transfusion-related immunomodulation (TRIM) has been the subject of research since the 1970s, when transfusion before kidney transplantation was found to decrease the rates of allograft rejection, but the mechanisms underlying this effect have yet to be fully elucidated. The recent description of regulatory T cells (TREG) has paved the way for a new understanding of this phenomenon, with major therapeutic implications. Objectives: To assess the levels of TREG cells before and after transfusion of packed red blood cells in a clinical sample of non-immunosuppressed patients and to correlate findings with the volume of blood transfused and length of storage. Methods: Patients with a variety of clinical conditions and with an indication for transfusion of packed red blood cells were recruited consecutively. After providing informed consent, pre- and post-transfusion TREG levels were measured, and their correlation with number of units transfused and length of storage was assessed. Results: There was a significant increase in the levels of TREG cells (CD4+/CD25+/FOXP3+) within 72 hours of transfusion (p=0.003). This increase correlated with the number of units transfused, but not with length of storage (p=0.017 and 0.49, respectively). Conclusion: An increase in TREG cell levels appears to follow transfusion of non-leukoreduced packed red blood cells even in a heterogeneous sample, which highlights the clinical relevance of this phenomenon. The influence of number of transfused units, but not of length of storage, on the results corroborates the findings of previous non-clinical studies. Further research is warranted to better investigate the molecular mechanism of the TRIM effect, as well as its clinical impact in real-world settings.

A Tolerância Oral é tradicionalmente definida pela inibição da reatividade imune específica contra proteínas previamente ingeridas, devido a um decréscimo da atividade linfocitária. Pouca atenção tem sido dada à atividade imunológica sistêmica global em animais tolerantes orais. Por atividade imunológica global, entendemos a ativação concomitante de clones de linfócitos não específicos ao antígeno em questão, além dos clones antígeno-específicos. Paradoxalmente, nós observamos que a inibição da reatividade específica coexiste com um aumento da atividade global de linfócitos. Camundongos C57BL/6 tolerantes a ovalbumina apresentaram a supressão característica das respostas de anticorpos séricos específicos para todas as classes de Imunoglobulinas avaliadas: IgG1, IgE, IgM e IgA. Entretanto, o nível de IgM total sérica estava mais aumentado em animais tolerantes do que em imunizados. Os níveis de IgA total sérica estavam aumentados em ambos os grupos. Por consequência, animais tolerantes possuíam números elevados de células secretoras de imunoglobulinas (CSI) no baço e na medula óssea. No baço de animais tolerantes prevaleceu CSI produzindo IgA e IgM enquanto que na medula óssea predominam CSI produzindo IgG e IgM. Animais imunizados mostraram maior número de CSI secretando IgG no baço. Apesar de possuírem o mesmo número e frequência de linfócitos T ativados e reguladores no baço após a imunização secundária, animais tolerantes exibiram uma cinética particular de aparecimento dessas células após a imunização primária. Camundongos tolerantes mostraram uma expansão precoce de células T efetoras/memória CD4+CD44high um dia após a imunização, enquanto que animais imunizados tiveram esta população aumentada após o quarto dia. Similarmente, células T reguladoras CD4+Foxp3+ aparecem antes no baço de animais tolerantes, no segundo dia da cinética. Estas células expandem tardiamente em animais imunizados, porém alcançam uma frequência e número maior do que a de animais tolerantes após 7 dias. Digno de nota é o aumento no número de células T CD4+CD69+ (recém ativadas) e CD4+CD25+LAP+ (reguladoras) no baço de animais tolerantes mesmo antes da imunização parenteral, sete dias após a administração oral do antígeno. Neste período, animais tolerantes também possuem uma expressão aumentada de citocinas reguladoras (TGF- e IL- 10) e uma expressão transitória de citocinas efetoras (IL-2 e IFN-). Assim, concluímos que os fenômenos imunológicos subjacentes à tolerância oral vão além da inibição da reatividade específica, envolvendo uma ativação linfocitária mais distribuída e uma rápida mobilização de linfócitos ativados e reguladores. Oral tolerance is traditionally understood as a reduction of specific immune responsiveness to ingested proteins due to lymphocyte activity decrease. Few attention has been given to systemic immunological activity in orally tolerant organisms. Paradoxically, we found that specific lymphocyte activity inhibition was parallel to an increased global lymphocyte activity. C57BL/6 mice rendered orally tolerant to ovalbumin showed the characteristic suppression of antigen specific antibody responses in all serum immunoglobulin classes analyzed: IgG1, IgE, IgM and IgA. Nevertheless, these mice presented total IgA levels similar to immunized mice and higher levels of total IgM in serum. Accordingly, orally tolerant mice had higher number of immunoglobulin secreting cells (ISC) in spleen and bone marrow. Moreover, tolerant mice Ig-secreting cells in spleen were mainly IgM and IgA producers, whereas immunized mice had mostly IgG-secreting cells. Despite having the same number of regulatory and activated T cells in spleen after booster immunization, tolerant animals exhibit a different cells appearance kinetics in the spleen after the primary intraperitoneal immunization with antigen and adjuvant. Tolerant mice showed an earlier expansion of CD4+CD44high effector/memory T cell as soon as one day after immunization while immunized mice had these cells expanded at the fourth day. Similarly, CD4+Foxp3+ regulatory T cells appeared sooner in tolerant mice, two days after immunization. Immunized mice showed a CD4+Foxp3+ Treg cells expansion delay, achieving higher cells frequencies and numbers 7 days after immunization. Importantly, orally tolerant mice presented higher numbers of CD4+CD69+ T cells and CD4+CD25+LAP+ regulatory T cells in spleen even before parenteral immunization. Also, at this time tolerant animals showed a higher expression of regulatory cytokines (TGF- and IL-10) and a transient expression of lymphocyte activation cytokines (IL-2 and IFN-). Thus, over inhibiting specific responsiveness, orally-tolerant mice display an early and widespread mobilization of activated and regulatory lymphocytes.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 Estudos recentes da literatura têm sugerido que um episódio de infarto miocárdico agudo pode deflagrar a atividade de linfócitos reativos aos próprios tecidos cardíacos. Nesse contexto, é possível que uma autorreatividade imune-inflamatória pós-infarto tenha conseqüências prejudiciais ao reparo tecidual e função cardíaca. No presente trabalho foi investigado se um reforço na tolerância imunológica aos componentes cardíacos, promovido através da exposição destes componentes pela via oral, poderia modificar o curso do reparo tecidual cardíaco pós-infarto. Para tal, lesões miocárdicas tipo-infarto foram deflagradas por meio da administração de altas doses de isoproterenol (140 µmol/kg, i.p.), e o reparo tecidual foi observado morfologicamente por um período de até 60 dias. A funcionalidade cardíaca foi analisada através da técnica de órgão isolado e perfundido, e a atividade de células obtidas a partir dos linfonodos drenantes foi avaliada in vitro. A tolerância imunológica aos componentes cardíacos foi promovida pela administração oral de extrato cardíaco (20 mg de proteínas, 7 dias antes da administração de isoproterenol). Observou-se que após 14 dias da indução das lesões miocárdicas, linfócitos coletados a partir dos linfonodos mediastinais foram ativados in vitro com proteínas cardíacas, respondendo com proliferação celular. Em contraste, linfócitos obtidos dos linfonodos de animais não infartados ou de animais que receberam administração oral dos antígenos cardíacos previamente ao infarto não apresentaram resposta proliferativa decorrente do estímulo com antígenos cardíacos. Como consequência, animais tornados tolerantes ao tecido cardíaco seguiram um reparo tecidual pós-infarto com menor infiltrado leucocitário, menor deposição de colágeno e menor prejuízo motor. Os dados obtidos no presente trabalho sugerem que uma atividade autoimune patogênica toma parte nos fenômenos de reparo tecidual pós-infarto favorecendo eventos pró-fibróticos exacerbados e se correlacionando com maior prejuízo motor do coração. Ademais, esses eventos imunológicos direcionados ao próprio coração podem ser modificados por meio da ingestão prévia de componentes cardíacos propiciando um melhor reparo das lesões miocárdicas. Following a myocardial infarction, lymphocytes infiltrate myocardial lesions. They may react with heart components and it has been suggested that that this may be disadvantageous to heart healing. In the present work we investigated whether ingestion of a crude rat heart extract tipping the balance in favor of oral tolerance, would modify the course of post-infarction myocardial repair. Infarction-like myocardial lesions were induced in Wistar rats by injection of high doses of isoproterenol. The healing process was accompanied morphologically and functionally for 60 days. Cardiac function was evaluated using isolated and perfused heart (Langendorff) preparation. At day 14 after isoproterenol, lymphocytes collected from mediastinal lymph nodesrates proliferated when exposed in vitro to myocardial extracts. In contrast, lymphocytes from rats receiving heart extract by gavage 7 days before isoproterenol, did not proliferate. Furthermore, gavaged rats presented a milder inflammatory infiltrate, less collagen deposition and improved cardiac performance when compared to animals that ingested saline before myocardial infarction. The present findings suggest that pathogenic autoimmune activity during cardiac infarction favors fibro-proliferative responses and loss of function. When this course of events is modified by interfering with natural tolerance to heart proteins, the healing process proceeds with less inflammation and fibrosis and better organ function.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Saúde Pública, Florianópolis, 2009 Objetivo: O objetivo deste estudo foi analisar o perfil sorológico dos marcadores de doenças entre os candidatos à doação de órgãos sólidos no Estado de Santa Catarina no período de janeiro de 2001 a dezembro de 2007. Métodos: Foi conduzido estudo epidemiológico, transversal baseado em dados secundários. A população estudada foi composta por 1424 candidatos à doação de órgãos sólidos, no Estado de Santa Catarina. O perfil sorológico das doenças da população do estudo foi realizado pelo Centro de Hematologia e Hemoterapia de Santa Catarina, HEMOSC e os dados sócio-econômicos foram captados pela Central de Notificação, Captação e Distribuição de Órgãos de Santa Catarina, CNCDO/SC. As variáveis analisadas neste estudo foram os resultados das sorologias realizadas nos candidatos à doação de órgãos sólidos, sexo, idade e ano do exame. Resultados: O estudo constitui-se de 1424 dados das sorologias de candidatos à doação de órgãos sólidos, 551 (38,7%) do sexo feminino e 873 (61,3%), do sexo masculino. Os marcadores sorológicos em candidatos à doação de órgãos sólidos foram: anti-HBc=21,7%, HBsAg= 3,9%, anti-HCV=1,3, doença de Chagas=0,3%, sífilis=0,9%, HTLV I/II =0,3%, HIV I/II=0,5%, toxo IgG=38,2%, toxo IgM=2,3%, CMV IgG=46,2% e CMV IgM=2,6%. A soroprevalência de CMV IgM foi maior nas mulheres (p

