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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES This study aimed to characterize the cases of malignant neoplasms of the oral cavity of dogs from approximately 23 years of routine diagnosis at the Laboratory of Veterinary Pathology (LPV) of the Federal University of Santa Maria (UFSM). Through these data, two scientific articles were prepared that make up this dissertation. The first article is an overview of malignant neoplasms of the oral cavity, collecting data such as sex, race, age, clinical signs, neoplasm location, macroscopy and histology. During the study period, 205 dogs were affected by oral neoplasms, of which 101 were malignant. Of these, 47 were melanomas, 19 fibrosarcomas, 17 squamous cell carcinomas. Other less prevalent malignant neoplasms included undifferentiated sarcoma, mast cell tumor, hemangiosarcoma, osteosarcoma, transmissible venereal tumor, chondrosarcoma, and acinar cell carcinoma of the salivary gland. 51 cases were observed in females and 45 cases in males. Mixed-breed dogs totaled 33 cases and 64 dogs were defined-breed. The age range was from 1 to 19 years. The main clinical signs were swelling in the oral region, dysphagia, oral bleeding and drooling. The most affected sites were the gingiva, oral mucosa, mandible and mucocutaneous junction. Thus, through the two articles of this dissertation, it is possible to establish the frequency of these neoplasms in the studied period, as well as their clinical, macroscopic and histological, histochemical and immunohistochemical characteristics. The second article addresses a total of 47 melanomas in the oral cavity of dogs, in which clinical signs and anatomopathological aspects were characterized and the use of histochemical Toluidine Blue (TA) staining for the evidencing of melanin granules in comparison with the Fontana Masson (FM). In addition, the use of AT as a counterstain for the immunohistochemistry technique was evaluated. The clinical sign most frequently observed in dogs with oral melanoma was swelling in the oral region. The main site of involvement was gingiva (27.65%), followed by oral mucosa (21.27%) and mucocutaneous junction (12.76%), among others. Tumors were described as ulcerated nodules or masses, mostly between 0.5 and 2.0 cm in diameter. Histologically, the subtypes observed were epithelioid (44.6%), fusiform (27.6%), mixed epithelioid and fusiform (14.8%), ballooning (4.2%), small cells (4.25%), myxoid (2.12%) and round cells (2.12%). The histochemical techniques for quantification of melanin granules did not show differences between FM and AT. TA showed melanin granules as green to dark green dots or aggregates. Sections counterstained with AT and Harris' hematoxylin allowed a clear distinction between melanin (stained green) and immunostaining for Melan-A (stained brown). When the cells were MelanA-positive and had melanin in the cytoplasm, a third color pattern was shown (a mixture of yellow and green). Este estudo teve como objetivo caracterizar os casos de neoplasmas malignos da cavidade oral de cães provenientes de aproximadamente 23 anos da rotina diagnóstica do Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Por meio desses dados, elaborou-se dois artigos científicos que compõem esta dissertação. O primeiro artigo, trata-se de um apanhado geral dos neoplasmas malignos de cavidade oral, coletando dados como sexo, raça, idade, sinais clínicos, localização do neoplasma, macroscopia e histologia. No período estudado, 205 cães foram acometidos por neoplasmas orais, dos quais 101 eram malignos. Destes, 47 eram melanomas, 19 fibrossarcomas, 17 carcinomas de células escamosas. Outros neoplasmas malignas menos prevalentes incluíram sarcoma indiferenciado, mastocitoma, hemangiossarcoma, osteossarcoma, tumor venéreo transmissível, condrossarcoma e carcinoma de células acinares da glândula salivar. Foram observados 51 casos em fêmeas e 45 casos em machos. Os cães sem raça definida totalizaram 33 casos e 64 cães tinham raça definida. A variação de idade foi de 1 a 19 anos. Os principais sinais clínicos foram aumento de volume na região oral, disfagia, sangramento oral e sialorreia. Os locais de maior acometimento foram a gengiva, mucosa oral, mandíbula e junção mucocutânea. Com isso, por meio dos dois artigos desta dissertação pode-se estabelecer a frequência dessas neoplasmas no período estudado, bem como suas características clínicas, macroscópicas e histológicas, histoquímicas e imuno-histoquímicas. O segundo artigo, aborda um total de 47 melanomas na cavidade oral de cães, no qual foram caracterizados os sinais clínicos e aspectos anatomopatológicos e foi avaliado o uso da coloração Azul de Toluidina (AT) histoquímica para a evidenciação de grânulos de melanina em comparação com o Fontana Masson (FM). Além disso, foi avaliado o uso de AT como contracoloração da técnica de imuno-histoquímica. O sinal clínico mais frequentemente observado em cães com melanoma oral foi o aumento de volume na região oral. O principal local de acometimento foi gengiva (27,65%), seguido de mucosa oral (21,27%) e junção mucocutânea (12,76%), entre outros. Os tumores foram descritos como nódulos ou massas, ulcerados, em sua maioria entre 0,5 e 2,0 cm de diâmetro. Histologicamente, os subtipos observados foram epitelioide (44,6%), fusiforme (27,6%), misto epitelioide e fusiforme (14,8%), balonoso (4,2%), células pequenas (4,25%), mixoide (2,12%) e células redondas (2,12%). As técnicas histoquímicas para quantificação dos grânulos de melanina não apresentaram diferenças entre FM e AT. O AT mostrou os grânulos de melanina como pontos ou agregados verdes a verde-escuros. Os cortes contracorados com AT e Hematoxilina de Harris permitiram uma distinção clara entre a melanina (corada em verde) e a imunomarcação para Melan-A (corada em marrom). Quando as células eram Melan-Apositivas e tinham melanina no citoplasma, um terceiro padrão de cor era mostrado (uma mistura de amarelo e verde).

