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Orientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Mariana Lazarini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A reorganização do citoesqueleto mediada pela família de proteínas Rho GTPases é essencial durante a diferenciação do megacariócito e formação de plaquetas. As diferentes funções plaquetárias também dependem da intensa reorganização do citoesqueleto. As proteínas RhoGAP, como ARHGAP21, atuam como reguladores negativos de Rho GTPases, acelerando sua inativação. Nosso grupo de pesquisa reportou a participação da ARHGAP21 na regulação de funções de células-tronco e progenitores hematopoiéticos, incluindo seu comprometimento nas células progenitoras megacariocíticas. No presente estudo, investigamos o papel da ARHGAP21 na diferenciação megacariocítica e função plaquetária. Para tal, utilizamos dois modelos: 1) células de eritroleucemia humana (HEL) silenciadas para ARHGAP21 e submetidas à diferenciação megacariocítica in vitro e 2) camundongos heterozigotos nocautes para Arhgap21 (Arhgap21+/-). Proteínas do citoesqueleto foram investigadas por microscopia confocal e western blot em células HEL silenciadas para ARHGAP21 e submetidas à diferenciação megacariocítica. Marcadores de diferenciação e ploidia foram avaliados por citometria de fluxo. O modelo de camundongo Arhgap21+/- foi usado para avaliar a diferenciação megacariocítica de células progenitoras primárias. O tempo de oclusão do vaso e a formação de trombo foram detectados após lesão da artéria carótida de camundongo Arhgap21+/- com FeCl3. Agregação plaquetária e exposição à p-selectina da Arhgap21+/- foram avaliados em resposta à trombina com um agregômetro. A morfologia plaquetária foi avaliada por microscopia eletrônica. A expressão da ARHGAP21 foi aumentada durante a diferenciação megacariocítica na linhagem celular e células primárias de camundongo. No modelo de células HEL, a proteína ARHGAP21 foi detectada nas protrusões citoplasmáticas colocalizada e associada à tubulina ? e foi detectada principalmente na fração celular proteica contendo a tubulina polimerizada. O silenciamento da ARHGAP21 diminuiu a expressão da tubulina glu, sugerindo instabilidade dos microtúbulos e maior espalhamento com aumento de protrusões celulares. Ainda, em células HEL, o silenciamento da ARHGAP21 aumentou a atividade de CDC42, enquanto não foram observadas alterações na atividade de RHOA. Em modelo de camundongo Arhgap21+/-, observamos aumento de agregação plaquetária in vitro induzida por trombina e exposição à p-selectina. Houve maior atividade de RHOA e CDC42 em células primarias da medula óssea de Arhgap21+/- submetidas a diferenciação megacariocítica em comparação a células selvagens. Plaquetas Arhgap21+/- também apresentaram aumento no tamanho de grânulos ?. Estes resultados foram associados com o menor tempo de sangramento caudal e aceleração de formação de trombo após injuria da artéria carótida com FeCl3. Nossos resultados indicam que ARHGAP21 é uma proteína crítica na regulação da produção e função plaquetária por meio do controle do rearranjo do citoesqueleto Abstract: Cytoskeleton reorganization mediated by the Rho family of GTPases is an essential part of megakaryocyte differentiation and platelet formation. The different functions of platelets also depend on the intense reorganization of the cytoskeleton. RhoGAP proteins, such as ARHGAP21, are negative regulators of Rho GTPases and accelerate their inactivation. Our research group has reported the participation of ARHGAP21 in the regulation of the functions of hematopoietic stem progenitor cells, including its involvement in megakaryocytic lineage differentiation. In the present study, we investigated the role of ARHGAP21 in megakaryocytic differentiation and platelet function. To this end, two models were used: 1) the human erythroleukemia cell line (HEL) silenced for ARHGAP21 and subjected to megakaryocytic differentiation in vitro and 2) heterozygous knockout mice for the Arhgap21 gene (Arhgap21+/-). The HEL cell line model was used to assess cytoskeleton proteins by confocal microscopy and western blotting as well as differentiation markers and ploidy by flow cytometry. The Arhgap21+/- mouse model was used in different experiments to investigate megakaryocytic differentiation of primary progenitor cells. Vessel occlusion time and thrombus formation were detected after injury of carotid artery with FeCl3. Arhgap21+/-platelet aggregation and exposure to p-selectin in response to thrombin were obtained using an aggregometer and platelet morphology was evaluated by electron microscopy. ARHGAP21 expression was increased during megakaryocytic differentiation both in the HEL cell line and in mice primary cells. In the HEL cell line, ARHGAP21 was detected in cytoplasmic protrusions, where it colocalized and associated with ?-tubulin, and mainly detected in the protein cell fraction containing polymerized tubulin. In those cells, ARHGAP21 silencing decreased the expression of glu tubulin suggesting microtubule instability and greater spreading with increased cell protrusions. Furthermore, ARHGAP21 silencing increased CDC42 activity in the HEL cell line, whereas no change in RHOA activity was observed. Using Arhgap21+/- mouse model, we observed increased platelet aggregation in vitro induced by thrombin and higher p-selectin exposure. There was higher RHOA and CDC42 activity in Arhgap21+/- bone marrow primary cells when they were subjected to megakaryocytic differentiation in comparison with wild-type cells. Arhgap21+/- platelets showed an increase in the size of ? granules. These results were associated with shorter tail bleeding time and accelerated thrombus formation after injury of carotid artery with FeCl3. Our results indicate that ARHGAP21 may be a critical protein in regulating platelet production and function through the control of cytoskeleton rearrangement Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2013/13022-2

Introdução: Recentemente terapias para carcinoma epidermoide oral tendo alvo para vias de sinalização moleculares são as mais utilizadas. TKI-258 é um inibidor simultâneo dos receptores tirosina quinase FGFRs, VEGFRs e PDGFRs. Essas vias de sinalização ativam proteínas, como as GTPases Rho que contriubem para a tumorigênese, atuando em diferentes processos biológicos, como apoptose. Objetivos: Este estudo avaliou o efeito do tratamento com TKI-258 sobre a apoptose, envolvendo as GTPases Rho e suas efetoras ROCKs e PAKs em células SCC-4 de carcinoma epidermoide oral. Material e Métodos: Marcadores de morte celular e apoptose foram analisados em células SCC-4 controle e tratadas com TKI-258 por citometria de fluxo. O envolvimento das GTPases Rho e das efetoras ROCKs na indução da apoptose pelo TKI-258 foi avaliado por meio da quantificação de PARP clivada. Também foram realizadas análises de expressão gênica das GTPases Rho e de algumas de suas efetoras. Resultados: O tratamento com TKI-258 levou a um aumento significativo na morte celular (7-AAD) e apoptose (Anexina V e PARP clivado). Quando as GTPases Rho foram estimuladas com LPA e inibidas com Toxina Clostridium difficile, o percentual de células apoptóticas aumentou e diminuiu, respectivamente. O tratamento com TKI-258 combinado com LPA e Toxina A teve um efeito similar, aumentando e diminuindo a apoptose, respectivamente. O tratamento com TKI-258 aumentou significativamente a expressão gênica de RhoA, enquanto que em RhoB, RhoC, Rac1 e Cdc42 diminui significativamente. Os inibidores de ROCKs (Y-27632 e HA-1077) reduziram a apoptose comparado com o controle. TKI-258 combinado com Y-27632 ou HA-1077 levou ao aumento da apoptose em comparação apenas com os inibidores. O tratamento com TKI-258 levou a um aumento na expressão dos genes ROCK1 e ROCK2 e uma diminuição na expressão dos genes PAK1 e PAK2. Conclusão: O TKI-258 estimulou a apoptose em células SCC-4 de carcinoma epidermoide oral. Possivelmente, GTPases Rho e suas efetoras ROCKs participam da via de sinalização inibida pelo TKI-258. Terapias com inibidores multialvos, como o TKI-258, podem ser alternativas promissoras para o tratamento clínico do carcinoma epidermoide oral. Background: Recently therapies for oral squamous cell carcinoma targeting molecular pathways are the most useful. TKI-258 is a simultaneous inhibitor of tyrosine kinase receptors FGFRs, VEGFRs, and PDGFRs. These pathways activate proteins such as Rho GTPases that contribute to tumorigenesis, performing different biological processes, as apoptosis. Objectives: This study evaluated the effect of treatment with TKI-258 on apoptosis, involving Rho GTPases and their effectors ROCKs and PAKs in SCC-4 cells of oral squamous cell carcinoma. Materials and Methods: Markers of cell death and apoptosis were analyzed in control and TKI-258 treated SCC-4 cells by flow cytometry. The involvement of Rho GTPases and the effectors ROCKs in the induction of apoptosis by TKI-258 was evaluated by quantification of cleaved PARP. Also gene expression analysis of Rho GTPases and some of their effectors was performed. Results: The treatment with TKI-258 led to a significant increase in cell death (7-AAD) and apoptosis (Annexin V and cleaved PARP). When Rho GTPases were stimulated with LPA and inhibited with Toxin A Clostridium difficile, the percentage of apoptotic cells increased and decreased, respectively. The treatment with TKI-258 combined with LPA and Toxin A had a similar effect, increasing and decreasing apoptosis, respectively. Treatment with TKI-258 significantly increased RhoA gene expression, while RhoB, RhoC, Rac1 and Cdc42 decreased significantly. ROCKs inhibitors (Y-27632 and HA-1077) reduced apoptosis compared with control. TKI-258 combined with Y-27632 or HA-1077 led to an increase in apoptosis compared with inhibitors only. Treatment with TKI-258 led to an increase in ROCK1 and ROCK2 gene expression, and a decrease in PAK1 and PAK2 gene expression. Conclusion: TKI-258 stimulates apoptosis in SCC-4 cells of oral squamous cell carcinoma. Possibly, Rho GTPases and their effectors ROCKs participate in the signaling pathway inhibited by TKI-258. Therapies with multi-target inhibitors, such as TKI-258, may be promising alternatives for the clinical treatment of oral squamous cell carcinoma. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Orientadores: Hernandes Faustino Carvalho, Aline Mara dos Santos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A próstata é uma glândula acessória do trato reprodutor masculino responsável pela produção e armazenamento do líquido prostático. Esta glândula é alvo de várias afecções como prostatite, hiperplasia e câncer, doenças que comprometem a saúde e bem-estar do homem e são responsáveis por grande número de mortes. A nível histológico podem ser identificados três compartimentos nesta glândula: o epitelio, o lúmen e o estroma. As células musculares lisas (CMLs) são o principal componente do estroma e apresentam uma modulação fenotípica dependendo de diferentes fatores, sendo que um deles é a matriz extracelular (MEC). Neste trabalho avaliamos o efeito de diferentes componentes de MEC (colágeno, fibrina e Matrigel) na adesão, morfologia, fenótipo e localização da quinase de adesão focal (FAK) nas CMLs de próstata. Os resultados preliminares nos levaram estudar a adesão das células no colágeno e o posterior bloqueio das proteínas Rho GTPases. Por último, estudamos o efeito do TGF'alfa' e TGF'beta' na migração celular. Os resultados mostram que o colágeno favorece uma rápida adesão das CMLs, que fibrina é degradada na presença destas e que no Matrigel elas se agrupam. No colágeno, o citoesqueleto de actina se organiza em grandes fibras de estresse, que não são observadas na fibrina nem no Matrigel. A FAK apresentou uma localização nuclear nas células semeadas no colágeno. Na fibrina e no Matrigel a marcação nuclear estava ausente e sua distribuição no citoplasma estava em forma de agregados. A forma fosforilada da FAK na tirosina 925 apresenta uma maior co-localização com a cadeia pesada da miosina (MYH11) no colágeno. As CMLs na fibrina e no Matrigel apresentaram diminuição nos marcadores do fenótipo contrátil, sugerindo que esses componentes de MEC favorecem o fenótipo sintético. Enquanto aos efeitos da inibição das proteínas Rho GTPases na adesão das CMLs sobre o colágeno, Rac1, Rac3 e Cdc42 são importantes para a adesão das células, enquanto a inibição de ROCK não inibiu a adesão das CMLs ao colágeno e, posteriormente, permitiu a migração ? evento que não acontecia quando as CMLs estavam somente sobre o colágeno. A exposição ao inibidor de ROCK nas CMLs desencadeou alterações na morfologia celular, no citoesqueleto de actina, na distribuição de ?-actinina e na diminuição da expressão de SM-actina e MYH11. Finalmente observamos que o TGF? estimula a migração das CMLs, mesmo em concentrações baixas. Os resultados aqui apresentados demostram que a MEC influencia o comportamento e o fenótipo das CMLs de próstata. As GTPases Rac e Cdc42 são importantes para a adesão das células enquanto que ROCK tem efeito na manutenção do fenótipo contrátil Abstract: The prostate is an accessory gland of the male reproductive tract and is responsible for the production and storage of prostate fluid. This gland is affected by numerous diseases such as prostatitis, hyperplasia and cancer. These diseases compromise men¿s health and well being and are responsible for a large number of deaths, worsening with the advanced age. At histological level three compartments can be identified: epithelium, lumen and stroma. Smooth muscle cells (SMCs) are the main component of the stroma and showing a phenotypic modulation depending on different factors, one of them being the extracellular matrix (ECM). In this work we evaluated the effect of different components of ECM (collagen, fibrin and Matrigel) on adhesion, morphology, phenotype and focal adhesion kinase (FAK) localization in prostate SMCs. Preliminary results led us to study cell adhesion in collagen and subsequent blockade of Rho GTPases proteins. Finally, we study the effect of TGF'alfa' and TGF'beta' on cell migration. The results show that collagen promote a fast adhesion of SMCs, whereas, fibrin is degraded by the cells and that on Matrigel they formed cell clusters. In collagen, the actin cytoskeleton organizes into large stress fibers, which are not observed in fibrin or Matrigel. FAK had a nuclear localization in the cells seeded on collagen. On fibrin and Matrigel nuclear labeling was absent and its distribution in the cytoplasm was in as aggregates. The phosphorylated form of FAK on tyrosine 925 shows a greater co-location with the myosin heavy chain (MYH11) on collagen. SMCs on fibrin and Matrigel decreased markers of contractile phenotype, suggesting that these components of ECM favor the synthetic phenotype. The effects of inhibition of Rho GTPases proteins on the adhesion of CMLs on collagen, Rac1, Rac3 and Cdc42 are important for cell adhesion, while ROCK inhibition did not inhibit adhesion of SMCs to collagen and subsequently allowed migration - an event that did not happen when SMCs were only on collagen. Exposure to ROCK inhibitor triggered changes in cell morphology, actin cytoskeleton, ?-actinin distribution, and decreased expression of SM-actin and MYH11. Finally, we observed that TGF? stimulates the migration of CMLs, even at low concentrations. The results presented here demonstrate that ECM influences the behavior and phenotype of prostate CMLs. Rac and Cdc42 GTPases are important for cell adhesion while ROCK has an effect on the maintenance of contractile phenotype Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural FAPESP 2015/03235-4 CAPES 001

Orientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Mariana Lazarini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As síndromes mielodisplásicas (SMD) são desordens resultantes de alterações em células-tronco hematopoéticas, caracterizadas por hematopoese ineficaz e pela probabilidade de progressão para leucemia mieloide aguda (LMA). A SMD e LMA são causadas por uma combinação de mutações e alterações epigenéticas que resultam na desregulação de funções proteicas, conferindo maior capacidade de proliferação, defeito na apoptose e na diferenciação celular. O estudo de novos genes envolvidos é importante para um melhor entendimento e para a identificação de possíveis alvos terapêuticos nestas neoplasias hematológicas. As Rho GTPases constituem uma família de 20 proteínas que participam de diversos processos celulares, como rearranjo do citoesqueleto, migração, adesão e polarização celular. As três proteínas Rho GTPases mais estudadas são RhoA, Rac1 e Cdc42 e estão relacionadas ao desenvolvimento do câncer, incluindo neoplasias hematológicas. Entretanto, poucos estudos foram realizados para investigar o papel dos outros membros desta família nestas doenças. O objetivo do presente estudo foi investigar a expressão de genes da família das Rho GTPases em SMD e LMA. A partir destes resultados, um gene promissor foi escolhido para que sua função fosse avaliada em células leucêmicas. A expressão gênica das Rho GTPases RhoC, RhoBTB2 e Rnd2 foram encontradas significativamente aumentadas em amostras de medula óssea de pacientes com LMA de novo, enquanto RhoQ foi encontrada diminuída em amostras de medula óssea de pacientes com LMA secundária à SMD em comparação a doadores sadios. Utilizamos o banco de dados do cBioPortal para analisar uma segunda coorte de pacientes e observamos aumento da expressão de RhoC em pacientes com LMA estratificados em risco citogenético desvaforável em comparação a pacientes em risco citogenético intermediário. Além disso, o aumento da expressão de RhoC foi um fator independente de menor sobrevida global em pacientes com LMA. RhoC foi então selecionada como a melhor candidata para as análises funcionais através do tratamento de linhagens mieloides com o fármaco Rhosin. As linhagens leucêmicas tratadas com Rhosin (inibidor dual de RhoA/RhoC) apresentaram redução da viabilidade celular, aumento na apoptose, aumento na autofagia, aumento na fase G1 do ciclo celular e redução de proliferação e proliferação clonal. Os achados aqui descritos sugerem a desregulação da expressão de Rho GTPases em LMA e indicam RhoC como uma molécula alvo promissora para a terapia desta doença. Estudos adicionais através da inibição específica de RhoC serão importantes para esclarecer a participação desta Rho GTPase na fisiopatologia da LMA Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) are disorders resulting from changes in hematopoietic stem cells and characterized by ineffective hematopoiesis and probability of progression to acute myeloid leukemia (AML). MDS and AML are caused by a combination of mutations and epigenetic alterations that result in protein dysregulation, conferring greater proliferation capacity and defects in apoptosis and in cell differentiation. The study of new genes involved in these hematologic neoplasms is important for the identification of new therapeutic targets. Rho GTPases are a family of 20 proteins that participate in various cellular functions. RhoA, Rac1 and Cdc42 are the three most studied Rho GTPases and have been related to cancer development, including hematologic malignancies. However, few studies have been performed to investigate the role of the other members of the Rho GTPase family in these diseases. The aim of the present study was to investigate the gene expression of Rho GTPases in MDS and AML. Based on these results, the function of a promising gene was chosen so that its function could be evaluated in leukemia cells. RhoC, RhoBTB2 and Rnd2 gene expression was significantly increased in bone marrow samples from de novo AML patients, whereas RhoQ expression was decreased in secondary AML compared to healthy donors. Using the cBioPortal database, we analyzed a second cohort of AML patients and detected an increased RhoC expression in patients with unfavorable cytogenetic risk compared to patients with intermediate cytogenetic risk. In addition, the increased RhoC expression was an independent factor of poor overall survival in AML patients. RhoC was then selected as the best candidate for functional analyses, which were performed using Rhosin (a dual RhoA / RhoC inhibitor). Leukemia cells treated with Rhosin presented reduction in viability and proliferation and increase in apoptosis, autophagy and in the percentage of cells in the G1 phase of the cell cycle. The findings herein suggest a deregulation of Rho GTPases expression in AML and indicate RhoC as a promising molecule target for AML therapy. Further studies through specific inhibition of RhoC are important to clarify the participation of this Rho GTPase in AML pathophysiology Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências CAPES 001 FAPESP 2011/51959-0