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais No início do século XX observou-se que certos materiais associados ao antígeno, como o hidróxido de alumínio (Al(OH)3) atuavam como adjuvantes aumentando muito a produção de anticorpos. Por outro lado, também no início do século XX observou-se que cobaias que haviam se alimentado com ração contendo milho não reagiam imunologicamente às proteínas do milho, como a zeína, como faziam as outras cobaias que não tinham sido alimentadas com milho. Atualmente sabemos que a absorção de proteínas intactas ou parcialmente digeridas através da mucosa intestinal é uma ocorrência comum após as refeições. Estas proteínas interferem na atividade do sistema imune e um resultado usual destas interferências é a tolerância oral, um fenômeno que consiste na diminuição de respostas imunes para proteínas previamente contactadas por via oral. Os primeiros relatos sobre a influência de proteínas da dieta sobre a atividade imunológica foram feitos com proteínas vegetais e animais mas a maioria dos estudos sobre a tolerância oral têm sido feitos usando proteínas derivadas de animais, como ovalbumina (OVA), gamablobulina bovina (BGG) e hemocianina (KLH). Uma vez que estas proteínas animais não fazem parte da dieta usual dos camundongos, elas são introduzidas na ração ou diluidas na água para a indução de tolerância oral. Desta forma sabemos que os animais que ingerem OVA antes da imunização com OVA+Al(OH)3 formam menos anticorpos para OVA do que os que não ingerem OVA. Mas a ingestão de OVA não interfere na imunização com outra proteína, a não ser que durante a imunização com esta segunda proteína seja dada também uma imunização com a proteína tolerada. Esta última observação tem sido objeto de estudo do nosso grupo há alguns anos após mostrarmos que a imunização de animais tolerantes com o antígeno tolerado em adjuvante inibe respostas imunes para antígenos não relacionados e que inibe também reações inflamatórias, como as desencadeadas por carragenina. Este fenômeno desencadeado pela injeção do antígeno tolerado foi denominado "efeitos indiretos da tolerância oral”. Mostramos que os efeitos indiretos da injeção de OVA em camundongos tolerantes a OVA inibem a inflamação após lesões na pele de camundongos resultando numa menor cicatriz. Avaliamos os efeitos indiretos da tolerância oral sobre as lesões cutâneas e elas também ocorrem com uma proteína presente na dieta usual dos camundongos. Usamos a zeína, proteína que faz parte da composição da ração dos camundongos, e os modelos de lesão incisional e excisional na pele. Os efeitos indiretos da imunização parenteral com uma proteína tolerada (Zeína do milho): reduzem o infiltrado inflamatório na área da lesão incisional e excisional nos dias 5, 7 e 40 respectivamente, melhora o reparo e reduz a cicatriz formada pela deposição de uma matriz extracelular de estrutura mais similar à pele normal. A imunização secundária com uma proteína tolerada sem adjuvante e concomitante com a lesão na pele de camundongos, não diminui o infiltrado inflamatório e a área do tecido de granulação, analisando histologicamente a pele no dia 5 após a lesão Early in the twentieth century it was observed that certain materials associated with the antigen, such as aluminum hydroxide (Al (OH) 3) served as adjuvant greatly increased the production of antibodies. On the other hand, also in the early twentieth century it was observed that mice that had been fed with feed containing corn not respond immunologically to protein of maize, such as zein, as did other specimens which had not been fed corn. Today we know that the absorption of intact proteins or partially digested by intestinal mucosa is a common occurrence after meals. These proteins interfere with the activity of the immune system and a result of these interferences is usual oral tolerance, a phenomenon consisting in reducing immune responses to proteins previously contacted orally. The first reports on the influence of dietary proteins on the immune activity were made with plant and animal proteins but most studies of oral tolerance have been made using animal-derived proteins such as ovalbumin (OVA), bovine gamablobulina (BGG) and keyhole limpet hemocyanin (KLH). Since these proteins are not part of animals usual diet of mice, they are introduced in the feed or diluted in water for oral tolerance induction. Thus we know that animals ingest OVA before immunization with OVA + Al (OH) 3 OVA antibodies to form less than that do not ingest OVA. However the ingestion of OVA immunization does not interfere with other proteins, except that during the immunization with this second protein is also given one immunization with the protein tolerated. This last observation has been studied by our group a few years show that immunization of tolerant animals with antigen in adjuvant tolerated inhibits immune responses to unrelated antigens and also inhibits inflammatory reactions, such as those triggered by carrageenan. This phenomenon triggered by injection of tolerated antigen has been termed "indirect effects of oral tolerance." We show that the indirect effects of injection of OVA in OVA-tolerant mice inhibit inflammation after skin lesions in mice resulting in less scarring. Evaluate the indirect effects Oral tolerance on the cutaneous lesions and they also occur with a protein present in the usual diet of mice. We zein, forming part of protein composition of the feed of the mice and model incision and excision of the skin. The indirect effects of parenteral immunization with a tolerated protein (zein from corn) reduces the inflammatory infiltrate in the area of incision and excision on days 5, 7 and 40 respectively, improves the repair and reduces the scar formed by deposition of an extracellular matrix structure more similar to normal skin. The secondary immunization with a protein tolerated without adjuvant and concomitant damage to the skin of mice, did not reduce the inflammatory infiltrate and the area of granulation tissue histologically analyzing the skin at days after injury.

Orientador: Lair Zambon Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Os resultados terapêuticos globais do carcinoma de pulmão não pequenas células em estádio avançado são bem limitados. A imunoterapia com células dendríticas foi desenvolvida como uma nova estratégia para o tratamento de câncer de pulmão. O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade, segurança e respostas imunológicas em pacientes com carcinoma de pulmão não pequenas células tratados com vacina autóloga de células dendríticas maduras pulsadas com antígenos. Cinco pacientes HLA-A2 com carcinoma de pulmão não pequenas células inoperável (estádio III ou IV) foram selecionados para receber duas doses de 5 x 107 de células dendríticas administradas por vias subcutânea e intravenosa, duas vezes em intervalos de duas semanas. A segurança, tolerabilidade e respostas imunológica e tumoral à vacina foram avaliadas pela evolução clínica e laboratorial, ensaio de linfoproliferação e critérios de RECIST, respectivamente. A dose utilizada para a imunoterapia demonstrou ser segura e bem tolerada. O ensaio de linfoproliferação mostrou uma melhora na resposta imune específica após a imunização, com uma resposta significativa após a segunda dose (p = 0,001). Esta resposta não foi persistente e houve uma tendência à redução após duas semanas da segunda dose da vacina. Dois pacientes apresentaram uma sobrevida quase duas vezes maior que a média esperada e foram os únicos que expressaram os antígenos tumorais HER-2 e CEA Apesar do pequeno tamanho da amostra, os resultados sobre o tempo de sobrevida, resposta imune, segurança e tolerabilidade, combinado com os resultados de outros estudos, são animadores para a condução de um estudo clínico com doses múltiplas em pacientes com câncer de pulmão que foram submetidos a tratamento cirúrgico, seguindo as diretrizes do Cancer Vaccine Clinical Trial Working Group Abstract: Overall therapeutic outcomes of advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC) are poor. The dendritic cell (DC) immunotherapy has been developed as a new strategy for the treatment of lung cancer. The purpose of this study was to evaluate the feasibility, safety and immunologic responses in use in mature, antigen-pulsed autologous DC vaccine in NSCLC patients. Five HLA-A2 patients with inoperable stage III or IV NSCLC were selected to receive two doses of 5x107 DC cells administered subcutaneous and intravenously two times at two week intervals. The safety, tolerability and immunologic and tumor responses to the vaccine were evaluated by the clinical and laboratorial evolution, lymphoproliferation assay and RECIST's criteria, respectively. The dose of the vaccine has shown to be safe and well tolerated. The lymphoproliferation assay showed an improvement in the specific immune response after the immunization, with a significant response after the second dose (p = 0.001). This response was not long lasting and a tendency to reduction two weeks after the second dose of the vaccine was observed. Two patients had a survival almost twice greater than the expected average and were the only ones that expressed HER-2 and CEA together. Despite the small sample size, the results on the survival time, immune response, and safety and tolerability, combined with the results of other studies, are encouraging to the conduction of a large clinical trial with multiples doses in patients with early lung cancer who underwent surgical treatment, following the guidelines of the Cancer Vaccine Clinical Trial Working Group Doutorado Clínica Médica Doutor em Ciências