RESUMO A cultura da canola (Brassica napus L. var. oleifera) foi recentemente introduzida na região do Triângulo Mineiro e Alta Paranaíba, MG. A podridão negra causada pela bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) é uma das principais doenças da cultura. A bactéria é disseminada pelas sementes e métodos alternativos de controle devem ser avaliados. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o uso da terapia fotodinâmica, com os corantes Azul de Metileno (AM) e Azul de Toluidina (AT), sob à irradiação, na inibição do crescimento de Xcc in vitro e no tratamento de sementes de canola naturalmente contaminadas com a bactéria. A suspensão bacteriana de Xcc foi tratada com os corantes AM, AT e associação deles (AM+AT) nas concentrações 25, 50 e 100 µmol L-1, irradiadas ou não, e cultivada em meio de cultura, em seguida foi avaliado o número de unidades formadoras de colônias. Sementes de três genótipos de canola foram tratadas com NaCl 0,45% (Testemunha), AM, AT e AM+AT, nas concentrações 100, 50 e 25 µmol L-1, respectivamente, irradiadas ou não. A porcentagem de germinação das sementes, índice de velocidade de emergência, porcentagem de emergência de plântulas e o controle da bactéria nas sementes foram avaliados. Os corantes AM, AT e AM+AT, nas concentrações 100, 50 e 25 µmol L-1 respectivamente, sob irradiação inibiram o crescimento de Xcc in vitro. A combinação dos corantes AM+AT a 25 µmol L-1 pode ser utilizada no tratamento das sementes de canola. O controle da bactéria Xcc em sementes de canola naturalmente contaminada não foi possível ser determinada com os diferentes corantes. ABSTRACT Canola (Brassica napus L. var. oleifera) crop was recently introduced in the regions of “Triângulo Mineiro” and “Alta Paranaíba”, Minas Gerais State, Brazil. Black rot, caused by the bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), is one of the major diseases affecting this crop. The bacterium is disseminated via seeds and alternative control methods should be investigated. Therefore, the objective of this study was to evaluate the use of photodynamic therapy with the dyes Methylene Blue (MB) and Toluidine Blue (TB), under irradiation, on Xcc growth inhibition in vitro and on the treatment of canola seeds naturally contaminated with the bacterium. Xcc bacterial suspension was treated with MB, TB and their association (MB+TB) at the concentrations 25, 50 and 100 μmol L-1, irradiated or not, and cultivated on culture medium; then, the number of colony-forming units was assessed. Seeds of three canola genotypes were treated with 0.45% NaCl (Control), MB, TB and MB+TB, at the concentrations 100, 50 and 25 μmol L-1, respectively, irradiated or not. Seed germination percentage, emergence speed rate, seedling emergence percentage and control of bacteria in the seeds were evaluated. MB, TB and MB+TB, at 100, 50 and 25 μmol L-1, respectively, under irradiation, inhibited Xcc growth in vitro. The combination of dyes MB+TB, at 25 µmol L-1, can be used in the treatment of canola seeds. Control of the bacterium Xcc in naturally contaminated canola seeds could not be determined with the different dyes.

Submitted by Izabella Pazzoto Alves null (izapazzoto@hotmail.com) on 2017-03-29T18:48:37Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado - Alves, IP 2017.pdf: 1322169 bytes, checksum: 9b200f325b4ed42b13b4e4aafcd85329 (MD5) Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-30T18:04:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alves_ip_me_jabo.pdf: 1322169 bytes, checksum: 9b200f325b4ed42b13b4e4aafcd85329 (MD5) Made available in DSpace on 2017-03-30T18:04:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alves_ip_me_jabo.pdf: 1322169 bytes, checksum: 9b200f325b4ed42b13b4e4aafcd85329 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A avaliação de espermatozoides em tecnologias de reprodução assistida raramente analisa a integridade do DNA, crucial para o desenvolvimento embrionário. A técnica do azul de toluidina permite identificar alterações da cromatina com avaliação concomitante da morfometria espermática. O método foi descrito em diversas espécies, mas ao conhecimento dos autores, ainda não foi relatado em gatos. O objetivo deste estudo foi verificar a aplicabilidade da técnica de coloração de azul de toluidina em avaliar as anormalidades de DNA de espermatozoides epididimários (cabeça, corpo e cauda) de gatos. Investigar ainda se houve correlação entre as variáveis: condensação do DNA, morfologia e morfometria da cabeça espermática. Para este propósito, os índices de alteração de DNA obtidos pela técnica de azul de toluidina e laranja de acridina foram comparados, observando correlação de 65,38% (p

