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Este artigo tem como temática Alteridade e Educação. Objetiva compreender como a Alteridade está presente no contexto escolar, a partir dos dizeres e atitudes de educandos. Utilizamos Emmanuel Lévinas e Paulo Freire para fundamentar nossas reflexões respectivamente em torno das temáticas da Alteridade e da formação de professores, além de outros autores e documentos da educação básica. De cunho qualitativo e exploratório, esta pesquisa foi desenvolvida com educandos de uma escola pública de Blumenau-SC. Para produção dos dados utilizamos a realização de rodas de conversa com um grupo focal. Os dados que foram coletados a partir dos dizeres dos educandos, em relação às diferenças, demonstram que há estereótipos ainda fortemente presentes na sociedade e que, consequentemente, excluem aqueles que fogem do padrão. Palavras-chave: Alteridade. Outro/Outridade. Educação escolar. " The presence of otherness in the context of a public school: na analysis based on the thoughts of the students Abstract This article has the theme of Alterity and Education. It aims to understand how the Alterity is present in the context of the school, based on sayings and attitudes of learners. We use Emannuel Levinas and Paulo Freire to base our reflections respectively on the subject of Alterity and teacher training, as well as other authors and documents of the basic education. This research used qualitative method and is defined as exploratory. It was developed with students of a public school in the city of Blumenau-SC. To produce the data we did conversation circles with a focus group. The data show that students' statements about differences carry stereotypes that are still strongly present in our society and therefore exclude those who are out of the patterns. Keywords: Alterity. Other/Otherness. Schoolar education.

A dependência com a temperatura da intensidade de luz espalhada por dispersões aquosas do lipídio aniônico DMPG (dimiristoil fosfatidilglicerol) foi estudada para diferentes forças iônicas. A transição principal, gel - líquido cristal, pode ser bem monitorada por um decréscimo abrupto na turbidez. Como esperado, a temperatura da transição de fase principal (Tm) aumenta com o aumento da força iônica. Para baixa força iônica, uma segunda transição com a temperatura para o DMPG, chamada de pós-transição, pode ser monitorada tanto por um aumento no espalhamento de luz quanto por um decréscimo na condutividade. Análises de Zimm plot indicam que abaixo de Tm os lipossomos tendem a se agregar, resultando em um segundo coeficiente de virial, A2, negativo, e em uma grande massa molecular da partícula. Na transição de fase, juntamente com uma diminuição na turbidez, ocorre um aumento na condutividade da amostra, A2 torna-se positivo e a massa molecular da partícula diminui, indicando um estado não agregado. Além disso, na pós-transição (Tp) A2 torna-se muito pequeno, e a massa molecular aumenta novamente. Ambas as transições são reversíveis. Opostamente à transição principal, a pós-transição não pôde ser detectada por marcadores de spin situados tanto na superfície da membrana quanto em seu interior. Considerando um aumento na área por cabeça polar do lipídio após a transição principal, e o modelo de Stern-Gouy-Chapman, foi possível mostrar que a transição causa um aumento no grau de dissociação da vesícula, aumentando portanto a concentração de íons em solução. Entretanto, dentro da estrutura desse modelo simples, foi necessário considerar diferentes constante de associação Na+-DMPG nas fases gel e líquido cristal, para explicar um aumento na repulsão entre as vesículas com a transição principal. Os mecanismos que governam a pós-transição são ainda menos claros. The temperature dependence of the intensity of light scattered by aqueous dispersions of the anionic lipid DMPG (dimyristoyl phosphatidylglycerol) was studied at different ionic strengths. The lipid main transition, gel-liquid crystal, can be well monitored by a sharp decrease in turbidity. As expected, the temperature of the main transition (Tm) was found to increase with the increase of the ionic strength. For low ionic strength, a DMPG second temperature transition, named post-transition, can be monitored by both an increase in light scattering and a decrease in conductivity. Zimm plot analysis indicates that bellow Tm the liposomes tend to aggregate, yielding a negative second virial coefficient A2, and particles of large molecular weight. At the phase transition, parallel to the decrease in turbidity, there is an increase in the sample conductivity, A2 becomes positive and the particle molecular weight decreases, indicating a non-aggregated state. Moreover, at the post-transition (Tp) A2 becomes very small, and the molecular weight increases again. Both the main and post transitions were found to be reversible. Opposite to the main transition, the post-transition could not be detected by spin labels placed either at the membrane surface, or in the bilayer core. Considering an increase in area per lipid headgroup upon the main transition, and the Stern-Gouy- Chapman model, it was possible to show that the main transition increases the vesicle degree of dissociation, hence increasing the ion concentration in solution. However, within the framework of that simple model, it was necessary to consider different Na+- DMPG association constants, in the gel and liquid phases, to explain an increase in vesicles repulsion upon the main transition. The mechanisms governing the posttransition are even less clear.