O Sistema Nacional de Transplantes (SNT) Brasileiro coordena e regulamenta o, provavelmente, maior programa de transplantes públicos do mundo. Desde o seu estabelecimento, em 1997, o número de transplantes renais aumentou de 920 (5,8 pmp), em 1988, para 4.630 (24,1 pmp), em 2010. Esse crescimento foi primariamente devido ao aumento no número de doadores efetivos (de 1,8 pmp em 1998 para 9,3 pmp em 2010), com aumento correspondente no número de rins transplantados de doadores falecidos (3,8 pmp em 1999 versus 9,9 pmp em 2010). O número de rins transplantados com órgãos de doadores vivos não aumentou significativamente, 1.065 (6,7 pmp), em 1998, para 1.641 (8,6 pmp), em 2010, tanto em consequência do melhor desempenho do programa de doadores falecidos, como talvez também devido a mais restrita regulamentação, permitindo apenas doação entre doadores vivos relacionados. De 2000 a 2009, a idade média dos doadores vivos aumentou de 40 para 45 anos, e a dos doadores falecidos, de 33 para 41 anos, com eventos cerebrovasculares sendo responsáveis por 50% dos episódios de óbito atualmente. Existem disparidades geográficas evidentes nos desempenhos entre as 5 regiões nacionais. Enquanto o estado de São Paulo ocupa a primeira posição em doação e captação de órgãos (22,5 pmp), alguns estados da região Norte apresentam pequena ou nenhuma atividade de transplante. Essas disparidades estão diretamente relacionadas à densidade populacional regional, ao produto interno bruto e ao número de médicos com treinamento em transplante. A avaliação inicial de desfechos clínicos robustos não indica diferenças nas sobrevidas do enxerto em comparação com as observadas nos EUA e na Europa. A etnia e o tempo em diálise, mas não o tipo de imunossupressão, apresentam influência decisiva nos desfechos medidos. A regulamentação nacional da pesquisa clínica foi implementada a partir de 1996, permitindo a participação de centros brasileiros em numerosos estudos clínicos nacionais e internacionais para o desenvolvimento de regimes imunossupressores. Acompanhando o desafio de atenuar as disparidades regionais no acesso ao transplante, o sistema pode ser aperfeiçoado pela criação de um registro nacional para receptores de transplante e de doadores vivos de rins e também pela promoção de estudos clínicos e experimentais voltados a melhor compreender a resposta imune relacionada ao transplante em nossa população. The Brazilian National Transplantation System coordinates and regulates perhaps the largest public transplantation program worldwide. Since its implementation in 1997, the number of kidney transplantations increased from 920 (5.8 pmp) in 1998, to 4,630 (24.1 pmp) in 2010. This growth was primarily due to the increased number of effective donors (from 1.8 pmp in 1998 to 9.3 pmp in 2010), with a corresponding increased number of kidneys transplanted from deceased donors (3.8 pmp in 1999 versus 9.9 pmp in 2010).The number of kidney transplantations from living donors has not increased significantly, from 1,065 (6.7 pmp) in 1998 to 1,641 (8.6 pmp) in 2010, either as a consequence of the observed increase in the deceased donor program or perhaps because of strict government regulations allowing only transplantations from related donors. From 2000 to 2009, the mean age of living donors increased from 40 to 45 years, while it increased from 33 to 41 years for deceased donors, of whom roughly 50% die of stroke. There are clear regional disparities in transplantation performance across the national regions. While the state of São Paulo is ranked first in organ donation and recovery (22.5 pmp), some states of the Northern region have much poorer performances. These disparities are directly related to different regional population densities, gross domestic product distribution, and number of trained transplantation physicians. The initial evaluation of the centers with robust outcomes indicates no clear differences in graft survival in comparison with centers in the USA and Europe. Ethnicity and time on dialysis, but not the type of immunosuppressive regimen, decisively influence the measured outcomes. Since the implementation of national clinical research regulations in 1996, Brazilian centers have participated in a number of national and international collaborative trials for the development of immunosuppressive regimens. Besides the challenge of reducing the regional disparities related to access to transplantation, further improvements can be obtained by the creation of a national registry of the outcomes of transplanted patients and living donors, and also by the promotion of clinical and experimental studies to better understand the transplantation-related immune response of the Brazilian population.

OBJETIVO: Relatar os resultados de testes de desencadeamento aplicados em crianças alimentadas com dieta de exclusão das proteínas do leite de vaca. DESCRIÇÃO: Estudo transversal que avaliou testes de desencadeamento oral aberto, com leite de vaca, realizados sob supervisão em ambiente hospitalar por 2,5 horas e ambulatoriamente por 30 dias quando não ocorreu reação imediata. Foram incluídos 121 pacientes, com idades entre 4 e 95 meses. O teste de desencadeamento com leite de vaca foi positivo em 28 (23,1%) pacientes. Manifestação clínica de alergia ao leite de vaca diferente da apresentada por ocasião da suspeita diagnóstica ocorreu em 12 (42,9%) pacientes com desencadeamento positivo. O desencadeamento positivo foi mais frequente (p = 0,042) nos pacientes alimentados com fórmulas extensamente hidrolisadas ou de aminoácidos (30,3%) quando comparados com os alimentados com outras dietas de exclusão (14,5%). CONCLUSÃO: O teste de desencadeamento permitiu que fosse suspensa a dieta de exclusão de grande parte dos pacientes. OBJECTIVES: To report the results of open challenge tests performed in children fed with cow's milk-free diet. DESCRIPTIONS: Cross-sectional study evaluating cow's milk open challenge performed under supervision in a hospital setting during 2.5 hours and ambulatory follow-up for 30 days when no immediate reaction occurred. One hundred and twenty-one patients were included, with ages between 4 and 95 months. Cow's milk open challenge tests were positive in 28 patients (23.1%). A clinical manifestation of cow's milk allergy different from the one presented at diagnosis occurred in 12 (24.9%) patients with positive challenge. Positive challenge was more frequent (p = 0.042) in patients fed with extensively hydrolyzed formulae or amino acid-based formulae (30.3%) when compared to those fed with other exclusion diets (14.5%). CONCLUSION: Open challenge allowed the interruption of exclusion diet in a significant proportion of the patients.