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Babesiosis is a hemolytic tick-borne disease caused by intraerythrocytic protozoal parasites of the genus Babesia. This is a disease of high incidence in the South region of Brazil and responsible for considerable economic losses. Clinical-pathological diagnosis can be made by demonstrating the parasite by examining blood smears or fresh tissues. However, frequently, only formalin-fixed organs are sent to pathology laboratories, which makes it impossible to perform the smears. The main objective of this study was to find alternative histochemical techniques capable to improve the identification of intraerythrocytic B. bovis in histological sections. For this study, tissue samples from 50 bovine necropsy cases were retrospectively analyzed, which had been fixed in formalin and routinely processed for histopathology. The cases were divided into a control group, consisting of 12 cases of cerebral babesiosis with characteristic pink-cherry gray matter (group A), and 38 cases suggestive of cattle tick fever (group B), according to necropsy protocols. Histochemical techniques of Alcian Blue, Methylene Blue, Toluidine Blue, Giemsa, Gram (McCallum-Goodpasture method), Grocott, Periodic Acid of Schiff and Ziehl-Neelsen were tested. Among these, it was observed that the techniques of Methylene Blue and Toluidine Blue allowed to observe morphological and dye characteristics in a clearer way, aiding in the identification of B. bovis. In addition, several clinical-epidemiological and anatomopathological parameters of babesiosis caused by B. bovis were established. A babesiose é uma doença hemolítica transmitida por carrapatos e causada por protozoários intraeritrocitários do gênero Babesia. Esta é uma doença de incidência elevada na Região Sul do Brasil e responsável por perdas econômicas consideráveis. O diagnóstico clínico-patológico pode ser feito através da demonstração do parasita pelo exame de esfregaços sanguíneos ou de tecidos frescos. Entretanto, com frequência, somente órgãos fixados em formol são remetidos para laboratórios de patologia, o que impossibilita a realização do esfregaço. O principal objetivo deste estudo foi encontrar técnicas histoquímicas alternativas e capazes de aprimorar a evidenciação de B. bovis intraeritrocitária. Para este estudo, foram analisadas, retrospectivamente, amostras de tecidos de 50 casos de necropsias de bovinos, as quais haviam sido fixadas em formol e processadas rotineiramente para histopatologia. Os casos foram divididos em um grupo controle, constituído por 12 casos de babesiose cerebral com substância cinzenta encefálica róseo-cereja característica (grupo A), e 38 casos sugestivos de tristeza parasitária bovina (grupo B), conforme os protocolos de necropsias. Foram testadas as técnicas histoquímicas de Azul Alciano, Azul de Metileno, Azul de Toluidina, Giemsa, Gram (método de McCallum-Goodpasture), Grocott, Ácido Periódico de Schiff e Ziehl-Neelsen. Dentre estas, observou-se que as técnicas de Azul de Metileno e Azul de Toluidina permitiram observar características morfológicas e tintoriais de maneira mais nítida, auxiliando na identificação de B. bovis. Adicionalmente, foram estabelecidos vários parâmetros clínico-epidemiológicos e anatomopatológicos da babesiose por B. bovis.

Formulations of Methylene Blue (MB) and toluidine blue (TB) with ethanol or oxygen carrier were evaluated for antimicrobial effect on Pseudomonas aeruginosa biofilms. Formulations photoactivated had photosensitizers (Ps) (250 μM) diluted in PBS (pH 5.6 - sodium acetate / acetic acid), 10% ethanol (buffer:ethanol 90:10), 20% ethanol (buffer:ethanol 80:20) and perfluordecalin emulsion, buffer and triton-X100 (60: 35: 5). The controls were biofilms untreated and without photoactivation. The production of singlet oxygen was measured by photo-oxidation of 1,3-difenilisobenzofuran.The data of photo-oxidation and CFU (log10) were evaluated by One-Way ANOVA and post hoc Tukey and Dunnett, respectively. Student t-test assessed differences between the Ps in the same formulation. MB showed higher singlet-oxygen production. Buffer or etanol 10% hadn´t antimicrobial effect. Ethanol 20% reduced the bacterial viability (1.2 log10, p = 0.009). The lower mean CFU were observed with MB and ethanol 10% (P = 0.052; reduction of 2.18 log10) and 20% (P = 0.053; reduction of 2.18 log10). Microbial reductions in water MB and TB were 1.13 log10 and 1.10 log10, respectively. With carredor reductions were 1.74 and 1.70 for MB and TB, respectively. MB formulations containing ethanol are comparable to some antibiotics in treating P. aeruginosa biofilms in vitro. Formulações de Azul de Metileno (AM) e Azul de Toluidina (AT) contendo etanol ou carreador de oxigênio foram avaliadas quanto ao efeito antimicrobiano em biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. Formulações fotoativadas continham os fotossensibilizados (Fs) (250 μM) diluídos em água tamponada (pH 5,6 - acetato de sódio/ácido acético), etanol 10% (tampão:álcool etílico 90:10), etanol 20% (tampão:álcool etílico 80:20) e emulsão com perfluordecaleno, tampão e triton-X100 (60:35:5). Biofilmes sem tratamento e expostos ao tampão, etanol 10% e 20% sem fotoativação foram avaliados como controles. A produção de oxigênio singleto dos Fs foi mensurada por meio da foto-oxidação do 1,3-difenilisobenzofuran. Os dados de foto-oxidação e UFC (log10) foram avaliados por One-Way ANOVA e post hoc Tukey e Dunnett, respectivamente. Teste t-Student avaliou diferenças entre os Fs na mesma formulação. AM apresentou maior produção do oxigênio-singleto. Tampão ou etanol 10% não tiveram efeito antimicrobiano. Etanol 20% reduziu signficativamente a viabilidade bacteriana (1,2 log10, P=0,009). As menores médias de UFC log10 foram observadas com AM e etanol 10% (P=0,052; redução de 2,18 log10) e 20% (P=0,053; redução de 2,18 log10). Reduções microbianas do AM e AT em água foram de 1,13 log10 e 1,10 log10, respectivamente. Com o carredor as reduções foram de 1,74 e 1,70 para AM e AT, respectivamente. Formulações de AM contendo etanol são comparáveis a alguns antibióticos no tratamento de biofilmes de P. aeruginosa in vitro.