Clostridium difficile, an agent that causes diarrhea and colitis, produces toxin A (TcdA) and B, two potent enterotoxins. Both toxins reduce proliferation and apoptosis in intestinal epithelial cells. The Wnt-β-catenin pathway, when activated, stimulates the proliferation and differentiation of epithelial cells. In vitro, Clostridium difficile TcdA of has been shown to inhibit the Wnt/β-catenin pathway, even in the presence of pathway agonists. TcdA, as well as toxin B, inactivate Rho GTPases, including Rac1. Rac1 has an important role in the translocation of β-catenin to the nucleus, which stimulates the transcription of genes involved in cell proliferation. Therefore, the objective of this study was to evaluate the changes induced by the Clostridium difficile TcdA in the Wnt/β-catenin pathway in mice and to investigate the role of Rac-1 in the inhibitory activity of this toxin in the Wnt/β-catenin pathway in vitro. TcdA of Clostridium difficile (10 or 50μg/loop) or PBS (200 μl; control) were injeted on the ileal loop of C57BL/6 and Swiss mice. The animals were euthanized under anesthesia 4h later and segments of the ileum were collected to perform the histopathological analysis and to evaluate the components of the Wnt / β-catenin pathway by immunohistochemistry (β-catenin and Wnt-3a and ciclina), Western Blotting (β-catenin) and RT-qPCR (LGR5, cMYC, cyclin D1 and Wnt-3a), cell proliferation (by immunohistochemistry for Ki67 and cyclin D1) and Rac1 expression by RT-qPCR. Mouse intestinal epithelial cells (IEC-6) were transfected with pcDNA3-EGFP-Rac1-Q61L or pcDNA3 and incubated with TcdA (50 ng/ml) in the presence or absence of Wnt-3a conditioned medium. After 24h incubation, the activation of the Wnt/β-catenin pathway (through the TOP/FOPflash luciferase assay), nuclear β-catenin translocation by immunofluorescence and cell proliferation (immunocytochemistry for Ki67) wasevaluated. In vivo, TcdA of C.diff induced marked destruction of intestinal villi and intense inflammatory cell infiltration in the ileum tissue of both species. In the ileum of Swiss mice, the TcdA of Clostridium difficile increased the protein expression of β-catenin and reduced the gene expression of cyclin D1, while in the C57BL/6 mice, this toxin reduced β-catenin and cMYC gene expression, as well as increased gene expression of Wnt-3a and LGR5. In addition, TcdA decreased cell proliferation in the intestinal crypts and did not alter the expression of Rac1 in the ileum of both species. In intestinal epithelial cells (IEC-6), TcdA decreased the activation of the Wnt-β-catenin pathway by the pathway agonist (Wnt-3a), reduced β-catenin translocation to the nucleus and decreased proliferation, while transfection of IEC-6 with pcDNA3-EGFP-Rac1-Q61L reversed the TcdA of Clostridium difficile effects in the presence of Wnt-3a. We conclude that TcdA of Clostridium difficile inhibits the Wnt/β-catenin pathway in Swiss and C57BL/6 mice, despite the increasing level of endogenous agonist of the pathway, with the main altered genes being those involved in cell proliferation. In addition, the in vitro results show an important role of Rac1 inactivation by TcdA of Clostridium difficile in the Wnt/β-catenin pathway inhibition. O Clostridium difficile, agente causador de diarreia e colite, produz toxina A (TcdA) e B, duas potentes enterotoxinas. Ambas as toxinas reduzem a proliferação e apoptose em células epiteliais intestinais. A via Wnt-β-catenina quando ativada estimula a proliferação e diferenciação de células epiteliais. In vitro, foi demonstrado que TcdA do Clostridium difficile inibe a via Wnt/β-catenina, mesmo na presença de agonistas da via.TcdA, assim como a toxina B, inativam Rho GTPases, inclusive Rac1. Rac1 tem importante função na translocação de β-catenina para o núcleo, que por sua vez estimula a transcrição de genes envolvidos na proliferação celular. Portanto, o objetivo desse trabalho foi estudar as alterações induzidas pela TcdA do Clostridium difficile na via Wnt/β-catenina em camundongose investigar o papel de Rac-1 na atividade inibitória dessa toxina na via Wnt/β-catenina in vitro. Injetou-seTcdA do Clostridium difficile (10 ou 50 μg/alça) ou PBS (200l; controle) na alça ileal de camundongos C57BL/6 e Swiss. Os animais foram eutanasiados sob anestesia 4 h depois e segmentos do íleo foram coletados para realizar a análise histopatológica e avaliar os componentes da via Wnt/β-catenina por imunohistoquímica (β-catenina e Wnt 3a ciclina D1), Western Blotting (β-catenina) e RT-qPCR (LGR5, cMYC, ciclina D1 e Wnt-3a, Rac1), proliferação celular (imunohistoquímica para Ki67 e ciclina D1) e expressão de Rac1 por RT-qPCR. Células epiteliais intestinais de rato (IEC-6) foram transfectadas com pcDNA3-EGFP-Rac1-Q61L ou pcDNA3 e incubadas com TcdA (50 ng/mL) na presença ou ausência de meio condicionado com Wnt-3a. Após 24h de incubação, avaliou-se a ativação da via Wnt/β-catenina (por meio do ensaio TOP/FOPflash luciferase), a translocação nuclear β-catenina por imunofluorescência e proliferação celular (imunocitoquímica para Ki67). In vivo, a TcdA do Clostridium difficile induziu acentuada destruição das vilosidades intestinais e intenso infiltrado de células inflamatórias no íleo de ambas as espécies. No íleo de camundongos Swiss, a TcdA do Clostridium difficile aumentou a expressão proteica de β-catenina e reduziu a expressão gênica de ciclina D1, enquanto que nos camundongos C57BL/6 reduziu a expressão gênica de β-catenina e cMYC, além de aumento da imunomarcação e expressão gênica de Wnt-3a e LGR5. Em adição, TcdA diminuiu a proliferação celular nas criptas intestinais e não alterou a expressão de Rac1 no íleo de ambas as espécies. Em células epiteliais intestinais (IEC-6), TcdA diminuiu a ativação da via Wnt-β-catenina pelo agonista da via (Wnt-3a), reduziu a translocação de β-catenina para o núcleo e diminuiu a proliferação. Enquanto que a transfecção de IEC-6 com pcDNA3-EGFP-Rac1-Q61L reverteu os efeitos da TcdA do Clostridium difficile na presença de Wnt-3a. Concluímos que TcdA do Clostridium difficile inibe a via Wnt/β-catenina em camundongos Swiss e C57BL/6, apesar do nível aumentando de agonista endógeno da via, sendo que os principais genes alterados foram os envolvidos na proliferação celular. Adicionalmente, os resultados in vitro mostram um importante papel da inativação de Rac1 pela TcdA do Clostridium difficile na inibição da via Wnt/β-catenina por essa toxina.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 2017 Inclui referências : f. 55-60 Resumo: A proteína STI1 foi descrita como uma molécula relacionada ao estresse térmico de leveduras, e por isso é denominada Stress-Inducible Protein 1. Sua homóloga humana é a Hop (Heat-shock organizing protein). Ela tem expressão praticamente ubíqua e é encontrada em vesículas intracelulares, complexo de Golgi ou dispersa no citoplasma. Estudos indicam que esta proteína participa de vários eventos celulares como desenvolvimento de astrócitos, diferenciação de neurônios, neuroproteção, neuritogênese, formação da memória em ratos e proliferação celular em tumor de ovário. Além disso, a STI1 foi também recentemente caracterizada como ligante da GTPase Rnd1. As GTPases de baixa massa molecular são um grupo de moléculas que ciclam entre as formas ativa e inativa. Aquelas pertencentes à subfamília Rnd possuem pouca atividade GTPásica intrínseca, encontrando-se constitutivamente ativas, sendo desse modo diferentes das outras Rho GTPases. A proteína Rnd1 é encontrada principalmente no cérebro, e está envolvida em vários mecanismos celulares, como a inibição de fibras de estresse e a indução da desorganização do citoesqueleto de actina e adesão focal. Além disso, Rnd1 está presente na extensão inicial de neuritos em células PC-12, e no desenvolvimento de dendritos em neurônios hipocampais de ratos. Foi demonstrada que a interação da STI1 com a Rnd1 pode interferir na fenomenologia (colapso do cone de crescimento) desencadeada pelo eixo Sema3A/Plexina-A1. Por outro lado ainda não foi determinado quais são as vias de sinalização que estão a jusante da interação STI1- Rnd1, responsáveis por esta interferência. Desse modo, as proteínas recombinantes GST, GST-RhoA G14V e GST-RBD foram expressas para a realização de ensaios de pulldown visando elucidar o papel de STI1 na atividade de p190RhoGAP e seu substrato RhoA. Primeiramente foi possível detectar que a presença de STI1 ao inativar Rnd1, leva também a inativação de sua ligante p190RhoGAP. Porém, não foi possível esclarecer o papel desta proteína na atividade de RhoA bem como sua atuação na atividade de cofilina. A produção de anticorpo monoclonal anti-Rnd1 também foi um objetivo do presente trabalho, porém apesar da indicação da presença de anticorpos anti-Rnd1 em soro policlonal, não foi possível detectar a clone positivo para este anticorpo na produção de hibridomas. Palavras-chave: GTPases, Rnd1, STI1, atividade. Abstract: STI1 protein has been described as a yeast thermal stress-related molecule, and is therefore called Stress-Inducible Protein 1. Its human counterpart is Hop (Heat-shock organizing protein). It has virtually ubiquitous expression and is found in intracellular vesicles, Golgi complex or dispersed in the cytoplasm. Studies indicate that this protein participates in several cellular events such as astrocyte development, differentiation of neurons, neuroprotection, neuritogenesis, memory formation in rats and cell proliferation in ovarian tumor. In addition, STI1 has also recently been characterized as GTPase Rnd1 linker. Low molecular weight GTPases are a group of molecules that cycle between active and inactive forms. Those belonging to the subfamily Rnd have little intrinsic GTPase activity, being constitutively active, thus being different from the other Rho GTPases. Rnd1 protein is found primarily in the brain, and it is involved in several cellular mechanisms, such as inhibition of stress fibers and induction of actin cytoskeleton disorganization and focal adhesion. In addition, Rnd1 is present in the initial extension of neurites in PC-12 cells, and in the development of dendrites in hippocampal neurons of rats. It has been shown that the interaction of STI1 with Rnd1 can interfere in the phenomenology (growth cone collapse) triggered by the Sema3A / Plexin-A1 axis. On the other hand, it has not yet been determined which are the signaling pathways that are downstream of the STI1-Rnd1 interaction, responsible for this interference. Thus, the recombinant GST, GST-RhoA G14V and GST-RBD proteins were expressed for pulldown assays to elucidate the role of STI1 in p190RhoGAP activity and its RhoA substrate. First, it was possible to detect that the presence of STI1 when inactivating Rnd1 also leads to the inactivation of its p190RhoGAP ligand. However, it was not possible to clarify the role of this protein in RhoA activity as well in cofilin activity. The production of anti-Rnd1 monoclonal antibody was also an objective of the present work, but despite the presence of anti-Rnd1 antibodies in polyclonal serum, it was not possible to detect the positive clone for this antibody in the production of hybridomas. Key words: GTPases, Rnd1, STI1, activity.