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As células dendríticas (DCs) desempenham um papel central na iniciação de respostas de células T. Neste trabalho, investigamos os efeitos de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) sobre a resposta imune de camundongos BALB/c e DO11. 10. Observou-se que a modulação de BMDCs com LPS+TNF-? elevou a expressão de CD80, CD86 e CD40 e com IL-10+TGF-? aumentou a expressão de CD86 e CD40. BMDCs moduladas com LPS+TNF-? induziram a produção de citocinas TH1 e TH2 em TCD4+ de linfonodos mesentéricos (LNM) de todos os grupos de BALB/c e DO11. 10, bem como de células T reguladoras CD25+Foxp3+ (Tregs) em DO11. 10 e BALB/c imunizados por via i.p. A transferência adotiva de BMDCs moduladas com LPS+TNF-? aumentou a produção de anticorpos em camundongos BALB/c, bem como a proliferação e produção de IFN-? por células TCD4+ de DO11. 10. BMDCs moduladas com IL-10+TGF-? elevaram a proliferação, bem como a expansão de Tregs, em células TCD4+ de DO11. 10 e BALB/c imunizados, mas reduziu significativamente a produção de citocinas TH1 e TH2. A transferência adotiva de BMDCs moduladas com IL-10+TGF-? para camundongos BALB/c elevou a níveis de anti-OVA, mas não teve efeito sobre a proliferação de células TCD4+ de camundongos tolerizados ou imunizados. Em DO11. 10, a transferência de BMDCs moduladas com IL-10+TGF-? não alterou os níveis de anticorpos, mas reduziu a proliferação de células T esplênicas dos transgênicos imunizados, bem como a produção de IL-2 e INF-? nessas culturas. O tratamento de BMDCs com L-NAME elevou a expressão de CD80 e reduziu a de CD40, enquanto a NOHA elevou a expressão CD80 e CD86, mas reduziu CD40. BMDCs tratadas com L-NAME não alteraram a proliferação de células TCD4+ de BALB/c e DO11. 10, mas as BMDCs tratadas com NOHA reduziram a proliferação e produção de citocinas por células TCD4+ de ambas as linhagens. A expressão CD28 e CTLA-4 não se modificou em células TCD4+ de BALB/c e DO11. 10 co-cultivados com BMDCs moduladas com os inibidores. A freqüência de Tregs aumentou pelo cultivo de células TCD4+ de BALB/c imunizados com BMDCs moduladas ou não. A freqüência de Tregs foi mais elevada quando as células TCD4+ de camundongos DO11. 10 foram co-cultivadas com BMDCs não moduladas. A transferência adotiva de BMDCs moduladas com L-NAME para camundongos BALB/c elevou os níveis de anticorpos séricos, enquanto a de BMDCs moduladas com NOHA diminuiu a resposta proliferativa das células T esplênicas, mas não afetou a proliferação de células TCD4+ de LNM e nem a produção de citocinas TH1 e TH2. Em DO11. 10, a transferência adotiva de BMDCs modulada com os inibidores não teve efeito sobre os níveis de anticorpos, bem como sobre a proliferação e produção de citocinas in vitro por células T esplênicas e de LNM. Embora a administração de L-NAME e NOHA não tenha resultado em nenhuma alteração na expressão de CD80, CD86 e CD40 nas DCs esplênicas de ambos BALB/c e DO11. 10, notamos uma redução significativa da produção de anticorpos nesses animais, mas teve menos efeitos in vitro sobre a resposta proliferativa e produção de citocinas por células T esplênicas. Abstract: Dendritic cells (DCs) play a central role in the initiation of T cell responses. In this study, we investigated the effects of dendritic cells derived from bone marrow (BMDC) on the immune response of BALB/c and DO11. 10. It was observed that the modulation of BMDCs with LPS+TNF-? increased the expression of CD80, CD86 and CD40 and IL-10 +TGF-? increased the expression of CD86 and CD40. BMDCs modulated with LPS+ TNF-? induced the production of TH1 and TH2 cytokines in CD4+ T cells of mesenteric lymph nodes (LNM) of all groups of BALB/c and DO11. 10, as well as regulatory T cells CD25+Foxp3+ (Tregs) in DO11.10 and BALB/c mice immunized by i.p. route. The adoptive transfer of BMDCs modulated with LPS+TNF-? increased the production of antibodies in BALB/c, as well as the proliferation and IFN-? production by T CD4+ cells from DO11. 10. BMDCs modulated with IL-10+TGF-? increased the proliferation and expansion of Tregs in TCD4+ cells from DO11.10 and BALB/c mice immunized, but significantly reduced the production of TH1 and TH2 cytokines. The adoptive transfer of BMDCs modulated IL-10+TGF-? to BALB/c mice increased the levels of anti-OVA, but had no effect on the proliferation of TCD4+ cells from mice tolerized or immunized. In DO11.10, the adoptive transfer of BMDCs modulated IL-10+TGF-? did not alter the levels of antibodies, but reduced the proliferation of splenic T cells of immunized transgenic mice, as well as the production of IL-2 and INF-? in these cultures. Treatment of BMDCs with L-NAME increased the expression of CD80 and reduced CD40, while treatment with NOHA increased the expression of CD80 and CD86, but reduced CD40. BMDCs treated with L-NAME did not alter the proliferation of TCD4+ cells from BALB/c and DO11.10, but BMDCs treated with NOHA reduced proliferation and cytokine production by TCD4+ cells from both strains. The expression CD28 and CTLA-4 did not change in TCD4+ cells from BALB/c and DO11.10 co-cultured with BMDCs modulated with inhibitors. The frequency of Tregs increased by the cultivation of TCD4+ cells from immunized BALB/c mice with BMDCs modulated or not. The frequency of Tregs was higher when the TCD4+ cells from DO11. 10 mice were co-cultured with BMDCs non modulated. The adoptive transfer of BMDCs modulated with L-NAME to BALB/c mice increased the serum antibody levels, whereas the BMDCs modulated with NOHA decreased the proliferative response of splenic T cells but did not affect the proliferation of TCD4+ cells of LNM and neither production of TH1 and TH2 cytokines. In DO11. 10, the adoptive transfer of BMDCs modulated with the inhibitors had no effect on antibody levels, as well as on the proliferation and cytokine production in vitro by T cells from spleen and LNM. Although the administration of L-NAME and NOHA has not resulted in change in the expression of CD80, CD86 and CD40 on splenic DCs from both BALB/c DO11. 10 led to a significant reduction in the production of antibodies in these animals, but had less effects in vitro on the proliferative response and cytokine production by splenic T cells. Doutorado Imunologia Doutor em Genética e Biologia Molecular

A tolerância oral é caracterizada por uma redução da reatividade imunológica específica a uma proteína previamente administrada por via oral. A exposição parenteral a antígenos para os quais a tolerância oral foi previamente induzida afeta (inibe) atividades imunológicas ligadas a antígenos não relacionados, fenômeno que denominamos efeitos indiretos da tolerância oral. Investigamos a possibilidade de transferir a tolerância oral e seus efeitos indiretos para receptores singênicos imunocompetentes por transfusão de células do baço e soro de doadores tolerantes. Investigamos também se os efeitos indiretos da tolerância oral interferem no processo de rejeição de enxertos alogênicos. A transferência adotiva da tolerância oral e de seus efeitos indiretos é mais facilmente observada quando avaliamos a reação de DTH em receptores C57BL/6 e BALB/c. Camundongos BALB/c são mais susceptíveis à transferência adotiva destes fenômenos quando analisamos a produção de anticorpos específicos. Em receptores com o sistema imune intacto, existe uma barreira (barreira singênica) que dificulta a implantação funcional das células transferidas, interferindo em suas atividades imunológicas específicas. Entretanto, a transferência de diferentes componentes do sistema imune é capaz de suplantar essa barreira, demonstrando a importância de interações entre componentes celulares e moleculares para o estabelecimento dos fenômenos aqui estudados. Os efeitos indiretos da tolerância oral parecem retardar a rejeição de enxertos de pele alogênicos, demonstrando seu caráter sistêmico. Fenômenos como a barreira singênica e os efeitos indiretos da tolerância oral são melhor entendidos em modelos que descrevam a interdependência dos componentes do sistema imune. Oral tolerance is characterized by a reduction in specific immunological activities to a protein previously given by oral route. Parenteral exposure to antigens to which oral tolerance had been previously induced affects (inhibits) immunological activities connected to unrelated antigens, a phenomenon we have called indirect effects of oral tolerance. Herein, we investigated the possibility of adoptively transferring oral tolerance and its indirect effects to immunocompetent syngeneic recipients by the transfusion of spleen cells and serum from tolerant donors. We also investigated if the indirect effects of oral tolerance interfere in the rejection of allografts. The adoptive transfer of oral tolerance and its indirect effects is more easily demonstrated when we evaluated DTH reaction in C57BL/6 and BALB/c recipient mice. BALB/c mice are more susceptible to the adoptive transfer of these phenomena when we evaluate specific antibody production. In recipients with an intact immune system, there is a barrier (syngeneic barrier) that impairs the functional implantation of transferred cells, interfering with their specific immunological activities. However, the transfer of different immune system components is able to bypass this barrier, demonstrating the importance of interactions between molecular and cellular components to the establishment of the phenomena studied herein. The indirect effects of oral tolerance seem to delay the rejection of skin allografts, demonstrating its systemic character. Phenomena such as the syngeneic barrier and the indirect effects of oral tolerance will better understood in models that describe the interdependence among the components of the immune system.