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A estabilidade das membranas celulares é de importância vital para as células. Após estímulos de alta intensidade, como os causados pela aplicação de pulsos elétricos, poros são abertos na membrana (eletroporação) e se fecham em poucos ms, permitindo que a integridade da membrana seja preservada, conforme observado em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) neutras de PC (fosfatidilcolina). No entanto, a adição do lipídio negativo PG (fosfatidilglicerol) mostrou desempenhar um papel importante na desestabilização das membranas após eletroporação: (i) alguns poros se abrem indefinidamente, levando à completa perda da integridade da vesícula (bursting) e (ii) GUVs que sobreviveram à poração exibem permeabilidade de longa duração, revelando a permanência de poros submicroscópicos após o fechamento dos macroporos. Nesta tese, foi investigada a resposta mecânica de GUVs a campos elétricos, com foco na estabilidade de membranas contendo frações crescentes de lipídios aniônicos de conhecida relevância biológica, como o fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2), cardiolipina (CL), fosfatigilglicerol (PG) e extrato lipídico de E. coli, bem como foi examinada a relevância da assimetria dos lipídios negativos entre as monocamadas na estabilidade dessas membranas. Também foram explorados sistemas mais complexos, como vesículas gigantes de membrana plasmática (GPMVs), que representam um passo intermediário entre GUVs lipídicas e células, apresentando as características lipídicas e proteicas das células que as originaram. Métodos experimentais e computacionais foram desenvolvidos e aperfeiçoados ao longo do trabalho para a realização e análise dos experimentos executados. Em GUVs com distribuição simétrica de lipídios aniônicos, medidas da ocorrência de eventos desestabilizantes, como bursting e permeabilidade duradoura, mostraram que as membranas contendo frações mais altas de lipídios negativos (50 mol%) são mais instáveis e propensas à desestabilização. Esses efeitos, que se mostraram independentes do tipo de lipídio negativo utilizado, foram relacionados a uma redução de cerca de 50% na tensão de linha do poro, propriedade que governa o seu fechamento e que foi calculada através de um software desenvolvido durante o projeto (PoET). GUVs com distribuição assimétrica de lipídio negativo entre as monocamadas da membrana foram obtidas por dois métodos diferentes: transferência de fase e alterações do pH do meio externo das vesículas. A assimetria foi verificada por meio de um ensaio de supressão de fluorescência aperfeiçoado ao longo do estudo, em combinação com um algoritmo desenvolvido para medidas de fluorescência em GUVs. Eventos desestabilizantes foram observados já para pequenos graus de assimetria de carga (5 mol%), que potencializam a ocorrência de eventos mais extremos, como o bursting, devido à geração de curvatura espontânea acentuada. Quando consideramos modelos ainda mais relevantes, resultados preliminares mostram que existem diferenças na forma com que GPMVs e GUVs respondem a pulsos elétricos, provavelmente devido à maior complexidade exibida pelas membranas das GPMVs. Os resultados apresentados aqui evidenciam que os lipídios aniônicos possuem um papel importante na desestabilização das membranas após eletroporação, sendo os efeitos realçados no caso em que estes estão assimetricamente distribuídos entre as monocamadas das membranas, como observado nas membranas celulares. Acreditamos que os achados possam contribuir para o desenvolvimento de sistemas de entrega intracelular de drogas baseados em eletroporação mais eficientes. Ainda, julgamos que o aperfeiçoamento do ensaio de supressão de fluorescência e o desenvolvimento do software para cálculo da tensão de linha e do algoritmo para medidas de fluorescência serão de grande contribuição para a comunidade científica, permitindo a realização de experimentos e obtenção de dados de forma mais confiável e reprodutível. Membrane stability is of vital importance to cells. After high-intensity stimuli, such as those caused by the application of electric pulses, pores are opened in the membrane (electroporation) and close within a few ms, allowing the integrity of the membrane to be preserved, as observed in neutral PC (phosphatidylcholine) giant unilamellar vesicles (GUVs). However, the addition of the negative lipid PG (phosphatidylglycerol) has shown to play an important role in the destabilization of membranes after electroporation: (i) some pores open indefinitely, leading to complete loss of vesicle integrity (bursting) and (ii) GUVs that survived poration exhibit longlasting permeability, revealing the persistence of submicroscopic pores after macropores have closed. In this thesis, the mechanical response of GUVs to electric fields was investigated, focusing on the stability of membranes containing increasing fractions of anionic lipids of known biological relevance, such as phosphatidylinositol (PI), phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2), cardiolipin (CL), phosphatidylglycerol (PG) and E. coli lipid extract, as well as the relevance of the asymmetry of negative lipids between the membrane monolayers in the stability of these membranes. More complex systems were also explored, such as Giant Plasma Membrane Vesicles (GPMVs), which represent an intermediate step between lipid GUVs and cells, exhibiting the lipid and protein characteristics of the cells that originated them. Experimental and computational methods were developed and improved throughout the work to execute and analyze the experiments performed. In GUVs with symmetric distribution of anionic lipids, measurements of the occurrence frequency of destabilizing events, such as bursting and long-lasting permeability, showed that membranes containing higher fractions of negative lipids (50 mol%) are more unstable and prone to destabilization. These effects, which proved to be independent of the type of negative lipid used, were related to a reduction of about 50% in the pore edge tension, a property that governs its closure and that was calculated using a software developed during the project (PoET). GUVs with asymmetric negative lipid distribution between the membrane monolayers were obtained by two different methods: phase transfer and changes in the pH of the external solution of the vesicles. Asymmetry was verified using a fluorescence quenching assay improved throughout the study, in combination with an algorithm developed for fluorescence measurements in GUVs. Destabilizing events were already observed for small amounts of charge asymmetry (5 mol%), which enhances the occurrence of more extreme events, such as bursting, due to the generation of accentuated spontaneous curvature. When we consider even more relevant models, preliminary results show that there are differences in the way GPMVs and GUVs respond to electric pulses, probably due to the greater complexity exhibited by GPMV membranes. The results presented here show that anionic lipids play an important role in the destabilization of membranes after electroporation, the effects being enhanced in the case where they are asymmetrically distributed between the membrane monolayers, as observed in cell membranes. We believe that the findings may contribute to the development of more efficient electroporation-based intracellular drug delivery systems. Furthermore, we believe that the improvement of the fluorescence quenching assay and the development of the software for calculating the edge tension and the algorithm for fluorescence measurements will be of great contribution to the scientific community, allowing the performance of experiments and data collection in a more reliable and reproducible way.