A doença de Chagas é causada pelo parasito intracelular Trypanosoma cruzi, que é capaz de infectar vários tipos celulares. A interação inicial entre parasito e hospedeiro envolve a ativação de vias responsáveis pela internalização do parasito, resposta imune inata do hospedeiro e o combate aos parasitos intracelulares. Diversas mudanças na expressão gênica acontecem na célula hospedeira em resposta ao patógeno e vice-versa. As vias de RNA de interferência (RNAi) estão relacionadas à regulação pós-transcricional da expressão gênica mediada por pequenos RNAs não codificantes como os microRNAs (miRNAs), que permitem um ajuste fino de várias respostas biológicas e são alteradas em infecções parasitárias. Macrófagos infectados por Leishmania sp. ou Toxoplasma sp. tem a expressão alterada de miRNAs que regulam a resposta à estes parasitos. Até o momento, não há descrição do papel de miRNAs durante a infeção do Trypanosoma cruzi em macrófagos murinos. Neste trabalho, realizamos o sequenciamento de pequenos RNAs de macrófagos murinos infectados com o parasito Trypanosoma cruzi nos tempos de 2, 4, 8 e 48 horas após infeção, para avaliar a expressão geral do transcriptoma de pequenos RNAs, especialmente os miRNAs do hospedeiro. A expressão da citocina pro-inflamatória TNF- foi avaliada como indicador da resposta imune inata durante a infeção, bem como o crescimento dos parasitos intracelulares. Não houve mudanças qualitativas no perfil de pequenos RNAs derivados do genoma do parasito ao longo da infeção. Em contraste, entre os pequenos RNAs do hospedeiro, observamos a expressão diferencial de vários miRNAs entre os tempos de 2 e 48 horas. Dos 18 miRNAs que apresentaram expressão diferencial em algum tempo da infeção, somente 1 foi expresso positivamente em pelo menos dois tempos analisados, o miR-34c-5p. Identificamos pela ferramenta TargetScan e pela base de dados StarBase, alvos preditos e validados para os miRNAs diferencialmente expressos e utilizamos os alvos encontrados em ambos para o estudo das funções dos miRNAs. A análise de enriquecimento dos mRNAs alvos para vias biológicas sugerem que os miRNAs estão relacionados com vias como, sinalização de TGF-, atividade transcricional das Smads, cascata de sinalização de PI3K, sinalização de morte celular via JNK bem como a ativação de NFKB via TRAF6. O miR-34c-5p mostrou regulação positiva significativa ao longo da infeção e validamos a expressão por RT-qPCR. A análise dos mRNAs alvos do miR-34c-5p mostrou enriquecimento para processos biológicos como resposta de apoptose e sinalização por Notch. Como os miRNAs agem através da regulação da estabilidade de seus mRNAs alvos, o transcriptoma dos macrófagos após 4 e 8 horas de infeção foi sequenciado e analisado. Ao todo, 274 mRNAs foram regulados: 33 foram regulados negativamente e 241 foram regulados positivamente em algum dos tempos analisados. Entretanto, não houve nenhuma correlação direta, positiva ou negativa, entre os alvos dos miRNAs diferencialmente expressos durante a infeção e sua expressão no transcriptoma. Apesar disto, nós observamos a intersecção de vias biológicas enriquecidas para os mRNAs alvos dos miRNAs diferencialmente expressos e vias biológicas enriquecidas para os mRNAs diferencialmente expressos no transcriptoma. As vias biológicas enriquecidas foram, sinalização de Rho GTPases, transporte de membrana, controle do ciclo celular, sinalização por Notch e transporte e modificação pelo complexo de Golgi. Assim, os miRNAs induzidos pela infeção do T. cruzi em macrófagos estão, provavelmente, envolvidos no ajuste fino de atividades das vias biológicas importantes na resposta à infeção, podendo atuar como reguladores indiretos dos componentes dessas vias. Como perspectiva futura, os miRNAs diferencialmente expressos serão bloqueados e avaliados o seu impacto na reposta à infeção pelo T. cruzi em macrófagos murinos. Chagas disease is caused by the intracellular parasite Trypanosoma cruzi, which is capable of infecting several cell types. The initial interaction between parasite and host involves the activation of pathways responsible for the internalization of the parasite, the innate immune response of the host and the fight against intracellular parasites. Several changes in gene expression occur in the host cell in response to the pathogen and vice versa. Interfering RNA pathways (RNAi) are related to posttranscriptional regulation of gene expression mediated by small non-coding RNAs such as microRNAs (miRNAs), which allow fine-tuning of various biological responses and are altered in parasitic infections. Macrophages infected with Leishmania sp. or Toxoplasma sp. has the altered expression of miRNAs that regulate the response to these parasites. To date, there is no description of the role of miRNAs during Trypanosoma cruzi infection in murine macrophages. In this work, we performed the sequencing of small RNAs from murine macrophages infected with the parasite Trypanosoma cruzi at 2, 4, 8 and 48 hours after infection to evaluate the general expression of the transcriptome of small RNAs, especially the host miRNAs. Expression of the proinflammatory cytokine TNF- was evaluated as an indicator of the innate immune response during infection, as well as the growth of intracellular parasites. There were no qualitative changes in the profile of small RNAs derived from the genome of the parasite throughout the infection. In contrast, among the small host RNAs, we observed the differential expression of several miRNAs between the times of 2 and 48 hours. Of the 18 miRNAs that showed differential expression at some time of infection, only 1 was expressed positively in at least two analyzed times, miR-34c-5p. We identified the predicted and validated targets for the miRNAs differentially expressed by the TargetScan tool and the StarBase database, and used the targets found in both for the study of miRNAs functions. The enrichment analysis of target mRNAs for biological pathways suggests that miRNAs are related to pathways such as TGF- signaling, Smads transcriptional activity, PI3K signaling cascade, signaling of cell death via JNK as well as the activation of NFKB via TRAF6. The miR-34c-5p showed significant positive regulation throughout the infection and validated the expression by RT-qPCR. Analysis of miR-34c-5p target mRNAs showed enrichment for biological processes as apoptosis response and Notch signaling. As the miRNAs act by regulating the stability of their target mRNAs, the macrophage transcriptome after 4 and 8 hours of infection was sequenced and analyzed. In all, 274 mRNAs were regulated: 33 were down-regulated and 241 were down-regulated at any of the times analyzed. However, there was no direct correlation, either positive or negative, between the miRNA targets differentially expressed during infection and their expression in the transcriptome. In spite of this, we observed the intersection of enriched biological pathways for the mRNAs targets of the differentially expressed miRNAs and biological pathways enriched for the mRNAs differentially expressed in the transcriptome. Enriched biological pathways were Rho GTPases signaling, membrane transport, cell cycle control, Notch signaling and transport and modification by the Golgi complex. Thus, the miRNAs induced by T. cruzi infection in macrophages are probably involved in the fine-tuning of activities of the biological pathways important in the response to infection and may act as indirect regulators of the components of these pathways. As a future perspective, differentially expressed miRNAs will be blocked and evaluated for their impact on T. cruzi infection response in murine macrophages.

A reconsolidação e a extinção da memória aversiva são dependentes dos mecanismos de síntese de novas proteínas e estabilização do citoesqueleto de actina. Já, a reaquisição da memória aversiva não necessita da síntese de novas proteínas, mas é dependente do processo de rearranjo de citoesqueleto de actina. Os mecanismos de síntese de novas proteínas e alterações no citoesqueleto são decorrentes da atividade das Rho GTPases Cdc42 e Rac1 e suas efetoras cinase ativada por p21 isoformas 1 e 3 (PAK1/3). Nesta tese, primeiramente foi realizado uma revisão de literatura sobre a PAK 1 e 3 onde discorremos sobre os seguintes aspectos: estrutura, mecanismos de ação, localização no sistema nervoso central de mamíferos, substratos alvos, regulação do citoesqueleto e participação nos processos de neuroplasticidade. Num segundo momento nós avaliamos a importância da PAK 1 e 3 na região CA1 do hipocampo de ratos, relacionada à reconsolidação, extinção e reaquisição da memória aversiva no medo condicionado contextual (CFC - do inglês contextual fear conditioning). Para tanto, ratos machos adultos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implante de cânulas na região CA1 do hipocampo para infusão de DMSO 3% (veículo) ou IPA-3 (inibidor alostérico da PAK 1 e 3). Para verificar a reconsolidação; no dia 1 os animais foram treinados no CFC; dia 2 sofreram reativação e imediatamente ou 3h após receberam as infusões; dia 3 foram testados no CFC. Para avaliar extinção: dia 1 os animais foram treinados no CFC; dia 2 e 3 foram treinados para extinção e imediatamente ou 3h após receberam as infusões; dia 4 foram testados no CFC. Para verificar reaquisição: dia 1 os animais foram treinados no CFC; dia 2, 3 e 4 treinados para extinção; dia 5 foram novamente treinados no CFC e imediatamente ou 3 h após receberam as infusões. Os resultados mostram que o bloqueio da PAK 1 e 3 em CA1 não prejudica a reconsolidação da memória aversiva. O bloqueio da PAK 1 e 3 em CA1 imediatamente após o primeiro treino de extinção retarda esse processo, mas não impede que a memória aversiva seja extinta. No entanto, a infusão do IPA-3 3h após o treino de extinção não afeta esse processo mnemônico. Quanto a reaquisição, o bloqueio da PAK 1 e 3 imediatamente, mas não 3 h, após o seu treino (dia 5) impede que essa memória seja fortalecida novamente. Assim, podemos sugerir que o bloqueio da PAK pode afetar os mecanismos moleculares subjacentes a extinção e reaquisição da memória de CFC, mas não tem nenhum efeito sobre os mecanismos relacionados com à reconsolidação. The stabilization of memory depends on molecular and morphological changes at synapses activated during mnemonic training in key regions such as CA1 of the hippocampus. The reconsolidation and extinction of aversive memory mechanisms are dependent on new protein synthesis and stabilization of the actin cytoskeleton. Since the reacquisition of aversive memory does not require synthesis of new proteins, but is dependent on the actin cytoskeleton rearrangement process. The mechanisms of synthesis of new proteins and changes in the cytoskeleton are due to the activity of Rho GTPases Cdc42 and Rac1 and its effector kinase activated by p21 isoforms 1 and 3 (PAK1 / 3). This thesis was first conducted a literature review of the PAK 1 and 3 which carry on about the following aspects: structure, mechanisms of action, located in the central nervous system of mammals, substrates targets, cytoskeletal regulation and participation in neuroplasticity processes. Secondly we value the importance of PAK 1 and 3 in the CA1 region of the hippocampus, related to reconsolidation, extinction and reacquisition of aversive memory in contextual fear conditioning (CFC). For this purpose, male adult rats underwent stereotaxic surgery to implant cannulae in the hippocampus CA1 region for infusion of 3% DMSO (vehicle) or IPA-3 (allosteric inhibitor of PAK 1 and 3). To check the reconsolidation; on day 1, the animals were trained in CFC; day 2 suffered reactivation and immediately or 3 hours after receiving infusions; day 3 were tested in CFC. To assess extinction: day 1 the animals were trained in the CFC; day 2 and 3 were trained to extinction and immediately or 3 hours after receiving infusions; day 4 were tested in CFC. To check reacquisition: day 1 the animals were trained in the CFC; day 2, 3:04 trained to extinction; day 5 were again trained in the CFC and immediately or 3 hours after receiving infusions. The results show that blocking the PAK 1 and 3 in CA1 not affect the reconsolidation of aversive memory. The lock 1 and 3 PAK in CA1 immediately after the first extinction training slows this process, but does not prevent the aversive memory is extinguished. However, infusion IPA-3 3h after extinction training mnemonic does not affect this process. The reacquisition, the lock 1 and 3 PAK immediately, but not 3 h after training (day 5) prevents this memory is strengthened again. Thus, we suggest that blocking PAK can affect the molecular mechanisms underlying the extinction and reacquisition of CFC memory, but has no effect on the mechanisms related to the reconsolidation.

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is an important pathogen associated with diarrheal diseases. Intestinal infections cause impairment of the intestinal barrier and one of the earliest response mechanisms to recover is migration of the intestinal cells to cover the injured area. The key proteins that regulate cell migration are small Rho GTPases, Rac1, Cdc42 and RhoA. The alanyl-glutamine (Ala-Gln) increases this migration process, however the mechanisms involved in this response are still unknown. Thus, we investigated the effect of a wild type strain and standard (E2348/69) of EPEC strain and a commensal E. coli HS on intestinal cell migration, as well as transcriptional regulation and gene expression of Rho GTPases and the role of supplemental Ala-Gln in the migration process in the presence or absence of infection. Infection by EPEC strains and commensal E. coli HS significantly reduced intestinal cell migration. However, this effect was more pronounced in cells infected by the strains of EPEC compared to those infected by the commensal strain of E. coli HS. We observed a high percentage of necrotic cells, about 30%, induced only by EPEC strain pattern 12 and 24 hours after infection. The addition of Ala-Gln in uninfected cells significantly stimulated in a dose dependent migration after 24 hours. However, when this nutrient was added over 12 and 24 hours in the presence of infection, there was no reversion of the damage. Regarding the gene expression of Rho GTPases, we observed an increase in transcription of rac1 in cells that had been infected by the strains of EPEC and E. coli HS as well as an increase in rhoA transcription in cells infected with EPEC strain pattern at 2 hours after infection. However, the analysis of proteins by immunofluorescence, RhoA and Cdc42 shown to be elevated in cells infected with EPEC pattern when compared to the control. Whereas cells infected with wild EPEC strain was observed an increase of Rac1 and reduction of RhoA. These data showed that cell migration is reduced mainly by the intestinal pathogenic strains of EPEC, in regulating gene transcription and expression of the protein Rho GTPases. Supplementation with Ala-Gln in intestinal cells only promoted cell migration in the absence of infection. Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um importante patógeno associado às doenças diarreicas. Infecções intestinais ocasionam comprometimento da barreira intestinal e um dos primeiros mecanismos de resposta à recuperação é a migração das células intestinais. As principais proteínas que regulam esse processo são as pequenas GTPases Rho, Rac1, RhoA e Cdc42A. A alanil-glutamina (Ala-Gln) estimula este processo migratório, entretanto os mecanismos envolvidos nesta resposta ainda são desconhecidos. Desse modo, investigou-se o efeito de uma cepa selvagem e padrão (E2348/69) de EPEC, e de uma cepa comensal E. coli HS na migração celular intestinal, bem como a regulação da transcrição e expressão gênica das GTPases Rho e o papel da suplementação com Ala-Gln no processo de migração na presença ou ausência da infecção. A infecção pelas cepas de EPEC e pela cepa comensal reduziram significativamente a migração celular intestinal. Entretanto, houve uma maior redução desse efeito nas células infectadas pelas cepas de EPEC quando comparado àquelas infectadas pela cepa comensal de E. coli HS. Observou-se um alto percentual de células necróticas, cerca de 30%, induzido pela cepa padrão de EPEC apenas nos tempo de 12 e 24 horas após infecção. A adição da Ala-Gln em células não infectadas estimulou significativamente e de modo dose dependente a migração após 24 horas. Porém, quando esse nutriente foi adicionado durante 12 e 24 horas na presença da infecção, não houve uma reversão do dano. Em relação à expressão gênica das GTPases Rho, observou-se um aumento da transcrição de rac1 nas células que haviam sido infectadas pelas cepas de EPEC e E. coli HS, bem como um aumento da transcrição de rhoA nas células infectadas pela cepa padrão de EPEC após 2 horas da infecção. Todavia, na análise das proteínas por imunofluorescência, RhoA e Cdc42 mostraram-se aumentadas nas células infectadas pela EPEC padrão quando comparado ao controle. Enquanto que as células infectadas com a cepa selvagem de EPEC observou-se um aumento de Rac1 e redução de RhoA. Esses dados mostraram que a migração das células intestinais é reduzida principalmente pelas cepas patogênicas de EPEC, ao regular a transcrição e expressão gênicas das proteínas GTPases Rho. A suplementação com Ala-Gln em células intestinais promoveu a migração celular apenas na ausência da infecção.