O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença inflamatória crônica pertencente ao grupo das doenças reumáticas autoimunes sistêmicas, caracterizando- se por apresentar as mais variadas manifestações clínicas e laboratoriais. Seu mecanismo exato de etiopatogenia ainda permanece obscuro. Observações prévias avaliando o papel das células TREG CD4+ CD25+ nas doenças autoimunes, em que se tem detectado tanto alterações de freqüência como alterações funcionas e fenotípicas em modelos murinos e humanos, sugerem o papel significante dessa população celular na etiopatogenia da autoimunidade. No LES podemos observar a existência de uma complexa rede de interações que caracterizam a doença, em que muitos alvos para intervenção terapêutica podem ser considerados. Atualmente tem-se voltado bastante a atenção para o estudo das células TREG CD4+CD25+, a fim de que possam ser usadas como alvos potenciais para terapia imunomoduladora. Os dados sobre a freqüência e fenótipo das células TREG publicados ate o momento são controversos devido à heterogeneidade de marcadores fenotípicos e estratégias de análises utilizadas. Um alto nível de células efetoras ativadas contaminam as amostras de células selecionadas de acordo com as estratégias clássicas de identificação de células TREG no LES e este fenômeno é ainda mais acentuado quanto maior o grau de atividade da doença. Assim, o presente projeto pretendeu inicialmente validar uma estratégia de análise capaz de identificar e quantificar células TREG utilizando a combinação dos marcadores CD25 e CD127 associados à expressão de Foxp3 em pacientes com LES em atividade ou fora de atividade. Concluiu-se pelo painel CD4+CD25+/highCD127Æ/low como melhor marcador de células TREG em virtude de sua alta associação com Foxp3 tanto em sadios como em pacientes com LES. Num segundo momento avaliamos a freqüência de células TREG e células Tconvonde observamos níveis normais de células TREG e níveis elevados de células Tconv ativadas em pacientes com doença em atividade. Foi nosso objetivo, também, avaliar a expressão de marcadores fenotípicos importantes para biologia das células TREG. Foi avaliada a expressão dos marcadores: CTLA-4, GITR, PD-1, OX40, HLA-DR, CD95, CD45Ra, CD28, CD40L nas células CD4+CD25+/hiCD127Æ/low, em pacientes com LES em fase ativa e inativa. Avaliamos também a relação entre o balanço de células TREG versus células Tconv expressando estes marcadores mediante o calculo da razão de equilíbrio fenotípico TREG/Tconv. Em pacientes com doença ativa observamos níveis diminuídos de células TREG positivas para as moléculas CTLA-4 e CD28 e níveis elevados de células TREG CD40L+. Quando avaliada a razão TREG/Tconv observamos uma alteração no balanço TREG/Tconv positivas para GITR, HLA-DR, OX40, CD40L e CD45RO. Houve queda na razão TREG/Tconv para os marcadores GITR, HLADR, OX40 e CD45RO e ganho para o marcador CD40L em pacientes com LES quando comparado a controles sadios. Além da caracterização fenotípica ampla, o presente estudo tem um ponto original extra, que consiste na definição da população de células TREG a partir do fenótipo CD4+CD127lowCD25+, que tem se mostrado mais específico que o tradicional fenótipo CD4+CD25high altamente contaminado por células Teff. Estas informações, no futuro, poderiam levar a pistas importantes na busca de alternativas mais eficazes de imunoterapia, capazes de restabelecer os mecanismos normais de tolerância imunológica, evitando ou minimizando assim os danos causados pela resposta autoimune. Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic inflammatory disease that is part of the group of rheumatic autoimmune inflammatory diseases, being characterized by heterogeneous clinical and laboratory manifestations. The exact etiopathogenic mechanism underlying SLE still remains obscure. Previousr observations evaluating CD4+ CD25+ TREG cell function in auto-immune diseases detected alterations on frequency and on phenotypic and functional features in murine and human models that support the significant activity of this cell population on autoimmune pathophysiology. In SLE we can observe the existence of a complex interaction network that characterizes the disease, in which many targets for therapeutic intervention may be considered. The present study has focused on TREG cells, since they may represent putative targets for immunomodulatory therapy in this disease. Published data on frequency and phenotype of TREG cells is controversial due to heterogeneity of phenotypic markers and analytic strategies used. The present project aimed to validate an appropriate strategy to identify and quantify TREG in SLE. The CD4+CD25highCD127 low/- panel was validated as an appropriate strategy for identification of Foxp3+ TREG cells in healthy and in SLE patients. The frequency of TREG cells presented normal frequency in active and inactive SLE. In contrast, the frequency of conventional non-regulatory T cells was increased in patients with active disease. We also evaluated the expression of important phenotypic markers for TREG cells biology, including CTLA-4, GITR, PD-1, OX40, HLA-DR, CD95, CD45RO, CD28 and CD40L in patients with active and inactive disease. In addition we evaluated the relationship between the balance of TREG cells versus conventional non-regulatory T cells expressing these markers by means of deriving the TREG/Tconv rate for each surface marker. In patients with active disease we observe reduced levels of TREG cells expressing CTLA-4 and CD28 molecules, and elevated levels of CD40L+ TREG cells. There was an imbalance in TREG/Tconv for GITR, HLA-DR, OX40, CD40L and CD45RO: samples from active SLE patients depicted a decreased TREG/Tconv ratio for GITR, HLA-DR, OX40 and CD45RO and an increased ratto for CD40L when compared with healthy controls. The knowledge on the role of TREG cells in SLE may bring important contribution in devising therapeutic alternatives for this disease. TEDE BV UNIFESP: Teses e dissertações

O óxido nítrico (NO) constitui uma das mais importantes moléculas biossintetizadas e participa como mediador em diversos processos biológicos. A determinação laboratorial do NO representa um desafio devido, principalmente, à sua ínfima meia-vida e concentração em amostras biológicas. Recentemente, a citometria de fluxo foi proposta como método para determinação de NO intracelular, utilizando-se o diacetato de 4,5-diaminofluoresceína (DAF-2DA). Evidências crescentes sugerem um papel do NO resultante da NO-sintase induzível (iNOS) como mediador do processo de rejeição a enxertos. O transplante renal é o tratamento de escolha para pacientes que se encontram no estágio final da doença renal e a nefropatia crônica do enxerto (NCE) constitui a causa mais importante de perda do rim transplantado. Neste estudo, foi otimizado o protocolo para determinação de NO intracelular em monócitos e neutrófilos circulantes por citometria de fluxo e foi determinado o perfil de produção desse composto em pacientes transplantados renais com NCE (n=11) e indivíduos saudáveis (n=10). Não foi observada diferença na produção de NO, comparando-se os dois grupos. A produção de NO em monócitos e neutrófilos circulantes em pacientes com NCE provavelmente encontra-se suprimida devido à ação de imunossupressores. Nitric oxide (NO) is one of the most important biosynthesized molecules and participates as a mediator in various biological processes. The laboratorial determination of NO represents a challenge principally because of its unreliable half-life and concentration in biological samples. Recently, flow cytometry was proposed as a method for the determination of intracellular NO with 4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2DA). Increasing evidence suggests a role for the NO resulting from inducible NO synthase (iNOS) as a mediator in the graft rejection process. Renal transplant is the treatment of choice for patients that are in the final stage of kidney disease and the chronic nephropathy of the graft is the most important cause of loss of a transplanted kidney. In the present study, the protocol for the determination of intracellular NO in monocytes and circulating neutrophils by flow cytometry was optimized, and the profile for the production of this compound in kidney-transplanted individuals with chronic nephropathy of the graft (n=11) and healthy individuals (n=10) was determined. No difference in the production of NO was observed in the two groups. The production of NO in monocytes and circulating neutrophils in patients with chronic nephropathy of the graft is probably suppressed as a result of the action of immunosuppressors.

A infecção pelo Scedosporium apiospermum pode tornar-se grave quando afeta pacientes imunodeprimidos, contexto em que diagnóstico e tratamento são geralmente difíceis. Os autores apresentam caso de paciente diabética usuária de ciclosporina, metotrexato e corticoesteróide sistêmico para o tramento de artrite reumatóide e que apresentou úlceras cutâneas pelo S. apiospermum. Após uso de itraconazol, sem sucesso, ocorreu resolução do quadro com o uso de voriconazol, nova alternativa para determinadas infecções fúngicas. Infection by Scedosporium apiospermum may be severe when it affects immunosuppressed patients, circumstances under which diagnosis and treatment are difficult. The authors present the case of a diabetic patient using cyclosporine, methotrexate and systemic steroids to treat rheumatoid arthritis, who presented ulcers caused by S. apiospermum. After unsuccessful treatment with itraconazole, there was good response to voriconazole therapy. This drug represents a new alternative for the treatment of fungal infections.

O fibroadenoma é a neoplasia benigna mais freqüente da mama feminina e é considerado tumor misto, constituído por quantidades variáveis de tecido conjuntivo e epitelial. A ciclosporina parece ter implicações no desenvolvimento de fibroadenomas mamários em pacientes transplantadas renais em idade reprodutiva. Descrevemos o caso no qual a paciente, em uso terapêutico de ciclosporina A, após transplante renal, apresentou vários nódulos mamários bilaterais na evolução. O exame físico e os achados de imagem sugeriram fibroadenoma, diagnóstico que foi confirmado após biópsias. Fibroadenoma is the most frequent benign neoplasia in the female breast and it is considered a mixed tumor, constituted by variable amounts of connective and epithelial tissue. Cyclosporine A seems to be related with the development of mamary fibroadenomas in patients who underwent kidney transplantation in reproductive age. We reported the case in which the patient, in therapeutic use of cyclosporine A, after kidney transplantation, presented several bilateral lumps. The imaging and palpable findings suggested fibroadenoma, confirmed after biopsy.