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Lipossomas são vesículas lipídicas comumente utilizadas como modelo estrutural de membranas biológicas e carreadores de fármacos. A fim de melhorar sua capacidade de entrega intracelular, um sistema de lipossomas fusogênicos composto pelos lipídios DOTAP (catiônico) e DOPE (zwitteriônico) foi desenvolvido anteriormente e tem como principal rota de entrega a fusão de membranas. Este trabalho de doutorado direto teve como objetivo principal a investigação das propriedades da membrana (e.g, carga superficial e fase de membrana) e sua influência na eficiência de fusão desses lipossomas fusogênicos com vesículas biomiméticas (também chamadas de vesículas aceptoras). A eficiência de fusão foi analisada após mistura de vesículas unilamelares grandes (LUVs) do sistema fusogênico com o sistema aceptor formado por LUVs ou por vesículas unilamelares gigantes (GUVs). A carga superficial foi modulada a partir da variação na fração molar de um lipídio negativo (POPG), enquanto que a fase da membrana foi controlada a partir da adição de colesterol (fase líquido-ordenada, Lo) e de lipídios com diferentes temperaturas de transição de fase gel-fluida (Tm) (nas fases líquido-desordenada e sólido-ordenada, Ld e So). Mais especificamente, as vesículas aceptoras foram compostas pela mistura de POPC:POPG (fase Ld) e DPPC:DPPG (fase So) com e sem colesterol, assim como pelas misturas de POPC:DPPG e POPG:DPPC (coexistência das fases Ld/So). Além disso, uma nova composição de sistema fusogênico foi proposta com os lipídios DMTAP e DMPE, os quais possuem Tm ≈ 40 oC. Alterações no tamanho e carga superficial foram observadas utilizando o espalhamento de luz dinâmico (DLS) e potencial zeta. A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi utilizada para definir a entalpia de ligação entre os sistemas. Experimentos de calorimetria diferencial de varredura (DSC) e anisotropia de sonda fluorescente foram feitos para avaliar o comportamento térmico e grau de ordenamento das misturas, respectivamente. As microscopias ópticas convencional e confocal foram utilizadas para investigar a eficiência de fusão. As medidas de DLS, potencial zeta e ITC mostraram que a eficiência de fusão entre LUVs na fase Ld era dependente da concentração de POPG, e que esse processo era do tipo exotérmico. A adição de colesterol pareceu não interferir na eficiência de fusão; entretanto, a presença do colesterol adicionou uma componente endotérmica à interação do sistema fusogênico-aceptor. Ainda, os experimentos de anisotropia da sonda fluorescente mostraram que o grau de ordenamento Ld/Lo < So/Lo. A alta eficiência de fusão entre as LUVs fusogênicas e ambos sistemas de GUVs com a coexistência das fases Ld/So resultou na dissolução dos domínios. Por fim, a nova composição do sistema fusogênico apresentou uma alta eficiência de fusão com GUVs carregadas negativamente. Portanto, a fase da membrana, assim como sua carga superficial, alteram a eficiência de fusão de lipossomas fusogênicos e vesículas biomiméticas. A modulação dessas propriedades da membrana possibilita o controle da fusão de sistemas carreadores – e portanto a entrega intracelular do material encapsulado – com a célula. Liposomes have been used as a biological model membrane in many biophysical and biochemical studies. To optimize the intracellular delivery, a liposomal system composed of the equimolar mixture of the lipids DOTAP (cationic) and DOPE (zwitterionic) was previously developed. The preferable route of this liposomal system, which is through membrane fusion, leads to an efficient intracellular delivery. The main goal of this PhD project was to investigate the properties of the membrane (e.g., charge and phase/packing) and its influence in the membrane fusion efficiency of these fusogenic liposomes with biomimetic vesicles (also called here acceptor vesicles). Fusion efficiency was investigated after incubation of large unilamellar vesicles (LUVs) composed of the fusogenic with the acceptor system forming both LUVs and giant unilamellar vesicles (GUVs). The membrane charged was modulated by using different concentration of an anionic lipid (POPG), while the phase of the membrane was modulated by adding cholesterol (liquid-ordered phase, Lo) and lipids with different melting transition temperatures (Tm) (liquid-disordered, Ld, and solid-disorder, So, phases). More specifically, the acceptor vesicles were composed of the mixture of POPC:POPG (Ld phase) and DPPC:DPPG (So phase) with and without cholesterol, as well as the mixture of POPC:DPPG and POPG:DPPC (Ld/So phase coexistence). Besides, a new fusogenic composition was proposed using DMTAP and DMPE lipids, which exhibit Tm ≈ 40 oC. The changes in the size and surface were measured using dynamic light scattering (DLS) and zeta potential. The isothermal titration calorimetry (ITC) was used to define the binding enthalpy between the systems. To assess the thermal behavior and membrane order of the mixtures, experiments using differential scanning calorimetry (DSC) and anisotropy were performed. To assess membrane fusion efficiency, multiple optical microscopy techniques were used, such as phase contrast and confocal. The experiments using DLS, zeta potential and ITC showed that membrane fusion was dependent on the molar fraction of POPG, and that this process was exothermic. The addition of cholesterol did not seem to change membrane fusion efficiency; however, the presence of cholesterol added an endothermic component to the fusogenic-acceptor interaction. The fluorescence anisotropy measurements demonstrated a membrane order degree Ld/Lo < So/Lo. High membrane fusion efficiency between the fusogenic liposomes and both compositions of the acceptor vesicles with the Ld/So phase coexistence led to the dissolution of the phase domains. At last, it was observed high membrane fusion efficiency of the new fusogenic composition with negatively charged GUVs. Thus, membrane phase, as well as the surface charge, change the membrane fusion efficiency of fusogenic liposomes and acceptor vesicles. The modulation of these membrane properties can control the fusion of carrier systems, and, therefore, the intracellular delivery of the encapsulated material. 2017/09367-5 2018/08014-4

