Search

Pacientes com doença cardiovascular e fatores de risco para doença cardiovascular (DCV) têm sido afetados com mais frequência e mais gravemente pelo novo coronavírus. Isso agravou o cenário anterior de subutilização dos programas de reabilitação cardiovascular (RCV) antes da pandemia, exigindo alternativas otimizadas de RCV, como por exemplo aquelas baseadas em aplicativos móveis (mHeath), não apenas por gerar benefícios bem estabelecidos, mas agora também para manter esses pacientes clinicamente estáveis, diminuindo a chance de eventos cardiovasculares e risco de contaminação naqueles não infectados pelo vírus, bem como tratando dos sobreviventes da COVID-19, tendo em vista as disfunções adicionais que tem sido descritas nos sistemas respiratório, cardiovascular e muscular. Serão realizados dois estudos: o estudo 1, qualitativo, de concordância e reprodutibilidade. Criação aplicativo baseado em tecnologia móvel (mHealth), para dar suporte a um programa otimizado (capaz de avaliar após COVID-19) de reabilitação cardiovascular (RCV) em ambiente domiciliar, desenvolvido pela Universidade do Luxemburgo (Centro 4), integrando instrumentos reconhecidos internacionalmente, como o EXPERT Tool, Hasselt University (Centro 3) e PACERProject, University of Miami (Centro 2). O aplicativo será testado e avaliado por profissionais de saúde nos dois centros colaboradores do estudo (Centro 2 e Centro 3) e na instituição executora - Universidade de Brasília (Centro 1).

Selenium (Se) plays a biological role for many organisms that may include reproduction, immune defense, and disease resistance. A selenoprotein has an amino acid residue containing the element selenium (Se), called selenocysteine (Sec) or 21st amino acid. Selenoproteins are a broad group of proteins identified as misidentified and poorly annotated in databases. These genes are complex due to the ambiguity of the identification codon "UGA", considered a stop codon and selenocysteine signal. SECIS elements are RNA structures essential for selenocysteine incorporation, being used as gene indicators of selenoproteins in bioinformatics. The objective of this research was to evaluate the pre-verbal candidate genes of selenoproteins from Aedes aegypti and Aedes albopictus, in silico, evaluating their modulation during infection by the arboviruses Dengue virus 1 (DENV1) and 2 (DENV2). Search for possible selenoprotein genes in Ae.aegypti and Ae.albopictus, in the NCBI database “National Center for Biotechnology Information” and analysis of the sequences in the Seblastian platform, predictor of SECIS, resulted in the identification in Ae. aegypti from 11 candidate genes for selenoproteins in the mRNA set and 2 in ncRNAs and in Ae. albopictus of 3 possible genes among the set of mRNAs and 3 in ncRNAs. In addition, genes for selenoproteins and genes associated with their biosynthesis machinery were evaluated for their expression at the transcriptional level in two species-derived mosquito strains. All the putative selenoprotein genes already described, as well as the genes associated with the synthesis machinery, were transcribed at different levels. During DENV1 invasion of Ae.aegypti Aag2 cells, there was a transcriptional increase in the Gawky gene, a candidate gene for selenoprotein, and a transcriptional increase in the Sergef gene, a gene for the selenoprotein synthesis machinery. DENV1 infection in Ae. albopictus did not consider the transcriptional modulation of genes. Aag2 cells, during DENV2 infection, significantly decreased transcription of the SelenoK gene commonly found in arthropods, Eif1ax, Kcnt2 and Tigd6, candidate genes, Pstk, Sars1 and Sbp2 genes, machinery genes, and increased transcription of SelenoH, also found in most arthropods. In C6/36 cells there was a transcriptional decrease of SelenoH induced by DENV2 infection and a transcriptional increase of Sars1 and decrease in the transcription of Secp43, another gene in the machinery. Wolbachia co-infection induced a transcriptional increase of SelenoK in Aag2 cells and decreased transcription of the putative selenoproteins Gawky, Girdin, Ikzf1, Kcnt2, Rip3 and Tigd6 and of the machinery genes Efsec, Sbp2 and Sepsecs. In C6/36 cells, Wolbachia co-infection increased SelenoH transcription and increased transcription of Xpr1, a gene predicted in Ae.albopictus, and Efsec. These data corroborate the importance of Se in the nutrition of mosquitoes and may have an implication in the modulation of the immune system during persistent infection by arboviruses of human interest. In fact, the results of the present work reinforce the need for further studies to refine the selenoprotein search tools. O selênio (Se) exerce um papel biológico para muitos organismos que podem incluir reprodução, defesa imunológica e resistência a doenças. Uma selenoproteína apresenta um resíduo de aminoácido contendo o elemento selênio (Se), chamado selenocisteína (Sec) o 21º aminoácido. As selenoproteínas são um grupo amplo de proteínas normalmente mal identificadas e mal anotadas em bancos de dados de sequências. A identificação desses genes é complexa devido à ambiguidade do códon "UGA", considerado um códon de terminação e sinalizador de selenocisteína. Elementos SECIS são estruturas de RNA essenciais para a incorporação de selenocisteína, sendo usados como marcadores gênicos de selenoproteínas em diversos estudos de bioinformática. O objetivo desta pesquisa foi prever genes candidatos de selenoproteínas de Aedes aegypti e Aedes.albopictus, in silico, avaliando sua modulação durante a infecção pelos arbovírus Dengue vírus 1 (DENV1) e 2 (DENV2). A busca por possíveis genes de selenoproteínas em Ae.aegypti e Ae.albopictus, no banco de dados NCBI “National Center for Biotechnology Information” e análise das sequências na plataforma Seblastian, preditor de SECIS, resultou na identificação em Ae. aegypti de 11 genes candidatos para selenoproteínas no conjunto de mRNAs e 2 em ncRNAs e em Ae. albopictus de 3 genes possíveis entre o conjunto de mRNAs e 3 em ncRNAs. Além disso, os genes para selenoproteínas e genes associados à sua maquinaria de biossíntese foram avaliados quanto a sua expressão em nível transcricional em duas linhagens de mosquito derivadas das duas espécies. Todos os genes de selenoproteínas putativos já descritos, bem como os genes associados a maquinaria de síntese foram transcritos em diferentes níveis. Durante a infecção por DENV1 em células Aag2 de Ae.aegypti, houve diminuição transcricional do gene Gawky, gene candidato para selenoproteína, e um aumento transcricional do gene Sergef, gene da maquinaria de síntese das selenoproteínas. A infecção por DENV1 em células C6/36 de Ae. albopictus não causou modulação transcricional nos genes avaliados. Células Aag2, durante a infecção por DENV2, diminuiu significativamente a transcrição do gene de SelenoK comumente encontrado em artrópodes, o Eif1ax, o Kcnt2 e o Tigd6, genes candidatos, os genes Pstk, Sars1 e Sbp2, genes da maquinaria, e aumentou a transcrição de SelenoH, também encontrado na maioria dos artrópodes. Em células C6/36 houve uma diminuição transcricional de SelenoH induzida pela infecção por DENV2 e um aumento transcricional de Sars1 e diminuição na transcrição de Secp43, outro gene da maquinaria. A co-infecção de Wolbachia induziu um aumento transcricional de SelenoK, em células Aag2, e diminuiu a transcrição das selenoproteínas putativas Gawky, Girdin, Ikzf1, Kcnt2, Rip3 e Tigd6 e dos genes Efsec, Sbp2 e Sepsecs da maquinaria. Nas células C6/36 a co-infecção por Wolbachia aumentou a transcrição de SelenoH e aumentou a transcrição de Xpr1, um gene predito em Ae.albopictus, e do Efsec. Esses dados corroboram a importância do Se na nutrição dos mosquitos, e pode ter implicação na modulação do sistema imune durante infecção persistente por arbovírus de interesse humano. De fato, os resultados do presente trabalho reforçam a necessidade de maiores estudos para refinar as ferramentas de busca de selenoproteínas.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2021. Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Os baculovírus são vírus que infectam insetos de diferentes ordens, incluindo insetos- praga de cultivares economicamente relevantes para o Brasil. Eles são amplamente utilizados como agentes de controle biológico ao redor do mundo e seu uso é caracterizado pela especificidade ao hospedeiro, não acarretando danos a outras espécies e ao meio ambiente. A eficiência da infecção pelos baculovírus nas células de inseto se dá, em grande parte, pela atuação de proteínas de fusão de envelope (EFP, do inglês, Envelope Fusion Protein) que possibilitam o acesso e espalhamento do vírus por diferentes tecidos do animal. Estas proteínas se encontram no fenótipo viral chamado vírus brotado (BV, do inglês, Budded Virus), responsável pela infecção sistêmica. São reportados dois tipos diferentes de EFPs em baculovírus: a proteína GP64 e a proteína F. Estudos prévios com diferentes EFPs demonstraram que a GP64 foi uma aquisição recente na história evolutiva dos baculovírus, enquanto que a proteína F seria mais ancestral a desempenhar a função de entrada do vírus nas células. Dada a sua relevância no ciclo infectivo, o objetivo desse estudo foi realizar uma análise funcional de proteínas de fusão de envelope de dois baculovírus distintos: a GP64 do Condylorrhiza vestigialis nucleopolyhedrovirus (CoveNPV) – um Alphabaculovirus – e a proteína F do Diatraea saccharalis granulovírus (DisaGV) – um Betabaculovirus. Para isso, baculovírus recombinantes foram construídos inserindo o gene destas proteínas no genoma de um baculovírus modelo (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) sem o gene da sua EFP endógena (aqui denominado de gp64-null AcMNPV). Ensaios em cultura de células de inseto foram realizados para analisar a capacidade dessas EFPs em recuperar a infectividade viral do gp64-null AcMNPV, bem como análises qualitativas e quantitativas. Os resultados obtidos indicam que a GP64 do CoveNPV é capaz de recuperar a infectividade eficientemente, o que pode ser relacionada à proximidade evolutiva observada para com a GP64 do AcMNPV. Por outro lado, a proteína F do DisaGV não foi capaz de recuperar a infectividade viral, possivelmente por esta proteína pertencer a um vírus com relação filogenética distante do AcMNPV. Além disso, o DisaGV é o único vírus conhecido do gênero Betabaculovirus que possui, além da proteína F, o gene da proteína GP64 funcional. Esses resultados demonstram a intercambialidade que a proteína GP64 possui entre os alphabaculovírus do grupo I e também reforça a distância evolutiva existente para com a proteína F que, por sua vez, possui maior variabilidade de sequência de aminoácidos podendo ser incompatível com a estrutura que um AcMNPV necessita para gerar uma progênie viral. Baculoviruses infect insects of many orders, including pests of economically important crops in Brazil. They are widely used as biological control agents worldwide and their use is characterized by host specificity, not infecting other beneficial insect species in the environment. The efficiency of baculovirus infection in insect cells is largely due to the action of envelope fusion proteins (EFP), which enables the access and spread of the virus through different animal tissues. These proteins are in the virus phenotype called budded virus (BV), responsible for systemic infections. Two kind of EFPs are functional in baculoviruses: the GP64 protein and the F protein. Previous studies with different EFPs showed that the GP64 was a recent acquisition in the baculovirus evolutionary history, while the F protein was the more ancestral protein to play the role of virus entry into cells. Given its relevance on the infective cycle, the aim of this study was to perform a functional analysis of envelope fusion proteins from two distinct baculoviruses: the GP64 from Condylorrhiza vestigialis nucleopolyhedrovirus (CoveNPV) – an Alphabaculovirus – and the F protein from Diatraea saccharalis granulovirus (DisaGV) – a Betabaculovirus. For that, recombinant baculoviruses were constructed inserting the genes into a model baculovirus genome (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) without its endogenous EFP (here called gp64-null AcMNPV). Assays in insect cell cultures were performed to analyze the EFPs ability in rescuing the viral infectivity of the gp64-null AcMNPV, as well as qualitative and quantitative analyzes. The results indicate that CoveNPV GP64 is able to rescue the infectivity efficiently, which may be related to the evolutionary proximity observed for the GP64 of AcMNPV. On the other hand, the F protein from DisaGV was not able to rescue the viral infectivity, possibly for this protein belongs to a virus with a distant phylogenetic relationship to AcMNPV. Furthermore, the DisaGV is unique in the Betabaculovirus genus because it has, besides the F protein, a functional GP64 protein gene. These results demonstrate the interchangeability that GP64 protein has between alphabaculoviruses from group I and also reinforces the existing evolutionary distance to the F protein which, in turn, has more amino acid sequence variability and may be incompatible with the structure that an AcMNPV needs to generate virus progeny.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2021. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Devido à estreita relação genética entre primatas não humanos e humanos, alguns organismos causadores de doenças, especialmente vírus, podem infectar ambos. Diante desse fato, é extremamente importante estudar vírus de primatas não humanos para prever novas doenças emergentes. Para investigar novos vírus emergentes em primatas não humanos, sequenciamos o ácido nucleico total extraídos de amostras de sangue total de 56 Callithrix penicillata e 31 Sapajus libidinosus de vida livre do Distrito Federal, Brasil, usando a plataforma HiSeq TM 2000 (Illumina). Os resultados revelaram a presença de dois novos vírus da família Anelloviridae. Os anellovírus são diversos em termos de tamanho e sequência do genoma. Esses vírus têm genoma composto de DNA circular, fita simples, variando de 2,0 a 3,9 quilobases (kb) em tamanho. Um dos genomas montados possui 3.398 nucleotídeos de comprimento, codificando 3 fases abertas de leitura (ORFs), com 46,4% de similaridade com o vírus Torque teno tamarin (número de acesso do GenBank AB041960). O outro genoma possui 2.771 nucleotídeos de comprimento, codificando 2 ORFs, com 25,6% de similaridade com o vírus Torque teno midi (número de acesso do GenBank AB449063). Desta forma, devido às suas relações filogenéticas, denominamos esses possíveis novos vírus como Torque teno vírus Bsb1 (TTVBsb1) e Torque teno vírus Bsb2 (TTVBsb2). TTVBsB1 foi encontrado em 18 C. penicillata e 5 Sapajus libidinosus, TTVBsb2 foi encontrado em apenas dois C. penicillata. De acordo com o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV), o critério de demarcação de uma nova espécie de annellovírus é estabelecido em 35% de divergência na sequência de nucleotídeos da ORF1. Uma vez que TTVBSb1 e TTVBsb2 têm mais de 46% de divergência de sequência em ORF1 com os vírus próximos filogeneticamente, eles devem ser classificados como duas novas espécies na família Anelloviridae. As sequencias relativas às ORF1s de cada vírus foram clonadas para expressão em células de inseto usando baculovirus como vetor de expressão. Entretanto, não foi possível detectar a expressão dessas proteínas. O uso de metodologias de sequenciamento de alto desempenho vem revolucionando o estudo da diversidade de micro-organismos e na vigilância epidemiológica de vírus zoonóticos. A descoberta de novas espécies de vírus é de grande importância para a saúde humana, tanto no cenário de surtos de doenças infecciosas emergentes quanto em síndromes de doenças de etiologia desconhecida. Due to the close genetic relationship between non-human and human primates, some disease-causing organisms, especially viruses, can infect both. Given this fact, it is extremely important to study non-human primate viruses to predict new emerging diseases. To investigate new viruses emerging in non-human primates, we sequenced genetic material extracted from whole blood samples of 56 Callithrix penicillata and 31 Sapajus libidinosus from Distrito Federal, Brazil. Total nucleic acid sequenced using the HiSeq TM 2000 platform (Illumina). The results revealed the presence of two new viruses from the Anelloviridae family. Anelloviruses are diverse in terms of genome size and sequence. These viruses have a single-stranded circular DNA genome ranging from 2.0 to 3.9 kb in size; for example, human anelloviruses include tenovirus torque (3.6–3.9 kb), teno minivirus torque (2.8–2.9 kb) and teno midi virus (3.2 kb). One of the assembled genomes has a genome of 3,398 nucleotides in length, coding for 3 ORFs, with 46.4% nucleotide identity with the Torque teno tamarin virus (GenBank accession number AB041960). The other genome is 2,771 nucleotides long, encoding 2 ORFs, with 25.6% nucleotide identity with the Torque teno midi virus (GenBank accession number AB449063). So, due to their phylogenetic relationships, we call these new viruses as Torque teno virus BsB1 (TTVBsB1) and Torque teno virus BsB2 (TTVBsB2). TTVBsB1 was found in 18 C. penicillata and 5 Sapajus libidinosus, TTVBsB2 was found in only two C. penicillata. According to the International Virus Taxonomy Committee (ICTV), the demarcation criterion for a new anellovirus species is set at 35% divergence in the ORF1 nucleotide sequence. Since TTVBSB1 and TTVBsB2 have more than 46% sequence divergence in ORF1 with their closely related viruses, they must be classified as two new species in the Anelloviridae family. Sequences relating to the ORF1s of each virus were cloned for protein expression in insect cells using baculovirus as an expression system for heterologous proteins. No protein was detected in the SDS-page and Western Blot analyzes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Continuous exposure to small doses of toxic substances elicit changes in the transcriptional profile and function of proteins before causing physical damage to organisms. Toxic effects can appear even after exposure stops. Knowing the mechanism of action and identifying biomarkers of early substance toxicity are interests of the scientific community. As humans are continually exposed to several xenobiotics, it is necessary to study the effects of concomitant exposure to two or more toxic agents and establish experimental models for translational studies. Xenobiotics like methylmercury (MeHg+) and vinylcyclohexene (VCH) have similar electrophilic properties, albeit their combined toxicity profile has not been assessed. Thus, this work aims to study the effects of per os acute, intermediate and chronic exposure to MeHg+ and the possible reversal of the effects of this xenobiotic after the interruption of exposure in behavioral and biochemical parameters of the Lobster cockroach N. cinerea, as well as the individual and combined effect of MeHg+ and VCH on the transcriptional profile of the fly D. melanogaster since these compounds have similarities in their toxicity mechanisms (affinity for proteins containing –SH and –SeH). Cockroaches were exposed to diets containing 0 (control), 2.5, 25, and 100 μg of MeHg+/g of diet for 10, 30, and 90 days. Additional groups of cockroaches were fed the same doses of MeHg+ for 30 days and then underwent a detoxification period for 60 days. Nymphs exposed to 100 μg MeHg+/g succumbed to a high mortality rate, along with biochemical changes (increased production of reactive oxygen species and activity of glutathione S-transferase, as well as decreased acetylcholinesterase activity) and behavioral changes. We observed delayed mortality and behavioral changes in nymphs exposed to 100 μg MeHg+/g for 30 days with a subsequent 60 day detoxification period. To evaluate the transcriptional profile of D. melanogaster, RNA-sequencing of exposed flies was performed individually and concurrently at 1 mM VCH and 200 μM MeHg+ for three days. The VCH deregulated 38 genes (most of which were overexpressed), while MeHg+ altered 26 genes (14 down-regulated genes). The co-exposure of the VCH + MeHg+ altered 72 genes with a greater number of down-regulated genes. These results suggest that, although the compounds might have some similar protein targets, the transcriptional profile after individual exposures and co-exposure was different. The set of proteins that contains –SH and –SeH was explored and we identified thioredoxin, glutaredoxin, glutathione S-transferase, and glucose dehydrogenase as targets for VCH and/or MeHg+. Together, these data suggest that the use of insects in the study of compound toxicity is relevant, with D. melanogaster being widely used in research and N. cinerea being validated as a potential experimental organism for translational studies. We also indicate possible targets for MeHg+ and VCH that may be potential biomarkers of early toxicity to these xenobiotics. A exposição contínua a pequenas doses de substâncias tóxicas causam alterações no perfil transcricional e na função de proteínas antes de causarem prejuizos físicos nos organismos. Os efeitos tóxicos podem surgir até mesmo após a interrupção da exposição. Conhecer o mecanimo de ação e identificar biomarcadores de toxicidade precoce para substâncias são interesses da comunidade científica. Como o ser humano está constantemente exposto a vários xenobióticos, torna-se necessário estudar os efeitos da exposição a dois ou mais agentes tóxicos concomitantemente. Para isso, é necessário estabelecer modelos experimentais para estudos translacionais. Dentre os xenobióticos destacam-se o metilmercúrio (MeHg+) e o vinilciclohexeno (VCH), os quais ainda não possuem mecanismo de toxicidade completamente elucidados e apresentam propriedades eletrônicas semelhantes. Desta forma, este trabalho visa estudar os efeitos da exposição per os aguda, intermediária e crônica ao MeHg+ e a possível reversão dos efeitos deste xenobiótico após a interrupção da exposição em parâmetros comportamentais e bioquímicos da barata N. cinerea, assim como, o efeito isolado e da interação do MeHg+ e do VCH sobre o transcriptoma da mosca D. melanogaster, uma vez que estes compostos apresentam semelhanças nos seus mecanismos de toxicidade (afinidade por proteínas que contém –SH e –SeH). As baratas foram expostas a dietas contendo 0 (controle), 2,5, 25 e 100 μg de MeHg+/g de dieta por 10, 30 e 90 dias. Grupos adicionais de baratas foram alimentados com as mesmas doses de MeHg+ por 30 dias e depois foram submetidos a um período de desintoxicação por 60 dias. As ninfas expostas a 100 μg de MeHg+/g sucumbiram a uma alta taxa de mortalidade, juntamente com alterações bioquímicas (aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e atividade da glutationa S-transferase, bem como diminuição da atividade da acetilcolinesterase) e alterações comportamentais. Observamos atraso na taxa de mortalidade e alterações comportamentais nas ninfas expostas a 100 μg de MeHg+/g por 30 dias e posteriormente submetidas a 60 dias de desintoxicação. Para avaliar o perfil transcricional da D. melanogaster foi realizado o sequenciamento de RNA de moscas expostas individual e concomitantemente a 1 mM de VCH e 200 μM de MeHg+ por três dias. O VCH desregulou 38 genes (dos quais a maioria estava super-expresso), enquanto o MeHg+ alterou 26 genes (14 genes sub-expressos). Já a coexposição do VCH + MeHg+ alterou 72 genes com maior número de genes sub-expressos. Estes resultados sugerem que, embora os compostos pudessem ter alguns alvos proteicos semelhantes, o perfil transcricional após exposições individuais e coexposição foi diferente. O conjunto de proteínas que contém –SH e –SeH foi prospectado e identicamos a tiorredoxina, glutarredoxina, glutationa S-transferase e glicose desidrogenase como alvos do VCH e/ou MeHg+. Em conjunto estes dados sugerem que o uso de insetos no estudo da toxicidade de compostos é relevante, sendo a D. melanogaster amplamente utilizada na pesquisa e a N. cinerea sendo validada como organismo experimental potencial para estudos translacionais. Indicamos também potenciais alvos do MeHg+ e VCH que podem ser potenciais biomarcadores de toxicidade precoce a estes xenobióticos.