O fibroadenoma é a neoplasia benigna mais freqüente da mama feminina e é considerado tumor misto, constituído por quantidades variáveis de tecido conjuntivo e epitelial. A ciclosporina parece ter implicações no desenvolvimento de fibroadenomas mamários em pacientes transplantadas renais em idade reprodutiva. Descrevemos o caso no qual a paciente, em uso terapêutico de ciclosporina A, após transplante renal, apresentou vários nódulos mamários bilaterais na evolução. O exame físico e os achados de imagem sugeriram fibroadenoma, diagnóstico que foi confirmado após biópsias.

A infecção pelo Scedosporium apiospermum pode tornar-se grave quando afeta pacientes imunodeprimidos, contexto em que diagnóstico e tratamento são geralmente difíceis. Os autores apresentam caso de paciente diabética usuária de ciclosporina, metotrexato e corticoesteróide sistêmico para o tramento de artrite reumatóide e que apresentou úlceras cutâneas pelo S. apiospermum. Após uso de itraconazol, sem sucesso, ocorreu resolução do quadro com o uso de voriconazol, nova alternativa para determinadas infecções fúngicas. Infection by Scedosporium apiospermum may be severe when it affects immunosuppressed patients, circumstances under which diagnosis and treatment are difficult. The authors present the case of a diabetic patient using cyclosporine, methotrexate and systemic steroids to treat rheumatoid arthritis, who presented ulcers caused by S. apiospermum. After unsuccessful treatment with itraconazole, there was good response to voriconazole therapy. This drug represents a new alternative for the treatment of fungal infections.

OBJETIVO: Apesar da evolução das técnicas cirúrgicas que permitiram a padronização do transplante cardíaco e da descoberta dos imunossupressores, ainda hoje, a rejeição, os efeitos colaterais dos medicamentos e o processo de vasculopatia crônica são os principais problemas nos pós-transplantados. A procura por alternativas para superar estes impedimentos é o objetivo principal deste trabalho. Assim, foram realizados experimentos para determinar se a tolerância oral pode interferir no transplante cardíaco. MÉTODO: Camundongos C57BI/6J e C3H/HEJ, machos adultos foram divididos em dois grupos. O grupo denominado tolerante recebeu amendoim ad libitum na dieta por sete dias, enquanto o grupo imune foi mantido com uma dieta convencional para murinos. Ambos foram imunizados com 100 mg de extrato protéico derivado do amendoim por via sc. O transplante de coração de BAL/C recém-nato, de 24h, foi depositado no tecido subcutâneo das orelhas dos animais de ambos os grupos, com ou sem imunização concomitante do antígeno alimentar. RESULTADOS: Confirmamos que a administração de proteínas por via oral é capaz de induzir tolerância sistêmica, uma vez que os grupos tolerantes apresentam títulos de anticorpos específicos ao amendoim mais baixos que os grupos imunes. O coração transplantado apresentou-se mais preservado no grupo de animais C3H/HEJ tolerantes que foram desafiados concomitantemente com o antígeno da dieta do que os demais grupos. CONCLUSÃO: Foi determinado que os mecanismos de tolerância oral interferem no processo de rejeição de transplantes cardíacos alogênicos avasculares para a orelha de camundongos adultos, no entanto, de maneira não homogênea. Como os mecanismos de tolerância oral que alteram o sistema imunológico de modo a reduzir a rejeição ainda não foram esclarecidos, são precisos mais trabalhos nesta linha de pesquisa. OBJECTIVE: Although the development of surgical techniques and the discovery of immune-suppressors permitted heart transplantation to be accepted as a widespread treatment for terminally ill patients, rejection, complications due to these drugs and the chronic vasculopathies continue to be majority problems. The search for alternatives to supplant these impediments by performing avascular allogeneic heart transplants from newborn BALB/C mice (24h old) to the subcutaneous tissue of the ears of adult male C57BI/6J and C3H/HEJ mice to evaluate the interference of systemic oral tolerance on the rejection mechanisms are our main goal. METHOD: Adult, male C57BI/6 e C3H/HEJ were divided in two groups. The tolerant group received peanuts ad libitum for one week in the diet while the immune group continued to eat mouse chow. Both groups were immunized sc with 100mg of peanut extract. The transplanted newborn BALB/C hearts were deposited of into the subcutaneous tissue of the ears of tolerant and immune mice in the presence or not of concomitant immunization to peanut protein. RESULTS: We demonstrated that feeding proteins induces systemic tolerance since animals of both strains that ate the seeds before being immunized had lower systemic antibodies than immune animals. Tolerant C3H/HEJ mice with concomitant administration of the tolerogenic antigen presented a more preserved transplanted heart than all other groups. CONCLUSION: Although not homegeneously, the immunoregulatory mecanisms of oral tolerance modified the rejection process of alogenic avascular heart transplant to the ear of adult mice. As these mecanisms are not yet well understood more work needs to be done in this field.

OBJETIVO: Apesar da evolucao das tecnicas cirurgicas que permitiram a padronizacao do transplante cardiaco e da descoberta dos imunossupressores, ainda hoje, a rejeicao, os efeitos colaterais dos medicamentos e o processo de vasculopatia cronica sao os principais problemas nos pos-transplantados. A procura por alternativas para superar estes impedimentos e o objetivo principal deste trabalho. Assim, foram realizados experimentos para determinar se a tolerância oral pode interferir no transplante cardiaco. METODO: Camundongos C57BI/6J e C3H/HEJ, machos adultos foram divididos em dois grupos. O grupo denominado tolerante recebeu amendoim ad libitum na dieta por sete dias, enquanto o grupo imune foi mantido com uma dieta convencional para murinos. Ambos foram imunizados com 100 mg de extrato proteico derivado do amendoim por via sc. O transplante de coracao de BAL/C recem-nato, de 24h, foi depositado no tecido subcutâneo das orelhas dos animais de ambos os grupos, com ou sem imunizacao concomitante do antigeno alimentar. RESULTADOS: Confirmamos que a administracao de proteinas por via oral e capaz de induzir tolerância sistemica, uma vez que os grupos tolerantes apresentam titulos de anticorpos especificos ao amendoim mais baixos que os grupos imunes. O coracao transplantado apresentou-se mais preservado no grupo de animais C3H/HEJ tolerantes que foram desafiados concomitantemente com o antigeno da dieta do que os demais grupos. CONCLUSAO: Foi determinado que os mecanismos de tolerância oral interferem no processo de rejeicao de transplantes cardiacos alogenicos avasculares para a orelha de camundongos adultos, no entanto, de maneira nao homogenea. Como os mecanismos de tolerância oral que alteram o sistema imunologico de modo a reduzir a rejeicao ainda nao foram esclarecidos, sao precisos mais trabalhos nesta linha de pesquisa.

A exposição parenteral a antígenos para os quais a tolerância oral foi previamente induzida afeta (inibe) atividades imunológicas ligadas a antígenos não relacionados, fenômeno que denominamos efeitos indiretos da tolerância oral (Carvalho, et al., 1994). Investigamos a possibilidade de transferir a tolerância oral e seus efeitos indiretos para receptores singênicos normais ou previamente irradiados por transfusão de células do baço. Tanto a tolerância oral, quanto seus efeitos indiretos, foram transferidos apenas para receptores irradiados, sendo que os efeitos indiretos requisitaram um maior número de células, o que sugere o envolvimento de um maior número de interações celulares nos efeitos indiretos. Em receptores não-irradiados existe uma barreira (barreira singênica) que impede a implantação funcional das células transferidas, interferindo em suas atividades imunológicas específicas. O padrão de distribuição das células transferidas em diferentes órgãos linfóides foi estudado por marcação com CFSE. Nos receptores irradiados, a porcentagem de células marcadas era maior em todos os órgãos estudados, independentemente se provindas de doadores tolerantes ou não-tolerantes. Entretanto, o número absoluto tende a ser um pouco maior nos receptores não irradiados. Animais receptores de células de doadores não-tolerantes, no terceiro dia após a transferência, apresentaram uma redução, tanto na porcentagem quanto no número absoluto de células marcadas com CFSE, quando comparados com os receptores de células de doadores tolerantes. Isto sugere que há diferenças na dinâmica de decaimento das células transferidas de doadores tolerantes ou não-tolerantes. Fenômenos como a barreira singênica e os efeitos indiretos da tolerância oral talvez sejam melhor entendidos em modelos que descrevam a interdependência dos componentes do sistema imune. Parenteral exposure to antigens to which oral tolerance had been previously induced affects (inhibits) immunological activities connected to unrelated antigens, a phenomenon we have called indirect effects of oral tolerance (Carvalho, et al., 1994). Herein, we investigated the possibility of adoptively transferring oral tolerance and its indirect effects to normal or previously irradiated syngeneic recipients, by spleen cells. Both oral tolerance and its indirect effects were transferred only to irradiated recipients and a larger number of cells was necessary for the transfer of the indirect effects, which suggests the participation of more complex cellular interactions in these effects. In nonirradiated recipients, there is a barrier (syngeneic barrier) that impairs the functional implantation of transferred cells, interfering with their specific immunological activities. We also studied the distribution patterns of transferred cells in different lymphoid organs from recipient mice, by CFSE labeling. In irradiated recipients, independently of the origin of transferred cells, the percentage of labeled cells was higher, in every studied organ. However, the absolute number was a little higher in nonirradiated recipients. Recipients of cells from nontolerant donors displayed a decrease, both in the percentage and in the absolute number of CFSE labeled cells on the third day after cell transference, as compared to recipients of cells from tolerant donors. This suggests different dynamics of decay of adoptively transferred cells from tolerant or non-tolerant donors. Phenomena such as the syngeneic barrier and the indirect effects of oral tolerance will be better understood in models that describe the interdependence among the components of the immune system.