Schistosoma mansoni é um trematódeo digenético que causa a esquistossomose, doença parasitária que constitui um importante problema de saúde pública no Brasil e em muitos outros países do mundo. O Projeto Genoma de S. mansoni teve início em 1992 como uma iniciativa brasileira que visa à descoberta de novos genes do parasita para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas. No início do programa, centenas de Etiquetas de Sequência Transcritas (ESTs) foram geradas a partir de uma biblioteca de cDNA de vermes adultos. Entretanto, S. mansoni tem um complexo ciclo de vida o que tornou necessário a expansão do programa de descoberta de novos genes para outros estágios de desenvolvimento do parasita. No presente trabalho, oito bibliotecas de diferentes estágios do desenvolvimento do parasita, todas construídas utilizando-se o sistema ZapII, foram excisadas em massa para a obtenção de moldes de cDNA de fita dupla para que fosse possível a geração de grandes números de ESTs a partir de cada uma delas. A qualidade dos transcritos das bibliotecas excisadas foi então avaliada. Ao menos 30 colônias de cada biblioteca foram selecionadas para avaliação do tamanho médio dos insertos por PCR. A maior parte deles tinha um tamanho médio maior do que 500 pb. Na maior parte das bibliotecas menos 20% dos clones eram de sequências não informativas e mais de 50% deles eram de novos genes. Quando se considera apenas os genes presentes em mais de uma biblioteca, um total de 466 genes únicos foi obtido, o que corresponde a 427 genes novos de S. mansoni. Dos genes únicos, 20,2% foram identificados com base na sua homologia com genes de outros organismos, 8,3% eram genes já conhecidos do parasita e 71,5% do total era de genes desconhecidos. Após estas avaliações iniciais, nossos esforços foram direcionados para a cercária, a forma larvária do parasita que infecta o homem e outros vertebrados. Duas bibliotecas de cDNA de cercárias de S. mansoni foram examinadas e sequências parciais foram obtidas de 957 clones selecionados ao acaso. Baseado em buscas por homologia, 551 (57,6%) das ESTs geradas não tinham homólogos nas bases de dados públicas enquanto que 308 (32,2%) foram identificadas totalizando 859 ESTs. As 98 restantes (10,2%) eram ESTs não informativas (RNA ribossomal e sequências mitocondriais não codificantes). Através de análises de clusters, fomos capazes de identificar 453 genes diferentes. Cento e dezenove genes identificados foram agrupados em 11 categorias funcionais onde genes associados com o metabolismo de energia foram os mais abundantes (13%) e diversos. A diversidade e a abundância de genes associados com a maquinaria de transcrição e tradução e com funções regulatórias e de sinalização celular também foram marcantes. Um transcrito de paramiosina foi identificado indicando que este gene não é expresso exclusivamente em vermes adultos e esporocistos (como tem sido sugerido na literatura). Dentre os novos genes de S. mansoni descobertos, identificamos um gene que codifica uma Rho-type GTP-binding protein o qual foi sequenciado inteiramente neste trabalho. A sua janela aberta de leitura é de 579 pb e codifica um polipeptídeo de 193 aminoácidos cujo peso molecular estimado é de 21,8 kDa. A sequência de aminoácidos deduzida apresenta alta homologia com Rho GTPases de várias espécies e possui todos os domínios conservados característicos de Rho GTPases. A superexpressão do gene de Rho GTPase de S. mansoni (SMRHO) complementa uma cepa mutante da levedura Saccharomyces cerevisiae que teve seu gene rho1 selvagem eliminado artificialmente por nocaute gênico. A complementação ocorre mesmo em condições de alta temperatura e de concentração de Ca2+ que são restritivas para o crescimento da levedura. Entretanto, algumas alterações fenotípicas, tais como parada do ciclo celular, aumento do tamanho da célula e brotamento ao acaso, foram observadas indicando que a Rho GTPase de S. mansoni não é capaz de complementar perfeitamente todas as funções executadas pela RHO1 GTPase selvagem de S. cerevisiae. Os resultados de complementação junto com alinhamentos de sequências tornaram evidente que uma maior conservação de resíduos de aminoácidos específicos na região da hélice á3 e loop 7 da Rho GTPase de S. mansoni podem explicar a complementação observada mesmo nas condições de alta temperatura e de concentração de Ca2+. Os resultados obtidos durante este trabalho demonstraram que ESTs constituem uma abordagem versátil e eficiente para a descoberta de novos genes de S. mansoni nos seus diferentes estágios do ciclo de vida e que a levedura S. cerevisiae pode ser uma ferramenta poderosa em investigações sobre as funções dos genes deste complexo parasita. Schistosoma mansoni is a digenetic trematode that causes schistosomiasis, a parasitic disease that constitutes an important public health problem in Brazil and in many other countries throughout the world. The S. mansoni genome project was started in 1992 as a Brazilian initiative to discover new genes of this parasite for new drugs and vaccine development. At the debut of the program, hundreds of Expressed Sequence Tags (EST) were generated from an adult worm cDNA library. However, S. mansoni has a complex life cycle, which made necessary to expand the gene discovery program to other developmental stages of the parasite. In the present work, eight libraries from distinct developmental stages, all constructed using the ZapII system, were excised "en masse" to obtain double strand cDNA templates and generate large numbers of ESTs from each one of them. The quality of the transcripts from the excised libraries was then evaluated. At least 30 colonies from each library were selected to evaluate the average size of the inserts by PCR. Most of them had an average insert size greater than 500 bp. Most of them were shown to have less than 20% useless clones and more than 50% new genes. When considering only genes presents in more than one library, a total of 466 unique genes were obtained, corresponding to 427 new S. mansoni genes. From the total of unique genes, 20.2% were identified based on homology with genes from other organisms, 8.3% matched S. mansoni characterized genes and 71.5% represent unknown genes. After these initial evaluations, our efforts were directed to cercaria, the parasite larval form which infects humans and other vertebrates. Two S. mansoni cercarial cDNA libraries were examined and partial sequences obtained from 957 randomly selected clones. Based on homology searches, 551 (57.6%) ESTs generated had no homologs in the public databases while 308 (32.2%) were putatively identified, totaling 859 informative ESTs. The remaining 98 (10.2%) were uninformative ESTs (ribosomal RNA and non-coding mitochondrial sequences). By clustering analysis we were able to identify 453 different genes. One hundred and nineteen identified genes were sorted into 11 functional categories where genes associated with energy metabolism were the most abundant (13%) and diverse. The diversity and abundance of genes associated with the transcription-translation machinery and with regulatory-signaling functions were also noticeable. A paramyosin transcript was identified, indicating that this gene is not exclusively expressed in adult worms and sporocysts (as had been suggested previously). Among the new genes discovered, we identified a S. mansoni Rho-type GTP-binding gene, which was entirely sequenced in this work. The gene open reading frame was 579 bp long and encoded a putative 193 amino acid polypeptide with an estimated molecular weight of 21.8 kDa. The deduced amino acid sequence was highly homologous to the Rho GTPases of several species and contained all Rho-type GTPase conserved domains. S. mansoni Rho GTPase gene (SMRHO) overexpression complements a Sacharomyces cerevisiae rho1 null mutant strain. The complementation is seen even in high temperature and Ca2+ concentration conditions which are restrictive for the yeast growing. However, some phenotypical alterations, such as cell cycle arrest, cell enlargement, and random budding, were also observed indicating that S. mansoni Rho GTPase could not complement suitably all functions performed by the wild type RHO1 GTPase of S. cerevisiae. The complementation results of a knockout S. cerevisiae strain with SMRHO gene along with sequence alignments made evident that a higher conservation of specific amino acid residues at á3-helix loop7 region of the S. mansoni Rho GTPase protein may explain the complementation seen even in high temperature and Ca2+ concentration conditions. Our results demonstrate that ESTs are a very versatile and efficient approach for gene discovery in the different developmental stages of the S. mansoni life cycle and that S. cerevisiae may be a powerful alternative for gene function investigations in this complex parasite.