The tomato crop is a one of the highest expressed cultivation in the world; however, various pests may attack the crop. The bacterial spot, caused by the bacterium Xanthomonas spp., is one of the most important diseases that cause losses in yield and quality of tomato and one of the most effective ways to control the disease currently is the use of pathogen-free seeds. This paper studied a new type of seed treatment, effective in controlling fitobactérias. A study in vitro was performed of the photodynamic activity of the dyes Methylene Blue, Toluidine Blue and a combination of both dyes in various concentrations, containing a suspension of Xanthomonas spp. The tested dyes are able to inhibit bacterial growth effectively, under irradiation conditions and with all concentrations tested. In this work we developed a seed treatment, and the method tested was effective in controlling bacteria without causing damage quality physiological seed, figuring a new type of seed treatment that avoids the use of pesticides. tomate é uma das culturas de maior expressão no mundo; entretanto várias pragas podem atacar a cultura. A mancha bacteriana, causada pela bactéria Xanthomonas spp., é uma das doenças que mais causa perdas na produtividade e na qualidade do tomate, sendo o uso de sementes livres do patógeno uma das formas mais eficazes de controlar a doença atualmente. O presente trabalho estudou uma nova modalidade de tratamento de sementes, eficaz no controle de fitobactérias. Foi efetuado um estudo in vitro, da atividade fotodinâmica dos corantes Azul de Metileno, Azul de Toluidina e uma combinação de ambos os corantes, em várias concentrações, sobre uma suspensão contendo Xanthomonas spp., onde sob condições de irradiação todos os corantes testados, em todas as concentrações testadas, são capazes de inibir o crescimento bacteriano de forma eficaz. O tratamento de sementes desenvolvido foi eficaz no controle da bactéria sem causar danos à qualidade fisiológica e sanitária das sementes, figurando uma nova modalidade de tratamento de sementes que dispensa o uso de agrotóxicos. Mestre em Química

Pádua S.B. & Ishikawa M.M. [Metachromasia for blood basophils identification in hybrid surubim catfish: methodological contribution]. Metacromasia para identificação de basófilos sanguíneos em surubim híbrido: contribuição metodológica. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 33(3):147-150, 2011. Centro de Aquicultura da Unesp/Jaboticabal Rod. Paulo Donato Castellane, s/n Bairro Rural, Jaboticabal, 14884-900, SP. Brasil. E-mail: santiagopadua@live.com Different protocols of fixation and hydrolysis of blood smears of hybrid surubim catfish for metachromasia to marking blood basophils were evaluated. For this reason, methanol, acid-alcohol and formalin vapor were tested as fixatives. For hydrolysis of blood smears, HCl, citric acid and 2-Mercaptoethanol + Urea + NaCl solutions was evaluated. After procedures, the blood smears was stained with toluidine blue (0.025%) diluted in McIlvaine buffer (pH 4). The different protocols for fixation and hydrolysis of blood smears for metachromasia influenced the quality of the reaction. Hydrolysis with 2-Mercaptoethanol + Urea + NaCl solutions provided negative results when using methanol and acid-alcohol as fixatives. The fixation with acid-alcohol associated with citric acid hydrolysis provides highest quality reason., O presente estudo avaliou diferentes protocolos de fixação e hidrólise das extensões sanguíneas de surubim híbrido para reação de metacromasia e marcação de basófilos sanguíneos. Para isso, metanol, álcool-ácido e vapor de formol foram testados como fixadores. Para hidrólise das extensões sanguíneas foi avaliado HCl, ácido cítrico e soluções de 2-Mercaptoetanol + Uréia + NaCl. Após estes procedimentos, as extensões foram submetidas à coloração com azul de toluidina (0,025%) diluída em tampão de McIlvaine (pH 4). Diferentes protocolos para fixação e hidrólise das extensões sanguíneas destinadas à reação de metacromasia influenciam na qualidade da reação. A hidrólise com soluções de 2-Mercaptoetanol + Uréia + NaCl proporcionaram resultados negativos quando utilizadometanol e álcool-ácido como fixadores. A fixação com álcool-ácido associada à hidrólise com ácido cítrico proporciona reações com melhor qualidade.