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2020. CAPES Baculovírus são um grupo de vírus extensamente estudados utilizados como controle biológico de pragas agrícolas, e como ferramenta biotecnológica para expressão de proteínas heterólogas. O vírus infecta naturalmente e exclusivamente insetos, sendo a sua manipulação laboratorial extremamente segura. Sua utilização como vetor para expressão em células de inseto apresenta diversas vantagens, como a capacidade do genoma viral de comportar a inserção de grandes segmentos de DNA de interesse, assim como a ocorrência de modificações pós-traducionais mais complexas ocorridas nas células eucarióticas. Essa tecnologia possuí ampla utilização na indústria para produção proteínas antigênicas de diversos patógenos, com aplicações vacinais e de diagnóstico. Uma estratégia atualmente muito promissora para desenvolvimento de vacinas é a produção e utilização de VLPs (“Virus like particles”). VLPs são partículas que utilizam da capacidade de automontagem de proteínas estruturais de vírus para formação de estruturas que se assemelham a estrutura de partículas virais, porém não possuem material genético e, consequentemente, não são capazes de ocasionar infecção. O sistema de expressão usando baculovírus em células de inseto já foi utilizado para produção de VLPs de diversos vírus, o que resultou no desenvolvimento de vacinas comerciais contra o papiloma vírus humano. Neste trabalho, foram construídos baculovírus recombinantes como ferramentas para expressão de proteínas, e produção de VLPs de dois vírus transmitidos por artrópodes (arbovírus): vírus da febre amarela (“Yellow fever vírus” – YFV), membro do gênero flavivirus, e do vírus Mayaro (MAYV), membro do gênero alphavirus. No capítulo 1 é descrita a construção de baculovírus utilizando de estratégias de controle temporal da expressão gênica, para coexpressão de proteínas não-estruturais (proteínas NS2A, NS2B e NS3), e proteínas estruturais (C, prM e E) do YFV. Isso foi feito com o objetivo de induzir a maturação das proteínas estruturais virais, e formação de estruturas complexas. A infecção dos baculovírus recombinante em células Tn5B levou a indução de fusão de membranas celulares bastante evidente, efeito citopático claro conhecido da atividade da proteína de envelope viral E de flavivirus. Essa indução de fusão de membranas foi exacerbada pela coexpressão de ambas as proteínas não-estruturais e estruturais, se comparada a expressão individual das proteínas estruturais, indicando importante papel de complementação para produção de proteínas maduras com alta atividade fusogênica. Análises de microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelaram a formação de partículas que se assemelham a vírions do YFV em estruturas membranosas citoplasmáticas, e da presença de partículas no meio de cultura de células infectadas. O capítulo 2 descreve a construção de baculovírus recombinantes contendo genes estruturais do MAYV (C, E3, E2, 6k e E1). Foi confirmada a expressão das proteínas em células de inseto por Western blot, mostrando o processamento da poliproteína e liberação da proteína de envelope E1 clivada, assim como da proteína de capsídeo C. A localização celular destas proteínas virais foi analisada por imunomarcação e microscopia de fluorescência, indicando a concentração da proteína E1 na membrana celular, e da proteína C no núcleo. Análise do meio de cultura de cultura de células infectadas por contrastação negativa em MET, após ultracentrifugação, indicou a presença de partículas com as dimensões esperadas de vírions de alphavirus. Este trabalho reforça a flexibilidade do sistema de expressão de baculovírus em células de inseto para produção de antígenos de arbovírus emergentes que podem ter grande impacto na saúde pública. Baculoviruses are a group of viruses extensively studied and utilized as biological control agents of agricultural pests, as well as biotechnological tools for the expression of heterologous proteins. Baculoviruses naturally and exclusively infect only insects, making their laboratory manipulation extremely safe. Its use as a vector for the expression of proteins in insect cells provides several advantages, such as the capacity of the large viral genome to tolerate the insertion of large DNA segments of interest, and the occurrence of more complex post-translational modifications that occur in eukaryotic cells. This technology has ample use in industry for the production of antigenic proteins of several pathogens, with diagnostic and vaccine applications. One strategy that is currently very promising for the development of vaccines is the production e utilization of VLPs (“Virus like particles”). VLPs are particles that utilize the capacity of self-assembly of viral structural proteins, to form structures that closely resemble that of viral particles, but do not possess any viral genetic material, and are therefore unable to cause infection. The baculovírus in insect cells expression system has been used for the production of VLPs of several viruses, with commercial vaccines against the human papilloma virus already available. In this work, recombinant baculoviruses were constructed as tools for the expression of proteins and formation of VLPs of two arthropod borne viruses (arboviruses): the yellow fever virus (YFV), member of the genus flavivirus, and of Mayaro virus (MAYV), member of the genus alphavirus. In chapter 1 it is described the construction of recombinant baculoviruses utilizing strategies for temporal control of the gene expression, for the co-expression of non-structural proteins (NS2A, NS2B and NS3), and structural proteins (C, prM and E) of YFV. This was done with the goal of inducing the maturation of viral structural proteins, and the formation of complex structures. Recombinant baculoviral infection of Tn5B cells lead to the induction of very evident membrane fusion, a clear known cytopathic effect of the activity of the flavivirus envelope protein E. This induction of membrane fusion was severely exacerbated by the co-expression of both the non-structural and structural proteins, when compared to the individual expression of structural proteins, indicating the complementation role for the production of mature proteins with high fusogenic activity. Transmission electron microscopy (TEM) analysis revealed the formation of particles that resemble YFV virions in cytoplasmic membranous structures, and the presence of particles in the infected cells culture medium. Chapter 2 describes the construction of recombinant baculoviruses containing the structural genes of MAYV (C, E3, E2, 6k and E1). Protein expression in insect cells was confirmed by Western blotting, showing the processing of the polyprotein and production of cleaved E1 envelope protein, as well as the capsid protein C. Cellular localization of these proteins were analyzed by immunostaining and fluorescence microscopy, indicating the concentration of E1 protein in the cellular membrane and, the C protein in the nucleus. Infected cell culture medium analyzed by negative staining, after ultracentrifugation, indicated the presence of particles with the dimensions expected for alphavirus virions. This work reinforces the flexibility of the baculovírus in insect cells expression system for the production of antigens of emerging arbovirus that pose a severe public health risk.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2019. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Dengue virus (DENV) e Zika virus (ZIKV) são arbovírus pertencentes à família Flaviviridae, gênero Flavivirus, que provocam milhões de infecções em todo o mundo. Devido à emergência do ZIKV em áreas endêmicas para o DENV, o diagnóstico clínico não consegue distinguir as viroses devido à similaridade dos sintomas. Além disso, os métodos sorológicos disponíveis no mercado têm baixa especificidade devido à alta similaridade entre as proteínas do DENV e do ZIKV que provocam reatividade cruzada entre os anticorpos anti-flavivírus. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi expressar antígenos de multiepítopo de DENV e ZIKV utilizando sistemas de planta e baculovírus recombinante para desenvolver kit diagnóstico sorológico específico para cada vírus. Os genes de multiepítopos foram desenhados através de alinhamento múltiplo e mapeamento de epítopos. Então, os genes foram clonados em um vetor viral vegetal, o Pepper mild mottle virus (PMMoV) e no vetor baseado em baculovírus para infecção em folhas de Nicotiana benthamiana e células TN5-B de Trichoplusia ni, respectivamente. Após as inoculações, plantas de N. benthamiana foram mantidas por 10 dias em condições favoráveis de crescimento, e as células TN5-B foram cultivadas por 72 horas a 28°C. Em seguida, os extratos de folha e de células TN5-B foram submetidos à análise eletroforética de proteínas e Western blotting. Os antígenos foram confirmados utilizando anticorpos anti-his e, então, foram purificados em gradiente de sacarose por ultracentrifugação para utilização nos ensaios de ELISA. Amostras de soro IgG positivas para DENV e ZIKV foram utilizadas em ELISA indireto. Os resultados mostram que os antígenos produzidos não apresentaram reatividade cruzada entre os soros dos pacientes e, portanto, são ótimos candidatos para o desenvolvimento de testes sorológicos mais específicos. Dengue (DENV) and Zika (ZIKV) viruses are arthropod-borned virus that belongs to the family Flaviviridae, Flavivirus genus, that causes millions of infections worldwide. Due to the emergence of ZIKV in endemics areas for DENV, clinical diagnostic cannot distinguish both viruses due to similar symptoms. Furthermore, available serological methods have low specificity due to the high similarity between DENV and ZIKV proteins. In addition, anti-flavivirus antibodies may cross-react with proteins of such viruses. Therefore, the purpose of this work is to express DENV and ZIKV multi-epitope antigens using plant system via Agrobacterium tumefaciens and recombinant baculovirus. Multi-epitope antigens genes were designed using multiple alignment and epitope mapping. Then, genes were cloned in vegetable viral vector Pepper mild mottle virus (PMMoV) and in pFastBac-Amino vector (pFB-A) to further infection in Nicotiana benthamiana leafs and Trichoplusia ni TN5B cells, respectively. After infection, N. benthamiana plants were maintained for 10 days in favorable conditions to their growth while TN5B cells were cultivated at 28ºC for 3 days. Next, western blotting was performed using leaf and TNB5 cells extracts to detect antigens with anti-histidine monoclonal antibody. Antigens were purified using sucrose gradient by ultracentrifugation for use in ELISA. Results shows the antigens produced did not present cross-reactivity between patients’ sera and, therefore, are good candidates for specific serological test development.

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Baculoviruses are insect viruses largely used as vectors for gene expression and biopesticides. These viruses can efficiently infect larvae of several agricultural pests worldwide, causing a lethal disease. In this work, a novel baculovirus isolated from the larval stage of Urbanus proteus (L.), the bean leafhopper caterpillar was found in the 1980s and the complete genome was characterized. This was an important pest of several legumes in Brazil and belongs to the butterfly family Hesperiidae, from where no baculovirus genome sequence has been described. This new virus was shown to have the smallest genome among all alphabaculoviruses sequenced to date, with 105,555 bp and 119 putative ORFs. Ten unique genes, seven bro genes and the 38 baculovirus core genes were found. UrprNPV was found to be related to the Adoxophyes-infecting baculoviruses AdorNPV and AdhoNPV, with high genetic distance and long branch length. Interestingly, few individual core gene-based phylogenies were found to support the relationship of UrprNPV to both AdorNPV and AdhoNPV. Importantly to note that the increase in the number of completely sequenced baculoviruses points to an interesting way of understanding baculoviruses and their evolution, potentially helping the use of baculovirus, both as biopesticide and expression vectors. Os baculovírus são vírus de insetos amplamente utilizados como vetores de expressão gênica e biopesticidas. Esses vírus podem infectar eficientemente larvas de várias pragas agrícolas em todo o mundo, causando uma doença letal. Neste trabalho, foi encontrado um novo baculovírus isolado do estágio larval de Urbanus proteus (L.), a lagarta desfolhadora do feijão nos anos de 1980 e foi caracterizado o seu genoma completo. Esta foi uma importante praga de várias leguminosas no Brasil e pertence à família das borboletas Hesperiidae, de onde não foi descrita nenhuma sequência genômica de baculovírus. Este novo vírus mostrou ter o menor genoma entre todos os alphabaculovírus sequenciados até o momento, com 105.555 pb e 119 ORFs. Foram encontrados dez genes únicos, sete genes bro e os 38 genes compartilhados entre todos os baculovírus. Verificou-se que UrprNPV estava relacionado com os baculovírus que infectam o gênero Adoxophyes, AdorNPV e AdhoNPV, com alta distância genética e comprimento longo do ramo. Curiosamente, poucas filogenias baseadas nos genes compartilhados individuais apoiaram a relação de UrprNPV com ambos, AdorNPV e AdhoNPV. É importante ressaltar que o aumento no número de baculovírus completamente sequenciados aponta para uma forma interessante de entender os baculovírus e a sua evolução, podendo ajudar potencialmente o uso de baculovírus tanto como biopesticida e vetores de expressão.

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. Baculovírus são vírus de DNA de dupla fita circular que infectam insetos, inicialmente utilizados apenas como controle biológico por serem capazes de eliminar insetos-praga associados à agricultura. Nas décadas de 70 e 80, seu potencial como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas começou a ser explorado. Hoje, os baculovírus têm sido utilizados amplamente para expressar antígenos de uso vacinal ou diagnóstico e até mesmo utilizados como potenciais vetores de terapia gênica e vacinas de DNA. Sua biossegurança é garantida pelo fato de não serem capazes de se replicar em células de mamífero. Entretanto, são capazes de penetrar nessas células, além de apresentarem propriedades imunoestimulatórias. Deste modo, inúmeras proteínas de importância médica e econômica foram expressas em níveis elevados aplicando desse sistema. Atualmente, não existem indústrias ou empresas nacionais disponíveis para a produção escalonável do antígeno de superfície HBsAg. Perante disso, os insumos são importados tanto para fins vacinais como para o diagnóstico. A vacina anti-rábica altualmente é constituída por suspensões de vírus purificados e inativados com β- propiolactona, representando um risco de manipulação. Portanto, a produção de proteínas virais recombinantes permitiu o desenvolvimento e métodos de diagnóstico e vacinas mais seguras. Neste trabalho foram construídos baculovírus recombinantes contendo os genes do antígeno HBsAg de HBV e de um peptídeo imunogênico derivado da glicoproteína do vírus da Raiva (Pept/G), fusionados à proteína poliederina (POLH) do baculovírus Autrographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). As proteínas recombinantes foram expressas em inseto e culturas de células na forma de agregrados protéicos cristalinos. A proteína recombinante contendo o antígeno HBSAg foi reconhecida por anticorpos anti-HBsAg em testes de imunoensaio (EIA) comerciais. A protéina recombinante contendo o Pept/G foi capaz de estimular o sistema immune de camundongos com sucesso, verificado por meio da proliferação celular in vitro. Desta forma, é possível concluir que proteínas recombinantes derivadas de vírus humanos fusionadas à protéina POLH de baculovírus são uma alternativa para a produção destes antígenos. Baculovirus are circular double-stranded DNA viruses that infect insects and initially used only as biological control agents for being able to eliminate insect pests associated with agriculture. In the 1970s and 1980s, its potential as a tool for the expression of heterologous proteins began to be explored. Today, baculoviruses have been used extensively to express antigens for vaccine production, diagnostics and even as potential vectors for gene therapy and DNA vaccines. Their biosafety isguaranteed by the fact that baculoviruses are not able to replicate in mammalian cells. However, they can enter these cells and present immunostimulatory abilities. In this way, numerous proteins of medical and economic importance have been expressed at high levels applying this system. Currently, there are no Brazilian-based companies available to produce HBsAg surface antigen in a large scale, and the supplies to produce both vaccines and diagnostic kits are imported from other countries. The rabies vaccine currently consists of purified and inactivated virus suspensions with β-propiolactone, representing a health risk from its manipulation. Therefore, the use of recombinant proteins from viruses allowed the development of safer diagnostic methods and vaccines. In addition, this strategy may reduce the cost of vaccine manufacturing and eventually, contribute towards disease control. In this work, we constructed two recombinant baculoviruses; one containing of sHBsAg antigen gene of HBV and second recombinant containing an immunogenic peptide derived from the rabies virus glycoprotein (Pept/G). Both were fused to the polyhedrin protein (POLH) of the baculovirus Autrographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Recombinant proteins were expressed in insect cells and in insects in the form of crystalline protein aggregates. The recombinant protein containing the HBSAg antigen was used in commercial immunoassay (EIA) tests and was recognized by the anti-HBsAg antibodies. A recombinant protein containing Pept/G could successfully stimulate the immune system of mice which was verified by cell proliferation in vitro. Thus, it is possible to conclude that recombinant proteins derived from human viruses fused to the baculovírus POLH protein are an alternative to produce diagnostic tests and possible subunit vaccines.

Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram positiva, produtora de cristais protéicos ou δ-endotoxinas (toxinas Cry e Cyt) durante a fase de esporulação. As toxinas. Cry apresentam atividade inseticida específica, e as toxinas Cyt apresentam atividade citolítica inespecífica. Algumas proteínas produzidas por B. thuringiensis durante a fase de esporulação que não apresentam caráter inseticida, mas apresentam-se tóxica para células tumorais foram descritas. Essas proteínas receberam o nome de Parasporinas (PS), devido à capacidade de produzir cristais paraesporais e até o momento são classificadas em seis tipos (PS1-PS6). Baculovírus são vírus de insetos usados no controle biológico de pragas da agricultura, porém também têm sido muito utilizados como vetores de expressão de proteínas heterólogas em células de inseto. No presente trabalho, o gene ps2 foi montado, por meio de PCR, através de fragmentos sintetizados a partir de uma sequência lotada no banco de dados, e o produto de PCR foi clonado em um vetor de transferência para construção de um baculovírus recombinante. Após obtenção do vírus recombinante, observou-se que células SF9 quando infectadas com vAcPS2, morriam em um tempo curto de infecção, quando comparado com células infectadas com o vírus selvagem. Após purificação, solubilização e ativação da toxina PS2 recombinante, ensaios de viabilidade celular foram feitos com linhagens de células tumorais, câncer mamário (MCF-7) e câncer mamário metastático (MDA-MB-231), células não tumorais humanas (fibroblastos) e células de inseto (Sf9), confirmando a atividade tóxica de PS2 apenas para as células tumorais. Bacillus thunringiensis is a Gram positive bacterium that produces crystal forming proteins called δ-endotoxins (Cry and Cyt toxins), during sporulation phase. Cry toxins show specific insecticidal activity, and Cyt toxins shows non-specific cytolitic activity. Some proteins of B. thuringiensis produced during sporulation have not shown insecticidal activity, but a specific toxic activity to some cancer cells. These proteins were called Parasporins (PS) due to their ability to form paraporal crystals and they are divided in six groups (PS1-PS6). Baculoviruses are insect viruses that have been widely used as biological control of agricultural pests, but also as expression vectors of heterologous proteins in insect cells. In this work, the gene ps2, constructed by PCR, trough fragments synthetized using a gene sequence from a database and cloned in a transfer vector for recombinant virus construction After recombinant virus construction we observed that SF9 cells died faster than cells infected with the wild-type virus. After purification, solubilization and activation of the heterologous protein, cell viability assays was performed with cancer cell lines, breast cancer (MCF-7), metastatic brest cancer (MDA-MB-231), non-tumor human cells (fibroblasts) and insect cells (Sf9) confirming PS2 toxic activity only to cancer cells.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. Os baculovírus são vírus de insetos amplamente utilizados no controle biológico de pragas agrícolas e também como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas. Os baixos custos, a segurança na manipulação e as diferentes formas de expressão de proteínas tornam os baculovírus e células de inseto uma escolha eficaz para a correta expressão de antígenos vacinais e produção de VLPs (“Virus like particles”). No capítulo 1 deste trabalho, foi avaliado o potencial imunogênico de BVs (“Budded virus”) recombinantes contendo o EDIII (Domínio III da proteína de envelope do vírus da Febre amarela – FA) fusionado à proteína GP64 dos baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV); e também de uma massa protéica gerada pela fusão de EDIII com a proteína poliedrina de AcMNPV. O EDIII interage com os receptores celulares e contém os epítopos reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes, sendo assim alvo para a produção de uma vacina de subunidade. Foi mostrado neste trabalho, a confirmação da correta expressão das proteínas recombinantes (GP64 + EDIII e Poliedrina + EDIII) por Western blot, microscopia de luz e confocal. No caso do EDIII fusionado à GP64 de AcMNPV e AgMNPV, as partículas virais recombinantes foram purificadas e inoculadas em camundongos. O teste de proliferação de linfócitos indicou uma maior proliferação em camundongos inoculados com o vírus recombinante contendo o EDIII fusionado à proteína GP64 do baculovírus AgMNPV quando comparado com o controle LPS. Testes complementares serão feitos, para avaliar o perfil da resposta imunológica e confirmar a obtenção de um antígeno vacinal contra FA. No capítulo 2, o sistema baculovírus de expressão foi utilizado para expressar o precursor da proteína GAG (Pr55) de HIV-1. A expressão de Pr55 HIV-1 é suficiente para a montagem de VLPs na membrana plasmática da célula do hospedeiro. Porém, a proteína GP64 de baculovírus é altamente imunogênica e também é expressa na superfície de células infectadas e normalmente está presente na superfície da VLP. Neste trabalho, mostramos que não é possível separar BVs e VLPs produzidos em um mesmo ciclo de infecção por baculovírus mesmo usando diferentes metodologias de separação. Então, utilizando um sistema que consegue produzir baculovírus recombinantes livres de GP64, foi construído o vírus recombinante vGAGHIV-1 GP64 null e utilizado na infecção de células Sf9. Por Western blot foi observado a perda do sinal da proteína GP64 de baculovírus no extrato de células infectadas com esse vírus recombinante. Essas mesmas células foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET), mostrando que mesmo quando GP64 não está presente (o que resulta na ausência de produção de BVs), o brotamento de VLPs continua a acontecer. Essa técnica mostrou-se eficiente para a produção de VLPs livres de partículas ou proteínas baculovirais. Este trabalho confirma a eficiência do uso do sistema de expressão baseado em baculovírus para a expressão de proteínas e VLPs de interesse famacológico. Baculoviruses are insect viruses widely used in the biological control of agricultural pests and as a tool for heterologous protein expression. Their low production costs, security in manipulation and the many ways of protein expression, make baculoviruses and insect cells an effective choice for the efficient expression of vaccine antigens and VLPs (Virus like particles) production. In chapter 1 of this work, it was evaluated the immunogenic potential of recombinant BVs (Budded virus) containing EDIII (Yellow fever virus -YF- envelope protein domain III) fused to the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) GP64 protein; and also of a protein mass generated by the fusion of the EDIII and AcMNPV polyhedrin protein. The EDIII interacts with cell receptors and contains epitopes recognized by neutralizing antibodies, being the target for the production of a subunit vaccine. We showed in this work the confirmation of the correct recombinant protein expression (GP64 + EDIII and Polyhedrin + EDIII) by Western blot, optical and confocal microscopy. In the case of the EDIII fused with AcMNPV and AgMNPV GP64, the recombinant viral particles were purified and inoculated in mice. The lymphocyte proliferation assay showed a higher proliferation in mice immunized with recombinant virus containing the EDIII fused with the GP64 from the AgMNPV baculovirus comparing to the LPS control. Complementary assays will be carried out in order to evaluate the immunological response pattern and to confirm the production of a vaccine antigen against YF. In chapter 2, the baculovirus expression system was used to express the GAG protein precursor (Pr55) of HIV-1. The Pr55 expression is sufficient to VLP assembly on the cell host plasma membrane. However, the GP64 baculovirus protein is highly immunogenic and is also expressed on the surface of infected cells and is also present on the surface of the VLP. In this work, we showed that is not possible to separate BVs and VLPs produced in the same baculovirus infection cycle using different separation methodologies. Then, using a system able to produce GP64 free recombinant baculovirus, the recombinant virus vGAGHIV-1 GP64 null was produced and used to infect Sf9 cells. By Western blot analyses, it was shown that the baculovirus protein GP64 signal was missing in the recombinant virus infected cell extract. These same cells were observed by transmission electron microscopy (MET), showing that even when the GP64 is absent (which results in the absence of BVs production), VLPs budding continues to happen. This technique was shown to be efficient for VLPs production, free of baculvirus particles or proteins. This work confirms the efficiency of the baculovirus expression system for protein expression and VLPs of pharmacological interest.