A progressão do câncer depende não somente das habilidades adquiridas pelas células cancerigênas, mas também da interação entre as células e seu microambiente. Os componentes da matriz extracelular (MEC) estão envolvidos em vários aspectos da biologia tumoral, fornecendo não somente suporte sólido para as células, bem como citocinas e fatores de crescimento. As ADAMTSs (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs ) são proteases secretadas dependentes de Zn2+/Ca2+ que estão envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos. Já demonstramos que além de ter influência sobre os níveis gênicos e proteicos das ADAMTSs, a progesterona mostrou reduzir a capacidade migratória e invasiva das células de ovário NIHOVCAR-3 e ES-2 quando comparada às células sem tratamento. Nosso objetivo neste trabalho foi investigar por qual mecanismo a progesterona leva a diminuição da invasão e migração das células CHO, NIH-OVCAR-3 e ES-2 e se a protease estudada está envolvida neste processo. Para isso, células derivadas de ovário tiveram os níveis de ADAMTS-1 modulados, tanto com o aumento ou diminuição, e foram comparadas com células parentais. Além disso, células com o gene de ADAMTS-1 modulado e células parentais foram tratadas com progesterona e comparadas com células não tratadas. A partir desses grupos, observou-se que o tratamento com 500 nM ou 1 &#181 M de progesterona diminuiu a migração e invasão das células, em 24 horas ou menos, sem afetar a viabilidade, sendo que o uso do antagonista do receptor de progesterona, RU486, recuperou a capacidade migratória e invasiva das células. Tanto o tratamento com o meio enriquecido com ADAMTS-1 ou progesterona levaram a diminuição na migração e invasão celular quando comparadas aos controles. Por outro lado, a redução de ADAMTS-1 parece não prevenir a diminuição da migração celular quando estas são tratadas com progesterona. Por Immunoblot observou-se que o tratamento com 1 &#181 M de progesterona diminuiu a forma fosforilada de Src e FAK, moléculas que participam da cascata de sinalização envolvidas na ativação da migração e invasão celular. Utilizando o kit G-LISA &#174, medimos a forma GTP, ativa, de pequenas proteínas G, a partir de lisados de células. O sinal de Cdc42- GTP aumentou na presença de células com níveis reduzidos de ADAMTS-1 e tendeu a diminuir nas células tratadas com o meio enriquecido com ADAMTS-1. Esses dados foram confirmados através da análise do biosensor de Cdc42 transfectado em células ES-2 e analisado por FRET, que demostraram que esta GTPase está mais ativa e presente na borda de migração das células com diminuição de ADAMTS-1 em relação as células selvagens. Concluímos, portanto, que ADAMTS-1 e a progesterona atuam na inibição da proliferação, polarização, migração e crescimento sem adesão das células de câncer de ovário. Este efeito mostrou ser de forma independente por parte do hormônio e da protease estudados, mas não descarta que possa haver um trabalho em conjunto entre essas moleculas na redução de efeitos pro-tumorigênicos. The progression of cancer depends not only on the abilities acquired by neoplastic cells, but also on the interaction between cells and their microenvironment. Extracellular matrix (ECM) components are involved in various aspects of tumor biology, providing not only solid support for cells, but also cytokines and growth factors. ADAMTSs (disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs ) are secreted proteases dependent on Zn 2+ / Ca2+, are involved in several processes and are part of the ECM. In a previous project, we demonstrated that progesterone influences on the gene and protein levels of ADAMTSs in ovarian cancer and it has been shown to reduce the migratory and invasive capacity of NIH-OVCAR-3 and ES-2 cells when compared to control cells. Our goal was to investigate by which mechanism progesterone leads to decreased invasion and migration of CHO, NIH-OVCAR-3 and ES-2 and whether the protease studied is involved in this process. For this, ovary-derived cells had ADAMTS-1 levels modulated, either with increase or decrease, and were compared with parental cells. In addition, cells with the modulated ADAMTS-1 gene and parental cells underwent progesterone treatment and were compared to untreated cells. From these groups it was observed that treatment with 500 nM or 1 &#181 M progesterone decreased cell migration and invasion, within 24 hours or less, without affecting viability, and the use of the progesterone receptor antagonist, RU486, recovered the migratory and invasive capacity. Both treatments, with the medium enriched with ADAMTS-1 or progesterone, led to a decrease in cell migration and invasion when compared to controls. On the other hand, the decresed levels of ADAMTS-1 does not seem to prevent the decrease of cellular migration when the cells are treated with progesterone. By Immunoblot, it was observed that treatment with 1 &#181 M progesterone decrease the phosphorylated form of Src and FAK, molecules that participate in the signaling cascade involved in the activation of cell migration and invasion. Using the GLISA &#174 kit evaluating the activity of Rho GTPases, we measured the active GTP form of small G proteins from cell lysates. The Cdc42-GTP signal increased in the decresed levels of ADAMTS-1 and tended to decrease in cells treated with ADAMTS-1-enriched medium. These data were confirmed by analysis of the transfected Cdc42 biosensor in ES-2 cells, which demonstrated that this GTPase is more active and present in the migration edge of the cells with decresed levels of ADAMTS-1 compared to the wild type cells. Therefore, we conclude that ADAMTS-1 and progesterone inhibit proliferation, polarization, migration and growth without adhesion of ovarian cancer cells. This effect has been shown to be independently to the hormone and protease studied, but does not rule out that there may be a joint work between these molecules in reducing pro-tumorigenic effects.

A proteína Cell Division Cycle 42 (CDC42), pertencente à família das Rho GTPases, está envolvida em diversos processos biológicos relacionados à reorganização do citoesqueleto, proliferação celular, motilidade, polaridade, citocinese e transporte vesicular. Nos últimos anos, Cdc42 tem sido implicada também em cenários de instabilidade genômica, sendo observada a sua superexpressão em diversas células tumorais, bem como a sua interação com importantes supressores tumorais em diferentes contextos celulares. Além disso, estudos recentes indicam a sua participação no envelhecimento precoce de linhagens celulares hematopoiéticas e a possível atuação sobre novas estruturas celulares, em contraposição ao tradicional papel desempenhado na membrana plasmática. Estudos prévios conduzidos por nosso grupo mostraram que mutantes de células HeLa Cdc42 constitutivamente ativos (Cdc42-G12V) apresentam uma maior sensibilidade à radiação ultravioleta em relação aos mutantes selvagens de Cdc42. Além disso, estudos de interactoma e proteômica indicaram a possível interação de Cdc42 com as proteínas PHB-2, 14-3-3η, PAK-4 e Cdc42EP3/Borg2 em condições de instabilidade genômica. Com o intuito de validar molecularmente tais interações por outros métodos experimentais, foram conduzidos ensaios de pull down, ligação de proximidade (PLA) e colocalização por microscopia confocal de fluorescência para as três primeiras proteínas parceiras nas linhagens HeLa Parental e HeLa Cdc42-G12V, tratadas ou não com radiação ultravioleta. Por fim, como forma de validação funcional, promoveu-se a expressão ectópica da parceira Cdc42EP3/Borg2 em ambas as linhagens com o intuito de avaliar a influência desta proteína em particular sobre a sobrevivência celular após o estresse genotóxico. Os resultados experimentais comprovaram a interação das parceiras PHB-2, 14-3-3η e PAK-4 pela GTPase no seu estado ativo, fornecendo indícios de papéis relevantes em estruturas subcelulares pouco exploradas para Cdc42 em condições de instabilidade genômica. Para a efetora Cdc42EP3/Borg2, os resultados obtidos demonstraram que sua interação com Cdc42 possivelmente tem papel no seu envolvimento na sensibilização das células à radiação UVC (sobrevivência celular). Essas respostas também são dependentes da ativação constitutiva de Cdc42 e sugerem que parceiros downstream à Cdc42EP3/Borg2, a exemplo das proteínas Sept2 e NCK1/2, poderiam agir conjuntamente para as respostas celulares observadas após estresse genotóxico. Assim, a comprovação molecular e funcional das interações aqui descritas certamente contribuirá para o melhor entendimento do papel de Cdc42 no contexto de resposta a danos ao DNA, abrindo novas possibilidades para a modulação farmacológica de vias envolvendo essa proteína. Cell Division Cycle 42 (CDC42), which belongs to the Rho GTPase family, is a wellknown protein involved in cytoskeleton regulation, cell proliferation, motility, polarity, cytokinesis and vesicular transport. In the past years, Cdc42 has been implicated in genomic instability conditions, where its overexpression in cancer cells and its correlation with tumor suppressor proteins have been widely reported. Besides, recent studies indicated that inhibition of Cdc42 prevents premature aging in hematopoietic cell lines and its possible role in the context of novel subcellular localization, including the perinuclear region. Studies conducted by our group demonstrated that Cdc42 constitutively active mutants (Cdc42V12) of HeLa cell line submitted to genotoxic stress exhibit a higher sensibility to ultraviolet radiation in comparison to Cdc42 wild type mutants. Furthermore, interactome and proteomic studies undertaken by our group unveiled a possible interaction of Cdc42 with PHB- 2, 14-3-3η, PAK-4 and Cdc42EP3/Borg2 proteins under genomic instability conditions. In order to experimentally validate these interactions, we conducted pull down assays, proximity ligation assays and fluorescence confocal microscopy for the three protein partners in HeLa Parental and HeLa Cdc42-G12V cell lines with or without ultraviolet radiation. Lastly, ectopic expression of Cdc42EP3/Borg2 was undertaken in both cell lines as a functional validation, with the aim to evaluate the influence of its particular expression towards cell survival following genotoxic stress. The results herein presented proved the preferential interaction of activated Cdc42 with the partners PHB-2, 14-3-3η e PAK-4 as well as indicated that these interactions display relevant roles on subcellular structures fairly unexplored for Cdc42. In the case of Cdc42EP3/Borg2, obtained data demonstrated its involvement in cell sensitization in response to UVC radiation. These responses are also dependent on constitutive activation of Cdc42 and suggest proteins downstream to Cdc42EP3/Borg2, as Septin2 and NCK1/2 proteins, as players that could coordinately act to result in the observed cellular outcomes following genotoxic stress. Therefore, the clarification of the interactions here described will certainly contribute to a better understanding of Cdc42 role in the context of DNA damage response, shedding light on novel possibilities for the pharmacological modulation of pathways involving this protein.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Depression is a complex multidimensional disorder affecting around 20% of the world population. Nevertheless, its pathophysiology is still incompletely understood. Currently available antidepressant treatments are ineffective in a significant proportion of the depressed patients and relapse rates are high, emphasizing the need for better therapeutic strategies. Depression is thought to result from the interplay between genetic predisposition and environmental factors, such as stress, a major precipitating factor for depression. Depressed individuals and chronic stress animal models of depression present impairments in several systems, including neurotransmitters, neuroimmune, endocrine systems and neurotrophic factors. Adult brain retains the capacity to adapt and re-organize neural networks in response to stimuli. This ability to change occurs in several brain regions and is called neural plasticity. Neural plasticity phenomena include synapto-dendritic changes and the generation of new cells. Neural plasticity impairments in specific brain regions are involved in the pathophysiology of depression. One of these regions is the hippocampus, which is involved in several forms of memory and in stress response. Moreover, the hippocampus comprises one of the few brain regions in the adult brain where neurogenesis occurs, the dentate gyrus (DG). Previous works showed that decreased cell genesis and dendritic morphology alterations are detected in the hippocampus of depressed individuals and animal models of depression, whereas antidepressant treatment prevents these changes. Here, we used a validated rat model of depression, the unpredictable chronic mild stress (uCMS), to explore the molecular underpinnings of neural plasticity in the hippocampal DG (hDG), in the context of depression and antidepressant treatment. For that, in a first study we performed a transcriptome analysis, in the hDG of untreated depressive-like animals and after chronic treatment with either fluoxetine, imipramine, tianeptine or agomelatine. Behavioral characterization and neuromorphological analysis in the DG revealed that all antidepressants, except agomelatine, were able to reverse the depressive-like profile and the dendritic plasticity impairments induced by uCMS. UCMS-exposure produced molecular changes that were partly reversed by antidepressants. Interestingly, agomelatine reversed less uCMS-induced changes compared to other treatments. In general, fluoxetine impacted more on neurons to reduce the expression of pro-inflammatory response genes, promoting the expression of cell metabolism-related molecules. Imipramine and tianeptine presented similar molecular profiles, promoting pathways related to cellular protection. Agomelatine produced changes in several pathways, namely on Rho-GTPase-related pathways, impacting on neurons and oligodendrocytes. In summary, antidepressants belonging to different pharmacological classes generated distinct molecular profiles that may be useful in different clinical contexts. In a second study, we aimed to assess the cell cycle mechanisms regulating hippocampal cell proliferation in the context of depression and antidepressant treatment. For that we used both in vivo - uCMS rat model -and in vitro - rat hippocampal-derived neurospheres - approaches. UCMS-exposed animals presented decreased proliferation and generation of newborn neurons that were reversed by fluoxetine. In our in vivo model, results suggest that uCMS-exposure produces a cell cycle arrest in the hDG progenitor cells that is accompanied by decreased levels of cyclins D1, E and A expression. Chronic fluoxetine treatment reversed the G1 phase arrest and increased cyclin E expression. Dexamethasone (DEX), used to mimic the elevation of glucocorticoids after chronic stress, decreased proliferation in vitro, whereas the administration of serotonin (5-HT), a neurotransmitter involved in the actions of fluoxetine, partly reversed this decrease. DEX also induced a G1-phase arrest, decreasing the expression of cyclins D1, cyclin D2 and Cdk6, while increasing p27 expression. 