O reumatismo pós-quimioterapia (RPQ) é uma síndrome pouco descrita na literatura, que se caracteriza por poliartralgia desenvolvida um a quatro meses após o término de diversos esquemas quimioterápicos, no contexto de vários tipos de câncer. Relatamos o caso de uma paciente de 21 anos com linfoma de Hodgkin, em cujo esquema quimioterápico não foi utilizada a droga ciclofosfamida, considerada como possível fator etiológico. Sugere-se, então, a possibilidade de uma disfunção transitória do mecanismo de tolerância imunológica. Post-chemotherapy rheumatism is a rare syndrome characterised by polyarthralgia that develops following a period of 1 to 4 months of various forms of chemotherapy for cancer treatment. There is very little representation of post-chemotherapy rheumatism (PCR) in literature. Here we report the case of a 21 years old girl with Hodgkin lymphoma who was not treated with cyclophosphamide, the drug considered as an etiological factor in PCR. Rather, we suggest the possibility of a transitory dysfunction in immunological tolerance mechanisms.

Previous studies have shown that individuals exposed to Leishmania amazonensis respond differentially with regard to interferon gamma (IFN)_ production. Individuals who have a low production of IFN_ develop a Th2 response, while those who produce high amounts of this cytokine during the early stages of infection show the Th1 response. In order to evaluate the mechanism of suppression induced by L. amazonensis, the profile and kinetics of chemokines and theirs receptors were determined, as also the cytokines in the cultures of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy individuals, stimulated with live promastigotes of L. amazonensis. A semiquantitative analysis of mRNA expression for the chemokines and their receptor was performed by RT-PCR, and the cytokines were quantified by ELISA, at 12, 48 and 120 hours after infection. The two patterns of IFN_ response were studied. Individuals with a production higher than 145,8 pg/mL were classified as high responders (HR), and those with lower levels of production were considered as low responders (LR). Individuals in the HR group developed a mixed response, with a predominance of Th1, which was associated with the expression of relevant quantities of MIP-1_, RANTES, MCP-1, IP-10, IL-8, CCR1, CCR2 and CXCR3, within 12 and 48 hours after infection. IL-12, IL-13 and IL-10 were observed in significant quantities. In the LR group, the suppression of expression of MIP-1_, RANTES, MCP-1, I-309, CCR2, CXCR3 and CCR5 during the entire period of study, and that of IP-10 during the first 48 hours of infection, was observed. IL-10 and IL-13 were found in elevated concentrations from 12 hours of infection onwards, with a peak production at 48 hours. These results suggest that the pattern of response apparently is defined around 48 hours of infection. IL-10 and IL-13 appear to exercise a relevant role in the modulation of suppression of IFN_, induced in the LR group by L. amazonensis. Estudos anteriores mostraram que indivíduos expostos à Leishmania amazonensis apresentam resposta diferenciada em relação à produção de IFNγ. Aqueles com baixa produção geram uma resposta Th2 e os que apresentam alta produção desta citocina, desde as primeiras horas de infecção, uma resposta Th1. Com o objetivo de avaliar o mecanismo de supressão induzido por L. amazonensis, foi determinado o perfil e a cinética da expressão de quimiocinas e receptores de quimiocinas, como também de citocinas em culturas de células mononucleadas do sangue periférico de indivíduos sadios, estimuladas com promastigotas vivas de L. amazonensis. A análise semiquantitativa da expressão de RNAm das quimiocinas e seus receptores, através de RT-PCR, e a quantificação das citocinas foi determinada por ELISA, após 12 horas, 48 horas e 120 horas de infecção. Verificaram-se dois padrões de resposta em relação à secreção de IFNγ. Indivíduos com produção superior a 145,8 pg/mL foram classificados como alto respondedor (AR) e aqueles com produção inferior, como baixo respondedor (BR). Observou-se no grupo AR o desenvolvimento de uma resposta mista, com predomínio de Th1. Esta resposta está associada à expressão de quantidades relevantes de MIP-1α (CCL3), RANTES (CCL5), MCP-1(CCL2), IP-10 (CXCL10), IL-8 (CXCL8), CCR1, CCR2 e CXCR3 em 12 e 48 horas de infecção. IL-12, IL-13 e IL-10 foram observadas em altas concentrações. Em relação ao grupo BR, observou-se diminuição da expressão de MIP-1α (CCL3), RANTES (CCL5), MCP-1(CCL2), I-309 (CCL1), CCR2, CXCR3 e CCR5 durante todo o período avaliado e de IP-10 (CXCL10) nas primeiras 48h de infecção. IL-10 e IL-13 encontravam-se em elevadas concentrações desde 12h, tendo um pico de produção com 48h de infecção. Os resultados sugerem que após 48 horas de exposição é o momento em que há diferenciação na expressão das moléculas. IL-10 e IL-13 parecem ter papel relevante na modulação da supressão de INFγ induzida nos BR por L. amazonensis.