Polímeros são constituídos por unidades repetitivas (meros). Quando consistem em apenas um tipo de mero são denominados homopolímeros e, possuindo mais de um tipo, copolímeros. A natureza destas unidades e a maneira como se ligam nas cadeias poliméricas definem as propriedades dos polímeros, que podem incluir mudanças com pH e temperatura. O uso de diferentes monômeros permite desenvolver polímeros para aplicações como entrega de genes ou formação de vesículas poliméricas (polimerossomos), objetivos desta tese. Visando desenvolver materiais poliméricos para essas aplicações, vários polímeros e copolímeros foram sintetizados, usando a técnica RAFT: (sigla inglesa para Reversible AdditionFragmentation Chain Transfer), uma das variantes da técnica de Polimerização por Desativação Reversível de Radicais (PDRR). Proporções variáveis de metacrilato de 2-(dimetilamino) etila (DMAEMA), metacrilato de metila (MMA) e estireno (S) permitiram sintetizar vários materiais. Os polímeros obtidos neste trabalho foram caracterizados por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC, como sigla em inglês), Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (comumente chamada pela sigla inglesa: FTIR) e Ressonância Magnética Nuclear de prótons (RMN de 1H). Resultados obtidos por Espalhamento Dinâmico de Luz (em inglês, DLS: Dynamic Light Scattering) das amostras de PDMAEMA315-b-PS244 e PDMAEMA315-b-PS781 em tampão TRIS-HCl, (pHs 7,4 e 8,0) demonstraram que o número de partículas diminuiu com o aumento de pH. O número de partículas é maior quando formadas em tampão fosfato pH 8 devido a uma maior compactação do polímero. As amostras preparadas em tampões Tris-HCl e fosfato, (pH 8), mostraram menores valores de Potencial Zeta quando em tampão fosfato. O tamanho das partículas foi compatível com vesículas em todas as condições estudadas e esses polimerossomos tiveram aumento no seu diâmetro hidrodinâmico (Dh), a partir de 65 °C (PDMAEMA315-b-PS244) e 85 °C (PDMAEMA315-b-PS781), quando em tampão fosfato. Análise dos polimerossomos por Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) e Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) por Coloração Negativa mostraram, respectivamente, a existência de um compartimento interno capaz de incorporar uma sonda hidrofílica e revelaram vesículas com aproximadamente 80 nm de diâmetro. Paralelamente, foram realizados experimentos de eletroforese em gel de agarose com um DNA plasmideal (pUC19), na presença de polímeros de PDMAEMA315 (RAFT), PMMA3-co-PDMAEMA26 e PMMA31-co-PDMAEMA70 (RAFT). Observou-se migração alterada de pUC19 no gel de agarose e até mesmo retenção de DNA próximo ao slot de aplicação. O PMMA60 não afetou a migração do pUC19, mostrando a importância do PDMAEMA para a interação com DNA. Polímeros contendo DMAEMA também mediaram a entrega de pUC19 em células de E. coli não competentes. Apenas as células de E. coli incubadas com PMMA3-co-PDMAEMA26 ou PMMA31-co-PDMAEMA70 (RAFT), mas não com PDMAEMA315 ou PMMA60 (ambos obtidos via RAFT), foram eficientemente transformadas, sugerindo que uma pequena fração de PMMA nas cadeias depolímeros é necessária para transfecção. Esses resultados abrem caminho para o desenvolvimento de novos agentes de entrega de DNA, candidatos a uma variedade de aplicações. Polymers consist of repeating units or groups (monomers). Homopolymers consist of only one type of group and copolymers contain more than one type of monomer. The nature of the monomers and the binding type in the polymer chains define the properties of the polymers, which may include changes with pH and temperature. The use of different monomers allows the development of polymers for applications such as gene delivery or the formation of polymeric vesicles (polymersomes), the objectives of this thesis. In order to develop polymeric materials for these applications, several polymers and copolymers were synthesized using RAFT (Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer), one of the variants of the Radical Reversible Deactivation Polymerization (RRDP) technique. Variable proportions of 2- (dimethylamine) ethyl methacrylate (DMAEMA), methyl methacrylate (MMA) and styrene (S) allowed the synthesis of several materials. The polymers obtained here were characterized by Gel Permeation Chromatography (GPC), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H NMR). Results obtained by Dynamic Light Scattering (DLS) of the PDMAEMA315-b-PS244 and PDMAEMA315-b-PS781 in TRIS-HCl buffer (pHs 7.4 and 8.0) demonstrated that the number of particles decreased with increasing pH. The number of particles was higher when formed in phosphate buffer pH 8 due to increased compaction of the polymer. Samples prepared in Tris-HCl and phosphate buffers, (pH 8), showed lower Zeta Potential values. The size of the particles was compatible with vesicles under all conditions studied and these polymers increased the hydrodynamic diameter (Dh), from 65 °C (PDMAEMA315-b-PS244) and 85 °C (PDMAEMA315-b-PS781), when in phosphate buffer. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and Negative Staining Transmission Electron Microscopy showed the existence of an internal vesicle compartments capable of incorporating a hydrophilic probe and revealed vesicles with approximately 80 nm diameter. In parallel, agarose gel electrophoresis experiments with a plasmid DNA (pUC19) were performed in the presence of PDMAEMA315, PMMA3-co-PDMAEMA26 and PMMA31- co-PDMAEMA70 (RAFT) polymers. There was altered migration of pUC19 on the agarose gel and even retention of DNA near the application slot. PMMA60 did not affect the migration of pUC19, showing the importance of PDMAEMA for interaction with DNA. DMAEMA-containing polymers also mediated the delivery of pUC19 in non-competent E. coli cells. Only E. coli cells incubated with PMMA3-co-PDMAEMA26 or PMMA31-co-PDMAEMA70 (RAFT), but not with PDMAEMA315 (RAFT) or PMMA60 (RAFT), were efficiently transformed, suggesting that a small fraction of PMMA in the polymer chains is required for transfection. These results pave the way for the development of new DNA delivery agents, candidates for a variety of applications.