5-HT treatment partly reversed the G1-phase arrest and restored the expression of cyclin D1 and Cdk6. These results suggest that the anti-proliferative actions of chronic stress in the adult hDG result from a glucocorticoid-mediated G1-phase arrest in the progenitor cells that may be overcome by antidepressant treatment. Together, these findings contribute to the identification of novel molecular players and targets underlying neural plasticity phenomena in the hDG in the context of depression, unravelling unique properties of different classes of antidepressant. This knowledge may help paving the way for the implementation of more personalized treatments and open new avenues for the development of novel antidepressant strategies. Future studies will further disclose the molecular changes in this and other brain regions implicated in depression and hopefully provide clues for forthcoming translational approaches in depressive patients., A depressão é uma doença complexa que afeta cerca de 20% da população mundial. No entanto, a patofisiologia da doença é ainda pouco compreendida. Uma parte significativa dos doentes não responde aos antidepressivos existentes e os índices de recidiva são elevados, sublinhando a necessidade de melhores estratégias terapêuticas. Pensa-se que a depressão resulte da interação entre predisposição genética e fatores ambientais, como por exemplo o stress, um dos principais fatores precipitantes da depressão. Indivíduos com depressão e modelos animais de stress crónico apresentam alterações em vários sistemas, incluindo sistemas de neurotransmissores, neuroimunológicos e endócrinos e fatores neurotróficos. O cérebro adulto mantém a capacidade de se adaptar e reorganizar as redes neurais em resposta a estímulos. Estas respostas, que incluem alterações sinapto-dendríticas e geração de novas células, ocorrem em várias regiões do cérebro e designam-se globalmente por plasticidade neural. Modificações na plasticidade neural em regiões específicas estão envolvidas na patofisiologia da depressão. Uma destas regiões é o hipocampo, região responsável por várias formas de memória e envolvida na resposta ao stress. É também no hipocampo que se encontra a circunvolução dentada (DG), uma das regiões neurogénicas do cérebro adulto. Em doentes com depressão e em modelos animais verifica-se uma diminuição da geração de novas células e alterações na morfologia dendrítica no hipocampo; estas alterações são prevenidas pela administração de antidepressivos. Neste trabalho, usou-se um modelo animal de depressão, o modelo de exposição a stress crónico moderado e imprevisível (uCMS), para identificar as bases moleculares da plasticidade neural no DG hipocampal (hDG), no contexto da depressão e do tratamento com antidepressivos. Num primeiro estudo, procedeu-se à análise do transcritoma no hDG de ratos com fenótipo do tipo depressivo e após tratamento com fluoxetina, imipramina, tianeptina ou agomelatina. A caracterização comportamental e a análise neuromorfológica no hDG revelaram que todos os antidepressivos, exceto a agomelatina, revertem o perfil do tipo depressivo e os défices de plasticidade dendrítica produzidos pelo uCMS. A exposição ao uCMS promoveu alterações moleculares que foram parcialmente revertidas pelo tratamento com antidepressivos. Curiosamente, a agomelatina reverteu um menor número de alterações quando comparada com os outros antidepressivos. Em geral, a fluoxetina teve um impacto significativo em neurónios, reduzindo a expressão de genes de resposta inflamatória e promovendo a expressão de moléculas relacionadas com metabolismo celular. A imipramina e a tianeptina apresentaram um perfil molecular semelhante, promovendo vias de sinalização relacionadas com a proteção celular. A agomelatina produziu alterações em diversas vias, nomeadamente em vias relacionadas com as Rho-GTPases, em neurónios e oligodendrócitos. Em suma, antidepressivos de diferentes classes farmacológicas induzem perfis moleculares distintos que podem ser úteis em diferentes contextos clínicos. Num segundo estudo, avaliaram-se os mecanismos de ciclo celular que regulam a proliferação hipocampal no contexto da depressão e do tratamento com antidepressivos. Usaram-se duas abordagens complementares: in vivo – o modelo animal uCMS – e in vitro – neuroesferas derivadas do hipocampo de rato. Os animais uCMS apresentaram uma diminuição da proliferação e da geração de novos neurónios que foram revertidas pela fluoxetina. A exposição ao uCMS produziu uma ligeira repressão da progressão do ciclo celular na fase G1, nas células progenitoras do hDG, que foi acompanhada por uma diminuição dos níveis de expressão das ciclinas D1, E e A. O tratamento crónico com fluoxetina reverteu esta repressão promovendo a expressão da ciclina E. In vitro, o tratamento com dexametasona (DEX), para mimetizar a elevação dos glucocorticóides (GCs) induzida pela exposição prolongada a stress, promoveu uma diminuição da proliferação. Por sua vez, a administração de serotonina (5-HT), neurotransmissor envolvido na ação da fluoxetina, reverteu parcialmente estas alterações. A DEX também induziu repressão do ciclo celular na fase G1, diminuindo a expressão das ciclinas D1, D2 e da Cdk6, e aumentando a expressão do p27. O tratamento com 5-HT reverteu parcialmente esta repressão e repôs a expressão da ciclina D1 e da Cdk6. Estes resultados sugerem que as ações anti-proliferativas do stress crónico no hDG adulto resultam de uma repressão na fase G1 em células progenitoras, mediada por GCs, que pode ser revertida pelo tratamento com antidepressivos. Em conjunto, estes resultados contribuem para a identificação de novos intervenientes na regulação dos fenómenos de plasticidade neural no hDG, na depressão, revelando ainda propriedades particulares de cada antidepressivo. Este conhecimento poderá auxiliar na implementação de tratamentos mais personalizados e encetar oportunidades para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Estudos futuros permitirão desvendar as alterações moleculares nesta e outras regiões do cérebro envolvidas na depressão, esperando-se que estas possam fornecer pistas importantes que promovam o estudo da depressão em pacientes., A tese de doutoramento aqui apresentada foi desenvolvida no âmbito de uma bolsa individual de doutoramento financiada pela FCT, com a referência SFRH/BD/77454/2011.

A proteína Cdc42 (Cell Division Cycle 42) é um membro da família das Rho GTPases, sinalizadores intracelulares conhecidos pelo seu papel na regulação do citoesqueleto. Essa proteína e capaz de ciclar entre um estado ativo (ligado à GTP) e um estado inativo (ligado à GDP) e essa ativação é modulada por diversas proteínas, conhecidas como GEFs (guanine nucleotide-exchange factors), GAPs (GTPase-activating proteins) e GDIs (guanine nucleotide-dissociation inhibitors). Trabalhos recentes têm demonstrado um papel de Cdc42 na apoptose e na senescência, respostas relacionadas e comumente desencadeadas por estresse genotóxico. Neste contexto este trabalho procurou identificar interações de Cdc42 com outras proteínas, que podem ou não estar envolvidas nos mecanismos de resposta ao dano do DNA. Para isso foram utilizadas as linhagens celulares HeLa e MRC-5 submetidas a tratamento com radiação ultravioleta tipo C, a fim de provocar danos no DNA. Foram realizados dois diferentes tratamentos em cada uma das linhagens com diferentes tempos de incubação pós radiação UV, visando a busca de proteínas envolvidas em uma resposta rápida ou tardia ao dano causado. Os lisados celulares desses tratamentos foram submetidos ao pull-down com proteínas recombinantes GST, GST-Cdc42WT (Selvagem) e GST-Cdc42V12 (Mutação constitutivamente ativa). As proteínas purificadas foram digeridas e submetidas à análise por espectrometria de massa e os dados obtidos foram utilizados para a construção de redes de interação proteica. Dentre as proteínas identificadas as que despertaram maior atenção foram: Proibitina-2 (PHB2) encontrada nas amostras incubadas por 48 horas pós irradiação e Cullina-4A (CUL4A) e P53, encontradas em amostra incubada por 5 minutos pós radiação. Essas proteínas possuem papéis em apoptose e reparo de DNA e foram observadas em posições muito próximas de Cdc42 nas redes de interação, fazendo delas interessantes alvos para futuras validações de interação proteica por análises experimentais distintas The Cdc42 protein (Cell Division Cycle 42) is a member of the Rho family of GTPases, intracellular signalling molecules well known for their role in the cytoskeleton regulation. This protein cycles between an active state (GTP-bound) and an inactive state (GDP-bound) and this regulation is modulated by proteins known as GEFs, GAPs and GDIs. Recent studies demonstrated roles for Cdc42 in apoptosis and senescence, cellular responses commonly triggered by genotoxic stress. This work sought to identify Cdc42 interactions with other proteins that possibly involved in response to DNA damage mechanisms. To reach this aims we used HeLa and MRC-5 cell lines submitted to treatments with ultraviolet C radiation to induce DNA damage. Two experimental conditions were used in each cell line with different times and doses post UV irradiation in order to search for proteins involved in either rapid or delayed response to the installed DNA damage. Cell lysates obtained from these treatments were subjected to pull-down experiments using recombinant proteins GST, GST-Cdc42-WT (Wild type) and GST-Cdc42-V12 (constitutively active mutant). Purified proteins were digested by trypsin, analyzed by mass spectrometry and th obtained data were used for the construction of protein-protein interaction (PPI) networks. Among the identified proteins those that seem more relevant to the aims of this project were: Prohibitin-2 (PHB2), found in samples incubated 48 hours post irradiation; Cullin-4A (CUL4A) and P53, found in samples incubated 5 minutes after radiation. These proteins have roles in apoptosis and DNA repair and were observed in close proximity to Cdc42 in PPI networks, making them interesting targets for future validation by different experimental approaches

Clostridium difficile toxins A and B (TcdA and TcdB) are homologous glycosyltransferases that inhibit a group of small GTPases within host cells, but several mechanisms underlying their pathogenic activity remain unclear. Here, we evaluated the effects of TcdA and TcdB on the Wnt/Beta-catenin pathway, the major driving force behind the proliferation of epithelial cells in colonic crypts. IEC-6 and RKO cells stimulated with Wnt3a-conditioned medium were incubated with 10, 50 and 100 ng/mL of TcdA or TcdB for 24h, resulting in a dose-dependent inhibition of the Wnt signaling, as demonstrated by a T-cell factor (TCF) reporter assay. This was further confirmed by immunofluorescence staining for nuclear localization of Beta-catenin and western blotting for Beta-catenin and c-Myc (encoded by a Wnt target gene). Moreover, our western blot analysis showed a decrease in the Beta-catenin protein levels, which was reversed by z-VAD-fmk, a pan-caspase inhibitor. Nonetheless, TcdA was still able to inhibit the Wnt/Beta-catenin pathway even in the presence of z-VAD-fmk, lithium chloride (a GSK3B inhibitor), or constitutively active Beta-catenin, as determined by a TCF reporter assay. Furthermore, pre-incubation of RKO cells with TcdA for 12h also attenuated Wnt3a-mediated activation of Wnt signaling, suggesting that inactivation of Rho GTPases plays a significant role in that inhibition. Taken together, these findings suggest that attenuation of the Wnt signaling by TcdA and TcdB is important for their anti-proliferative effects. As toxinas A e B do Clostridium difficile (TcdA e TcdB) são glicosiltransferases homólogas que inibem um grupo de pequenas GTPases dentro da célula hospedeira, contudo, vários mecanismos envolvidos na atividade patogênica dessas toxinas permanecem desconhecidos. No presente estudo, avaliamos os efeitos das TcdA e TcdB na via de Wnt/Beta-catenina que representa a força motora principal responsável pela proliferação das células epiteliais nas criptas colônicas. Foram utilizadas células IEC-6 (células epiteliais de criptas de Rattus novergicus) e RKO (células de adenocarcinoma de cólon humano). Estas células foram estimuladas com meio condicionado contendo Wnt3a e incubadas com 10, 50 ou 100 ng/mL de TcdA ou 1, 5 ou 10 ng/mL de TcdB por 24h, resultando em uma inibição dose-dependente da via de sinalização canônica de Wnt, como demonstrado pelo ensaio de repórter de fator de célula T (TCF). Esse resultado foi corroborado pelos dados da imunofluorescência com marcação para a localização nuclear de Beta-catenina e por western blotting para Beta-catenina e c-MYC (gene-alvo da via de Wnt). Além disso, os dados do experimento de western blot evidenciaram uma diminuição dos níveis da proteína Beta-catenina, o qual foi prontamente revertido por z-VAD-fmk, um pan-inibidor de caspase. Entretanto, a TcdA ainda foi capaz de inibir a via de Wnt/Beta-catenina mesmo na presença do z-VAD-fmk, cloreto de lítio (um inibidor de GSK3Beta) ou plasmídeo de Beta-catenina constitutivamente ativo, como determinado pelo ensaio do TCF (TOPFlash/Luciferase). O estudo evidenciou ainda que a pré-incubação de células RKO com TcdA por 12h também atenuou a ativação da via de Wnt mediada por Wnt3a, o que sugere que a inativação de RhoGTPases, particularmente Rac1, possui um papel nessa inibição. Em conclusão, esses achados sugerem que a inibição da via canônica de Wnt pelas TcdA e TcdB representa um mecanismo importante da sua patogênese e explica seus efeitos anti-proliferativos.