Made available in DSpace on 2013-08-12T18:49:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T17:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:12:36Z No. of bitstreams: 0 Made available in DSpace on 2014-05-20T13:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-01 Padua S.B. & Ishikawa M.M. [Metachromasia for blood basophils identification in hybrid surubim catfish: methodological contribution]. Metacromasia para identificacao de basofilos sanguineos em surubim hibrido: contribuicao metodologica. Revista Brasileira de Medicina Veterinaria, 33(3):147-150, 2011. Centro de Aquicultura da Unesp/Jaboticabal Rod. Paulo Donato Castellane, s/n Bairro Rural, Jaboticabal, 14884-900, SP. Brasil. E-mail: santiagopadua@live.comDifferent protocols of fixation and hydrolysis of blood smears of hybrid surubim catfish for metachromasia to marking blood basophils were evaluated. For this reason, methanol, acid-alcohol and formalin vapor were tested as fixatives. For hydrolysis of blood smears, HCl, citric acid and 2-Mercaptoethanol + Urea + NaCl solutions was evaluated. After procedures, the blood smears was stained with toluidine blue (0.025%) diluted in McIlvaine buffer (pH 4). The different protocols for fixation and hydrolysis of blood smears for metachromasia influenced the quality of the reaction. Hydrolysis with 2-Mercaptoethanol + Urea + NaCl solutions provided negative results when using methanol and acid-alcohol as fixatives. The fixation with acid-alcohol associated with citric acid hydrolysis provides highest quality reason. Ctr Aquicultura Unesp CAUNESP, BR-14884900 Jaboticabal, SP, Brazil Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) Agropecuaria Oeste, BR-79804970 Dourados, MS, Brazil Ctr Aquicultura Unesp CAUNESP, BR-14884900 Jaboticabal, SP, Brazil

Investigou-se a correlação entre a morfometria da cabeça e a intensidade da condensação e heterogeneidade da cromatina em espermatozoides de coelho (Oryctolagus cuniculus). Para tal, utilizaram-se 35 esfregaços de sêmen de coelhos da raça Nova Zelândia, corados com azul de toluidina e avaliados por análise de imagem computacional. As imagens foram obtidas digitalmente em tons de cinza e avaliadas por algoritmos desenvolvidos em ambiente de programação Scilab. As mensurações obtidas da cabeça dos espermatozoides foram área, perímetro, comprimento, largura, relação comprimento largura, elipsidade, fator de forma, descritores Fourier e simetria lateral e anteroposterior. Também foram avaliadas a intensidade da compactação e a heterogeneidade da cromatina espermática. Os espermatozoides de coelho apresentaram compactação e heterogeneidade cromatínica mais intensas do que os de touro e observou-se correlação significativa entre características morfométricas da cabeça e compactação e heterogeneidade cromatínica. Conclui-se que a cromatina é importante para a constituição morfológica da cabeça de espermatozoides de coelho e que a cromatina espermática de coelho é naturalmente mais heterogênea e menos compactada que a de touro The correlation between the head morphometry and the intensity of condensation and heterogeneity of sperm chromatin were investigated in rabbit (Oryctolagus cuniculus). To this, 35 semen smears from New Zealand rabbits were stained with toluidine blue and evaluated by computer image analysis. The images were obtained in digital grayscale and analyzed by algorithms developed in the Scilab programming environment. The measurements obtained from the sperm heads were area, perimeter, length, width, length:width ratio, ellipticity, shape factor, lateral and anterior-posterior symmetries, and Fourier descriptors. The intensity and heterogeneity of the compaction of sperm chromatin was also evaluated. The rabbit spermatozoa showed chromatin heterogeneity and condensation more intense than the bull spermatozoa, and it was observed correlation between morphometric characteristics of the head and chromatin compaction and heterogeneity. The results suggest that chromatin is important for the morphological constitution of the head morphology spermatozoa head, as well as, rabbit sperm chromatin is inherently more heterogeneous and less condensed than the bull sperm chromatin

Reprodutores com espermograma normal podem se comportar como subférteis ou passarem por períodos de subfertilidade. As alterações na cromatina dos espermatozóides são possíveis explicações encontradas para tais comportamentos. Conduziu-se este trabalho, com o objetivo de testar a eficiência de azul de toluidina (AT) e do alaranjado de acridina (AA) na identificação de alterações na compactação de cromatina em espermatozóides de ovinos e caprinos, além de avaliar a correlação entre essas alterações e as de morfologia espermática. Para tal, foram avaliadas amostras de sêmen de 15 ovinos e de 15 caprinos, com dez repetições para cada método por animal. Calcularam-se a média, o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (CV) para cada técnica e animal. Utilizou-se o teste t-Student para avaliar diferença entre as médias obtidas nos dois métodos. Também foram calculados a correlação de Pearson e os coeficientes kappa ponderado e não ponderado para avaliar a concordância entre os métodos com AT e AA. Foi verificado que nem sempre as anomalias morfológicas de cabeça são acompanhadas por alterações na cromatina identificáveis pelos métodos utilizados neste trabalho. O método AT é mais estável e possui maior sensibilidade do que AA para ambas as espécies, sendo o mais indicado para caprinos. Contudo, em razão de apresentar repetibilidade muito baixa, ambos os métodos não são indicados para avaliação espermática em ovinos. Males with normal spermogram can behave as subfertile or pass for periods of subfertility. Chromatin alterations of spermatozoa can account for such behavior. The objective of the present work was to test the efficacy of toluidine blue (TB) and acridine orange (AO) in the identification of alterations in chromatin compaction in spermatozoa from rams and goats, in addition to evaluate the correlation between those alterations and the ones of spermatic morphology. In order to do that, samples of semen from 15 rams and 15 goats were evaluated with 10 replications for each method. Mean, standard deviation and coefficient of variation were calculated for each animal and technique. Student's t-test was used to evaluate differences between the averages of two methods. Pearson correlation coefficient, weighted and non weighted kappa coefficient were also calculated to evaluate the agreement between methods with TB and AO. It was verified that morphological alterations of head not always are accompanied by alterations in chromatin identified by the methods used in this work. The TB method is more stable and sensitive than AO method for both species and this is most appropriate for goats. However, due to the very low repeatability, both methods are not indicated for evaluating ram spermatozoa.