A maioria dos contatos naturais com antígenos ocorre pela mucosa do trato gastrointestinal. Esses contantos resultam normalmente no desenvolvimento de um estado de hipo-reatividade sistêmica a esses antígenos chamado de tolerância oral. A tolerância oral depende de mecanismos regulatórios desencadeados no microambiente da mucosa intestinal e perturbações inflamatórias nesse local podem interferir no seu estabelecimento. Nesse estudo, desenvolvemos dois modelos experimentais de patologias inflamatórias da mucosa adjacente ao intestino delgado: gastrite e colite induzidas pela administração aguda de álcool. Embora induzidas em duas raças diferentes de camundongos, C57BL/6 e BALB/c, ambas as doenças caracterizam-se por um infiltrado de células mono e polimorfonucleares na mucosa e pela produção local de citocinas também de um padrão misto: IL-4 e IFN-y. Nesses modelos, ocorrem perturbações no balanço de citocinas não somente no local mas em toda a mucosa intestinal sendo IL-4 a principal citocina afetada. Os animais com gastrite ou com colite tomam-se refratários à indução de tolerância oral. Os efeitos imunológicos do álcool foram estudados em mais detalhe no modelo de gastrite. Embora o álcool seja rapidamente metabolizado, várias alterações funcionais locais e sistêmicas são detectáveis nos animais com gastrite, tais como redução da atividade proteolítica e da produção de muco e de IgA secretária no estômago, anemia e leucopenia. Nesse modelo, mostramos também várias evidências de que a administração oral de álcool induz uma inflamação com características alérgicas e com repercussões sistêmicas importantes no sistema imune. Ocorre um aumento da procução de IL-4 no estômago e no baço assim como um aumento nos níveis séricos totais de IgE nos animais com gastrite. A administração oral de Ovalbumina (Ova) nesses animais induz aumento da permeabilidade vascular e do recrutamento de eosinófilos na mucosa do estômago além de desencadear uma sensibilização que aumenta os níveis de IgG 1 e IgE após a imunização parenteral. Esses animais sensibilizados apresentam aversão à ingestão de uma solução contendo Ova. Além disto, a reação de DTH desencadeada nos animais com gastrite é marcada pela presença de eosinófilos e se assemelha, nas características histológicas e na cinética, à fase tardia da hipersensibilidade imediata. Essas alterações inflamatórias juntamente com o comprometimento de mecanismos locais e sistêmicos de imuno-regulação, como a redução na produção de IL-10 por células do baço, podem ser responsáveis pelos distúrbios marcantes observados na indução de tolerância. Camundongos com gastrite são refratários à indução de tolerância por via oral e por via endovenosa para Ova. Camundongos geneticamente selecionados para a susceptibilidade à tolerância oral também se tornam refratários após o tratamento oral com álcool e o mesmo tratamento é capaz de eliminar a tolerância oral já estabelecida para uma proteína da dieta de camundongos C57BL/6, a caseína. Observamos também que o clareamento da Ova injetada por via subcutânea está comprometido nos animais com gastrite. A análise da atividade de macrófagos nesses animais mostrou uma redução significativa no tempo e na eficiência da fagocitose até 30 dias depois da última administração de álcool ainda que atividades efetoras como a produção de ll..,-6 e NO estejam alteradas apenas por um breve período pós-tratamento. Como a apresentação de antígenos é um evento importante na ativação de linfócitos T, essa pode ser uma das alterações relacionadas à interferência na indução de tolerância no modelo apresentado. Em conclusão, esse estudo descreve dois modelos inéditos de patologias inflamatórias da mucosa do trato gastrointestinal e mostra que a administração aguda de álcool pode ter efeitos inflamatórios locais e sistêmicos assim como pode comprometer o estabelecimento da tolerância a antígenos naturais como aqueles presentes na dieta. The majority of natural contacts with antigens take place through the mucosa of the gastrointestinal tract. Usually, these contacts result in a state of systemic immunological hyporesponsiveness to the antigen named oral tolerance. Oral tolerance depends on regulatory mechanisms that are triggered in the microenvironment of the gut mucosa and local inflammatory disturbances may compromise its development. In this study, we report two novel experimental models of inflammatory pathologies in the mucosa adjacent to the small intestine, both induced by topic administration of alcohol: gastritis and colitis. Although they are induced in two different strains of mice, C57BL/6 and BALB/c respectively, both diseases are characterized by an inflammatory infiltrate of mono and polimorphonuclear cells and by the local production of a mixed profile of cytokines with the presence of IL-4 and IFN-y. In these experimental models, disturbances in the balance of cytokines occur not only locally but throughout the intestinal mucosa. IL-4 is the most affected cytokine. Animais with either gastritis or colitis are refractory to oral tolerance induction. The immunological effects of alcohol administration were studied in more detail in the gastritis model. Although alcohol is promptly metabolized, several local and systernic functional alterations can be detected in these mice, such as reduction in the proteolytic activity, in the production of mucus and secretory IgA in the stomach, anemia and leukopenia. In these animais, we also demonstrate that alcohol administration induces an allergic-type inflammatory response. There is an increase in the production of IL-4, both in the stomach and in the spleen, as well as a rise in the leveis of serum IgE in mice with gastritis. Oral administration of ovalbumin (Ova) to these animais induces an increase in local vascular permeability and in the recruitment of eosinophils to the stomach. It also primes the animais augmenting the serum leveis of specific IgG 1 and IgE antibodies after parenteral immunization. Interestingly, sensitized mice show aversion to the intake of a sweetened Ovacontaining solution. In addition, DTH reaction triggered in mice with gastritis is marked by the presence of eosinophils and it resembles, in the histology and in the kinetics, the late phase of the hypersensitivity type 1 reaction. Such inflammatory alterations along with disturbances in the systemic and local immunoregulatory mechanisms, such as IL- 1 O production by spleen cells, may be related to the interference in oral tolerance induction. Mice with gastritis are refractory to tolerance induction by oral and intravenous routes. Mice genetically selected for susceptibility to oral tolerance induction to Ova become refractory after alcohol treatment and oral tolerance already stablished to a dietary protein, casein, can be disrupted by oral administration of alcohol. We also observed that the clearance of subcutaneously injected Ovais impaired in mice with gastritis. Analysis of macrophage activity in these mice shows a significant reduction in the time and efficiency of phagocytosis as long as 30 days after alcohol treatment although effector functions, such as ll..,-6 and NO production are only affected shortly after treatment. Since antigen presentation is an important event on the activation of T lymphocytes, it might be one of the alterations related to oral tolerance abrogation in this model. In conclusion, the present study describes two novel models of inflammatory pathologies of the mucosa of the gastrointestinal tract and shows that short-term alcohol administration have local and systemic immunological effects and it may compromise the development of oral tolerance to natural antigens such as dietary proteins.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.

As vacinas de DNA têm sido utilizadas para a indução de imunidade contra antígenos virais e bacterianos. A aplicação de modelos experimentais tem sido explorada visando a indução de tolerância imunológica através da expressão de genes cujos produtos podem modular o sistema imune para um estado de não responsividade. A terapia gênica oferece a possibilidade de manipulação do sistema imune do receptor, através de um sistema de administração de genes específicos sob condições pré-definidas. Sua eficácia depende dos níveis de expressão e da natureza do antígeno, da via de administração assim como de sua distribuição nos tecidos (a qual às vezes depende do promotor utilizado). Porém, sua aplicação clínica é limitada em parte devido aos baixos níveis de expressão obtidos in vivo. A VP22 é uma proteína do tegumento do vírus Herpes simples tipo 1, que tem a propriedade de fazer tráfego intercelular. Estudos recentes têm demonstrado a alta eficiência desta molécula no transporte de proteínas heterólogas como VP22-p53, VP22-β galactosidase e VP22-proteína verde fluorescente. Para a indução de tolerância imunológica, tem sido demonstrado que a persistência do antígeno, pelo menos por algum período, é muito importante. Moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) têm sido utilizadas para induzir tolerância a nível central ou periférico, em diferentes protocolos. Dentre estas, as moléculas da classe I do camundongo, Kb, têm sido utilizadas com sucesso. O objetivo desse trabalho foi de construir duas vacinas recombinantes: pVP22::Kb e pCIneo::Kb. A primeira contém dois genes clonados na mesma pauta de leitura: a cadeia pesada de classe I Kb e VP22. O cDNA que codifica para o Kb foi obtido pela extração de RNA total de baço de um camundongo C57BL/6 (haplótipo H-2b) seguido de transcrição reversa. Este produto foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Esta molécula também foi obtida pela amplificação direta do gene Kb previamente clonado no sítio EcoR I do plasmídeo pBluescriptIISK (Stratagene®). Ambos os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cegas no plasmídeo pCRBluntII (Invitrogen®). Foram obtidos dezenove plasmídeos recombinantes, denominados pCRBluntII::Kb, e um deles foi escolhido e digerido com as enzimas de restrição Spe I e Xba I e defosforilado com a enzima fosfatase alcalina (CIAP). O fragmento digerido foi clonado nos plasmídeos pVP22-myc/His (Invitrogen®) e pCIneo (Promega®) previamente digeridos com a enzima Xba I. Os novos plasmídeos pVP22::Kb e pCIneo::Kb foram utilizados para transfectar a linhagem celular eucariótica CHO. A expressão do mRNA para o Kb foi confirmada pela transcrição reversa e PCR e a expressão da proteína por imunofluorescência e citometria de fluxo.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia Utilizou-se microscopia de luz (óptica) para avaliar o comportamento tecidual de parafusos usinados em osso bovino e instalados em tíbias de coelhos, em relação a presença ou ausência de reabsorção do parafuso de osso, tecido ósseo neo-formado, osso necrótico, células inflamatórias e fibrose, a fim de que possamos inferir a possibilidade da utilização dos mesmos como: 1) material de preenchimento nas técnicas de aumento de rebordo, 2) dispositivo de fixação de membranas reabsorvíveis, 3) dispositivo de fixação de enxertos ósseos tipo aposicional e 4) dispositivo de estabilização de fraturas ósseas intra e extra-bucais em seres humanos. Os parafusos de osso bovino foram instalados na tíbia direita de 8 (oito) coelhos, machos albinos, da raça New Zealand, entre nove e doze meses de idade. Um coelho foi mantido como controle, ou seja, não recebeu parafuso. Após anestesia, tricotomia e antissepsia, os animais receberam uma incisão linear de 2 cm até exposição do tecido ósseo e uma perfuração de 7 mm de profundidade e 2 mm de diâmetro executada com brocas cirúrgicas do sistema de colocação de implantes. Os parafusos de osso bovino foram instalados, estabilizados manualmente e recobertos pela epiderme suturada. Sacrificaram-se os animais após 60 dias. As peças foram fixadas com formol a 10%, descalcificadas e coradas pela técnica da hematoxilina-eosina (H.E.). A análise microscópica das peças demonstrou que em 7 coelhos houve reabsorção completa do parafuso de osso bovino. Todas as amostras continham características de tecido ósseo em neo-formação, ausência de células inflamatórias, ausência de fibrose e ausência de áreas com reabsorção acentuada. As mesmas características foram encontradas no animal controle. Os resultados obtidos nesta pesquisa, tais como, reabsorção do parafuso com conseqüente preenchimento ósseo; obtenção de ganho ósseo vertical na maioria dos espécimes; ausência de células inflamatórias; inexistência de fibrose e presença de tecido ósseo em neo-formação, sugerem que os parafusos de osso bovino podem ser utilizados, em humanos, nas cirurgias ósseas reconstrutivas.

Embora com características genéticas diferentes, o embrião não é rejeitado pelo sistema imunitário materno, com o qual está em contacto através do trofoblasto. O HLA-G é uma molécula de HLA-I não clássica que é quase exclusivamente expresso pelo citotrofoblasto e é responsável pela inibição das células natural killer (NK) presentes na decídua. São descritos outros mecanismos envolvidos na tolerância materno-fatal, nomeadamente a não expressão de antigénios de classe II do MHC pelo citotrofoblasto, a produção de IL-10, e o HLA-G solúvel. A alteração destes mecanismos está associada a abortos de repetição e à preeclampsia.