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós Graduação em Biologia Molecular, 2015. Os baculovirus são um grupo de vírus de inseto com genoma grande de DNA fita dupla, cuja infecção primária é desencadeada por um vírion envelopado denominado vírus derivado da oclusão (do inglês: occlusion derived virus - ODV) embebido em um corpo de oclusão (do inglês, occclusion body- OB) formado por uma matriz proteica cristalina. Cada vírion pode conter um (SNPV) ou mais nucleocapsídeos (MNPV) por envelope, dependendo da espécie viral. A base genética deste fenótipo não foi identificada e há correlação deste fenótipo com a filogenia de baculovirus não foi estabelecida. Contudo, alguns baculovirus intimamente relacionados, como o BmNPV, BomaNPV-S2 e AcMNPV possuem fenótipos discordantes e podem ajudar a identificar possíveis genes responsáveis pelo múltiplo envelopamento. Portanto, nós comparamos os genomas desses vírus e identificamos um único gene presente em BomaNPV e AcMNPV e ausente em BmNPV. Esse gene é a diferença mais significativa entre esses genomas. Para avaliar se esse gene estava relacionado com o fenótipo MNPV nós construímos três baculovirus recombinantes: vAc-polh-p94-del (p94 deletado), vAc-polh-p94-ha-rep (p94 reparado com uma tag -HA) e vAc-polh (controle). Nós mostramos que a P94 é detectada a 6 h.p.i no citoplasma de células infectadas com acumulação máxima a 24 h.p.i.. A deleção completa do gene p94 no genoma do AcMNPV causou um retardo na replicação do DNA, na produção de BV, na expressão de IE1 e, a produção de OBs é diminuída. Entretanto, o fenótipo MNPV não foi alterado. Desta forma, o gene p94 de AcMNPV não é um gene essencial para replicação e estabelecimento da infecção viral e sua aquisição no genoma do AcMNPV provavelmente proporcionou ao vírus uma vantagem seletiva. The baculoviruses are a group of insect viruses with large dsDNA genomes, and their primary infection is triggered by rod-shaped enveloped virions (ODV) embedded in a crystalline protein matrix. Each virion may contain single (SNPV) or multiple nucleocapsids (MNPV) within an envelope, depending on the viral species. The genetic basis of this phenotype has not been identified and it does not seem to be correlated with baculovirus phylogeny. However, some closely related baculoviruses, such as BmNPV, BomaNPV and AcMNPV, have discordant phenotypes and may help to identify candidate genes. Therefore, we compared the genome of these viruses and found a unique gene (p94) that was present in BomaNPV and AcMNPV and was absent in BmNPV. This gene was the most significant difference among the BmNPV and the BomaNPN and AcMNPV genomes. To analyze whether this gene was related to the MNPV phenotype we constructed three recombinant baculoviruses: vAc-pol-p94-del (p94 disrupted), vAc-pol-p94-ha-rep (p94 repaired with -HA tag) and vAc-pol (control). We found that the P94 was detected at 6 h post-infection (p.i.) in the cytoplasm of infected cells with maximum accumulation at 24 h p.i. The lack of complete p94 gene (including the exclusion of the origin of DNA replication located there) in the AcMNPV genome resulted in a delay in DNA replication, BV production and IE1 expression. OB production in vitro was also decreased. Moreover, the ODV nucleocapsid envelopment was not chanced. Therefore, the p94 gene of AcMNPV is not an essential gene for viral DNA replication and establishment of viral infection. Its acquisition in some baculoviruses genomes might give a selective advantage for the virus.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. No capítulo I avaliamos a presença e análise filogenética de vírus de melancia no estado do Tocantins. Folhas com sintomas de infecção viral foram coletadas em 2013 eparticulas virais foram parcialmente purificadas e o RNA total dessas partículas foi purificado e sequenciado usando a plataforma Ilumina HiSeq 2000. As sequências obtidas foram analisadas com o programa CLC Genomics Workbench, e fases abertas de leitura (ORFs) foram procuradas usando o programa Blast x. Os 4.912 contigs que obtiveram hits com vírus de plantas foram analisados e comparados com o auxílio do programa Geneious. A presença dos vírus foi confirmada por diferentes métodos. Foram identificados genomas completos de vírus pertencentes às famílias Potyviridae,BunyaviridaeePartitiviridae. No capítulo II foi realizado estudo biotecnológico na tentativa de construção de um vetor de expressão de proteínas heterólogas com o genoma do baculovírusAnticarsiagemmatalismultilenucleopolyhedrovirus(AgMNPV), baseado no sistema de transposição sítio-específica comercialmente disponível para o baculovírus Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV). Foram utilizadas três metodologias: i) Recombinação homóloga em células de inseto; ii) Recombinação homóloga em células de E. coli (cepa BJ5183); iii) Digestão e ligação em sítio único Bsu36I e FseI no DNA genômico de AgMNPV. Foi construído um vetor de transferência p2100-KLM, para recombinação homóloga e/ou ligação em sítio único do baculovírus, porém, as tentativas para construção do vetor de expressão não foram efetivas. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT In chapter I we analized the presence and phylogeny of viruses found in watermelon in Tocatinsstate. Watermelon leaves with viral symptoms were collected in 2013, and viral particles were partialy purified and total RNA was extracted and sequenced using the Illumina HiSeq 2000 platform. The sequences obtained were analyzed using the CLC Genomics Workbench program, and used for ORF search with theBlastx program. The 4.912 contigs who got hits with plant viruses were analyzed and compared with the help of Geneious program. The presence of viruses in leaves with viral symptoms was confirmed using different methods. Possible complete viral genomes were identified and were related to viruses belonging to the families Potyviridae,Bunyaviridae, Partitiviridae. In chapter II we tried to construct a vector for expression of heterologous proteins using the baculovirusAnticarsiagemmatalismultiple nucleopolyhedrovirus(AgMNPV). This vector was based on site specific transposition system commercially available for the baculovirusAutographacalifornica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Three methodologies were used: i) Homologous recombination in insect cells; ii) Homologous recombination in E. coli cells (strain BJ5183); iii) Direct ligation in Bsu36I and FseI unique restriction sites in the genomic DNA of AgMNPV. One transfer vector (p2100-KLM) was constructed for homologous recombination and / or ligation in the baculovirus single site. However, all the different strategies were not effective.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2013. Os baculovírus são patogênicos a insetos e têm sido efetivos no controle de pragas em áreas agrícolas e florestais. No Brasil, o baculovírus anticarsia (AgMNPV) tem sido empregado como inseticida biológico desde o início da década de oitenta para o controle da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, uma das principais pragas dessa cultura. A principal rota de infecção do vírus se dá através da ingestão dos corpos de oclusão (OB) que, uma vez no intestino médio altamente alcalino, libera as partículas ODV (Occluded Derived Virus). A ligação, fusão e entrada dessas partículas nas células intestinais são mediadas por proteínas virais localizadas na membrana do ODV. Essas proteínas são codificadas por genes denominados pif (per os infectivity factors) os quais são fatores essenciais para infectividade oral, com consequente desenvolvimento da doença no corpo do inseto. Esse trabalho teve como objetivos: avaliar a estabilidade dos genes pif de isolados temporais e geográficos de AgMNPV; construir antissoros policlonais das proteínas PIF; construir vírus recombinantes com deleção de genes pif e analisar as sequências genômicas de dois clones de AgMNPV com grande diferença na virulência. Entre os genes pif dos isolados analisados, o gene pif2 apresentou ser o mais variável, possuindo maior número de sítios polimórficos entre os genes pif analisados. No entanto, a quantidade de SNP (Single Nucleotide Polymorphism) encontrada não indica alta variabilidade deste gene quando comparado a estudos semelhantes realizados com outros baculovírus. Este estudo revelou que apesar do vírus AgMNPV ter sido submetido a passagens subsequentes no inseto ao longo de 20 anos e da distância geográfica, os genes essenciais para a infectividade oral permaneceram estáveis. No estudo das proteínas PIF, somente a proteína PIF2 foi expressa, porém o anticorpo obtido não foi específico. Embora plasmídeos para deleção de genes pif tenham sido construídos, não foi possível a obtenção de vírus recombinantes. Os genomas dos clones virais analisados mostraram, entre outras características, a presença de uma única cópia dos genes pe38 e he65, que estão em duplicata no genoma do vírus AgMNPV-2D. Foi observado também que um dos clones virais (AgMNPV-16), com baixa virulência, possui muitas variações na região codificante do gene ie-2 e do gene pe-38. Esses genes são responsáveis pela transativação dos genes early que iniciam a replicação viral. Além disso, outros genes apresentaram alterações como odv-e56, que tem um papel essencial na maturação e envelopamento dos ODV, e os genes bro-a e bro-b que se encontram fundidos em uma única ORF. O número regiões hr também foi diferente entre os clones (Ag2D com nove, Ag-01 com oito e Ag-16 com sete hr). Os estudos de genes de infectividade oral e de fatores associados à virulência no hospedeiro são importantes para compreensão da dinâmica populacional do vírus em condições naturais e poder ser uteis no desenvolvimento de programas de controle biológico. Baculoviruses are pathogenic to insects and have been effective in controlling pests in agricultural and forestry areas. In Brazil, the baculovirus anticarsia (AgMNPV) has been used as a biological insecticide since the early eighties to control the soybean caterpillar, Anticarsia gemmatalis, a major pest of this crop. The main route of virus infection occurs through ingestion of occlusion bodies (OB) which once in the highly alkaline midgut, release ODV (Occluded Derived Virus) particles. The binding, fusion and entry of such particles into the intestinal cells are mediated by viral proteins located in the membrane of the ODV. These proteins are encoded by genes called pif (per os infectivity factors) which are essential for oral infectivity, with consequent development of the disease in the body of the insect. This study aimed to evaluate the stability of the pif genes of seasonal and geographic field isolates of AgMNPV; to express PIF proteins for construction of polyclonal antibodies; to construct recombinant viruses with deleted pif genes, and to analyze the genomic sequence of two AgMNPV clones with high difference on their virulence. Among the pif genes of the analyzed isolates the pif2 gene was the most variable among the genes studied, showing a higher number of polymorphic sites. However, the amount of SNP (Single Nucleotide Polymorphism) found does not indicate a high variability of this gene when compared to similar studies performed with other baculovirus. This study revealed that although the AgMNPV virus has been subjected to subsequent passages in insect for over 20 years and the geographic distance, the essential genes for oral infectivity remained stable. In the study of PIF proteins, only the PIF2 protein was expressed, but the obtained antibody was not specific. Although plasmids for pif gene deletion were constructed, the recombinant viruses with pif genes deletion have not been completed. The genomes of the viral clones analyzed showed the presence of a single copy of the pe38 and he65 genes which are in duplicate in the genome of the Ag-2D clone. Was observed that one of the viral clones (Ag-16), with lower virulence, has many variations in the ie-2 and pe-38 gene regions, which are responsible to transactivate early genes to start viral replication. Furthermore, other genes presented alterations like the odv-e56, and which have a essential role in the maturation and envelopment of the OD, and bro-a and bro-b genes that are in fused in only one ORF. The hr region number was also different among clones (Ag-2D with nine, Ag-01 with eight and Ag-16 with seven hrs). Studies on the per os infectivity factors genes and factors associated with virulence of the host are important to the understanding of the viral population dynamics in natural conditions and can be valuable in the development of biological control programs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. A Dengue é uma doença de grande importância epidemiológica no país, com cerca de seiscentos mil novos casos por ano, sem tratamento específico e com controle inadequado do vetor. O diagnóstico atual da Dengue na rede publica de saúde está baseada em MAC-ELISA que captura anticorpos IgM contra proteínas estruturais virais como a proteína do envelope. Entretanto, esta metodologia ainda causa falso-positivos e negativos da Dengue, por possuir baixa especificidade e sensibilidade. O trabalho desenvolvido apresenta como inovação uma nova ferramenta para diagnóstico da doença Dengue via detecção do anticorpo anti-NS1 (proteína não-estrutural) do Dengue virus (DENV) no plasma do paciente infectado. A proteína NS1 é secretada e circula no plasma no início da fase febril da Dengue, pacientes produzem anticorpos específicos ao NS1 do DENV, além de anticorpos contra proteínas estruturais como as proteínas do envelope, de membrana e do core. O projeto tem como objetivo produzir antígenos recombinantes da proteína NS1 e de peptídeos imunogênicos de NS1 de DENV sorotipos 1, 2, 3 e 4 utilizando baculovírus/célula de inseto como sistema de expressão e validação de antígeno como ferramenta para ELISA de imunocaptura utilizando soros de pacientes infectados com Dengue nos sete primeiros dias pós-infecção. O protótipo do kit de imunocaptura proposto apresentou especificidade máxima (100%) e sensibilidade elevada (89,8%-98,7%). Portanto, o teste proposto pode ser viabilizado para validação e posteriormente, caso validado, pode ser disponibilizado à população, e desta maneira, proporcionar melhora na diagnose e na evolução do quadro dos pacientes acometidos. Este trabalho foi uma parceria de duas instituições: Universidade de Brasília e o laboratório de Flavivírus do Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz). Dengue is a disease that has an outstanding epidemiological importance in Brazil, there are about six hundred thousand new cases per year, there isn’t a specific treatment and the insect vector control is inadequate. The current diagnosis of Dengue in the public health is based on MAC-ELISA, which capture IgM antibody against structural protein from the viral envelope. However, this methodology generates false-negative and false-positive of Dengue, since it has low sensitivity and specificity. This work presents a new tool for diagnosis of Dengue through detection of the antibody anti-NS1 (non-structural 1) of Dengue virus (DENV) in the plasma of infected patients. The NS1 protein is secreted and circulates in the plasma in the early stage of Dengue Fever. Patients generate specific antibody against DENV NS1, besides antibody against structural proteins as envelope, membrane and core. This project aims for development recombinant antigens of the complete NS1 protein and shorter immunogenic peptide of the NS1 from DENV serotypes 1, 2, 3 and 4 produced by baculovirus system /insect cells. For the purpose, the validation of recombinant antigen were evaluated for immune capture ELISA using patients’ sera infected with DENV in the first seven days post infection. The immune capture prototype kit using these recombinant antigens of NS1 showed maximum specificity (100%) and high sensitivity (89,8%-98,7%). The prototype kit could be viable for futher validation and, then, possibly for mass production for large scale use. Thus it can contribute to improved diagnosis and the condition for patients treatment. This work was a partnership of two institutes: Universidade de Brasilia and Laboratório de Flavivirus do Instituto Oswaldo Cruz (IOCFiocruz).

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-17T11:43:51Z No. of bitstreams: 1 Francisco de Assis Camara Rabelo Filho.pdf: 1431986 bytes, checksum: a5c762b1d10133b3e27a6ed470fcfa1b (MD5) Made available in DSpace on 2017-03-17T11:43:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francisco de Assis Camara Rabelo Filho.pdf: 1431986 bytes, checksum: a5c762b1d10133b3e27a6ed470fcfa1b (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq The yam (Dioscorea spp.) has an important economic and social role in the Northeast of Brazil, providing food with high value to the human diet. It is also a source of income to poor family, employing large number of manpower. Among the phytosanitary problems of this crop, the fungal and nematode diseases are the most important ones. The virus diseases also have high importance, especially for causing cultivar degeneracy, with reduction of plant vigor and consequent qualitative and quantitative production losses. Three viruses stand out in Brazil with occurrence on main cultivars used in Northeast, Yam mosaic virus (YMV) and Yam mild mosaic virus (YMMV), belonging to the genus Potyvirus, family Potyviridae and one virus of the genus Badnavirus, family Caulimoviridae. Recently, two more viruses from the genus Begomovirus and Curtovirus genus, family Geminiviridae were detected. In the present work, initially, the detection and characterization of an YMMV isolate obtained from D. trifida were undertaken by electronic microscope analysis including visualization of cytoplasmatic inclusions typical of the genus Potyvirus. In addition, molecular studies with specific primers for YMMV in RT–PCR, followed by RT–PCR with degenerate primers to viruses of the Potyvirus genus, cloning the product corresponding to the coat protein and phylogenetic analysis including sequences available at the GenBank were done. Sequencing of the complete genome of a YMMV isolate and a detailed study on the nucleotide sequence of this virus by cDNA amplification and cloning in plasmids pGEM-T Easy and the pCR 4 Topo were also realized, and the data deposited in GenBank. The diagnosis of plant virus diseases can be realized by serological and molecular techniques. In yam crop, molecular tools normally are used due to difficulties in acquiring specific antisera, making more expense the identification of viral agents. Polyclonal antiserum was produced in rabbit for YMMV, using the coat protein of an isolate of YMMV expressed in vitro using Escherichia coli system. O inhame (Dioscorea spp.) apresenta importante papel socioeconômico na região Nordeste do Brasil. Além de fornecer alimento de alto valor nutritivo para a dieta humana, é fonte de renda para famílias de baixo poder aquisitivo, empregando grande contingente de mão de obra. Dentre os problemas fitossanitários desta cultura, destacam-se as doenças fúngicas e aquelas causadas por nematoides. As viroses apresentam também elevada importância, principalmente por ocasionarem degenerescência de cultivares, com diminuição do vigor das plantas e, consequentemente perdas qualitativas e quantitativas da produção. Três vírus se destacam, em nível de Brasil, com registros nas principais cultivares empregadas no Nordeste, Yam mosaic virus (YMV) e Yam mild mosaic virus (YMMV), pertencentes ao gênero Potyvirus, família Potyviridae e um vírus do gênero Badnavirus, família Caulimoviridae. Recentemente, foram detectados mais dois vírus, pertencentes aos gêneros Begomovirus e Curtovirus, família Geminiviridae. No presente trabalho, inicialmente foram efetuadas a detecção e caracterização de um isolado de YMMV, obtido de D. trifida, por meio de análise eletromicroscópica, incluindo a visualização de inclusões citoplasmáticas típicas do gênero Potyvirus. Em seguida, foram realizados estudos moleculares com primers específicos para o YMMV em RT–PCR, seguido de RT–PCR com primers degenerados para vírus do gênero Potyvirus, clonagem do produto correspondente à capa proteica e análise filogenética, com os dados de sequências disponíveis no GenBank. Também foi realizado o sequenciamento do genoma completo de um isolado de YMMV e estudo detalhado da sequência de nucleotídeo, mediante amplificação do cDNA e clonagem em plasmídeos pGEM-T Easy e do pCR 4 Topo, cujos dados foram depositados no GenBank. A diagnose das fitoviroses pode ser efetuada por técnicas sorológicas e moleculares. Na cultura do inhame, usa-se, em geral, ferramentas moleculares, pela dificuldade na aquisição de antissoros específicos, o que encarece a identificação dos agentes virais. Antissoro policlonal para YMMV foi desenvolvido em coelho usando a proteína capsidial de um isolado do vírus expressa in vitro no sistema Escherichia coli.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. O Brasil destaca-se por ser um dos maiores exportadores de produtos agrícolas no mundo e diante dessa realidade a utilização de agrotóxicos impacta tanto o meio ambiente quanto a saúde pública. Uma alternativa a essa prática é a utilização de agentes biológicos no controle de pragas. Um exemplo é a utilização do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) no controle da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, sendo o maior exemplo mundial de sucesso de um vírus utilizado como bioinseticida. Os baculovírus são vírus de DNA fita dupla, específicos de artrópodes. Uma das características apresentada no genoma viral do isolado AgMNPV-2D está na ausência dos genes quitinase (chiA) e catepsina (v-cath). Essa ausência pode ser responsável por não ocorrer a liquefação e a melanização das larvas de A. gemmatalis mortas pela infecção com o AgMNPV-2D. O capítulo I do presente trabalho teve como objetivo analisar o efeito da expressão dessas proteínas em insetos infectados com AgMNPV recombinantes contendo esses genes derivados de dois baculovírus (Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus - CfDefNPV e Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus - AcMNPV). O vírus recombinante, contendo os genes chiA e v-cath provenientes do baculovírus CfDefNPV, (vAgp2100Cf.chiA/v-cath) foi capaz de promover a liquefação e melanização do corpo das larvas de A. gemmatalis após a morte das mesmas, entretanto, o vírus vAgp2100Ac.chiA/v-cath, construído neste trabalho, não teve o mesmo efeito. Bioensaios com larvas neonatas e de terceiro instar de A. gemmatalis infectadas com o vírus recombinante vAgp2100Cf.chiA/v-cath apresentaram uma maior atividade inseticida. A CL 50 do vírus recombinante foi de 3 (para larvas neonatas) a 4 vezes (para larvas de 3º estágio) menor do que a CL 50 do vírus selvagem. A expressão dos genes chiA e v-cath durante a infecção de células de inseto pelo vírus recombinante foi analisada por qPCR e detectou a presença e aumento de transcritos dos genes a partir de 6 h até 72 h p.i. Outro exemplo à prática de utilização de agentes biológicos no controle de inseto-praga destaca-se o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae. O capítulo II do presente trabalho propôs avaliar se a expressão de enzimas quitinase do fungo durante a infecção do vírus é capaz de aumentar a patogenicidade viral em larvas de Spodoptera frugiperda. Foi construído um vírus recombinante inserindo o gene de uma quitinase (chi2) do fungo entomopatogênico M. anisopliae no genoma do vírus AcMNPV, para avaliar o efeito da expressão heteróloga na patogenicidade do vírus recombinante. A CL 50 apresentada pelo vírus recombinante sugere um aumento na virulência quando comparado com o vírus selvagem e a quantidade de enzima detectada também apresentou maiores níveis em células de inseto infectadas com o vírus recombinante comparado ao vírus selvagem. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT Brazil stands out for being one of the largest exporters of agricultural products in the world, therefore the use of pesticides impacts on both the environment and public health. An alternative to this practice is the use of biological agents to control pests. An example is the use of baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) in the control of velvetbean caterpillar, A. gemmatalis, which is the greatest global example of successfully using a virus as a bio-insecticide. Baculoviruses are arthropod-specific double-stranded DNA viruses. One of the interesting features of the AgMNPV-2D isolateviral genome is the absence of chitinase (chiA) and cathepsin (v- cath) genes. This absence can be responsible for the lack of liquefaction and larval melanization in A. gemmatalis killed by AgMNPV-2D infection. Chapter I of this study intended to analyze the effect of these proteins expression in insects infected by recombinant AgMNPV containing these genes derived from two baculovirus (Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus - CfDefNPV e Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus - AcMNPV). The recombinant viruses containing the genes v-cath and chiA from the baculovirus CfDefNPV (vAgp2100Cf.chiA/v-cath) was able to promote the liquefaction and melanization of A. gemmatalis larvae bodies after their death, although the vAgp2100Ac.chiA/v-cath virus prepared in this study, did not present the same effect. Bioassays with third-instar neonate larvae of A. gemmatalis infected with the vAgp2100Cf.chiA/v-cath recombinant virus showed higher insecticidal activity. The LC 50 of the recombinant virus was from 3 (for neonate larvae) to 4 times (for 3rd larval stage) lower than the LC 50 of the wild-type virus. The expression of v-cath and chiA genes during infection of insect cells by the recombinant virus was analyzed by qPCR, which detected both the presence and the increase of gene transcripts from 6 h to 72 h p.i. Another noteworthy example of the practical use of biological agents to control insect pest is the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Chapter II of this study aimed to assess whether the expression of fungal chitinase enzymes during viral infection is able to increase viral pathogenicity in larvae of Spodoptera frugiperda. Constructs was made inserting a chitinase gene (chi2) from the entomopathogenic fungus M. anisopliae into the genome of AcMNPV virus, in order to evaluate the effect of heterologous expression in the recombinant virus pathogenicity. The LC 50 presented by the recombinant virus suggests an increase in virulence when compared to wild type virus and the amount of enzyme also showed the highest levels detected in insect cells infected with recombinant virus compared to wild virus.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. A família Caliciviridae é formada por vírus pertencentes a cinco gêneros: Sapovirus, Norovirus, Lagovirus, Vesivirus e Nebovirus. Alguns sapovírus e norovírus são conhecidos como agentes causadores de gastrenterites em humanos, sendo sapovírus o segundo agente viral mais importante depois dos norovírus. O genoma do sapovírus é linear, de senso positivo, ssRNA, com tamanho de cerca de 7,5 kb, poliadenilado na região terminal 3'. Os sapovirus, atualmente, são divididos em sete genogrupos (GI-GVII) que infectam humanos, suínos e visons. Essa classificação é baseada, principalmente na sequência da proteína do capsídeo. Nesse estudo, o genoma completo de um sapovírus isolado (Sapovirus Hu/GI.2/BRDF01/ BRA/2009) em Brasília, Brasil, foi analisado com todas as sequências de sapovírus disponíveis para determinar sua relação filogenética e possíveis eventos de recombinação intra- e inter-genogrupos. Foi determinada uma proximidade filogenética com uma sequência obtida em 2005 em Bangladesh. Uma possível recombinação inter-genogrupo entre GI (humano) e GIII (suíno) assim como recombinações intra-genogrupo foram encontradas nas análises. Outro achado relevante é a região RdRp-CP como sítio de recombinação. Devido à ausência de ferramenta eficaz de diagnóstico imunológico do vírus baseada em procedimento de ELISA, surgiu à demanda de se expressar o capsídeo viral utilizando sistema de expressão de proteína heteróloga para obter anticorpo específico. Dessa forma o segundo objetivo desse trabalho foi produzir VLP de sapovírus utilizando o sistema de baculovírus recombinante. Para a confirmação da montagem dessa particular além de análise em microscopia eletrônica foi produzido um anticorpo policlonal contra a porção variável da proteína do capsídeo (P2). A análise ao microscópio eletrônico de transmissão demonstrou partículas esféricas com tamanhos de 20-40 nm, no entanto a ligação entre o anticorpo anti-P2 e possível VLP expressa não foi demonstrada. Esses resultados indicam que maiores estudos quanto a expressão e purificação de VLP de sapovírus devem ser realizados. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT The family Caliciviridae consists of viruses belonging to five genera: Sapovirus, Norovirus, Lagovirus, Vesivirus and Nebovirus. Certain sapovirus and norovirus strains are well-known causative agents of serious human gastroenteritis. Sapovirus is the second most important causative agent of human diseases next to norovirus. The sapovirus genome is linear, positive-sense, single-stranded RNA, of approximately 7,5kb that is polyadenylated at the 3’ terminus. Sapovirus is divided into, at moment, seven genogroups (GI-GVII). This classification is based mainly on capsid protein sequence divergence. In this study, the entire genome of one sapovirus isolated in Brasília, Brazil (Sapovirus Hu/GI.2/BRDF01/ BRA/2009) was evaluated with all available sequences of sapovirus to determine its phylogenetic relationship and possible intra- and inter-genogroups recombination events using RDP3 program. It was determined the identity between the Brazilian sequence and one sequence collected in 2005 in Bangladesh and its possible recombination such as a possibility of an inter-genogroup recombination event between GI (human) and GIII (porcine). Another relevant found is the region of RdRp-CP as a hot spot of recombination. Due to the lack of the efficient diagnostic tools based on ELISA procedure, the preparation of capsid protein of the virus using heterologous protein expression system was requested. Thus the second objective of this work was to produce VLP sapovirus using recombinant baculovirus system. To confirm this particle assembly besides electronic microscopy analysis a polyclonal antibody was produced against the variable region (P2) of the capsid protein. The analysis by transmission electron microscope showed spherical particles with sizes of 20-40 nm, however the response between the anti-P2 and the possible VLP could not be demonstrated. These results indicate that further studies regarding the expression and purification of VLP sapovirus should be performed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. Febre amarela é uma doença infecciosa, endêmica nas florestas tropicais da África, Américas Central e do Sul. O agente etiológico da febre amarela é o vírus da febre amarela pertencente ao gênero Flavivirus, e espécie-tipo da família Flaviviridae. O genoma contêm 10.233 pares de bases (bp) , que codifica as proteínas estruturais (Capsídeo – C, Membrana – Pré M/M, Envelope – E) e não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). NS1 é um gene essencial requerido para replicação eficiente do RNA viral. O diagnóstico mais utilizado para febre amarela é o teste MAC-ELISA para a detecção de IgM (pesquisa de anticorpos recentes). As reações cruzadas entre o vírus amaralíco e outros flavivirus são fatores que dificultam o diagnóstico sorológico, principalmente em áreas endêmicas de múltiplos flavivirus. Desta forma, nesse trabalho, a proteína NS1 do vírus da febre amarela foi expressa em sistemas procariótico (Escherichia coli) e eucariótico (células de inseto) com o objetivo de utilizá-la no diagnóstico precoce de infecção pelo vírus da febre amarela. Para expressão da proteína NS1 de YFV em sistema procariótico, foi utilizado o sistema de recombinação sítio específica Gateway® (Invitrogen). A proteína recombinante expressa em E. coli foi purificada e inoculada em camundongos para produção do anti-soro policlonal anti-NS1. Para expressão da proteína NS1 em sistema eucariótico, foi utilizada a técnica de transposição sítio específica Bac-to-Bac® (Invitrogen). O gene NS1 foi fusionado ao gene da poliedrina do baculovírus AcMNPV e introduzido no genoma viral. O vírus recombinante foi usado para infectar células de inseto e a proteína recombinante foi detectada por Western blot. Ambos os sistemas de expressão foram utilizados com sucesso e as proteínas recombinantes serão testadas como antígenos para o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico de infecção pelo vírus da febre amarela. Palavras chaves: NS1; Baculovírus; Febre Amarela; Poliedrina; AcMNPV. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT Yellow Fever is an infectious disease, endemic in African, Central and South American tropical forests. The etiologic agent of the yellow fever is the Yellow Fever Virus belonging to the genus Flavivirus, and the type-species of the family Flaviviridae. The genome has 10.233 base pairs (bp), which encodes structural (Capsid – C, Membrane – Pre M/M, Envelope – E) and non-structural (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) proteins. NS1 is an essential gene required for an efficient RNA viral replication. The most used diagnosis test to confirm yellow fever is the MAC-ELISA for the detection of IgM (survey about recent antibodies). The cross-reactivities between the amarilic virus and other flaviviruses are factors that hinder the serological diagnosis, especially in endemic areas with multiple flaviviruses. Hence, in this work, the NS1 protein of the yellow fever virus was expressed in prokaryotic (Escherichia coli) as well as in eucariotic systems (insect cells) with the aim of using this protein in the early diagnosis of yellow fever virus infection. For the expression of the YFV NS1 protein in a prokaryotic system it was used the site-specific recombinant system Gateway® (Invitrogen). The recombinant protein expressed in E. coli was purified and inoculated in mice for the production of polyclonal anti-serum anti-NS1. For the expression of the NS1 in a eukaryotic system, the Bac-to-Bac® (Invitrogen) site-specific transposition was used. The NS1 gene was fused to the polyhedrin gene of the baculovirus AcMNPV and introduced into the viral genome. The recombinant virus was used to infect insect cells and the recombinant protein detected by Western blot. Both expression systems were used with success and the recombinant proteins will be tested as antigens for the development of new diagnostic methods for yellow fever virus infection.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva que produz proteínas formadoras de cristal ou δ-endotoxinas que compreendem as toxinas Cry, com atividade inseticida específica, e Cyt, com atividade citolítica inespecífica. Diferentes δ-endotoxinas mostram-se específicas para diferentes insetos-alvos. Esta especificidade deve-se a receptores de membrana distintos nas células do intestino dos insetos e à presença de diferentes proteases próprias dos insetos, necessárias para ativação proteolítica da prótoxina produzida na fase de esporulação do B. thuringiensis. Os genes cry4Aa, cry11A e cyt2Ba foram amplificados por PCR a partir das estirpes de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, S-1989 ou S-1806. Os produtos das PCR foram clonados em um vetor de expressão em B. thuringiensis, pSVP27A. O gene cyt2Ba foi também clonado em vetores de transferência para construção de baculovírus recombinantes para expressão da proteína Cyt2Ba nativa ou fusionada à proteína Poliedrina. Estirpes de B. thuringiensis acristalíferas foram usadas para expressão individual das proteínas. Após purificação e solubilização das proteínas heterólogas, as memsmas foram ativadas com tripsina ou suco gástrico de Spodoptera frugiperda, para a realização de ensaios de atividade em culturas de células de Lepidoptera, Diptera e mamífero. Foram usados, nos ensaios de citotoxicidade, 20 μg/mL de cada toxina Cry individual ou em combinações e 20 μg/mL ou 5 μg/mL da toxina Cyt2Ba. Atividades tóxicas das toxinas heterólogas ativadas por tripsina foram detectadas para todas as linhagens de células de insetos testadas, fato que não ocorreu após ativação das mesmas toxinas com suco gástrico de S. frugiperda. Para células humanas, apenas Cyt2Ba mostrou-se tóxica. Entretanto, a combinação entre Cyt2Ba e as toxinas Cry4Aa e Cry11A apresentou citotóxicidade maior que Cyt2Ba isoladamente, o que pode sugerir que Cyt2Ba funcione como receptor para Cry4Aa e Cry11A em células humanas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT Bacillus thuringiensis is a Gram-positive bacterium that produces crystal forming proteins, δ-endotoxins, which consist of Cry toxins harboring specific insecticidal activity, and Cyt toxins that contain non-specific cytolytic activity. Different δ-endotoxins are specific to different target insects. This specificity is due to distinct membrane receptors on the surface of the insect´s midgut cells and to the presence of different host´s proteases, which are necessary to proteolytic activation of the protoxin expressed during B. thuringiensis sporulation phase. The cry4Aa, Cry11A and cyt2Ba genes were amplified from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Brazilian strains, S-1989 or S-1806 by PCR. The PCR products were cloned into the B. thuringiensis expression vector, pSVP27A. The cyt2Ba gene was also cloned into transfer vectors to allow construction of recombinant baculoviruses, in order to express the native Cyt2Ba protein, or Cyt2Ba fusioned to the Polyhedrin protein. Acrystaliferous B. thuringiensis strains were used for the expression of the proteins individually. After purification and solubilization of the heterologous proteins, toxin activation by either trypsin or Spodoptera frugiperda´s gastric juice was carried out to perform citotoxicity assays using Lepidopteran, Dipteran and human cultured cells. Each Cry toxin was used at the concentration of 20 μg/mL, while Cyt2Ba was used at two different concentrations: 20 μg/mL or 5 μg/mL. Cytotoxic activities of the trypsin activated heterologous proteins were detected to all insect cell lines tested, but when the same proteins were digested by S. frugiperda´s gastric juice, no toxic activities were detected. Only Cyt2Ba was shown to be toxic to the human cells tested. Nevertheless, the combination of Cyt2Ba and both Cry4Aa and Cry11A toxins yelded a higher toxicity than that produced by Cyt2Ba isolatedly, which could suggest that Cyt2Ba could be functioning as a receptor for Cry4Aa and Cry11A on the surface of human cells.

Dissertação (Mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. Baculovírus são vírus de DNA dupla-fita circular que infectam insetos principalmente da ordem Lepidoptera. O problema de seu uso como inseticida é o tempo que este leva para matar o inseto hospedeiro. A fim de resolver este problema, inserção de genes inseticidas no genoma viral pode ser requerida. Uma importante fonte de proteínas inseticidas é o veneno de aracnídeos, cujo alvo e ação permanecem pouco elucidados. Assim, promopos o uso de baculovírus como ferramenta para entender mecanismo de ação de peptídeos tóxicos em células de inseto. Diante disso, diferentes versões da toxina putativa BaTx derivada de biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha caranguejeira Brachypelma albiceps foram obtidas por PCR e usadas para construção de baculovírus recombinantes. Os recombinantes foram usados para infecção de duas linhagens de lepidópteros, IPLB-Sf1-AE e BTI-Tn5B1-4 e a viabilidade celular foi avaliada durante a infecção. As diferentes versões da toxina causaram morte celular precoce por necrose em níveis diferenciados. Análise estrutural e ultraestrutural mostraram clara mudança citomorfológica em células, corroborando perda de integridade da membrana plasmática e do conteúdo citoplasmático, permanência do núcleo com carioteca intacta e associada a restos de membranas circundantes. Esta característica criou um aspecto rugoso quando observado em microscopia de luz. Além disso, o gene da toxina BaTx foi expresso em sistema procariótico para obtenção de antisoro policlonal murino. Entretanto, quando testado contra extratos de células infectadas com recombinantes, não houve marcação. Fato este esperado, uma vez que a toxina não foi observada em gel SDS-PAGE. Não há relatos de genes de toxinas de aranha com ação citotóxica clonadas em baculovírus, provavelmente esta característica não permitiu que houvesse acúmulo da toxina em níveis diagnosticáveis por imunomarcação ou pode ter promovido instabilidade peptídica. Peptídeos formadores de canais apresentam alto conteúdo de resíduos básicos (arginina e lisina), de cisteínas e conformação em folha-beta. BaTx apresenta todas estas características, porém alvo e ação permanecem obscuros. Canais tipo-TRP são encontrados em insetos e há indícios da presença desses transportadores na membrana plasmática e em membranas intracelulares. Talvez estes canais possam ser o alvo de ação da toxina BaTx. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT Baculoviruses are dsDNA circular virus infectives to insects mainly from the Order Lepidoptera. Its biopesticide use problem is the time of death during insect infection. To solve this problem, insecticide genes can be inserted into the viral genome. An important insectice protein source is the venom of arachinids. However, the target and action of many peptides remain unclear. Baculoviruses can be used as a tool to udersatand the toxic peptides playing in insect cells. Thus, different vesions of a putative toxin were obtained from cDNA library of the tarantula Brachypelma albiceps venom gland by PCR and used to construct recombinant baculoviruses. The recombinants were used to infect two lepidopteran cell lines, IPLB-Sf1-AE and BTITn5B1- 4, and cell viability was evaluated during infection. The toxin versions caused wide and early cell death by necrosis in different levels. Structural and ultrastructural analyses showed clear cytomorphological changes, corroborating loss of the plasma membrane integrity and cytoplasmic contents, and nucleus with intact karyotheca linked with surrounding plasma membrane remains. The features created a rough aspect when those infected cells were observed by light microscopy. Furthermore, the BaTx toxin gene was expressed by a prokaryotic system to obtain murine polyclonal antiserum. However, when the antiserum was tested against infected cells extract with recombinant virus carrying the BaTx toxin no reaction was detected. This observation was expected since the toxin was not observed by SDS-PAGE. There are no reports of spider toxin genes with necrotic action cloned into baculovirus, probably this feature did not allowed toxin accumulation in detectable levels by immunoblot or it could have promoted protein instability. Channel former peptides show high content of basic amino acid residues (lysine and arginine), cystein residues, and beta-sheet conformation. BaTx presents all those features, but its target and mode of action remain unknown. TRP-like channels are found in insects and there is evidence of the presence of these iontransporters in intracellular membranes as well as in plasma membrane. Perhaps TRPlike channels can be the BaTx toxin target of action.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. Apesar de afetarem praticamente um sexto da população mundial, doenças como a dengue e o mal de Chagas continuam sendo negligenciadas pela indústria farmacêutica e pelo governo. Assumindo a responsabilidade da pesquisa de base, as instituições de ensino superior podem tornar o desenvolvimento de fármacos contra as doenças negligenciadas mais atraentes aos olhos da indústria. Com a proposta de diminuir os gastos e o tempo na busca de novos medicamentos contra essas doenças, o presente trabalho buscou aplicar métodos de análise in silico para a implementação de uma plataforma de descoberta racional de fármacos voltada para as doenças importantes no Brasil. Dessa forma, duas doenças para as quais não existem vacinas ou tratamento efetivo foram escolhidas para um estudo piloto: a dengue e a doença de Chagas. Um dos alvos mais promissores contra a dengue é a protease virai NS3, que, associada ao seu cofator NS2B, promove o processamento da poliproteína virai e, consequentemente, a replicação do vírus. Por meio de técnicas de modelagem comparativa, dinâmicas moleculares e triagem virtual, um possível papel para o cofator NS2B e para o ligante no efeito de ajuste induzido do sítio ativo da NS3 foi proposto. Além disso, quatro famílias de conformações foram encontradas e exploradas em uma campanha de triagem virtual, onde foram obtidos quatro moléculas com atividade inibitória comprovada. Ao mesmo tempo, técnicas similares foram aplicadas a dois alvos de Trypanosoma cruzi já estudados pelo nosso grupo: a catepsina B (TcCatB) e a metiltioadenosina fosforilase (TcMTAP). Os modelos construídos se mostraram estáveis durante simulações de dinâmica molecular, e também foram submetidos à triagem virtual. Moléculas com atividade inibitória putativas contra esses alvos foram identificadas. Os resultados deste trabalho apontam para a viabilidade de estabelecer-se uma plataforma de busca racional de fármacos contra outras doenças negligenciadas. Despite affecting about one-sixt of the world's population, diseases like dengue fever and Chagas disease are still overlooked by the government and pharmaceutical industries. By assuming the responsibility over basic research, public institutions of higher education may play a role in making the development of new drugs against neglected diseases more attractive to the big pharma companies. With the aim of cutting costs and time for searching new drugs against those diseases, this work intended to apply in silico analysis methods towards the implementation of a rational drug design platform against neglected diseases occurring in Brazil. Thus, two illnesses for which there are no vaccines or effective treatments were chosen for a pilot study: dengue fever and Chagas disease. One of the most promising targets against dengue fever is the viral NS3 protease, which, together with its cofactor NS2B. promotes the viral polyprotein processing and therefore viral replication. By using comparative modeling techniques, molecular dynamics simulations and virtual screening, a possible role of the NS2B cofactor and the ligand binding in the induced fit effect at the NS3 active site was proposed. Also, four conformational families were found and explored in a virtual screening campaign, in which four compounds with proven inhibitory activity were found. At the same time, similar techniques were applied to two targets of Trypanosoma cruzi already studied by our team: the cathepsin B (TcCatB) and the methyltioadenosine phosphorilase (TcMTAP). The built models were shown to be stable during molecular dynamics simulations, and were also subjected to virtual screening campaigns. Molecules with putative inhibitory activity against those targets were detected. Together, those results point to the viability in establishing a rational drug discovery platform against neglected diseases.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde. As Hepatites virais são doenças causadas por diferentes agentes etiológicos, que possuem distribuição universal e têm em comum o hepatotropismo. Em todo mundo, as hepatites A e B continuam a ser um grande problema de saúde pública. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 170 milhões de pessoas estejam infectadas com o vírus da hepatite C (HCV) e que 300 milhões vivam com o vírus da hepatite B (HBV). O vírus da hepatite B está classificado na família Hepadnavirus, contém características como o tropismo pelas células hepáticas e material genético constituído por uma molécula de DNA com fita parcialmente dupla. O diagnóstico de qualquer uma das formas clínicas da Hepatite B realiza-se através de técnicas sorológicas. Tais técnicas revelam-se fundamentais não apenas para o diagnóstico, mas também mostram-se muito úteis no acompanhamento da infecção viral, na avaliação do estado clínico do paciente e na utilização de terapêutica específica. As importantes descobertas realizadas nas áreas da virologia e da biologia molecular desses vírus, nos últimos anos, foram progressivamente sendo incorporados à rotina diária dos laboratórios de patologia clínica, permitindo aos profissionais da área de saúde acesso às modernas técnicas capazes de avaliar a carga viral presente no indivíduo, o índice de replicação do agente infeccioso e a eficácia de novas medicações utilizadas no tratamento dessa virose. O HBsAg é uma glicoproteína antigênica exposta na superfície do envelope do HBV cuja presença no soro do paciente indica uma infecção ativa . Capaz de ativar uma resposta imunológica, o HBsAg é utilizado na confecção de vacinas e Kits diagnósticos. Este trabalho descreve a construção de um baculovírus recombinante contendo o gene do antígeno HBsAg de HBV fusionado ao gene da poliedrina do Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). O vírus reecombinante foi usado para infectar células de insetos e insetos e sua expressão analisada por SDS-PAGE. A proteina recombinante foi expressa em grande quantidade, purificada por centrifugação em gradiente de sacarose e usada como antígeno em um teste de diagnóstico comumente utilizado em latoratórios clínicos. A proteina recombinante foi reconhecida pelo soro de pacientes infectados pelo HBV e desta forma, possui potencial para ser usada em testes de diagnóstico dessa importante doença viral humana. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT Viral hepatitis are diseases caused by different etiologic agents, that have worldwide distribution and have in common hepatotropism. Worldwide, hepatitis A and B remains a major public health problem . The World Health Organization (WHO) estimates that 170 million people are infected with hepatitis C virus (HCV) and 300 million are living with hepatitis B virus (HBV). Hepatitis B is classified in the Hepadnavirus family, contains commun features such as tropism for liver cells and its genetic material consists of a partial double stranded DNA molecule. The diagnosis of a clinical form of hepatitis B is carried out by serological techniques. These techniques are not only important for diagnosis but are also very useful in monitoring viral infection, in assessing the patient's clinical status and in the use of specific therapy. Important developments derived from research in virology and molecular biology of these viruses in recent years, have gradually been incorporated into the daily routine of clinical pathology laboratories, allowing healthcare professionals to access modern techniques to evaluate the viral load present the individual, the replication of the infectious agent and effectiveness of new medications used to treat this viral infection. HBsAg is a glycoprotein antigen exposed on the surface of the envelope of HBV, whose presence in the serum of the patient indicates an active infection. HBSAg is able to activate a human immune response and is used in the production of vaccines and diagnostic kits. This work shows the construction of a recombinant baculovirus containing the HBsAg gene (from HBV) fused to the polyhedrin gene of the Autographa californica multicapsid Nucleopolyhedrovirus virus (AcMNPV). The recombinant virus was used to infect insect cells and insects and the expression of the recombinant protein was analysed by SDS-PAGE. The recombinant protein was highly expressed, purified by sucrose gradient centrifugation, and used as antigen in a diagnostic test commonly used in clinical laboratories m(ELISA). The recombinant protein was shown to be recognized by serum of HBV-infected patients and therefore, have the potential to be used in diagnosis of this important human viral disease.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2011. Baculovírus são vírus de DNA originalmente utilizados apenas como controle biológico por serem capazes de eliminar insetos-praga associados à agricultura. Nas décadas de 70 e 80, seu potencial como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas começou a ser explorado e hoje baculovírus podem ser aplicados para expressar antígenos de uso vacinal ou diagnóstico e até mesmo podem ser utilizados como vetores de terapia gênica e vacinas de DNA. Sua biossegurança é garantida pelo fato de não serem capazes de se replicar em células de mamífero, entretanto estudos comprovam que são capazes de entrar nessas células e produzir algumas proteínas virais. Apresentam ainda capacidades imunoestimulatórias e o estudo da interação baculovírus-saúde humana se torna cada vez mais importante com o aumento das várias aplicações biomédicas do uso desse vírus. Esta tese teve como objetivos, avaliar os efeitos imunológicos e a segurança dos baculovírus para vertebrados e o seu uso como vetores de expressão para produção de insumos biotecnológicos pela expressão das proteínas dos envelopes dos vírus da Febre Amarela e Vírus da Raiva. Para avaliar os efeitos imunológicos em vertebrados, foi realizada a inoculação intranasal de camundongos BALB/c com os dois fenótipos (ODVs contidos nos corpos de inclusão poliédrica, OB ou PIB e vírus extracelular, BV) dos baculovírus AcMNPV e AgMNPV. Foi demonstrado que os baculovirus são capazes de modular a resposta imune de mamíferos in vivo e in vitro. BVs ou PIBs de AgMNPV podem aumentar uma resposta de células Th1 e podem ser considerados mais úteis como vetores de vacinação ou adjuvantes imunológicos do que AcMNPV. AgMNPV na forma selvagem ou recombinante, pode ser também utilizado para alterar o tipo de resposta adaptativa desenvolvida. Com relação à expressão de proteínas heterólogas em células de inseto, os genes da proteína do envelope (E) do vírus da Febre Amarela (YFV) e da glicoproteína 16 G (RVGP) do vírus da Raiva foram introduzidos no genoma de um baculovírus e expressas em células de inseto. Tanto a proteína recombinante E (derivadas de YFV) como a proteína RVGP (derivada do vírus da Raiva) fusionada à proteína poliedrina de baculovírus foram antigenicamente similares às proteínas dos vírus selvagens, mostrando potencial para uso diagnóstico ou vacinal. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT Baculoviruses are DNA viruses originally used only as a biological control because they are able to eliminate insect pests associated with agriculture. In the 70's and 80's, its potential as a tool for expression of heterologous proteins began to be explored and today it can be applied to express vaccine or diagnosis antigens and can even be used as vectors for gene therapy and DNA vaccines. Its biosafety is guaranteed by the fact of not being able to replicate in mammalian cells but studies show that they are able to enter this cells and produce some viral proteins. They also present immunostimulating capabilities and the study of human health-baculovirus interaction becomes increasingly important with the increasing number of biomedical applications of using this virus.. This thesis had as objectives, to evaluate the immunological effects and safety of baculoviruses for vertebrates and to use baculoviruses as expression vectors for the production of biotechnological products by the expression of envelope proteins from yellow fever virus and Rabies Virus., In order to evaluate the effects of baculovirus in the immune system of vertebrates, intranasal inoculation of BALB / c mice with both phenotypes (ODVs in polyhedral inclusion bodies, OB and extracellular virus, BV) of AgMNPV and AcMNPV baculovirus was performed. It was shown that baculovirus was able to modulate the immune response in mammals in vivo and in vitro. BVs or PIBs of AgMNPV can increase a Th1 response and may be more useful as vectors for vaccination or immune adjuvants than AcMNPV. Wild or recombinant AgMNPV can also be used to change the type of adaptive response developed. Regarding the heterologous expression of proteins in insect cells, the the envelope protein gene of Yellow Fever virus and the glycoprotein G gene of Rabies virus were introduced into the genome of a baculovirus e expressed in insect cells. Both the recombinant proteins (E derived from YFV and RVGP derived from Rabies virus and fusioned with 18 polyhedrin of baculovirus) were shown to be antigenically similar to the wild type proteins, showing potential to be used for vaccine development or diagnosis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2011. No Brasil, a raiva e a dengue podem ser citadas como duas doenças que causam prejuízos econômicos. A raiva é uma doença causada por um vírus do gênero Lyssavirus, transmitida pela saliva de mamíferos infectados, e uma vez iniciados os sintomas, a mortalidade ocorre em praticamente todos os casos. O vírus da raiva é formado por cinco proteínas: a nucleoproteína, a fosfoproteína, a proteína de matriz, a RNA polimerase e a glicoproteína (GPV), principal proteína viral imunogênica. Neste trabalho, a GPV foi expressa em células de mamíferos utilizando um baculovírus recombinante. Baculovirus são vírus de insetos que têm sido amplamente utilizados como biopesticidas e como ferramenta para a expressão de proteínas heterólogas em células de inseto e de mamíferos. Eles são considerados seguros devido à sua especificidade ao hospedeiro e a incapacidade de se replicar em linhagens de células não-inseto, embora eles possam entrar nas células de mamíferos. Para a construção do vírus recombinante, um fragmento gênico contendo o promotor CMV e o gene GPV foi clonado no vetor pFastBac1. O vírus recombinante AcCMV-GPV foi obtido através do sistema Bac-to-Bac (Invitrogen) e foi usado para infectar células de inseto. O extrato celular foi analisado por SDS-PAGE e a presença da proteína GPV foi confirmada por western blot usando um anticorpo anti-vírus da raiva. Células HeLa, derivadas de hepatoma humano, foram transduzidas com o vírus recombinante e o extrato celular também foi analisado por SDS-PAGE e a proteína GPV marcada com o anticorpo anti-vírus da raiva. Células HuH-7, derivadas de hepatócitos humanos, foram transduzidas com o vírus recombinante e a proteína GPV foi quantificada através de um ELISA. Futuramente, testes in vivo poderão ser feitos a fim de analisar os efeitos imunogênicos do vírus recombinante. Baculovírus recombinante capaz de expressar GPV em células de mamíferos pode ser uma alternativa para o desenvolvimento de uma vacina contra a raiva a custos mais baixos. A dengue é uma doença tropical e tem se tornado um grave problema de saúde pública. A doença é causada pelo vírus da dengue (dengue virus, DENV), um Flavivirus composto de quatro sorotipos (DENV-1 a 4), todos transmitidos ao ser humano através da picada da fêmea de mosquitos do gênero Aedes. O DENV se replica tanto em células de vertebrados como nas células do mosquito. Há muito conhecimento sobre os mecanismos de entrada e replicação de Flavivirus em cultura de células de mamífero e seus efeitos in vivo. No entanto, pouco se sabe a respeito dos processos moleculares do vírus no vetor. Dentro desse contexto, o presente trabalho propos a análise transcricional de células de Ae. albopictus (C6/36) infectadas com DENV-1, isolado do Distrito Federal. Doze horas pósinfecção, as células foram coletadas, o RNA total de células infectadas e não infectadas foi extraído e utilizado para confecção da biblioteca subtrativa de cDNA, através da técnica de Representational Difference Analysis (RDA). Os cDNAs amplificados foram clonados no vetor pGEM-T Easy e seqüenciados. Cerca de 300 clones foram seqüenciados e as seqüências obtidas foram analisadas em um banco de dados. Infelizmente, a maioria das seqüências foi de RNA ribossomal. Tal resultado indica que houve problemas técnicos na construção da referida biblioteca. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT In Brazil, rabies and dengue fever may be cited as two diseases that cause economic impacts. Rabies is a disease caused by a virus of the genus Lyssavirus and it is transmitted through the saliva of infected mammals. Once the symptoms started, the mortality occurs in virtually all cases. The rabies virus is composed of five proteins: nucleoprotein, phosphoprotein, matrix protein, RNA polymerase and glycoprotein (GPV), the main immunogenic viral protein. In this work, the GPV was expressed in mammalian cells using a recombinant baculovirus. Baculovirus are insect viruses that have been widely used as biopesticides and as a tool for expression of heterologous proteins in insect and mammalian cells. They are considered safe due to their host specificity and the inability to replicate in non-insect cell lines, although they can enter in mammalian cells. To construct the recombinant virus, a gene cassete containing the CMV promoter and the GPV gene was cloned into the vector pFastBac1. The recombinant AcCMV-GPV was obtained by Bac-to- Bac system (Invitrogen) and was used to infect insect cells. The cell extract was analyzed by SDS-PAGE and the presence of the GPV protein was confirmed by western blot using an antibody anti-rabies virus. HeLa cells, derived from human hepatoma, were transduced with the recombinant virus, the cell extract was also analyzed by SDS-PAGE and the GPV protein was labeled with the same antibody. Huh-7 cells derived from human hepatocytes were transduced with the recombinant virus and the protein was quantified by ELISA. In future, in vivo tests can be done to examine the immunogenic effects of the recombinant virus. Recombinant baculovirus expressing GPV in mammalian cells may be an alternative for the development of vaccine against rabies at lower costs. Dengue is a tropical disease and has become a serious public health issue. The disease is caused by dengue virus (DENV), a Flavivirus, which has four serotypes (DENV-1 to 4), all transmitted to humans through the bite of female mosquitoes of the genus Aedes. The DENV replicates in both vertebrate and mosquito cells. There are a lot of knowledge about the mechanisms of Flavivirus entry and replication in mammalian cell culture and its effects in vivo. However, little is known about the molecular processes of the virus in the vector. In this context, this paper proposes cell transcriptional analysis of Ae. albopictus cells (C6/36) infected with DENV-1, isolated from Distrito Federal. Twelve hours after infection, cells were collected, total RNA from infected and uninfected cells was extracted and used to construct a subtractive cDNA library, using the technique of Representational Difference Analysis (RDA). The amplified cDNAs were cloned into pGEM-T Easy vector and sequenced. About 300 clones were sequenced and the sequences were analyzed in a database. Unfortunately, most of the sequences were ribosomal RNA. This result indicates that there were technical problems in building the library.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2010. O silenciamento gênico, ou RNA de interferência (RNAi), atua como um mecanismo de defesa contra infecções virais em organismos eucarióticos. Ao longo da evolução, os vírus adquiriram proteínas específicas com a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em diferentes pontos do processo. Como por exemplo, as proteínas AC2 de begomovírus, NS1 do vírus da gripe (Influenza A) e NSs de um tospovírus (Tomato spotted wilt virus - TSWV). Neste estudo, pretendeu-se induzir mecanismos de supressão de silenciamento gênico através da expressão heteróloga de AC2, NS1 e NSs por baculovírus AcMNPV – Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, a fim de analisar o efeito na replicação viral em diferentes células de inseto. Assim, no primeiro capítulo, foi feita uma revisão sobre o silenciamento gênico, a ação de proteínas virais supressoras de RNAi e o uso potencial de baculovírus recombinantes como agentes bioinseticidas melhorados. O segundo capítulo descreve a clonagem dos genes AC2, NS1 e NSs, a construção dos baculovírus recombinantes (vAcAC2, vAcNS1 e vAcNSs) e os ensaios preliminares de infecção em célula e em larvas de inseto. Nesses ensaios, o vAcNSs (contendo o gene NSs) foi o recombinante com maior influência na replicação do baculovírus selvagem AcMNPV. Por sua vez, o terceiro capítulo relata a ação da proteína supressora de silenciamento NSs de TSWV, expressa pelo baculovírus vAcNSs, em três linhagens hospedeiras: uma permissiva, derivada de Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4); outra semipermissiva, derivada de Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286); e, uma linhagem não-permissiva, derivada de Bombyx mori (BM-5). Os resultados mostraram que vAcNSs, em células semipermissivas, obteve maior eficiência na replicação quando comparado ao selvagem, pois produziu mais vírus extracelulares; em uma linhagem celular não-permissiva, causou efeito citopático, enquanto a infecção com o tipo selvagem AcMNPV não provocou nenhuma alteração morfológica; aumentou a produção de poliedros do baculovírus tipo selvagem em todas as linhagens de células testadas; aumentou fortemente a expressão da proteína fluorescente verde (EGFP) nas células semipermissivas e em hemócitos de A. gemmatalis quando co-infectado com um AcMNPV recombinante contendo o gene egfp. A análise de microscopia confocal revelou que a NSs acumulou em abundância no citoplasma de células permissivas e semipermissivas. Em contraste, a NSs foi detectada no núcleo da célula não-permissiva. A ausência de moléculas curtas de RNA (siRNA) de transcritos de egfp em linhagens semipermissivas e permissivas indica atividade de supressão do silenciamento gênico. Por outro lado, vAcNSs não suprimiu o RNAi na linhagem celular nãopermissiva. Por fim, o quarto capítulo investiga a ação bioinseticida do baculovírus vAcNSs em larvas de Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis - um hospedeiro permissivo e outro semi-permissivo, respectivamente. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a DL50 do vAcNSs para S. frugiperda e A. gemmatalis, quando comparada à DL50 observada para o tipo selvagem AcMNPV. Entretanto, o TL50 foi significativamente diferente, com valores menores para vAcNSs em S. frugiperda [5,62 dias com 1 p.f.u. e 4,82 dias com 105 p.f.u.] e em A. gemmatalis [7,46 dias com 1 p.f.u. e 3,2 dias com 105 p.f.u.] quando em comparação com o TL50 do AcMNPV em S. frugiperda [8,5 dias com 1 p.f.u. e 7,52 dias com 105 p.f.u.] e em A. gemmatalis [20,11 dias com 1 p.f.u. e 7,34 dias com 105 p.f.u.]. Estes resultados corroboram os dados observados in vitro, indicando que a proteína NSs de TSWV aumenta a replicação do baculovírus e pode contribuir para gerar bioinseticidas mais eficientes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT Gene silencing, or RNA interference (RNAi), works as a eukaryotic defense mechanism against viral infections. During evolutionary time viruses acquired specific proteins, which are able to halt the silencing process in different steps of its biochemical pathway e.g. the AC2 protein from Begomovirus, the NS1 protein from influenza (Influenza A) and the NSs protein from Tomato spotted wilt virus (TSWV). In this study we sought generation and evaluation of the gene-silencing suppression effect of three different genes, AC2 from begomovirus, NS1 from Influenza A and NSs from TSWV, via heterologous expression by recombinant Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV, genus Alphabaculovirus, family Baculoviridae) in different insect cell lines. In the first chapter, a review concerning gene silencing, suppression of gene silencing by viral proteins and the potential use of recombinant baculovirus as bio-insecticidal agents suitable for biological control is presented. The second chapter describes the cloning strategies designed for the construction of recombinant baculoviruses carrying the AC2, NS1 and NSs genes (vAcAC2, vAcNS1 and vAcNSs, respectively) as well as the results of preliminary insect cell infection assays. In these preliminary assays, vAcNSs had more influence on wild type AcMNPV replication than vAcAC2 and vAcNS1. The third chapter shows the effect of the protein NSs from TSWV on virus replication in different host insect cell lines: one permissive, Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4); other semi-permissive, Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286); and a non-permissive cell line, Bombyx mori (BM-5). Results showed that infection of the semi-permissive cell line by vAcNSs was more efficient than infection by wild type AcMNPV, since production of budded virus was higher. In the non-permissive cell line, vAcNSs was able to produce cytopathic effects whereas no morphological alteration was found when wild type AcMNPV was inoculated. When vAcNSs and wild type AcMNPV were co-inoculated, production of polyhedra was enhanced despite the insect cell line used. Co-infection of vAcNSs and a recombinant AcMNPV carrying the egfp gene was also evaluated. In the semi-permissive cell line and in A. gemmatalis hemocytes (permissive cell line) co-infection greatly increased enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression. Northern blotting assays showed absence of small interfering RNA (siRNA) molecules associated to egfp transcripts in the permissive and semi-permissive cell lines, which indicates suppression of gene silencing activity by the NSs protein. On the other hand, vAcNSs was not able to suppress the siRNA production in the non-permissive cell line. Confocal microscopy analysis showed that the NSs protein accumulated abundantly in the cytoplasm of permissive and semipermissive infected cells. In contrast, high amounts of NSs were detected in the nuclei of nonpermissive cells. Finally, chapter four presents the study of the bio-insecticidal activity of vAcNSs on Spodoptera frugiperda and Anticarsia gemmatalis larvae, a permissive and semipermissive host, respectively. The vAcNSs LD50 for S. frugiperda and A. gemmatalis was not statistically different from wild-type AcMNPV. However, the LT50 values were significantly smaller for vAcNSs in S. frugiperda [5.62 days with 1 p.f.u. and 4.82 days with 105 p.f.u.] and A. gemmatalis [7.46 days with 1 p.f.u. and 3.20 days with 105 p.f.u.) when compared to the LT50 for AcMNPV in S. frugiperda [8.5 days with 1 p.f.u. and 7.52 days with 105 p.f.u.] and A. gemmatalis [20.11 days with 1 p.f.u. and 7.34 days with 105 p.f.u.]. These in vivo results are in accordance with the data observed in vitro indicating that the protein NSs from TSWV could efficiently improve baculovirus replication and be used to generate more effective bioinsecticides.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. Os baculovírus compreendem o maior grupo de vírus de insetos estudados no mundo, principalmente pela eficiência em matar pragas da agricultura. Neste trabalho, três baculovírus recombinantes contendo os genes ScathL (Catepsina L) de Sarcophaga peregrina (vSynScathL), Kerat (Queratinase) do fungo Aspergillus fumigatus (vSynKerat) e Quit (Quitinase) do fungo Metarhizium anisopliae (vSynQuit) foram construídos e suas propriedades bioinseticidas analisadas em larvas de Spodoptera frugiperda. Bioensaios em larvas neonatas e de 3º ínstar de S. frugiperda infectadas com os baculovírus vSynScathL, vSynKerat e vSynQuit mostraram uma diminuição no tempo necessário para matar os insetos infectados quando comparado ao vírus selvagem. O vSynScathL apresentou uma TL50 e TD de 47 horas e 2,62 dias, respectivamente, enquanto o AcMNPV, uma TL50 de 136 horas e TD de 5,37 dias, respectivamente para larvas de S. frugiperda de 3º ínstar. Isso representa uma diminuição significativa de 65,5% para TL50 e 50,09% para TD, no tempo necessário para o vírus matar os insetos infectados quando comparado ao vírus selvagem. A TL50 e TD para o vírus vSynKerat foi de 91 horas e 3,70 dias, respectivamente, com uma redução de 32,8% para TL50 e 30,21% para TD, no tempo necessário para o vírus matar os insetos infectados quando comparado ao vírus AcMNPV. Já, o vírus recombinante vSynQuit apresentou uma TL50 de 110,67 horas, o que foi 23,6% menor do que o vírus selvagem (TL50 de 144,97). Já em larvas neonatas de S. frugiperda o vSynScathL mostrou uma TL50 de 77 horas comparado ao AcMNPV de 104 horas quando inoculado com 102 corpos de oclusão/nL, já o TD foi de 3,46 dias para o vírus recombinante e 4,16 dias para o AcMNPV. Isso representa uma redução de 26% na TL50 e 16,82% para TD no tempo necessário para matar os insetos infectados quando comparado ao vírus selvagem AcMNPV. A TL50 do vírus vSynKerat foi de 54 horas, com uma redução de xx 48% comparado ao vírus AcMNPV e o TD de 3,87 dias, reduzindo 6,97% no tempo necessário para matar os insetos; já a TL50 do vírus vSynQuit foi de 86 horas, com uma redução de 45,2% comparado ao vírus selvagem e o TD de 3,75 dias comparado com o vírus selvagem de 4,43 dias, representando uma redução de 15,34% no tempo necessário para matar os insetos. Também mostramos que os vírus vSynScathL e vSynKerat foram capazes de aumentar a atividade de fenoloxidase na hemolinfa de larvas de S. frugiperda em relação ao vírus selvagem e à larva não infectada. A expressão de proteases em larvas infectadas resulta na destruição dos tecidos internos em estágios tardios da infecção, podendo ser uma das razões para o aumento da velocidade para matar as larvas de S. frugiperda, como observado na microscopia eletrônica de varredura para os vírus vSynScathL e vSynKerat em relação ao vírus selvagem e à larva não infectada. O ensaio enzimático com quitina regenerada mostrou também uma diferença quitinolítica significativa em relação aos corpos de oclusão do vírus vSynQuit em comparação ao vírus selvagem. A transcrição de genes celulares em hemócitos derivados de larvas de Anticarsia gemmatalis infectados (12 h p.i.) pelos baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) e/ou Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) também foram analisados neste trabalho pela técnica análise de diferença representacional (RDA). Os trancritos mais abundantes encontrados foram para proteases celulares, que estão provavelmente envolvidas na resposta do inseto à infecção viral. Outros genes, como por exemplo, hsp70 e hsc70, proteínas ribossomais, aminopeptidase, beta 1,3 glicanase, proteína induzida pelo hormônio juvenil, lipase também foram detectados. Todos esses transcritos podem de alguma maneira ter um papel na defesa celular e/ou estabelecimento da infecção viral. Para confirmação dos dados obtidos pela RDA, a transcrição do gene hsc70 foi analisada por PCR em tempo real e confirmou sua expressão diferencial. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT Baculovirus comprise the largest group of insect viruses most studied worldwide, mainly because they efficiently kill agricutural insect pests. In this study, tree recombinant baculoviruses containing the ScathL gene (Cathepsin L) from Sarcophaga peregrina (vSynScathL), the Kerat gene (Keratinase) from the fungus Aspergillus fumigatus (vSynKerat) and Quit gene (Chitinase) from the fungus Metarhizium anisopliae (vSynQuit) were constructed and their insecticidal properties analysed against Spodoptera frugiperda larvae. Bioassays of third-instar and neonate S. frugiperda larvae with vSynScathL,vSynKerat and vSynQuit showed a decrease in the time needed to kill the infected insects when compared to the wild type virus. The vSynScathL showed LT50 and TD of 47 hours and 2.62 days respectively, while AcMNPV, a LT50 of 136 hours and TD of 5.37 days, respectively for third-instar S. frugiperda.larvae. This represents a significant decrease (from 65.5% for LT50 and 50.09% for TD) in the time required to kill the virus infected insects compared to wild virus. The LT50 and TD for vSynKerat was 91 hours and 3.70 days, respectively, showing also a reduction (32.8% for LT50 and 30.21% for TD), in the time required to kill the virus infected insects compared to AcMNPV. Also, the vSynQuit in another bioassay, showed a LT50 of 110.67 hours, which was 23.6% lower than the wild type virus (LT50 of 144.97 hours). Using neonate larvae of S.frugiperda, the vSynScathL showed a LT50 77 hours compared to 104 hours of AcMNPV when inoculated with 102 occlusion bodies/nL, since the TD was 3.46 days for the recombinant virus and 4.16 days for AcMNPV. This represents a 26% reduction in LT50 and 16.82% for TD compared to wild type virus AcMNPV. The LT50 of the virus vSynKerat was 54 hours with a 48% reduction compared to AcMNPV and in the TD of 3.87 days, 6.97%; with vSynQuit the LT50 was 86 hours, with a reduction of 45.2% compared to the wild virus and TD of 3.75 days compared with 4.43 days for wild type virus, a reduction of 15.34%. We have also shown that vSynScathL and vSynKerat were able to increase phenoloxidase activity in the hemolymph of S. frugiperda larvae compared with the wild type virus and with larvae not infected. The expression of proteases in infected larvae resulted in destruction of internal tissues late in infection, which could be the reason for the increased viral speed of kill, as observed in scanning electron microscopy for viruses vSynScathL and vSynKerat compared to the wild type virus and uninfected larvae. The enzyme assay with regenerated chitin also showed a significant chitinolytic difference with occlusion bodies of the vSynQuit compared to wild type virus . The transcription of cellular genes in hemocytes derived from infected larvae of Anticarsia gemmatalis (12 h p.i.) by Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) and/or Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) were also analyzed in this work by the representational difference analysis (RDA). Transcrits more abundants were cellular proteases, which are probably involved in insect response to viral infection. Other genes, such as hsc70 and hsp70, ribosomal proteins, aminopeptidase, beta 1.3 glucanase, protein induced by juvenile hormone, lipase were also detected. All of these transcripts can somehow play a role in cellular defense and/or establishment of viral infection. To confirm the data obtained by RDA, the hsc70 gene transcription was analyzed by real time PCR and confirmed their differential expression.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. O vírus causador da febre amarela (YFV) é um membro da família Flaviviridae e importante arbovírus patogênico ao homem. O diagnóstico da febre amarela é importante tanto para medidas de saúde pública como também para o tratamento adequado dos pacientes, já que os sintomas iniciais são típicos de outras doenças virais infecciosas. A glicoproteína do envelope (E) desse vírus é a maior determinante da imunogenicidade viral e da resposta imunológica do hospedeiro. Neste trabalho, a proteína do envelope do vírus da febre amarela foi expressa fusionada com a proteína poliedrina (POLH) dos corpos de oclusão do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em células de inseto pela infecção com um baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinante. Primeiramente, foi construído um vetor baculoviral modificado para expressão de proteínas heterólogas fusionadas à POLH, o pFastAgPol. O fragmento de DNA contendo o gene da poliedrina (polh) do AgMNPV foi amplificado e, em seguida, transferido para o plasmídeo comercial pFASTBac1¿ (Invitrogen). Utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), o AcMNPV recombinante contendo o gene polh de AgMNPV foi construído (vAcPolAg). Células de inseto foram infectadas pelo vAcPolAg, e a expressão da proteína recombinante analisada por microscopia de luz, SDS-PAGE e Western blot. A proteína foi detectada por Western-blot, mas não houve a formação de corpos de oclusão. Um fragmento de DNA contendo o gene do envelope do YFV foi clonado no vetor de transferência pFastAgPol, em fase com o gene polh, para ser expresso como uma proteína de fusão e inserido no genoma do AcMNPV. Células de inseto também foram infectadas com o AcMNPV recombinante (vAcPolAgEnv) e a expressão da proteína recombinante foi analisada por SDS-PAGE e Western blot, que detectou um polipeptídeo de aproximadamente 88 kDa, correspondente à fusão da proteína E do vírus amarílico com a POLH de AgMNPV. Entretanto, também não ocorreu a formação de corpos de oclusão. As células infectadas com os dois recombinantes também foram analisadas por microscopia de luz, de transmissão e pelo microscópio confocal. A não formação de corpos de oclusão pode ter sido causada, no caso do vAcPolAg, pela substituição do sítio de terminação do gene polh por um sítio de clonagem para a fusão do gene E, o que resultou na introdução de 41 amino ácidos no C-terminal da POLH. No caso do vírus contendo a proteína de fusão, POLHENV, a própria fusão pode ter resultado na formação de uma proteína incapaz de formar corpos de oclusão pelas mudanças conformacionais. A construção dos vírus recombinantes, vAcPolAg e vAcPolAgEnv, e a expressão das proteínas fusionadas foram bem sucedidas demostrando o potencial do sistema baculoviral para o desenvolvimento de técnicas alternativas de diagnóstico e produção de vacinas utilizando partes virais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT The yellow fever virus (YFV), a member of the family Flaviviridae, is an important arbovirus pathogenic to humans. The yellow fever diagnosis its important not only to public health measures but also to patients proper treatment, once the initial symptoms are similar to others viral infectious diseases. The envelope glycoprotein (E) of this virus is the major imunogenicity and host immune response determinant. In this work, the yellow fever virus envelope protein was expresse fused to the protein polyhedrin (POLH) of the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) occluded bodies in insect cells by the infection of a baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinant. First, was constructed a modified baculoviral vector (pFastAgPol) for heterologous protein expression fused to POLH. The DNA fragment containing the AgMNPV polyhedrin gene (polh) was amplified and then transferred to a commercial plasmid pFASTBac1™ (Invitrogen).Using the Bac-to-Bac system (Invitrogen), the AcMNPV recombinant containg the AgMNPV polh gene was constructed (vAcPolAg). Insect cells were infected with vAcPolAg and the protein expressed was analyzed by light microscopy, SDS-PAGE and Western blot. The protein was detected by Western-blot but was not capable of forming occlued bodies. A DNA fragment containing the envelope gene of YFV was cloned into the transfer vector pFastAgPol, in frame with the polh gene, in order to be expressed as a protein fusion, and inserted into the AcMNPV genome. Insect cells were also infected with the AcMNPV recombinant (vAcPolAgEnv) and recombinant protein expression was analyzed by SDS-PAGE and Western-blot which detected a polypeptide around 88kDa, corresponding to the fusion of the yellow fever virus protein E with the AgMNPV POLH. However, threre were no formation of occlusion bodies either. Infected cells with the two recombinants also were analyzed by light, electron and confocal microscopy. The lack of occlusion body formation, in the case of vAcPolAg, could have been due to the substitution of the stop codon of the polh gene by a restriction site for the fusion with the E gene which resulted in the introduction of 41 amino acids to the C-terminal end of POLH. In the case of virus containing the fusion protein POLHF, the fusion itself could be responsible for the formation of a protein uncapable of forming occlusion bodies due to conformational changes. The construction of recombinant viruses, vAcPolAg vAcPolAgEnv, and expression of fused proteins were successful, demonstrating the potential of the baculoviral system for the development of alternative techniques of diagnosis and production of viral vaccines using parts of it.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, 2010. Atualmente, a preocupação dos consumidores com os efeitos adversos de aditivos sintéticos nos alimentos tem estimulado o consumo de alimentos naturais e orgânicos. A adição de compostos antimicrobianos no processamento de alimentos tem se tornado uma poderosa ferramente. As bacteriocinas são uma atrativa opção para a resolução de parte desse problema. Esses peptideos são, geralmente, termoestaveis e capazes de inibir vários organismos patogenicos que podem contaminar alimentos processados. O objetivo do trabalho foi identificar uma estirpe de Bacillus thuringiensis que produza agentes antimicrobianos. Foi detectado um composto antimicrobiano produzido por B. thuringiensis subsp. kurstaki S1905, que inicia a atividade antimicrobiana no fim da fase exponencial e apresenta seu apice no meio da fase estacionaria. Esse composto mostrou ser termotolerante, resistente a variacoes de pH, liofilizacao e alguns solventes orgânicos. A atividade antimicrobiana foi totalmente perdida quando tratada com proteinase K, revelando sua natureza proteica. Um fragmento de DNA contendo o gene da bacteriocina thuricina S1905 foi clonado e sequenciado, revelando que a sequência codifica 3 peptideos idênticos de 40 aminoácidos com alta identidade com outras bacteriocinas de B. thuringiensis e B. cereus. Análises in silico desse peptideo mostraram que ele possui massa molecular de 3147.6 Da, pI de 3.67 e uma grande região com possível motivo transmembranico. Análise de superfície eletrostática mostrou que essa e uma bacteriocina anionica e seu modo de ação ainda é desconhecido. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT Consurmers concern about the unfavourable effects of sintetic additives on food is making the consumption of organic and natural food increase. The addition of antimicrobial compounds in food process has become a powerful tool. Bacteriocins are an attractive option for the resolution of this problem. These peptides are, generally, thermostable and can inhibit pathogens that can contaminate processed foods. The aim of this work was to identifie a Bacillus thuringiensis strain that produces antimicrobial compounds. The production of an antimicrobial compound was detected for the strain S1905 of B. thuringiensis subsp. kurstaki, which starts the activity in the end of the exponencial phase and reachs its maximum in the middle of the stationary phase. This compound showed to be thermotolerant, resistant to pH variations, liophilization and organic solvents. The inhibitory activity was totally lost after proteinase K treatment, thereby revealing its proteinaceous nature. A DNA fragment containing the gene of the bacteriocin thuricin S1905 was cloned and sequenced, revealing that this sequence encodes three identical peptides of 40 amino acids each with high identity to anothers bacteriocins of B. thuringiensis and B. cereus. In silico analysis of this peptide showed that it has a molecular weight of 3147.6 Da, pI of 3.67 and a great hydrophobic region with a possible transmembranic motif. The electrostatic surface’s analysis showed that this peptide is an anionic bacteriocin and its mode of action is still unknow.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Societal concerns about environmental sustainability has lead to the development of ecologically-friendly alternatives to chemical insecticides for crop protection. One such alternative is biological pest control. In particular, baculoviruses are well suited as insect biopesticides due to their narrow host specificity and relative ease of propagation. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent employed for the soybean pest, Anticarsia gemmatalis. This baculovirus biopesticide is currently produced using caterpillars, but increasing market demand for the product has encouraged the development of an in vitro manufacturing process, which can be scaled up to much higher virus productivities. In this study, three wild-type AgMNPV isolates (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 and AgMNPV-MP5) and a recombinant form (vAgEGT-LacZ) were characterised in terms of occlusion body (OB) production and infection kinetics, to enable future optimisation of the in vitro production process. These viruses were propagated using a Spodoptera frugiperda (IPLB-SF21) insect cell line grown in shaker-flask batch cultures. Among the virus isolates tested, AgMNPV-MP5 was found to be the best producer, yielding (5.3±0.85)x108 OB/mL after 8 days post infection. The characterisation of vAgEGT-LacZ propagation in suspension cell cultures has not been previously reported in the literature; hence it became the main focus for this thesis. In particular, it was carried out a study on the effect of the multiplicity of infection (MOI) on OB production. Five successive batches were performed getting a final production (8.9±1.42)x1014 occlusion bodies, considering that production is related for a bioreactor with final volume of 10m3. A low MOI associated with a fed-batch process for vAgEGT-LacZ production was found to support a 3-fold higher OB yield when compared to the default batch process (1.8x107 and 5.3x107 OB/mL, respectively). This yield is competitive with regards to the production process. A preocupação da sociedade com o meio ambiente tem levado a buscar alternativas de substituição dos inseticidas químicos por outros produtos menos agressivos ao homem e ao ambiente. Assim, a utilização de controle biológico contra pragas é altamente desejável, pois reduz os riscos ambientais e públicos da utilização de produtos químicos convencionais. Em particular, os vírus do tipo baculovírus são uma grande alternativa devido à especificidade oferecida aos seus hospedeiros e a sua forma de propagação. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no desenvolvimento de processos com base na produção in vitro de baculovírus. Deste modo, poderá aumentar a oferta de vírus, suprindo a necessidade do mercado deste bioinseticida para o controle de A. gemmatalis. Neste trabalho, estratégias de produção in vitro do baculovírus selvagem AgMNPV e do seu recombinante vAgEGTΔ-LacZ, como influência do isolado, da cinética e do modo de operação, foram analisadas como alternativa para futura ampliação de escala na produção deste bioinseticida viral. A produção em batelada de três isolados selvagens do baculovírus AgMNPV (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5) utilizando o cultivo em shaker, foi realizada com a finalidade de selecionar o melhor produtor de corpos de oclusão a partir das infecções em células de inseto Spodoptera frugiperda, linhagem IPLB-SF21 para avaliação comparativa com recombinante vAgEGTΔ-LacZ. A seleção identificou o isolado AgMNPVMP5 como melhor produtor de corpos de oclusão de (5,30±0,85) x108 OB/mL em 8 dias de infecção. A produção in vitro do vAgEGTΔ-LacZ foi foco principal deste trabalho, pois não há, na literatura, a produção deste recombinante em sistemas de cultivo em suspensão. Foi realizado estudo da multiplicidade de infecção para identificar a quantidade de inóculo viral para o cultivo. A partir daí, foram realizadas cinco bateladas sucessivas obtendo-se (8,9±1,42)x1014 corpos de oclusão para um volume final de 10m³ de suspensão de células infectadas. O aumento da produção de corpos de oclusão obtidos a partir do vAgEGTΔ-LacZ foi analisado utilizando a estratégia de cultivo em batelada alimentada utilizando baixa multiplicidade de infecção. Esta estratégia permitiu aumento de três vezes na produção de corpos de oclusão quando comparada à produção em cultivos em batelada (5,3x107 e 1,8x107 OB/mL, respectivamente). E ainda, o baculovírus recombinante vAgEGTΔ-LacZ mostrou-se competitivo em relação ao baculovírus selvagem AgMNPV-MP5

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. Toxinas Cry de Bacillus thuringiensis (Bt) são proteínas inseticidas utilizadas para controle de insetos. Elas agem por ingestão e são ativadas por proteases e interagem com receptores específicos localizados na superfície da célula hospedeira, resultando na lise de células do intestino médio. Este trabalho está dividido em quatro capítulos. No primeiro, foi feita uma revisão sobre Bacillus, ecologia e modo de ação, e insetos-praga do algodão. O segundo capítulo descreve a seleção e o estudo do conteúdo de genes cry de estirpes de B. thuringiensis com atividade para Anthonomus grandis. O terceiro capítulo descreve a clonagem, sequenciamento e expressão da toxina Cry1Ba da estirpe S601 de B thuringiensis, que é tóxica para A. grandis. A ligação da toxina Cry1Ba6 a proteínas localizadas na borda escovada de células do intestino médio de A. grandis foi analisada e descobriu-se que a proteína Cry1Ba6 se liga a duas proteínas (62 e 65 kDa) com atividade de fosfatase alcalina (ALP). Este trabalho é o primeiro relato da localização de receptores de toxina Cry em células do intestino médio de A. grandis. Finalmente, o capítulo quatro mostra como outras toxinas (Cry1Ia e Cry10A) expressas em Bt, com atividade já descrita para A. grandis interagem com BBMVs de A. grandis e S. frugiperda. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT Cry toxins from Bacillus thuringiensis (Bt) are isecticidal proteins used for insect control. They actin by ingetion and are activated by host proteases and interact with specific receptors located on the host cell surface, resulting in midgut epithelial cells lysis. This work is divided in four chapters. In the first, a review was done o Bacillus, ecology and action mode, and cotton insect-pests. The second chapter describes the selection and study of the content of cry genes of B. thuringiensis strains with activity against nthonomus. grandis. The third chapter describes cloning, sequencing and expression of a cry1Ba toxin gene from the B. thuringiensis S601 strain which is toxic to A. grandis. The binding of Cry1Ba6 toxin to proteins located on the midgut brush border membrane of A. grandis was analyzed and it was found that Cry1Ba6 binds to two proteins (62 and 65 kDa) that showed alkaline phosphatase (ALP) activity. This work is the first report that shows the localization of Cry toxin receptors on the midgut cells of A. grandis. Finally, the chapter four shows how other toxins (Cry1Ia and Cry10A) expressed in Bt, which previously had activity described to A. grandis, interact with A. grandis and S. frugiperda BBMVs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. Nas últimas décadas, a agricultura mundial vem crescendo exponencialmente. Culturas como as da soja recebem destaque por influenciar na geração de divisas e empregos em todo mundo. Essa cultura está vulnerável a diversas pragas, dentre estas, destaca-se a lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis Hübner, 1818 (Lepidoptera: Noctuidae), que é a principal desfolhadora da soja no Brasil. Além de provocar danos econômicos no setor agrícola, os insetos podem causar problemas relacionados à saúde pública. O principal exemplo é o Aedes aegypti, que é o vetor de doenças como a dengue e a febre amarela. Uma alternativa para o controle desses insetos é a utilização de agentes de controle biológico, como Bacillus thuringiensis (Bt). Essa bactéria possui a capacidade de produzir inclusões protéicas (proteínas Cry e Cyt) tóxicas para insetos e são largamente utilizadas no controle de pragas na agricultura e no controle de vetores de doenças humanas. Desta forma, o estudo do modo de ação e toxicidade dessas proteínas é importante para um melhor entendimento dos mecanismos de interação entre o patógeno e as pragas. Este trabalho teve como objetivo determinar a toxicidade de quatro proteínas Cry de B. thuringiensis para populações susceptíveis e resistentes de A. gemmatalis, e a construção de um baculovírus e de uma estirpe de Bt recombinantes contendo o gene cyt1Aa. Para o primeiro trabalho, as proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa foram expressas individualmente por estirpes de Bt. As proteínas foram purificadas, solubilizadas, ativadas com tripsina e biotiniladas para a realização de bioensaios, ensaios de ligação e ensaios de competição heteróloga. O ensaio de ligação mostrou que ocorreu interação entre todas as proteínas e os receptores das duas populações de lagartas. O ensaio de competição heteróloga e os bioensaios demonstraram haver competição das proteínas pelos mesmos sítios de ligação para a população resistente de A. gemmatalis e que essa população tornou-se resistente, provavelmente, devido a alterações nos seus receptores. Além disso, os resultados obtidos nos bioensaios demonstraram que, apesar de todas as toxinas testadas apresentarem toxicidade para lagartas de segundo instar de A. gemmatalis, as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac possuem toxicidade elevada quando comparadas com as outras proteínas testadas. No segundo trabalho, o gene cyt1Aa da estirpe S1806 de B. thuringiensis subsp. israelensis, foi amplificado por PCR, clonado em um vetor de clonagem e seqüenciado. A análise da seqüência do gene mostrou 100% de identidade com o gene cyt1Aa depositado no GenBank. O gene foi removido do vetor de clonagem, introduzido em um vetor de transferência (pFastBacTM1) e transferido para o genoma do baculovírus AcMNPV, utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), originando o baculovírus recombinante vFastCyt1Aa. Entretanto, a expressão da proteína recombinante não foi detectada em células de inseto infectadas com o vFastCyt1Aa. Além disso, o gene cyt1Aa foi inserido em um vetor de expressão para células de Bt (pSVP27A) e o plasmídeo recombinante (pSVPcyt1Aa) foi introduzido em uma estirpe de Bt acristalífera. Uma proteína de 27 kDa correspondente ao tamanho esperado para a proteína recombinante Cyt1Aa foi detectada por SDS-PAGE e Western-Blot de extratos de Bt recombinante. Entretanto, o extrato do Bt recombinante mostrou baixa toxicidade para mosquitos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT In the last decades, the world agriculture has grown exponentially. Crops like soybean have an important role in increasing foreign exchange and jobs all over the world. However, this crop is vulnerable to a diversity of insect pests that cause great economic losses. Among these insect pests, the soybean caterpillar, Anticarsia gemmatalis Hubner, 1918 (Lepidoptera: Noctuidae) is the main defoliator of soybean in Brazil. Besides the economic damage in agriculture, insects can also cause public health problems. Aedes aegypti, the vector of the dengue and yellow fever diseases is the main example. One alternative to control this insect is the use of biological control agents such as Bacillus thuringiensis (Bt). This bacterium produces protein inclusions (Cry and Cyt proteins) that are toxic to insects and are widelly used for the control of insect pests in agriculture and for the control of human disease vectors. Therefore, the study of the toxins mode of action and toxicity has a great importance for understanding the mechanisms of interaction between insect pests and their patogens. The aim of this study was the toxicity determination of four Cry proteins of B. thuringiensis to resistant and susceptible A. gemmatalis populations, and the construction of recombinant baculovirus and Bt containing the cyt1Aa gene. For the first work, the proteins Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa were expressed individually by Bt strains. The proteins were purified, solubilized, activated with trypsin and biotinilated for bioassays, binding assays and heterologous competition assays. The binding assay showed binding affinities between all the proteins and the receptors in both populations of caterpillars. The heterologous competition assay and the bioassays showed competition between proteins for the same binding site in the resistant population of A. gemmatalis and this population became resistant probably because of modifications in their receptors. Besides that, the results of the bioassays demonstrate that Cry1Ab and Cry1Ac have higher toxicity to second instar larvae of A. gemmatalis when compared to the others toxins tested. In the second work, the cyt1Aa gene from the strain S1806 of B. thuringiensis subsp. israelensis was amplified by PCR, cloned in a vector and sequenced. The sequence analyses showed that the cloned gene from strain S1806 has 100% identity with a cyt1Aa gene deposited in GenBank. The gene was removed from the cloning vector, introduced into a transfer vector (pFastBacTM1) and transferred to the baculovirus genome AcMNPV, using the Bac-to-Bac system (Invitrogen), originating the recombinant baculovírus vFastCyt1Aa. However, no recombinant protein expression was detected in insect cells infected with vFastCyt1Aa. Furthermore, the cyt1Aa gene was also inserted in an expression vector for Bt cells (pSVP27A) and the recombinant plasmid (pSVPcyt1Aa) introduced into an acrystalliferous strain of Bt. A 27 kDa protein of the expected size for the recombinant Cyt1Aa was detected by SDS-PAGE and Western-Blot in recombinant Bt extracts. However, the recombinant Bt extracts showed low toxicity towards mosquitoes.