Testaram-se variantes metodológicas utilizando azul de toluidina (AT), até se estabelecer um protocolo confiável para a avaliação computacional da compactação da cromatina em espermatozoides de galo. Para tal, foram utilizados sêmen de 10 galos com 35 semanas de idade e sêmen de 10 galos com 60 semanas de idade. O melhor método foi o de hidrólise com ácido clorídrico 1N por 10 minutos, coloração em cubeta com AT 0,025%, pH 4,0, por 20 minutos, desidratação em álcool, diafanização em xilol e montagem com bálsamo do Canadá. Todas as amostras de sêmen foram submetidas a este protocolo e posteriormente avaliadas por análise de imagem computacional, em que foram feitas mensurações da área, comprimento, largura, perímetro, homogeneidade da compactação da cromatina dentro de cada cabeça e intensidade de compactação da cromatina. Os espermatozoides de galos velhos apresentaram mais alterações na cromatina que os de galos jovens. Os galos jovens apresentaram cabeça dos espermatozoides maior que os galos mais velhos. A análise computacional da compactação da cromatina mostrou-se um método menos subjetivo e mais preciso que a avaliação visual das cabeças dos espermatozoides. The methodological variants using toluidina blue (AT) to establish a trustworthy protocol for the computational analysis of chromatin condensation of rooster spermatozoa were studied. Twenty semen samples were used: ten from 35-week-old roosters and ten from 60-week-old roosters. Different methods of denaturation and staining were tested. The best method was hydrolysis with 1N HCl for 10 minutes, staining in bucket with 0.025% AT, pH 4.0, for 20 minutes, dehydration in alcohol, clearing in xylol, and mounted with Canada balsam. All the semen samples were submitted to this protocol and later evaluated by computational image analysis. Area, length, width, perimeter, and chromatin compaction homogeneity of head spermatozoa were measured. The sperm of older roosters presented more chromatin changes than the ones of younger ones. The spermatozoa of younger roosters presented bigger heads than the ones of older roosters. The computational analysis of chromatin compaction showed to be less subjective and more precise than the visual evaluation for identification of chromatin alterations of rooster spermatozoa.

The objective of this work was to evaluate the relationship between sperm head morphometry and chromatin packaging with the cleavage ratio and blastocyst formation during in vitro fertilization programs (IVF). Data of 38 IVFs using semen of zebu bulls with normal spermogram, carried out at two laboratories in Uberaba, Minas Gerais, Brazil, were used in this study. Sperm smears stained with toluidine blue and analyzed by computer image analysis were used to evaluate the morphometry and chromatin packaging. The packaging intensity and homogeneity of sperm chromatin were evaluated. The results made it possible to conclude that light variations in the head morphometry and chromatin packaging had little influence on the cleavage and number of morphologically normal blastocysts during IVF. O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre a morfometria da cabeça do espermatozoide e a compactação da cromatina com as taxas de clivagem e formação de blastocisto em programas de produção de embriões in vitro (PIV). Neste estudo foram utilizados dados de 38 rotinas de PIVs com sêmen de touros zebuínos com espermograma de rotina normal, realizadas em dois diferentes laboratórios de Uberaba, Minas Gerais, Brasil. Para avaliar a morfometria e compactação da cromatina, foram usados esfregaços de sêmen corados com azul de toluidina e avaliados por análise de imagem computacional. A cromatina foi avaliada quanto à intensidade de compactação e homogeneidade. Os resultados permitem concluir que pequenas variações na morfometria da cabeça e na compactação da cromatina espermática pouco influenciam a clivagem e o número de blastocistos morfologicamente normais na PIV.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2017-08-15T18:23:07Z No. of bitstreams: 1 2009 - L?via Helena Moreira da Silva.pdf: 9761965 bytes, checksum: 0fa6815cc4bc10c43d8eea0b989dc84d (MD5) Made available in DSpace on 2017-08-15T18:23:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009 - L?via Helena Moreira da Silva.pdf: 9761965 bytes, checksum: 0fa6815cc4bc10c43d8eea0b989dc84d (MD5) Previous issue date: 2009-02-27 Item withdrawn by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2020-07-15T15:51:38Z Item was in collections: DOUTORADO EM CI?NCIAS VETERIN?RIAS (ID: 38) No. of bitstreams: 3 2009 - L?via Helena Moreira da Silva.pdf: 9134974 bytes, checksum: 08644029dbe2c700de14e7daa7f1d7e4 (MD5) 2009 - L?via Helena Moreira da Silva.pdf.txt: 177355 bytes, checksum: 265930a58227735a1ebcecda3b0b873c (MD5) 2009 - L?via Helena Moreira da Silva.pdf.jpg: 3947 bytes, checksum: 6601bb01765f75262bd04905882ff080 (MD5) Item reinstated by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2022-06-19T23:44:08Z Item was in collections: Doutorado em Ci?ncias Veterin?rias (ID: 38) No. of bitstreams: 3 2009 - L?via Helena Moreira da Silva.pdf: 5530667 bytes, checksum: a3c807f3b73197d4a2a91110fcfcfee6 (MD5) 2009 - L?via Helena Moreira da Silva.pdf.jpg: 3947 bytes, checksum: 6601bb01765f75262bd04905882ff080 (MD5) 2009 - L?via Helena Moreira da Silva.pdf.txt: 177355 bytes, checksum: 265930a58227735a1ebcecda3b0b873c (MD5) CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico Experiments were carried out to adapt the technical photodynamic therapy (PDT) to the subclinical mastitis treatment in bovine. Two LEDs equipments were tested with manufactured acrylic fibers to penetration in the teats. Different energy densities were tested to development the methodology. The photodynamic therapy using low energy density was efficient to treat subclinical mastitis, it can be seen the reduction of mammary infection. The constructions the acrylic fibers to LEDs equipments were efficient, where it was possible to reach all interior of the mammary treated. The toluidine blue at 2,5% was efficient to light dispersal and in microbial activity. The energy densities (ED) used was efficient to the principal microbial agents of subclinical mastitis found in the present work. Staphylococcus coagulase positive was removed with ED 25J/cm2 removed with