Em Triatoma infestans ainda não há pesquisas de isolamento de Peptídeos Antimicrobianas e como têm contato muitos microrganismos acreditamos que eles produzem esses componentes antimicrobianos. Neste estudo identificamos quatro peptídeos antimicrobianos principais. Os Tin-TK-I e Tin-TK-II que são similares com Taquicininas de insetos, não são hemolíticos e ativos contra três bactérias e três fungos, e são capazes de lisar membranas. Tin-TK-I é degradado por aminopeptidases e tem estrutura randômica. Tin-TK-II é degradado por carboxipeptidases e tem estrutura de hélice 310. A Triastina que é similar a uma proteína cuticular de T. infestans, é ativa contra duas bactérias e três fungos, não hemolítica, forma uma hélice 310, lisa membranas, e sofre ação de carboxi e aminopeptidases. E o Triatogênio que é similar ao fibrinopeptideo-A humano, e possui um análogo. É ativo contra três bactérias e seis fungos, e seu análogo contra três bactérias e três fungos. Não são hemolíticos, formam poros em membranas, formam alfa-hélices e são degradados por aminopeptidases. Regarding new researches with Antimicrobial Peptides in triatomines, none have been developed with T. infestans, and due to its survival in a highly infectious habitat, we believe that it products antimicrobial molecules. On this study, four main AMPs have been identified. Tin-TK-I and II that were similar to Tachykinin-like proteins from insects, they were not hemolytic, and were active against three bacteria and three fungi on the antimicrobial assay. Tin-TK-I presents a random structure and was degraded by aminopeptidases, as Tin-TK-II presents a helix 310 structure and was affected by carboxipeptidases. Both of them can disrupt negatively charged membranes. Triastin that was similar to a cuticular protein from T. infestans, was active against two bacteria and three fungi, had no hemolytic activity, presents a helix 310 structure and can disrupt negatively charged membranes. Triatogen was similar to the human fibrinopeptide A, and it has an analogue. Triatogen was active against three bacteria and six fungi, and its analogue was active against three bacteria and three fungi. They were not active against human erythrocytes, both were degraded by aminopeptidases. They can generate pores on membranes and both have alfa-helix structure.

A acne vulgar é uma das doenças cutâneas mais comuns, apresentando como um de seus fatores fisiopatológicos primários a colonização pelo microrganismo Propionibacterium acnes. Atualmente, têm-se buscado terapias alternativas para o combate ao P. acnes, destacando-se alguns ácidos graxos, como o ácido laúrico (LA). O LA é uma molécula pouco solúvel em água, sendo possível sua incorporação em lipossomas. Os lipossomas apresentam capacidade de encapsulação/ liberação de ativos e impedem a desidratação da pele, tornando-se ingredientes inovadores na área de cosméticos. Foram preparados lipossomas de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) contendo diferentes concentrações de LA, que variaram de 0 a 50% da concentração total em mol, em quatro pHs: 9,0, 7,4, 5,0 e 3,0. Nestes pHs o estado de protonação do LA muda variando de 0 a -1. Os lipossomas foram extrusados por filtros com poros de 100 nm de diâmetro visando à obtenção de vesículas unilamelares grandes (LUV). As LUV foram caracterizadas quanto a sua estabilidade em condições de prateleira, temperatura de transição de fase da bicamada, encapsulamento no interior aquoso, liberação do LA, difusão das vesículas na pele e seus aspectos morfológicos foram caracterizados por espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) e crio-microscopia eletrônica de transmissão. Estudos de estabilidade mostraram que independentemente da concentração de LA, as formulações são mais estáveis em pHs mais altos, quando LA está em sua maioria na forma de laurato. Os experimentos de DSC revelaram que em pHs 3,0 e 5,0 e concentrações maiores de LA, a interação deste ácido graxo com as bicamadas é favorecida, havendo um aumento da temperatura de transição de fase (Tm) e diminuição da cooperatividade. Análises de taxa de incorporação de sondas hidrofílicas confirmaram a presença de um compartimento aquoso interno para as vesículas de DPPC:LA. O LA conseguiu permear a pele no período avaliado e pouco LA foi liberado das vesículas em condições de temperatura ambiente. A morfologia das LUV se mostrou bem diferente da esperada e se observaram vesículas com mais de uma bicamada e outros formatos que não o esférico. Estes resultados podem auxiliar na otimização das condições para uma formulação que poderá ser usada no tratamento da acne, aumentando a eficácia do LA no sítio alvo. Acne vulgaris is one of the most common skin diseases, presenting as one of its causes the microorganism Propionibacterium acnes colonization. Currently, it has been sought alternatives therapies against P. acnes, especially some fatty acids, like the lauric acid (LA). LA is a molecule with low water solubility, allowing its incorporation in liposomes. Liposomes have encapsulation/release capacity of drugs and promote skin lipids regeneration, becoming an innovative ingredient in cosmetics area. Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) vesicles containing different LA concentrations were prepared at pHs: 9.0, 7.4, 5.0 and 3.0. At these pHs the LA protonation changes and its charge varies from 0 to -1. The vesicles were extruded through filters containing pores of 100 nm to obtain large unilamellar vesicles (LUV) that were characterized for stability in shelf conditions, bilayer phase transition temperature, aqueous internal compartment encapsulation, LA release and in vitro skin permeation. Its morphological features were characterized by small angle X-ray scattering (SAXS) and cryo-electron transmission microscopy. Stability assays showed that, regardless LA concentration, formulations were more long-term stable in higher pHs, when LA is mostly in the form of laurate. The differential scanning calorimetry, DSC, experiments showed that, at pHs 3.0 and 5.0 and higher LA concentrations, the interaction between the bilayer and LA is favored, increasing phase transition temperature (Tm) and reducing cooperativity. Incorporation of hydrophilic probes confirmed the presence of an internal aqueous compartment in DPPC:LA vesicles. The LA managed to permeate the skin on the period evaluated and, in ambient conditions, low LA concentration was released from the vesicles. LUV containing more than one bilayer and non-spherical structures were observed. The obtained results may help in the optimization of the conditions for a formulation that can be used in the treatment of acne and improving the effectiveness of LA delivery to the target site.