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva, entomopatogênica, que se caracteriza pela presença de inclusões cristalinas denominadas de #-endotoxinas ou proteínas Cry. Essas proteínas podem ser altamente tóxicas para insetos suscetíveis, não apresentando atividade para outros organismos. Alguns sistemas de expressão vêm sendo utilizados para expressar proteínas Cry com a finalidade de aumentar a sua toxicidade para diversas ordens de insetos. Os baculovírus são vírus de insetos que têm sido muito utilizados como vetores de expressão de genes heterólogos em células de insetos, devido principalmente à presença de promotores fortes que permitem altos níveis da proteína heteróloga na fase tardia da infecção. Neste trabalho, foram clonados genes cry (cry2Aa e cry11A) isolados das estirpes de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki S447 e subsp. israelensis S1806, respectivamente, no genoma do baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), por transposição sítio-específica, gerando os vírus vAcCry2Aa e vAcCry11A. A avaliação da expressão bem como a presença do transcrito foi realizada por RT-PCR. As proteínas heterólogas Cry2Aa e Cry11A foram analisadas em gel SDS-PAGE 12%, revelando a presença de bandas de aproximadamente 65 kDa e 70 kDa, respectivamente. A toxicidade das proteínas heterólogas foi testada para larvas de inseto das ordens Lepidoptera e Diptera. A proteína heteróloga Cry2Aa apresentou uma CL50 1,036 $g/mL para larvas de segundo instar de Anticarsia gemmatalis , enquanto Cry11A mostrou ser bastante tóxica para larvas de segundo instar de Aedes aegypti com CL50 de 53,3 ng/mL. A presença de cristais derivados da proteínas heteróloga Cry2Aa só foi evidenciada nos extratos de lagartas infectadas com os vírus recombinantes. A análise ultraestrutural da proteína heteróloga Cry2Aa purificada a partir dos extratos das larvas de terceiro instar infectadas com o vírus recombinante vAcCry2Aa mostrou a presença de grandes cristais na forma cubóide Neste trabalho foi possível avaliar que o baculovírus é um bom vetor de expressão de proteínas Cry. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram positive, entomopathogenic bacteria that produces crystalline inclusions called -endotoxins or Cry proteins. These proteins are highly toxic to susceptible insects, not showing activity against others organisms. Some expression systems have been used to express crystal proteins with the aim to increase their toxicity for several insect orders. Baculoviruses are insect viruses that have been widely used as expression vectors of heterologous proteins in insect cells, mainly due to the presence of strong promoters that allow high levels of expression of the heterologous protein during the late phase of virus infection. In this work, cry genes (cry2Aa and cry11A) from B. thuringiensis subsp. Kursaki S447 and subsp. israelensis S1806, respectively, were introduced into the genome of the baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), by site-specific transposition, generating the recombinant viruses vAcCry2Aa and vAcCry11A. Transcription of the heterologous genes were confirmed using mRNA from recombinant viruses infectedinsect cells (72 h p.i) by RT-PCR . The heterologous Total extracts from Spodoptera frugiperda infected with the recombinant viruses (vAcCry2Aa and vAcCry11A) were analyzed by SDS-PAGE, which detected the presence of polypeptides around 65 kDa and 70 kDa, respectively. Bioassays, using the heterologous proteins showed that Cry2Aa had toxicity to second instar Anticarsia gemmatalis larvae with a LC50 of 1.03 $g/mL and that Cry11A had toxicity to second instar Aedes aegypti larvae (Cry11A) with a LC50 of 53.3 ng/mL. Cuboid-shaped protein crystals (Cry2Aa) were observed only in vAcCry2Aa S. frugiperda infected-extracts by light and scanning electron microscopy. This work confirms the utility of the baculovirus expression system for the efficient expressionof Cry proteins.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. Baculovírus são vírus de DNA fita dupla, específicos de artrópodes, que têm sido utilizados, principalmente, como agentes de controle biológico de insetos-praga e como vetores de expressão de genes heterólogos. A utilização do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) no controle da lagarta da soja, A. gemmatalis, no Brasil, é o maior exemplo mundial de sucesso de um vírus utilizado como bioinseticida. Uma das características interessantes do genoma viral do AgMNPV está na ausência dos genes quitinase (v-chiA) e catepsina (v-cath), que por sua vez estão presentes na maioria dos genomas dos baculovírus pertencentes ao grupo I do gênero Nucleopolyhedrovirus (NPV). A ausência dos genes v-chiA e v-cath pode ser responsável pela ausência de liqüefação de larvas de A. gemmatalis mortas pela infecção do AgMNPV. Este trabalho teve como objetivo a construção de AgMNPV recombinantes com a introdução individual ou em conjunto dos genes v-chiA e v-cath, derivados dos vírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus (CfDefNPV) no genoma viral, para a observação dos efeitos causados pela infecção viral em larvas de A. gemmatalis, comparativamente ao vírus AgMNPV selvagem. O DNA plasmidial do vetor de transferência, contendo os dois genes derivados do vírus CfDefNPV, foi cotransfectado com o DNA de um vírus recombinate derivado do AgMNPV, o vírus vAgGalA2, em células A. gemmatalis (UFL-AG-286). O novo vírus recombinante construído (vAgp2100Cf.v-chiA/v-cath) foi isolado pelo método de diluição seriada, em placa de 96 poços. O vAgp2100Cf.v-chiA/v-cath foi capaz de promover a liqüefação do corpo das larvas de A. gemmatalis após a morte das mesmas. Porém, não houve diferenças significativas com relação à virulência, e conseqüentemente, o tempo de morte das larvas comparado com o AgMNPV selvagem. Os AgMNPV recombinantes possuindo apenas um dos genes (v-chiA ou v-cath) ainda não foram isolados e, desta forma, não foi possível analisar o efeito causado por esses genes separadamente, em larvas de A. gemmatalis. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT Baculoviruses are double-stranded DNA viruses, arthropod-specific that have been mainly used as biological-control agents of insect pests and as heterologous gene expression vectors. The use of the Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) in Brazil, for the control of the velvetbean caterpillar is the most successful example of a virus used as a biological pesticide. One of the interesting features of the AgMNPV genome is the absence of chitinase (v-chiA) e catepsin (v-cath) genes, which in turn are present in most of the genomes of baculoviruses belonging to group I of the Nucleopolyhedrovirus genus. The absence of v-chiA and v-cath genes may be responsible for the lack of liquefaction of A. gemmatalis larvae killed by AgMNPV. The aim of this work was the construction of recombinant AgMNPV with the introduction of each gene (v-chiA or v-cath) alone or both of them, derived from the baculoviruses Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus (CfDefNPV) into the AgMNPV genome and observation of the effects caused by the viral infection in A. gemmatalis larvae, comparared with the wild-type AgMNPV infection. A recombinant transfer vector DNA, containing both genes derived from CfDefNPV, was co-transfected with DNA from vAgGalA2 virus, derived from AgMNPV, in A. gemmatalis (UFL-AG-286) cells. The new recombinant AgMNPV virus construct (vAgp2100Cf.v-chiA/v-cath) was isolated using the serial dilution method in 96 well-plates. The vAgp2100Cf.v-chiA/vcath was able to promote liquefaction of infected A. gemmatalis larvae soon after death. However, we have not detected significant differences with regard to virulence, and consequently, the time of death, when compared with the wild-type AgMNPV. The AgMNPV recombinants, containing only one of the genes (v-chiA or v-cath) have not xx been isolated yet, and therefore, it was not possible to analyse the effects caused from this genes separately in A. gemmatalis larvae.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. Avanços nas técnicas de cultura de células têm possibilitado o isolamento e precisa caracterização de baculovírus mutantes. A maioria desses mutantes é derivada do vírus AcMNPV (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus), principalmente pela sua facilidade de propagação e estabilidade em cultura de células. Durante a rotina de purificação de um baculovírus recombinante, dois vírus mutantes derivados de AcMNPV, o vSynlitx1B12P (MutPolh) e o vSynlitx1G4 (MutApo) foram isolados (dados não publicados). A infecção pelo MutPolh não resultava na produção de poliedros e diferia da infecção tipo selvagem pela presença de massas protéicas dispersas no citoplasma. Para explicar esse fenótipo, o vírus MutPolh foi previamente investigado e análises moleculares revelaram uma mutação pontual no gene da poliedrina. Esse gene é altamente conservado entre os baculovírus e mudanças em sua seqüência nucleotídica podem levar à formação de poliedros mutantes, morfologicamente distintos do tipo-selvagem. O outro vírus mutante, o MutApo, mostrou induzir rápida e massiva morte nas células por ele infectadas. Esse mutante também foi investigado através de técnicas moleculares e foi encontrada uma inserção de DNA interrompendo um gene inibidor de apoptose (p35). Neste trabalho analisaram-se os efeitos citopatológicos desses dois mutantes em células de inseto das linhagens Sf-21 e Tn-5B. Estudos estruturais e ultraestruturais confirmaram os resultados das análises moleculares prévias feitas para esses mutantes. As observações ultra-estruturais feitas em células infectadas pelo MutPolh submetidas a imunomarcação mostraram que os agregados protéicos encontrados no citoplasma dessas células eram, de fato, acúmulo de poliedrina não cristalizada. Ainda, o mutante MutApo mostrou induzir eventos característicos da apoptose nas células dessas linhagens. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT Advances in cell culture techniques allowed the isolation and precise characterization of baculoviruses mutants. The majority of these mutants is derived from the virus AcMNPV, mainly due to its facility of propagation and stability in cell culture. During the purification routine of a recombinant baculovirus, two mutants derived from AcMNPV, vSynlitx1B12P (MutPolh) and vSynlitx1G4 (MutApo) were isolated (unpublished). The insect cell by the MutPolh did not result in polyhedra production and differed from wild-type infection by the presence of proteinaceous masses dispersed in the cytoplasm. To explain this phenotype, the virus MutPolh was previously investigated and molecular analysis revealed a point mutation in the polyhedrin gene. This gene is highly conserved among baculoviruses and changes in its nucleotide sequence may lead to mutant polyhedra, morphologically different from the wild-type. The other mutant virus, MutApo, was show to induce quick and massive cell death in infected cells. This mutant was also investigated and was found a DNA insertion interrupting an inhibitor of apoptosis gene (p35). In this work, the cytopathologic effects induced by these two mutants in Sf-21 and Tn-5B insect cell lines were analyzed. Structural and ultrastructural studies confirmed the findings of the molecular analysis previously done for these mutants. The observation of MutPolh-infected cells revealed that the proteinaceous aggregates found in the cytoplasm were, actually, accumulation of uncrystalized polyhedrin. Observations of cells infected by the MutApo mutant also confirmed previous information, showing that this mutant induces characteristic apoptosis events in these insect cell lines.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. Este trabalho objetivou construir um vetor baculoviral modificado capaz de expressar proteínas heterólogas fusionadas à poliedrina e à cauda de hexahistidina e utilizar esse vetor para expressão e purificação da proteína capsidial de vírus do complexo viral do alho. Via PCR, foi sintetizado o fragmento PH (gene da poliedrina fusionado a uma cauda de hexa-histidina). Entre a poliedrina e a cauda de histidina foi inserido um sítio de NcoI. Na primeira tentativa de obtenção do fragmento PH, em vez do gene da poliedrina, a reação de PCR amplificou uma parte do genoma de Escherichia coli. Na segunda tentativa de obtenção do fragmento PH, o gene da poliedrina foi amplificado, contudo foi verificado que havia um erro no “primer” 5’ utilizado, que gerou alteração da fase do fragmento PH. Somente na terceira tentativa (reação de PCR) o fragmento PH correto foi obtido. O fragmento PH foi clonado no vetor pFastBac1 (Invitrogen), gerando o vetor pFastPH. Um baculovírus recombinante vAcPH expressando a proteína PH foi construído via transposição sítio-específica utilizando o kit “Bac-to-Bac” (Invitrogen). Foi realizada análise da expressão de proteínas de células Tn5B infectadas com vAcPH (72 hpi). SDS-PAGE mostrou presença de uma proteína de peso molecular superior ao da poliedrina nativa e compatível com o esperado para a proteína PH. Western Blot mostrou que essa proteína é reconhecida tanto por anticorpo contra a poliedrina quanto por anticorpo contra a cauda de hexahistidina. Além da obtenção do fragmento PH correto, também foram sintetizados, via PCR, genes da capa protéica (de vírus presentes no complexo viral do alho:GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV) flanqueados por sítios de NcoI. Esses genes foram comprovados por análise do padrão de restrição. Futuramente, tais genes poderão ser clonados no pFastPH para gerar baculovírus recombinantes expressando uma proteína de fusão “poliedrina + proteína capsidial + cauda de hexa-histidina” que poderá ser utilizada para produção de anticorpos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT The present work goal was the production of a modified baculovirus vector capable of expressing an heterologous protein fused to the polyhedrin and to an hexahistidin tag. The PH fragment (polyhedrin gene with an NcoI site and a histidin tag at its 3’ end) was synthesized through PCR reaction. In the first attempt to obtain the PH fragment, instead of the polyhedrin gene, PCR reaction amplified a fragment of Escherichia coli genome. In the second attempt, the problem was the 5’ “primer”, which had an extra nucleotide and disrupted the PH fragment reading frame. In the third attempt, the correct PH fragment was obtained and cloned into pFastBac1 vector (Invitrogen), generating pFastPH. A recombinant baculovirus (vAcPH) expressing the PH protein was obtained through site-specific transposition (“Bac-to-Bac” kit, Invitrogen). SDS-PAGE showed the presence of a protein with molecular weight (MW) superior to the native polyhedrin MW (28,6 KDa). In Western Blot experiment, PH protein was recognized by antibody against polyhedrin and by antibody against hexahistidin tag, proving that the PH protein was being expressed. Also, this work attempted to use the modified baculovirus vector to express and purify the capsid protein of viruses present in the garlic virus complex (GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV). NcoI sites were added, through PCR, to both ends of these genes. In the future, these genes these genes may be cloned in pFastPH vector to generate baculovirus expressing these virus coat proteins fused to the PH gene. The purified fusion proteins may then be used in experiments to obtain antibodies against them.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. Os genes cry4Aa e cry4Ba, pertencentes a diferentes estirpes brasileiras de Bacillus thuringiensis, S1806 e S1989, respectivamente, foram amplificados por PCR e clonados em um vetor de clonagem. A análise do seqüenciamento do gene cry4Aa mostrou alta identidade com outras seqüências do gene já descritas e este foi clonado tanto no vetor de transferência pSynXIVVI+X3, como no pFastBac®1 para expressão e análise da toxicidade da proteína heteróloga a partir dos baculovírus construídos por recombinação homóloga, vSyncry4Aa, e por transposição sítio-específica, vBacCry4Aa. O gene cry4Ba foi introduzido no vetor pSynXIVVI+X3 dando origem, por recombinação homóloga, ao baculovírus recombinante vSyncry4Ba. Os vírus recombinantes, derivados de recombinação homóloga, foram isolados em placas de 96 poços, enquanto o vírus recombiante obtido por transposição foi isolado de colônias de células de Escherichia coli DH10BacTM crescidas em placas de Petri contendo antibióticos, X-Gal e IPTG. Células de inseto BTI-TN5B1-4 foram infectadas com os vírus recombinantes isoladamente e mRNA derivados dos extratos celulares (72 h.p.i.) analisados por RT-PCR, para confirmação da expressão e presença de transcritos específicos para os genes. Extratos de larvas de Spodoptera frugiperda, infectadas com os vírus recombinantes (120 h.p.i.) foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), mostrando a presença de bandas de aproximadamente 128 e 130 kDa correspondentes aos tamanhos das proteínas Cry4Aa e Cry4Ba, respectivamente. Possíveis cristais das proteínas recombinantes foram observados por microscopia de luz. Bioensaios com os extratos de insetos infectados mostraram-se tóxicos para larvas de segundo instar de Aedes aegypti. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT The cry4Aa and cry4Ba genes from Brazilian strains of Bacillus thuringiensis, S-1806 and S-1989, respectively, were amplified by PCR, cloned into a plasmid cloning vector and sequenced. Sequence analysis of the cry4Aa gene showed high identity to previous known cry genes and it was cloned into both pSynXIVVI+X3 and pFastBac®1 transfer vectors for expression and toxicity analysis of the heterologous proteins derived from the recombinant baculoviruses constructed by homologous recombination (vSynCry4Aa) and transposition (vBacCry4Aa). The cry4Ba gene was introduced into the transfer vector pSynXIVVI+X3/3 resulting in the construction of the recombinant virus vSynCry4Ba by homologous recombination. The recombinant viruses, derived from homologous recombination, were isolated by serial dilution in 96 well plates while the recombinant virus produced by transposition was isolated from Escherichi coli (DH10BacTM) colonies grown on Petri dishes containing antibiotics, X-Gal and IPTG. Insect cells BTI-TN5B1-4 were separetly infected with the recombinante viruses and mRNA from cell extracts (72 h.p.i.) analysed by RT-PCR, in order to confirm the presence of the genes specific transcripts. Recombinant viruses infected insect extracts (120 h p.i.) were analysed by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showing the presence of polypepitide bands of around 128 and 130 kDa, corresponding, respectively to the sizes of the proteins Cry4Aa and Cry4Ba. Putative crystals from the recombinant proteins were observed by light microscopy. Bioassays with virus-infected insect extracts were shown to be toxic to second instar Aedes aegypti larvae.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. A febre amarela é uma doença hemorrágica causada por um vírus pertencente à família Flavivirus que é transmitido aos humanos através de picada por mosquitos. O vírus possui RNA fita simples, sentido positivo, com genoma de 10.862 nucleotídeos e uma única fase aberta de leitura ou ORF (do inglês: "Open Reading Frame") de cerca de 10.233 nucleotídeos. A ORF codifica três proteínas estruturais (capsídeo, pré-M e envelope) e 7 não estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5), sendo que destas, a proteína do envelope é uma das mais estudadas devido ao seu alto potencial antigênico O isolamento de partes virais pode ser importante na utilização de antígenos para o desenvolvimento de novas vacinas e métodos diagnósticos. Na tentativa de isolar partes virais e expressá-las em separado são utilizados diferentes sistemas de expressão e dentre eles pode ser utilizado o sistema de expressão baseado em Baculovírus e células de inseto, que é um dos sistemas de expressão mais popular e eficiente. Baculovírus são vírus de DNA circular, dupla fita, que infectam artrópodes, principalmente os insetos. Existem muitas vantagens em se usar o sistema de expressão baseado em baculovírus e células de inseto, como altos níveis de expressão e modificações pós-traducionais, que permitem às proteínas recombinantes, serem montadas corretamente e biologicamente ativas. O gene do envelope do vírus da Febre Amarela foi isolado por técnica de RT-PCR, apresentando um tamanho de aproximadamente 1.600 pares de base. Em seguida, foi clonado em dois diferentes + plasmídeos de transferência: pSynXIV VI X3 e p2100, os quais foram co-transfectados, em células de inseto, com DNA de baculovírus recombinantes (vSynVI-gal, derivado do Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), para o pSynXIV + X3 e vAgGalA2, derivado do Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), para o p2100. Sete dias após a transfecção o sobrenadante da cultura celular foi coletado e utilizado para purificar o vírus recombinante pelo método de diluição seriada em placa de 96 poços. Os vírus recombinantes vSynYFE e vAgGalA2 foram, então, utilizados para infectar células de Trichopluisa ni em cultura (BTI- Tn5B1-4) e lagartas de Spodoptera frugiperda (para o vSynYFE) e Anticarsia gemmatalis (para o vAgYFE). Células de inseto infectadas com o vírus vSynYFE mostraram efeitos citopáticos manifestados pela formação de sincício celular (que é típico da infecção por flavivirus) e a análise desse extrato celular por SDS-PAGE detectou a presença de um polipeptídeo de aproximadamente 50 kDa, similar ao tamanho da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela. Entretanto, extratos de tecido adiposo de lagartas infectadas (96 h p. i.) analisadas por SDS-PAGE e western blot detectaram um polipeptídeo por volta de 70 kDa, maior do que o esperado para a proteína do envelope da Febre Amarela. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT Yellow fever is an haemorrhagic disease caused by a virus that belongs to the genus Flavivirus (Flaviviridae family) and is transmitted by mosquitoes. It is a positive- sense, single-stranded, enveloped RNA virus, and its genome consists of 10,862 nucleotides coding for a single ORF of 10,233 nucleotides. This ORF encodes three structural proteins (capsid, pre-M, and envelope) and seven non-structural proteins (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Among the viral proteins, the envelope protein is the most studied one, due to its high antigenic potencial. Isolated recombinant viral antigens may be useful in new vaccine and/or diagnosis development. On the purpose of isolating viral parts and expressing them separately, different heterologous expression systems may be used and within these, the Baculovirus Expression System in insect cells is one of the most popular and efficient. Baculoviruses have a circular, double stranded DNA genome and infect arthropodes, mainly insects. There are many advantages of using the baculovirus expression system such as high expression levels and post-translational modifications that allow the expressed proteins to be correctly folded and biologically active. The Yellow fever envelope gene was isolated by RT- PCR (1,600 base pairs). This fragment was cloned into two different transfer vectors: + pSynXIV VI X3 and p2100, that were co-transfected, in insect cells, with DNA from recombinant baculoviruses vSynVI-gal, derived from Autographa californica multiple + nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), for the pSynXIVVI X3 and vAgGalA2, derived from Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), for the p2100]. Seven days after transfection, the cell culture supernatant was collected and used to purify the recombinant virus by the end-point dilution method in 96-well plates. The recombinant viruses, vSynYFE e vAgGalA2 were used to infect Trichopluisa ni insect cells (BTI-Tn5B1-4) and Spodoptera frugiperda larvae (for vSynYFE) and Anticarsia gemmatalis larvae (for vAgYFE). Insect cells infected with vSynYFE virus showed cytopathic effects manifested by multinucleated syncytial cells (which is typical of Flavivirus infection) and analysis of these cells extracts by SDS-PAGE detected the presence of a polypeptide around 50 kDa, similar to the size of the original Yellow fever envelope protein. However, fat body extracts of infected larvae (96 h p.i.) analysed by SDS-PAGE and Western blot detected a polypeptide around 70 kDa, different from the predicted size of the envelope protein.