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Resumo: Apesar de ser considerada uma das principais causas de morte não natural de vertebrados, apenas recentemente os atropelamentos têm sido alvo de estudos no Brasil. Realizamos um levantamento de mamíferos de médio e grande porte atropelados em três rodovias no leste dos Estados do Paraná e Santa Catarina, sul do Brasil (SC-486, BR-470 e BR-101/BR-376), totalizando um percurso de 423 quilômetros. Calculamos o número de atropelamentos para cada 100km percorridos e estimamos a massa dos animais atropelados. Caracterizamos a distribuição temporal e analisamos a relação dos atropelamentos com o uso da terra e fragmentação florestal. Por fim, sugerimos locais potenciais para a mitigação dos atropelamentos. O percurso foi amostrado quatro vezes a cada mês no período de um ano, resultando em 393 registros de atropelamentos, distribuídos em 16 espécies. As espécies com mais registros foram Didelphis albiventris (56,2%), Didelphis aurita (10,4%) e Cerdocyon thous (10,2%). A estimativa do número de atropelamentos - obtida somente com registros de menos de um dia - foi de 0,8 (BR-101/BR-376 norte-sul), 0,71 (BR-101/BR-376 sul-norte), 2,34 (BR-470) e 2,54 registros/100km (SC-486). Não houve diferenças expressivas entre as estações, sendo significativa apenas para Didelphis albiventris entre primavera e verão e primavera e outono. Para a avaliação dos atropelamentos em relação ao uso da terra e fragmentação florestal, Didelphis albiventris foi analisado à parte dos demais mamíferos. A ocorrência de atropelamentos relacionou-se com áreas predominantemente agrícolas com poucos e fragmentados remanescentes florestais. Áreas urbanizadas relacionaram-se com atropelamentos de Didelphis albiventris e inversamente com os demais mamíferos.