Tritrpticina (TRP3) é um peptídeo antimicrobiano com 13 resíduos de amino ácidos com três Ws sequenciais. Com o objetivo de contribuir para a compreensão de seu mecanismo de ação, realizaram-se estudos funcionais e conformacionais da TRP3 e de dois análogos onde um (WLW) ou dois (LWL) W foram substituídos por L. Os peptídeos foram igualmente ativos contra bactérias Gram positivas e negativas. Sua atividade hemolítica requereu concentrações maiores, diminuindo na ordem TRP3>WLW>LWL. Os peptídeos permeabilizaram membranas modelo de E. coli ou contendo fosfolipídios carregados negativamente. Espectros de CD sugeriram que os peptídeos adquirem diferentes conformações ao se ligarem a bicamadas e micelas. Estudos de fluorescência mostraram que a ligação a membranas decresce na ordem: TRP3>WLW>LWL e que os peptídeos se localizam próximos à interface membrana-água. Espectros de RPE de marcadores de spin lipídicos indicaram que a ligação dos peptídeos altera a organização dos lipídios, aumentando o empacotamento molecular Tritrpticin (TRP3) is a 13-residue antimicrobial peptide that contains three sequential Ws. With the aim of contributing to the understanding of its mechanism of action, functional and conformational studies were performed with TRP3 and two of its analogues where one (WLW) or two (LWL) of the W were replaced by L. The peptides were equally active against both Gram positive and Gram negative bacteria. Higher concentrations were required for hemolytic activity which varied in the order: TRP3>WLW>LWL. The peptides permeabilized membranes model membranes mimicking E. coli\'s lipid composition or containing different negatively charged phospholipids. CD spectra suggested the peptides acquired different conformations upon binding to bilayers or micelles. Fluorescence studies showed that membrane binding decreases in the order: TRP3>WLW>LWL and that the peptides are located close to the water-membrane interface. EPR spectra of lipid spin labels indicated that peptide binding alter lipid organization, increasing molecular packing

A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada causada por diferentes espécies do gênero Leishmania que atinge grande parte da população mais pobre do mundo e sua manifestação visceral, que é fatal se não tratada, tem se alastrado atingindo grandes cidades, aumentando o número de pessoas com risco de infecção. Dentre os medicamentos em uso, está o análogo lipídico sintético hexadecilfosfocolina (miltefosina), administrado oralmente, que age nas membranas celulares do parasita e pode induzir apoptose, mas com modo de ação não totalmente esclarecido. O primeiro local de interação desse fármaco é a membrana celular do parasita, sendo importante o conhecimento da sua forma de interação. Neste trabalho examinamos propriedades de diversos modelos de membrana com diferentes composições, levando em consideração o conhecimento existente sobre a composição da membrana plasmática da Leishmania. Assim, as membranas modelo foram vesículas unilamelares grandes e gigantes (LUVs e GUVs), de fosfolipídios puros, de misturas binárias com fosfolipídios e colesterol e ainda misturas ternárias com ceramida, um esterol presente nas membranas de Leishmania. A interação com a miltefosina foi estudada em diferentes intervalos de concentração do fármaco. Como técnicas principais utilizamos a espectroscopia de fluorescência, estática e resolvida no tempo, a espectroscopia de correlação de fluorescência, microscopia de fluorescência e confocal e imagens por tempo de vida de fluorescência. Observou-se que a interação entre o fármaco e as membranas lipídicas ocorre de diferentes formas, dependendo i) da razão molar entre o fármaco e os lipídios; ii) da concentração real do fármaco, se abaixo ou acima da concentração micelar crítica (CMC); iii) da composição do modelo de membrana e da fase lipídica da bicamada. Em concentrações abaixo da CMC, a miltefosina tem efeito de fluidificação das bicamadas, principalmente quando elas se encontram em na fase gel, mas esse efeito é pouco pronunciado na presença de colesterol, pois esse composto protege a bicamada do efeito do fármaco. Em vesículas de misturas ternárias de fosfolipídio, colesterol e ceramida em alta concentração, não há separação de fases, e a presença de 10 mol% de miltefosina promove a formação de domínios de ceramida; nas vesículas em que a ceramida está em concentração molar mais baixa, formando domínios, a separação de fases fica menos evidente com o acréscimo de miltefosina. Em razões de concentração miltefosina/lipídio elevadas, mas ainda abaixo da CMC, observa-se diminuição no tamanho das vesículas, por formação de agregados de fármaco/lipídio com porções da bicamada. Em concentrações acima da CMC, ocorrem efeitos drásticos com solubilização de partes cada vez maiores da bicamada da membrana, e esses efeitos ocorrem em tempos menores quanto maior a concentração de miltefosina. Portanto, de maneira geral, o colesterol protege a bicamada do efeito da miltefosina, mas o fármaco tem efeito pronunciado em modelos de membrana de misturas ternárias contendo ceramida. Os efeitos variam com a concentração da miltefosina, com aumento da fluidez da bicamada em baixas razões fármaco/lipídios, solubilização de pequenas porções da bicamada e diminuição do tamanho das vesículas em razões maiores, mas ainda abaixo da CMC, e acima da CMC, formação de agregados do fármaco com porções dos lipídios da bicamada e fragmentação da membrana. Leishmaniasis is a complex of diseases part of the neglected tropical diseases caused by several species of the genus Leishmania. It reaches a large part of the poorest people in the world and its visceral form, which is fatal if left untreated, has been spread around big cities, increasing the number of people at risk of infection. Among the used drugs for the treatment, there is the synthetic lipid analogue hexadecylphosphocholine (miltefosine), orally administrated, which acts in the cell membranes and can induce apoptosis like death, but its mechanism of action is not totally clear. The first interactions site of this drug is the cell membrane, and it is important to know its mechanism of interaction. In this work we explore properties of several membrane models with different compositions, taking into account the existent knowledge about the composition of the Leishmania plasma membrane. Therefore, the model membranes were giant and large unilamellar vesicles (GUVs and LUVs), formed