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. Os genes cry1Ca, cry2Ab e cry10Aa de diferentes estirpes brasileiras de Bacillus thuringiensis foram amplificados por PCR, clonados em um vetor de clonagem e seqüenciados. As análises das seqüências mostraram alta identidade com outros genes cry já descritos. Os genes foram removidos dos vetores de clonagem e introduzidos em um plasmídeo vetor de transferência (pSynXIVVI+X3) para construção de baculovírus recombinantes por recombinação homóloga. Os vírus recombinantes foram purificados por diluição seriada em placa de 96 poços e usados para infectar células de Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) e larvas de Spodoptera frugiperda. A análise transcricional dos genes cry2Ab e cry10Aa foi realizada por RT-PCR, a partir de mRNA extraído de células de inseto infectadas (72 h p.i.), para confirmação da presença de um transcrito específico para os genes. Extratos de larvas infectadas (96 h p.i.) com os vírus vSyncry1Ca, vSyncry2Ab e vSyncry10Aa foram usados para purificação dos cristais das proteínas recombinantes por ultracentrifugação. Em SDS-PAGE, os extratos apresentaram polipeptídeos de aproximadamente 65, 65 e 74 kDa, correspondentes, respectivamente, ao tamanho das proteínas Cry1Ca, Cry2Ab e Cry10Aa. Estes mesmos cristais foram analisados por microscopia de luz e eletrônica e mostraram-se na forma de grandes cristais cubóides. A toxicidade dos cristais das proteínas recombinantes foram verificadas para larvas de segundo instar de S. frugiperda e Anticarsia gemmatalis (Cry1Ca, sendo a CL de 114,44 e 19,49 ng/mL, respectivamente), e a proteína 50 Cry2Ab recombinate foi tóxica para larvas de S. Frugiperda (CL de 3,40 g/mL). No 50 entanto, a proteína Cry10Aa recombinante foi altamente tóxica para larvas neonatas de de 7,12 g /mL. Neste trabalho, foi demonstrado que proteínas A. grandis com CL 50 Cry recombinants são similares às proteínas naturais, possuindo alta toxicidade para diferentes insetos-praga, o que confirma a utilidade do sistema de expressão baseado em baculovírus e células de inseto para o estudo de proteínas Cry. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT The cry1Ca, cry2Ab and cry10Aa genes from different Brazilian strains of Bacillus thuringiensis were amplified by PCR, cloned into a plasmid cloning vector and sequenced. Sequence analysis showed high identity to previous known cry genes. The genes were removed from the cloning vector and introduced into a transfer vector (pSynXIVVI+X3) for the construction of recombinant baculoviruses by homologous recombination. The recombinant viruses were purified by serial dilution in 96 well plates and used to infect Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) insect cells and Spodoptera frugiperda larvae. Transcritptional analysis of the cry2Ab and cry10Aa genes was carried out by RT-PCR, using mRNA extracted from infected insect cells (72 h p.i.), in order to confirm the presence of the gene specific transcript. Recombinant virus (vSyncry1Ca, vSyncry2Ab and vSyncry10Aa) infected insect extracts (96 h p.i.) were used for the purificaton of crystals, made of recombinant proteins, by ultracentrifugation. In SDS-PAGE, the insect extracts showed polypeptides of approximately 65, 65 and 74 kDa, corresponding, respectively to the sizes of the proteins Cry1Ca Cry2Ab e Cry10Aa. These same crystals were analysed by light and electron microscopy and showed the shape of big cuboidal crystals. Furthermore, the crystals preparations were toxic to second instar S. frugiperda and Anticarsia gemmatalis larvae, with a CL of 114,44 and 19,49 ng/mL, respectively (from 50 vSynCry1Ca-infected insect extracts), to second instar S. frugiperda, with a CL de 50 3,40 g/mL (from vSynCry2Ab-infected insect extracts) and neonate A. grandis larvae, of 7,12 g /mL (from vSynCry10Aa-infected insect extracts). This work with a CL 50 showed that recombinant Cry proteíns are similar to their natural couterpart, showing the high toxicity to different insect pests, which demonstrate the utility of the baculovirus expression system for the study of Cry proteins.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. A Dengue é a doença humana transmitida por mosquitos mais comum que pode evoluir para um doença potencialmente letal denominada de febre hemorrágica do dengue (FHD). Essa doença é causada por um vírus de RNA fita simples, senso positivo e envelopado que pertence ao gênero Flavivirus, onde o genoma é organizado em uma única fase aberta de leitura (ORF), que codifica três proteínas estruturais (capsídeo, pré- M e envelope) e sete proteínas não-estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Entre as proteínas virais, a proteína do envelope é uma das mais antigênicas e a proteína NS1 está relacionada com a lise de células infectadas, mediada pelo sistema complemento. Diferentes sistemas de expressão podem ser usados para a expressão de antígenos virais para o desenvolvimento de vacinas e/ou diagnóstico. Entre estes sistemas, o sistema de expressão baseado em baculovírus (BEV) é um dos mais populares e eficientes. Baculovírus infectam artrópodes, principalmente insetos e possuem um genoma de DNA circular, dupla fita. Existem muitas vantagens do BEV em relação a outros sistemas de expressão, como, por exemplo, o alto nível de expressão e as modificações pós-traducionais que permitem a montagem correta e atividade biológica da proteína expressa. Um isolado brasileiro de Dengue virus 1 foi usado para amplificar o gene do envelope ou o gene do envelope fusionado ao gene NS1 por RT-PCR, usando oligonucleotídeos específicos e os fragmentos obtidos foram clonados no vetor de transferência comercial pFastBac1 (Invitrogen). Esse plasmídeo possui regiões sítio-específicas que permitam a transposição do inserto de interesse dentro do genoma de um baculovírus (bacmídeo) propagado em Escherichia coli. O bacmídeo recombinante é usado para a expressão da proteína heteróloga em células de inseto infectadas. Dois vírus recombinantes foram obtidos, vAcDE e vAcDENS1, que expressão e as modificações pós-traducionais que permitem a montagem correta e atividade biológica da proteína expressa. Um isolado brasileiro de Dengue virus 1 foi usado para amplificar o gene do envelope ou o gene do envelope fusionado ao gene NS1 por RT-PCR, usando oligonucleotídeos específicos e os fragmentos obtidos foram clonados no vetor de transferência comercial pFastBac1 (Invitrogen). Esse plasmídeo possui regiões sítio-específicas que permitam a transposição do inserto de interesse dentro do genoma de um baculovírus (bacmídeo) propagado em Escherichia coli. O bacmídeo recombinante é usado para a expressão da proteína heteróloga em células de inseto infectadas. Dois vírus recombinantes foram obtidos, vAcDE e vAcDENS1, que foram, então, usados para infectar larvas de Spodoptera frugiperda. Extratos de tecido adiposo de larvas infectadas (96 h.p.i.) foram analisadas por SDS-PAGE e Western- blot, usando um anticorpo contra o vírus do dengue, que detectou um polipeptídeo por volta de 70 kDa em ambos os extratos. Esse polipeptídeo é diferente do tamanho predito da proteína do envelope (~50 kDa) e das proteínas do envelope mais NS1 fusionadas (~90kDa). Entretanto, a análise transcricional confirmou que os genes estavam sendo transcritos em células infectadas. Nós também usamos o virus vAcDENS1 em um ensaio de fusão de membrana e confirmamos a formação de sincício dependente de pH, o que é uma característica da proteína do envelope do vírus do dengue. O gene NS1 foi também clonado em um plasmídeo, sob o comando do promotor hsp70 de Drosophila melanogaster e usado em uma co-transfecção com um plasmídeo contendo um gene de resistência à puromicina, visando a construção de células de inseto estavelmente transformadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT Dengue is the most common mosquito-borne viral disease of humans and its infection may evolve to a potentially lethal disease known as Dengue haemorrhagic fever (DHF). This disease is caused by a positive-sense, single-stranded, enveloped RNA virus that belongs to the genus Flavivirus within Flaviviridae and its genome is organized in a single ORF which encodes three structural proteins (capsid, pre-M, and envelope) and seven non-structural proteins (NS1, NS2a, NS12b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Among the viral proteins, the envelope protein is one of the most antigenic and NS1 play a possible role in complement-mediated cytolysis. Different heterologous expression systems may be used for the expression of viral antigens for vaccine and/or diagnosis development. Among these, the Baculovirus Expression System (BEV) is one of the most popular and efficient system. Baculoviruses have a circular, double stranded DNA genome and infect arthropodes, mainly insects. There are many advantages of using BEV, when compared to other expression systems, such as high expression levels and post-translational modifications that allows the expressed proteins to be correctly folded and biologically active. A Brazilian Dengue 1 isolate was used to amplify the envelope gene alone or envelope plus NS1 gene by RT-PCR using specific oligonucleotides and cloned into the commercial transfer vector pFastBac1 (Invitrogen). This plasmid has site-specific regions which allows transposition of the chosen insert into a baculovirus genome (bacmid) propagated in Escherichia coli. The recombinant bacmid DNA is used to obtain recombinant baculovirus and heterologous protein expression in virus-infected insect cells. Two different recombinant virus were obtained, vAcDE and vAcDENS1, and they were used to infect Spodoptera frugiperda larvae. Fat body extracts of infected larvae (96 h p.i.) were analysed by SDS-PAGE and Western blot using an anti-Dengue antibody which detected a polypeptide around 70 kDa in both extracts. The size of this polypetide is different from the predicted size of the envelope protein (~50 kDa) and the fused envelope and NS1 proteins (~90kDa). However, transcriptional analysis confirmed that the genes were being transcribed in infected cells. We also used the vAcDENS1 virus in a membrane fusion assay and confirmed pH-dependent syncytium formation, which is a characteristic of the dengue virus envelope protein.. The NS1 gene alone was cloned under the control of hsp70 promoter and used to co-transfect insect cells with a plasmid containing the puromycin resistance gene, in order to produce stably transformed insect cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. Os túbulos de Malpighi constituem o principal órgão excretor de insetos. Suas funções vão além da excreção, podendo participar da desintoxicação e resposta imune do inseto. A infecção por baculovírus com deleção em seu gene egt em larvas de lepidópteros promove uma degeneração precoce dos túbulos, com conseqüente melhor atividade do baculovírus, resultando em uma redução no tempo de morte das larvas. Porém, não são observados indícios de infecção nas células dos túbulos. O gene ecdysteroid udp-glucosyltransferase (egt) codifica a enzima EGT que é responsável pela transferência de unidades de UDP-galactose ou UDP-glicose para a ecdisona, inativando-a. Utilizando baculovírus AgMNPV recombinantes contendo genes marcadores egfp ou lacZ, analisou-se as alterações causadas nos túbulos de Malpighi de A. gemmatalis, utilizando microscopia de luz e eletrônicas de transmissão (MET) e varredura (MEV). Verificou-se a relação destas alterações com a ausência do gene egt e/ou presença de um gene marcador. Realizou-se um bioensaio para comparar a atividade dos baculovírus entre si. As infecções pelos baculovírus causaram alterações visíveis a partir de 24 horas pós-infecção em microscopia de luz, sendo possível observar as proteínas marcadoras presentes em células traqueolares e em regiões dos túbulos associadas às mesmas. Com o avanço da infecção, as proteínas marcadoras apresentaram-se em maiores proporções e a degeneração dos túbulos aumentou. Em MET, observou-se um aumento progressivo da desorganização das microvilosidades, alterações nos espaços citoplasmáticos, nas invaginações basais e mitocôndrias, deformações da lâmina basal, secreções apócrinas e morte celular, conforme o progresso da infecção. Por sua vez, em MEV, observou-se mudanças na superfície, a qual apresentou aspecto flácido e ressecado, reentrâncias, protuberâncias, poros e cristais conforme a progressão da infecção. No entanto, em nenhuma das análises por microscopia, observou-se indícios de infecção nas células dos túbulos de Malpighi. Os resultados mostraram uma melhor atividade dos baculovírus contendo lacZ em relação aos que contém egfp, sendo que a ausência de egt implicou em maior intensidade e velocidade das alterações. O tempo médio de morte (LT50) calculado a partir do bioensaio para os diferentes vírus revelou melhor atividade dos recombinantes contendo lacZ, sendo que o recombinante contendo egt se mostrou mais eficaz. Devido à ausência de indícios de infecção nas células dos túbulos, acredita-se que a degeneração dos mesmos é provocada indiretamente pela infecção. A morte das células dos túbulos pode estar relacionada à oncose, que pode ser provocada pela depleção das reservas energéticas, e também à apoptose, que pode ser ativada pelo acúmulo das proteínas marcadoras EGFP e LacZ. A ausência do gene egt pode estar resultando em um maior gasto energético pelo hospedeiro, agravando o processo de morte celular que está ocorrendo nos túbulos de Malpighi, resultando em redução no tempo de morte do hospedeiro. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT The Malpighian tubules constitute the main excretion organ of insects. Its functions go beyond excretion and may play a role in detoxification and immune defense of the insect. The infection by baculoviruses with their egt gene deleted in lepidopteron larvae promotes an early degeneration of the tubules with consequent better baculovirus activity resulting in reduction of the larvae time of death. However, there was no trace of infection in the tubules cells. The ecdysteroid udp-glucosyltransferase (egt) gene encodes the EGT enzyme, which is responsible for the transfer of UDP-galactose or UDP-glucose units to the ecdisone, inactivating it. Using AgMNPV recombinant baculoviruses containing egfp or lacZ, the alterations caused in the Malpighian tubules of A. gemmatalis were analyzed by light microscopy and transmission (TEM) and scanning (SEM) electronic microscopies. The relationship of the alterations observed with the absence of the egt gene and/or presence of a marker gene was verified. A bioassay was made to compare the baculoviruses activities among them. The infections by the baculoviruses caused visible alterations from 24 hours post-infection by light microscopy, being possible to observe the marker proteins in the tracheolar cells and regions of the tubules associated with them. As the infection advanced, the marker proteins appeared in higher proportions and the degeneration of the tubules increased. In TEM, a progressive increase was observed in the disorganization of the microvilli, alterations in cytoplasmic spaces, basal infolds and mitochondria, deformations in the basal lamina, apocrine secretions and cell death, accordingly to the progress of the infection. Meanwhile, in SEM, changes in the surface as a loose and parched aspect, reentrances, protuberances, pores and crystals, were observed according to the progression of infection. However, there was no trace of infection in the cells of the Malpighian tubules by the microscopic analyses. The results showed best activity for the baculoviruses containing lacZ compared to the ones containing egfp and the absence of egt implied in higher intensity and speed of the alterations. The mean time to death (LT50) calculated for the different baculoviruses revealed best activity of the recombinants containing lacZ but the recombinants containing egt were more pathogenic. Due to the absence of vestiges of infection in the tubules cells, it is believed that the degeneration of the tubules is provoked by infection indirectly. The cell death in the tubules might be related to oncosis, which may be activated by depletion of energy reserves and also related to apoptosis, which may be activated by accumulation of EGFP and LacZ. The absence of egt gene might be resulting in a higher energetic expense by the host, aggravating the cell death process that is taking place in the Malpighian tubules, resulting in reduction of host time of death.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. Os baculovírus são vírus de DNA, específicos de artrópodes, possuindo uma ampla utilização, principalmente, como bioinseticida em lepidópteros e como vetores de expressão de genes heterólogos. A habilidade do vírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) de infectar um grande número de hospedeiros tem facilitado estudos moleculares desse vírus com o objetivo de melhorar sua propriedade bioinseticida. Este trabalho teve por objetivo a construção de AcMNPV recombinantes com a introdução de um gene de uma protease (catepsina-L) e de uma quitinase no genoma viral, para a observação dos efeitos da infecção viral em larvas de Spodoptera frugiperda, comparativamente aos vírus AcMNPV selvagem e outro AcMNPV recombinante, contendo o gene de uma serino-protease (queratinase) de Aspergillus fumigatus. Outro objetivo do trabalho foi a construção de Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) recombinantes com a introdução dos genes das proteases catepsina-L e queratinase no genoma viral. Foram utilizados os vetores de transferência pSynXIVVI+X3 e p2100, respectivamente, para cada vírus. O DNA plasmidial dos vetores de transferência recombinantes foi co-transfectado com o DNA do vírus vSyngalVI- e do vAgGalA2, em células de Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) e Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286), respectivamente. Os isolamentos dos vírus recombinantes foram feitos com a técnica de diluição seriada em placa de 96 poços e a detecção dos vírus recombinantes se deu pela observação de poliedros nas células infectadas por meio da microscopia de luz. O vírus AcMNPV recombinante contendo o gene da catepsina-L (vSynCAT) assim como o AcMNPV recombinante contendo o gene da queratinase (vSynQUERAT) foram mais virulentos contra larvas de 3° e 4° instar de S. frugiperda quando comparados aos vírus selvagem e o vírus AcMNPV xx recombinante contendo o gene da quitinase (vSynQUIT). Além disso, os vírus vSynCAT e vSynQUERAT induziram a melanização da cutícula dos insetos nos estágios mais tardios da infecção. Os AgMNPV recombinantes ainda não foram isolados e, desta forma, não foi possível analisar o efeito desses genes no genoma do baculovírus mais utilizado como bioinseticida no mundo. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT Baculoviruses are DNA viruses specific to artropods. They have been widely used as bioinseticides against lepidopterous insect pests and as heterologous gene expression vectors. The ability of the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) to infect a great variety of hosts, have facilitated molecular biology studies aiming the improvement of this virus as a biopesticide. The aim of this work is the construction of recombinant AcMNPV viruses with the introduction of a protease gene (cathepsin-L) from Sarcophaga peregrina and a chitinase gene from Metarhizium anisopliae, into the viral genome and observation of the effects of these recombinant viruses during the infection of Spodoptera frugiperda larvae, comparatively with the wild-type AcMNPV and another AcMNPV recombinant, containing a serino-protease (keratinase) gene from Aspergillus fumigatus . Another aim of this work was the construction of Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) recombinant viruses containing the cathepsin-L and keratinase genes into the viral genome. The pSynXIVVI+X3 e p2100 transfer vectors were used, respectively for each virus. Recombinant transfer vectors DNAs were co- transfected with DNA from polyhedrin minus vSyngalVI- and vAgGalA2 viruses, in Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) and Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286) cells, respectively. Isolation of the recombinant viruses was carried out using the serial dilution method in 96 well-plates and was achieved by the observation of polyhedra inside infected cells under a light microscope. The AcMNPV recombinant containing the cathepsin-L gene (vSynCAT), as well as the AcMNPV recombinant containing the keratinase gene (vSynQUERAT), were more virulent towards 3° and 4° instar S. frugiperda larvae, when compared to the wild-type AcMNPV and a AcMNPV xxii recombinant containing the kitinase gene (vSynQUIT). Furthermore, the vSynCAT and vSynQUERAT viruses induced melanization of insect cuticule late in infection. The AgMNPV recombinants have not been isolated yet, and therefore, it was not possible to analyse the effect of the introduction of these genes on the virulence of the world most used baculovirus biopesticide.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. As plantas normalmente são hospedeiras de mais de um patógeno. O maracujazeiro, por exemplo, é infectado por diversos vírus, bactérias e fungos, que limitam consideravelmente a sua produção. Devido a isso, o uso dos sistemas de controle de doenças que confiram amplo espectro de resistência é cada vez mais necessário. Trabalhos recentes demonstraram que plantas de fumo ou tomate expressando genes anti-apoptóticos são resistentes a estresses abióticos e a vários patógenos necrotróficos, isto é, patógenos que matam a célula da planta hospedeira como parte do seu processo de infecção. Neste trabalho, os genes p35 e iap-3 de baculovirus foram separadamente introduzidos no genoma de plantas de maracujá usando biobalística. Os genes estrangeiros estavam sob o comando transcricional dos promotores 35S ou UBQ3. As plantas transgênicas foram regeneradas e selecionadas pela presença do transgene usando a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou Southern blot. Somente plantas p35+ foram selecionadas pela análise por PCR e/ou Sothern-blot. Onze plantas regeneradas mostraram a presença do gene p35. Análises transcricionais de plantas regeneradas mostraram a presença de transcritos específicos para o gene p35 em 9 delas. As plantas regeneradas, contendo o gene p35, foram inoculadas com o vírus Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), a bactéria Xanthomonas axonopodis pv passiflorae, e o herbicida glufosinato (Syngenta). Nenhuma das plantas mostrou resistência ao CABMV. Plantas regeneradas (p35+) continham menos da metade do número de lesões detectadas nas plantas não-transgênicas, quando inoculadas com X. axonopodis pv. passiflorae e algumas plantas p35+ mostraram tolerância aumentada ao herbicida glufosinato, quando comparadas às plantas não-trangênicas. Além disso, no presente trabalho, é demonstrado que um promotor de baculovírus (promotor IE-1) é ativo em células vegetais e que, promotores usados em biotecnologia de plantas (UBQ e 35S) são também, ativos em células de inseto quando analisados em ensaios transientes de expressão onde o gene repórter luciferase (rluc) de Renilla reniformis estava sob o comando transcricional de cada promotor. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT Plants are usually hosts for more than one pathogen. The passion flower, for example, can be infected by a many virus, bactéria and fungi, which limit fruit yield considerably. Due to this, the use of diseases control systems that allow a wide range of disease resistance is needed. Recent work have shown that tobacco or tomato plants containing anti-apoptotic genes were more resistant to abiotic stresses and several necrotrophic pathogens, which are pathogens that kill the plant host cell as part of their infection process. In this work, the p35 and iap-3 genes from baculoviruses were separetely introduced into the genome of passion fruit plants by biobalistics. The foreign genes were under the transcriptional control of the 35S or UBQ3 promoters. The transgenic plants were regenerated and screened for the presence of the transgene by PCR and/or Southern blot. Only p35+ plants were confirmed by PCR and/or Sothern-blot analysis. Eleven regenerated plants showed the presence of the p35 gene. Transcriptional analysis of regenerated plants showed the presence of specific p35 transcripts in 9 of them. Regenerated plants containing the p35 gene were inoculated with the cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), the bacterium Xanthomonas axonopodis pv passiflorae, and the herbicide, glufosinate, (Syngenta). None of the plants showed resistance to CABMV. Regenerated plants (p35+) showed less than half of local lesions showed by non-transgenic plants when inoculated with X. axonopodis and some p35+ plants showed increased tolerance to the glufosinate herbicide when compared to non-transgenic plants. Furthermore, we have shown that a baculovirus promoter (IE-1 promoter) is active in plant cells and promoters used in plant biotechnology (UBQ and 35S) are also active in insect cells by transient expression assays using the luciferase gene (rluc) from Renilla reniformis under the transcriptional control of each promoter.