ED 75J/cm2, Staphylococus coagulase negative were , Bacillus sp was removed with ED 100J/cm2 , Streptococcus dysgalactiae bacterial total count was reduced when ED 200J/cm2 was used. Foram realizados v?rios experimentos para adequar ? t?cnica terapia fotodin?mica (PDT) para o tratamento de mastite subcl?nica em bovinos. Foram avaliados dois aparelhos de LEDs adaptados com fibra de acr?lico para a penetra??o nos tetos. Varias densidades de energia foram testadas para o efeito desejado com o desenvolvimento de uma metodologia pr?pria. A terapia fotodin?mica utilizando baixa densidade de energia para tratar mastite subcl?nica foi eficiente posto que, houve redu??o na infec??o nos quartos mam?rios tratados. As adapta??es para adequa??o dos aparelhos LEDs para tratamento dos tetos afetados com mastite subcl?nica em bovinos foi eficiente permitindo que a irradia??o atingisse todo interior do quarto mam?rio tratado. O agente fotossensibilizante azul de toluidina a 2,5% foi capaz de desencadear o efeito desejado permitindo a dispers?o da luz e estimulando resposta antimicrobiana. As densidades de energia (DE) testadas reduziram os principais agentes microbianos isolados. Staphylococcus coagulase positivos foi eliminado com DE 25J/cm2, Estafilococos coagulase negativos com DE 75J/cm2, Bacillus sp. com DE 100J/cm2 e Streptococcus dysgalactiae diminuiu na contagem bacteriana total quando se utilizou DE 200J/cm

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais The objectives of this work were to evaluate new methodological variants using toluidina blue (AT), to establish a trustworthy protocol for the computational evaluation of the chromatin compaction of the fowl s spermatozoa, to find out alterations in the chromatin compactation during the storage in the sperm storage tubules of fowl hens, to observe the storage time and to estimate the variation in the amount of stored spermatozoa in the cranial, medium and caudal sections of the uterovaginal junction during 23 days. Twenty semen samples were used: 10 from fowls that were 35 weeks old and had high fertility (young fowls) and 10 from fowls that were 60 weeks and had low fertility (Old fowls). To the analysis of the spermatozoa during the storage in the sperm storage tubules of hens, 48 thirty-six- week-old meat chickens (44 hens and 4 fowls) of the Cobb Avian 48 strain were also used. A sample from the uterovaginal junction of the hens was collected for 23 days after the match with the fowls, 6 hens being sacrificed every four days to make histological microscope slides. Different methods of denaturation and staining were tested. The best method with AT was the hydrolysis with 1N HCl for 10 minutes, staining in bucket with 0.025% AT, pH 4,0, for 20 minutes, dehydration in alcohol, clearing in xylol and mounted with Canada balsam. All the semen samples were submitted to this protocol and later evaluated through computational image analysis. Area, length, width, perimeter and the chromatin compaction homogeneity of head spermatozoa were measured. The sperm of old fowls presented more chromatin changes than the ones of young fowls. The spermatozoa of the young fowls presented bigger heads than the ones of old fowls. It was not possible to determine the chromatin compaction alterations of the fowl sperm after their storage in the sperm storage tubules through the used method. Spermatozoa were found through out the area of the sperm storage tubules. Most of then gathered in the medium section of the uterovaginal junction. There was not meaningful statistical difference in the amount of sperm in the sperm storage tubules over the days of the experiment. A greater amount of sperm cells were observed until the 23rd day of assessment. Therefore, the storage time of the spermatozoa in hens lasts at least 23 days. Os objetivos desse trabalho foram testar novas variantes metodológicas utilizando coloração com azul de toluidina, até se estabelecer um protocolo confiável para a avaliação computacional da compactação da cromatina em espermatozóides de galo, buscar alterações na compactação da cromatina durante o armazenamento dos mesmos na espermateca de galinhas, observar a duração do período de armazenamento e estimar a variação na quantidade de espermatozóides armazenados nos segmentos cranial, médio e caudal da região da espermateca durante 23 dias. Para avaliação computacional da compactação da cromatina, foram utilizadas 20 amostras de sêmen de galo, sendo 10 amostras de galos com 35 semanas de idade (Galos Novos) e 10 amostras de galos com 60 semanas de idade (Galos Velhos). Para a análise dos espermatozóides durante o armazenamento nas espermatecas das galinhas, foram utilizadas 48 matrizes pesadas (44 fêmeas e 4 machos) da linhagem Cobb avian 48 com 36 semanas de idade. Foi coletado material da junção utero-vaginal das fêmeas por 23 dias após a cópula com os machos, sendo que a cada 4 dias, 6 fêmeas foram sacrificadas para confecção de lâminas histológicas da região da espermateca. Foram testados diferentes métodos de desnaturação e coloração com AT, sendo que o melhor foi a hidrólise com ácido clorídrico 1N por 10 minutos, coloração em cubeta com azul de toluidina 0,025%, pH 4,0, por 20 minutos, desidratação em álcool, diafanização em xilol e montagem com bálsamo do Canadá. Todas as amostras de sêmen foram submetidas a este protocolo e posteriormente avaliadas por análise de imagem computacional, onde foram mensuradas as cabeças dos espermatozóides quanto a área, comprimento, largura, perímetro, homogeneidade da compactação da cromatina dentro de cada cabeça e intensidade de compactação da cromatina. Os espermatozóides de galos velhos apresentaram mais alterações na cromatina do que os de galos jovens. Os galos jovens apresentaram cabeças de espermatozóides maiores do que galos velhos. Não foi possível determinar as alterações na compactação da cromatina dos espermatozóides dos galos após o armazenamento na espermateca pelo método utilizado. Foram encontrados espermatozóides por toda a extensão das espermatecas, sendo que esses se concentravam no segmento médio da junção utero-vaginal. Não houve diferença estatística significativa na quantidade de espermatozóides presentes na espermateca no decorrer dos dias de experimento. Foram observadas grandes quantidades de células espermáticas até o 23º dia de coleta. Portanto, o período de armazenamento de espermatozóides em galinhas é de, no mínimo 23 dias. Mestre em Ciências Veterinárias