from pure phospholipids, binary mixtures of phospholipids and cholesterol and ternary mixtures with ceramide, a sterol present in the Leishmania membranes. The interaction with miltefosine was studied in different intervals of drug concentration. The main techniques used were the steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy, fluorescence correlation spectroscopy, confocal and fluorescence microscopy and fluorescence lifetime imaging. The interaction depends on i) the molar ratio of drug and lipids; ii) the real concentration of the drug, if it is below or above the critical micelle concentration (CMC); iii) the composition of the model membrane and the lipid phase of the bilayer. In concentration below the CMC, miltefosine has an effect of bilayer fluidization, mainly when it is in a more ordered phase, but this effect is less pronounced in cholesterol presence, because this compound protects the bilayers from the drug effect. In vesicles from ternary mixtures of phospholipid, cholesterol and ceramide in high concentration, there is no phase separation, and the presence of 10 mol% of miltefosine promotes ceramide domains formation; in vesicles in which ceramide is in low concentration, forming domains, the phase separation is less evident with miltefosine addition. In high concentration ratio miltefosine/lipids, but below CMC, it is observed a decrease in vesicles size with drug/lipids aggregates formation from portion of the bilayer. In concentrations above the CMC, drastic effects occur, with solubilization of bigger portions of the membrane bilayer, and the effects occur in lower times for higher drug concentration. Therefore, generally, cholesterol protects bilayer from the effect of miltefosine, but the drug has a pronounced effect in model membranes of ternary mixtures containing ceramide. The effects vary with miltefosine concentration, increasing the bilayer fluidity in lower drug/lipid ratio, solubilization of small portions of the bilayer and decrease of vesicles size in higher ratios, but still below CMC, and above CMC, formation of aggregates of the drug with portions of bilayer lipids, and membrane fragmentation.

Orientador: Eneida de Paula Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Detergentes constituem uma das ferramentas mais importantes no estudo de membranas biológicas. A eficiência de um detergente em solubilizar biomembranas e suas proteínas depende de suas propriedades físico-químicas e a solubilização parcial pode resultar em membranas resistentes a detergentes (DRMs). A resistência a detergentes dessas frações membranares constituídas principalmente de colesterol, esfingolipídios e proteínas específicas foi analisada nesse trabalho, usando membranas de eritrócitos humanos. Embora não haja evidências experimentais suficientes pra afirmar que DRMs correspondam aos microdomínios naturais existentes em biomembranas, conhecidos como lipid rafts e que também são enriquecidos em colesterol e esfingolipídios, DRMs são bons modelos para o estudo daqueles. A obtenção de DRMs com uso do detergente octaetilenoglicol mono lauril éter (C12E8) a baixa temperatura (4oC) é descrita pela primeira vez. Os detergentes zwiteriônicos ASB-14, ASB-16 e CHAPS também foram testados, mas falharam no isolamento de DRMs com baixa densidade. DRMs obtidas com C12E8 e com Triton X-100 apresentaram um aumento da razão colesterol/proteína de pelo menos três vezes em relação à membrana original. A proteína flotilina-2, considerada um marcador de lipid rafts, foi detectada em DRMs isoladas com Triton X-100 e em DRMs com C12E8 isoladas a partir de células depletadas de colesterol. Proteínas do citoesqueleto também foram encontradas em DRMs, exceto quando as células foram previamente depletadas de colesterol. Resultados de ressonância paramagnética eletrônica com uso de marcadores de spin do tipo doxil-estearato revelaram maior grau de organização das cadeias acila dos lipídios de DRMs em relação à membrana original, independentemente do detergente utilizado. Nossos resultados também mostraram que DRMs de eritrócitos podem ser também obtidos na temperatura fisiológica (37°C) como mesmo conteúdo de colesterol presente em DRMs isoladas a 4°C. A necessidade do uso de carbonato de sódio no protocolo para obtenção de DRMs sugere fortemente a existência de uma associação eletrostática entre DRMs e o citoesqueleto eritrocitário. Abstract: Detergents constitute an important tool for the study of cell membranes. The solubilization efficiency of a specific detergent depends upon its physicochemical properties so that detergent-resistant membranes (DRMs) can be obtained as a result of the partial solubilization of biological membranes. In this study DRMs which are structures enriched in cholesterol, sphingolipids and specific proteins, were isolated and characterized from human erythrocyte membranes. Although there are no evidences to support that DRMs correspond to the natural existing microdomains of natural membranes, known as lipid rafts which are also cholesterol and sphingolipid-enriched structures, DRMs are good models for the study of rafts. DRMs from erythrocytes obtained with 8 polyoxyethylene lauryl ether (C12E8) at low temperature (4oC) are described here for the first time. The zwitterionic detergents ASB-14, ASB-16 and CHAPS failed to isolate these low buoyant density fractions. Triton X-100 and C12E8 DRMs presented a cholesterol/protein mass ratio 3 times higher than in the whole membrane. Flotillin-2, a marker of lipid rafts, was confined within the DRM fractions obtained with Triton X-100 and it was partially associated with C12E8 DRMs when erythrocyte cells were previously cholesterol-depleted. Association of membrane-skeleton proteins with DRMs was also observed, except when DRMs were prepared from cholesterol-depleted cells. Results of electron paramagnetic resonance through the use of doxyl stearate spin labels revealed that DRMs are highly ordered structures in respect to the original membrane and that their acyl chain packing is not different if prepared with either Triton X-100 or C12E8. We have also found that DRMs from erythrocytes can be isolated at physiological temperature (37°C), presenting the same cholesterol content as in DRMs prepared at 4°C. The fact that we were only able to prepare DRMs when sodium carbonate was used stronglysuggests the existence of an electrostatic association between DRMs and the membrane-skeleton. Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Apresentamos os resultados de estudos sobre a utilização de técnicas baseadas no fenômeno de fluorescência para a investigação de processos relacionados a membranas modelo. Nessa investigação, estão envolvidas medidas de propriedades espectrais de absorção e emissão de luz por cromóforos adequados, determinação xperimental de perfis de decaimento temporal da fluorescência e correlação temporal de emissão fluorescente, bem como a utilização apropriada de metodologias para análise e interpretação dos dados experimentais. Foram utilizados diversos compostos que apresentam absorção e emissão na região ultravioleta/visível, como as sondas lipofílicas 2-Amino-N-hexadecil-benzamida (Ahba), 6-lauryl-2-dimethylaminonaphthalene (Laurdan), N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol-4-yl) (NBD), em diferentes condições: meio aquoso homogêneo, suspensões de micelas de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Cetyl-trimethyl-ammonium-bromide (CTAB) e 3-(Dodecyl-Dimethyl-Ammonio)-propane-sulfonate (DPS) e vesículas de fosfolipídios, como o 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), o 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt) (DMPG) e o 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (POPC). Supressores alquilpiridínios de diferentes comprimentos da cadeia alquila e, portanto, diferentes afinidades por agregados anfifílicos, foram utilizados em experimentos de supressão da fluorescência da sonda Ahba. Usando o formalismo que descreve fenômenos de supressão dependente de colisões entre fluoróforo e supressor, observamos que as taxas de supressão são maiores em presença de agregados anfifílicos carregados negativamente: micelas de SDS e vesículas de DMPG; em micelas zwiteriônicas o processo é mais eficiente quando a hidrofobicidade do supressor é grande, o que ocorre quando a cadeia alquila é mais longa. Realizamos experimentos de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) onde o grupo fluorescente da sonda lipofílica Ahba atuou como doador. Como aceitadores utilizamos os compostos Acridina Laranja, -(2,4,dinitrofenil)-etilenodiamina (Eddnp) e o NBD ligado a fosfolipídios. Fizemos uso do programa CONTIN para análise de dados experimentais de perfis de decaimento da fluorescência em sistemas em que ocorre transferência de energia e obtivemos distribuições de distâncias para os pares Ahba/Eddnp e Ahba/NBD-fosfolipídios na presença de vesículas de fosfolipídios. Para este último par, verificou-se que a distribuição de distâncias depende da temperatura do sistema, ou seja, da fase da bicamada, da concentração de aceitador e da posição onde o NBD está ligado ao fosfolipídio. Analisamos a utilização da sonda Laurdan em presença de vesículas de DMPC e POPC, em experimentos de espectroscopia de correlação de fluorescência. Embora tenha apresentado sinal elevado de fluorescência, a sonda é fotodegradável. Os mesmos experimentos de correlação de fluorescência foram realizados com o Ahba que, apesar de ter se mostrado bastante fotoestável, revelou não ser uma sonda adequada para uso em tal técnica. O espectro de excitação a dois fótons foi obtido para esta sonda, com máximo de absorção em 695 nm. Em experimentos de microscopia de fluorescência, o Ahba mostrou ser um bom marcador fluorescente para membranas lipídicas, ao possibilitar a aquisição de imagens de fluorescência de vesículas gigantes marcadas. In this work we showed results from studies about the use of fluorescence spectroscopy techniques as a tool to investigate amphiphilic aggregates, used as a model of the cell membrane. We performed measurements on the spectral properties of light absorption and emission of adequate chromophors, registered the experimental timeresolved decay of fluorescence and time correlated fluorescence emission of the probes and used also adequate methodologies for the analysis and interpretation of experimental data. Several compounds presenting absorption and emission in the UV/visible spectral range were employed: the lipophilic probes 2-Amino-N-hexadecil-benzamida (Ahba), 6-lauryl-2-dimethylaminonaphthalene (Laurdan), N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) (NBD), in different environment:homogeneous aqueous medium, micelles of surfactants like Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Cetyl-trimethyl-ammonium-bromide (CTAB) and 3- (Dodecyl-Dimethyl-Ammonio)-propane-sulfonate (DPS) and phospholipid vesicles of 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3- [Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt) (DMPG) and 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (POPC). Alkyilpyridinium halides with different alkyl chain length were employed fluorescence quenchers of the Ahba probe. Using the Stern-Volmer model to describe the quenching phenomena dependent on fluorophor/quencher collision, we observed that higher quenching rates were obtained in the presence of negatively charged amphiphilic agreggates: SDS micelles and DMPG vesicles; in the presence of zwitterionic vesicles the quenching efficiency was more efficient when the quencher hydrophobicity was high (long alkyl chain). We performed Förster resonance energy transfer (FRET) experiments where the fluorescent moiety of the probe Ahba was the energy donor. As acceptors molecules we used Acridine Orange, Ethylene-diamine-dinitrophenyl (Eddnp) and NBD-labeled phospholipids. The computational package CONTIN was adapted to analyze the experimentally obtained fluorescence decay profiles of the donor in the presence of the acceptor, in order to determine the distance distribution between the Ahba/Eddnp and Ahba/NBD-phospholipids pairs in the presence of lipid vesicles. For the Ahba/NBD pair, the distances were dependent on the emperature of the system (or the phase bilayer behavior), the acceptor concentration and the NBD position in the phospholipid. We observed that the Laurdan probe can be used in studies about DMPC vesicles diffusion using fluorescence correlation spectroscopy techniques. Investigation about the use of the probe Ahba with this technique had shown that its maximum absorption for two photon excitation occurs near to 695 nm, but it is not an appropriated probe to FCS experiments due to its very low brightness. On the other hand, Ahba can be used as a membrane fluorescent label in membrane fluorescence microscopy, as we can see in the fluorescence imaging experiments with giant vesicles labeled with Ahba.