38 PIVs carried through in two laboratories of the Uberaba MGBRASIL had been used in this work with the objective to evaluate the relationship between condensation chromatin and head morphometry of spermatozoa and cleavages and blastocyst formation rates using semen of zebu bulls with normal routine tests of fertility. Smears of semen stained with of Toluidine Blue and computer image analysis had been used to evaluate the morphometry and chromatin condensation. Area (A), perimeter (P), width (L), length (C), width:length ratio (L/C), ellipticity (E), shape factor (FF), side symmetry (SL), anterior-posterior symmetry (SAP) and the three first Fourier values (F0, F1, F2) had been evaluated in the morphometric analysis. The chromatin was evaluated in relation to intensity of condensation and homogeneity. The results allowed concluding that the influence of light variations in the sperm head morphometry and the chromatin condensation on the cleavage and number of normal morfologic blastocyst in the PIV is small. Foram utilizados os dados de 38 programações de produção in vitro de embriões (PIV), realizadas em dois laboratórios da cidade de Uberaba-MG-Brasil, com o objetivo de se avaliar a correlação entre compactação da cromatina e morfometria da cabeça de espermatozóides com a taxa de clivagem e formação de blastocisto utilizando sêmen de touros zebuínos com testes de rotina normais para fertilidade. Foram utilizados esfregaços de sêmen corados com Azul de Toluidina e análise de imagem por computador para avaliar a morfometria e a compactação de cromatina. Na análise morfométrica foram avaliados: área (A), perímetro (P), largura (L), comprimento (C), razão largura:comprimento (L/C), elipsidade (E), fator forma (FF), simetria lateral (SL), simetria ântero-posterior (SAP) e descritores Fourier com amplitude de 0 a 2 (F0, F1, F2). A cromatina foi avaliada quanto à intensidade de compactação e homogeneidade. Os resultados permitiram concluir que é discreta a influência de pequenas variações observadas na morfometria da cabeça e na compactação da cromatina espermática sobre a clivagem e número de blastocistos morfologicamente normais na PIV. Mestre em Ciências Veterinárias

In poultry breeding, male fertility has extreme importance to assure a better production of fertile eggs. Evaluation techniques for fertility of fowls are not well explored and in most cases, the evaluation is done through sampling considering only morphophysiological factors directly related with the spermatozoon. It's known that in other species, besides morphophysiological factors, there are intrinsic problems to the spermatozoon such as less chromatin condensation that can lead to fertility problems that in most cases are not diagnosised. The purpose of this work was the adaptation of techniques of chromatin evaluation for chicken (Gallus Gallus, Linnaeus, 1758) which have already been described in other species, correlating the chromatin alterations with the morphological alterations and the fertility. Fowl semen samples with different levels of fertility were used for test different methods to identify chromatin alterations using toluidine blue and acridine orange die. Evaluations have shown that smears of fresh semen with posterior fixation generate artfacts that change the head shape and the chromatin integrity not being indicated in methods of fertility evaluation. Although all the tested methods have presented methodology imperfections and some certain degree of subjectivity, the method that has generated best results was the mixture of one semen drop conserved in buffered phormol and a drop of acridine orange on microscopy slide with posterior staining and observation in fluorescence microscopy with blue excitation filter. Through this method it was verified that alterations in the chromatin condensation of fowl spermatozoa are generally not followed by morphological alterations and that generally the morphologic alterations of fowl spermatozoa are generally followed by alterations in chromatin condensation. This is an important factor in the determination of the fowl fertility. Na avicultura, a avaliação de fertilidade em machos é de extrema importância, para garantir uma melhor produção de ovos férteis. As técnicas para avaliação de fertilidade em galos são pouco exploradas, sendo que na maioria das vezes, a avaliação é feita por amostragem e levando em consideração, apenas fatores morfofisiológicos, diretamente relacionados com o espermatozóide. Mas é sabido que, em outras espécies, além dos fatores morfofisiológicos, existem problemas intrínsecos ao espermatozóide, como a baixa compactação da cromatina, que pode levar a disturbios de fertilidade, que na maioria das vezes não são diagnosticados. O objetivo desse trabalho foi a adaptação de técnicas de avaliação da cromatina, já descritas em outras espécies, para aves de linhagem pesada (Gallus gallus, Linnaeus, 1758), correlacionando as alterações cromatínicas com as alterações morfológicas e com a fertilidade. Para tanto, sêmen de galo com diferentes níveis de fertilidade, foram utilizados em diferentes métodos para identificação de alterações na cromatina, utilizando os corantes azul de toluidina e alaranjado de acridina. As avaliações demonstraram que esfregaços de sêmen fresco de galo com posterior fixação geram artefatos que levam a alterações na forma da cabeça e na integridade da cromatina, não sendo indicados em métodos de avaliação de fertilidade. Apesar de todos os métodos testados apresentarem falhas metodológicas e um certo grau de subjetividade, o método que gerou melhores resultados foi a mistura de uma gota de sêmen conservado em formol salina e uma gota do alaranjado de acridina sobre lâmina de microscopia, com posterior secagem e observação em microscopia de fluorescência com filtro de excitação azul. Pelo método verificou-se que alterações na compactação da cromatina de espermatozóides de galo geralmente não são acompanhadas por alterações morfológicas e que geralmente as alterações morfológicas de espermatozóides de galo são acompanhadas por alterações na compactação da cromatina e que esse é um importante fator na determinação da fertilidade de galos.