O autismo pode ser definido como um transtorno associado ao desenvolvimento e caracterizado por prejuízo na interação social, na comunicação e no comportamento. Sua etiologia ainda é pouco conhecida, existindo alterações no desenvolvimento encefálico durante a embriogênese e na vida pós-natal. Sugere-se uma complexa interface entre fatores genéticos e ambientais. Existem provas que mostram uma desregulação do controle da homeostase e redes neuronais por parte de células astrogliais, ativação da microglia e respostas neuroinflamatórias no encéfalo de pacientes autistas até a idade adulta, representando uma alteração celular comum dentro do espectro autista (ASD). A grande variabilidade dos sintomas encontrados nos pacientes torna extremamente difícil a identificação de cascatas de sinalização comuns associadas com a patologia tipicamente autista, críticas para a procura de marcadores periféricos de diagnóstico e para identificar novos alvos terapêuticos. Neste trabalho, (i) caracterizamos a natureza multifatorial do autismo, funções moleculares, componentes celulares e processos biológicos associados, (ii) mostramos que RAC1, em particular, e a família das RHO GTPases, em geral, poderiam ter um papel crítico nos eventos neuropatológicos associados ao autismo, sendo o cálcio (Ca2+) a molécula mais central na complexa interface entre fatores genéticos e ambientais e (iii) sugerimos um modelo baseado na ativação da enzima α-secretase, mediada por receptores de glutamato (NMDARs), influxo de Ca2+, ativação de Erk e adaptação da mitocôndria a apoptose, como cascata de sinalização bioquímica que poderia explicar o aumento do volume encefálico e a falha da conectividade cerebral observada em crianças autistas e que, potencialmente, poderia ser tratada com derivados de magnésio e rapamicina. Autism is a neurodevelopmental disorder characterized by specific activity patterns and aberrant social interaction and communication. Even though its etiology is not well understood, a number of neuropathological events during central nervous system development, in childhood and adolescence, have already been described. A complex interface between genetic and environmental factors is also suggested to account for the disorder. Evidence shows a deregulation of the homeostatic control of neuronal networks by astroglia, microglial activation, and neuroinflammation; changes that persist even until adulthood and may represent a common cellular disturbance in autism spectrum disorders (ASD). The great variability of symptoms found in the patients makes a difficult challenge the identification of disrupted signaling pathways associated to ASD, which is critical to identify potentially novel biomarkers for diagnoses as well as novel therapeutic targets. In the present study, (i) we characterized the multifactorial nature of autism, molecular functions, cellular components, and biological processes associated to the disorder, (ii) we showed RAC1, in particular, and the RHO family of GTPases, in general, could play a critical role in the neuropathological events associated with autism, with calcium (Ca2+) as the most central component in interface between genetic and environmental factors, and (iii) we proposed a model of glutamate receptors (NMDARs)-mediated Erk activation of α-secretase activity and mitochondrial adaptation to apoptosis that may explain the early brain overgrowth and disruption of synaptic plasticity and connectome in autistic children, which could potentially be targeted by magnesium-based drugs and rapamycin.

Orientador : Dr. Silvio Marques Zanata Co-orientadora : Drº Adriana Frohlich Mercadante Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/04/2012 Inclui referências Área de concentração : Biologia Celular e Molecular Resumo Resumo: A família de pequenas GTPases monoméricas compreende um grupo de moléculas que têm sua atividade regulada pela transição entre uma forma ativa ligada a GTP e uma forma inativa ligada a GDP. A subfamília de GTPases Rnd (Rnd1, Rnd2 e Rnd3) foram caracterizadas como um grupo diferente das outras Rho GTPases, pois possuem pouca atividade GTPásica intrínseca e encontram-se constitutivamente ativas. As proteínas Rnd são expressas em diferentes tecidos: Rnd1 foi identificada em fígado, cérebro e em miométrio humano durante a gravidez. Rnd2 é expressa em testículos e Rnd3 é ubiquamente expressa. Rnd1 está envolvida em uma variedade de mecanismos moleculares relacionados com a plasticidade do citoesqueleto de actina e dinâmica dos microtúbulos. A atividade de Rnd1 está envolvida com a extensão inicial de processos neuríticos em células PC-12 e com o alongamento de espinhos dendríticos e desenvolvimento de dendritos em neurônios de hipocampo de ratos. Compreender os mecanismos que regulam a atividade de Rnd1 é um desafio. A proteína STI1 foi descrita como uma proteína envolvida na formação de pseudopodia em associação com o citoesqueleto de actina, chamando por esta razão a nossa atenção. Entretanto, STI1 foi melhor caracterizada como uma molécula relacionada ao estresse térmico em leveduras e então denominada Stress-Inducible Protein 1 (STI1) e seu homólogo em humano Hop (Heat-shock organizing protein). Esta proteína desencadeia sinais intracelulares neuroprotetores e promove a neuritogênese em células neurais por interagir com a proteína prion celular. Assim, para investigar nossa hipótese ensaios de pulldown com diversas GTPases recombinantes, co-imunoprecipitação e ensaios de interação em placas de poliestireno foram realizados para avaliar a especificidade da interação entre Rnd1 e STI1. Células PC-12, N2a e SHSY-5Y foram utilizadas para ensaios de neuritogênese e diferenciação celular, enquanto células COS-7 foram empregadas em ensaios de contração celular. Lipid rafts foram purificados a partir de encéfalos de camundongos e células PC-12 biotiniladas na superfície celular, com o propósito de analisar a distribuição das proteínas Rnd1 e STI1. Os ensaios bioquímicos sugerem que Rnd1 e STI1 interagem in vitro. A expressão da proteína GFP-STI1 reverte a neuritogênese desencadeada pela proteína GFP-Rnd1 em células PC-12, N2a e SHSY-5Y e induz diferenciação em PC-12. A expressão da quimera GFP-STI1 e a proteína recombinante 6His- STI1 reduziram a contração celular em células COS-7 mediada pela interação entre GFP-Rnd1 e a porção citoplasmática da plexina-A1. STI1 e Rnd1 estão localizadas tanto nos lipid rafts quanto nas frações solúveis de membrana de encéfalos de camundongos. Entretanto, STI1 encontra-se predominantemente na porção intracelular dos lipid rafts de células PC-12. Os resultados demonstram que as proteínas Rnd1 e STI1 interagem e que tal interação promove a regulação da plasticidade do citoesqueleto. Abstract: The small GTPase family of proteins comprises a group of molecules that have their activity regulated by switching between an active form GTP bound and inactive when hydrolyses the GTP to GDP. The Rnd family (Rnd1, Rnd2 and Rnd3) was first characterized as a different branch of the Rho GTPase family that has low affinity for GDP and are in a constitutively activated form. The Rnd proteins are expressed in different tissues: Rnd1 was found in liver, brain and human myometria during pregnancy. Rnd2 is expressed in testis and Rnd3 has a ubiquitously low level expression and are mainly involved in a variety of molecular mechanisms related to rearrangements of the actin cytoskeleton and microtubule dynamics. Rnd1 activity has been involved with process extension in PC-12 cells and with the elongation of dendritic spines and dendrite development in rat hippocampal neurons.Understand the mechanisms that regulate its activity are a challenge. STI1 was first characterized as a molecule related to yeast stress and so called yeast-stress-inducible protein 1 (STI-1) and its homologous proteins were then identified as the co-chaperone murine Stress-Inducible protein 1 (mSTI1) and Hop (Heat-shock organizing protein) in human. This protein triggers neuroprotective signals and promotes neuritogenesis by its characterized interaction with the prion protein. STI1 was also characterized as a molecule that was associated with pseudopodia formation in association with actin cytoskeleton. So, the main purpose of this work was biochemically characterize the interaction between Rnd1 and STI1 and analyze its biological function in the regulation of cytoskeleton plasticity and neuronal modulation. Then, to investigate our hypothesis pulldown, coimmunoprecipitation and binding assays were performed to evaluate the specificity of the interaction between Rnd1 and STI1. PC-12, N2a and SHSY-5Y cells were used for neuritogenesis assays and differentiation assays, while COS-7 cells were employed for cell contraction analysis. Lipid rafts were purified from mice brain and from surface biotinylated PC-12 cells for analysis of STI1 and Rnd1 distribution. Biochemical assays suggested that Rnd1 and STI1 can interact in vitro. Cellular GFP-STI1 expression reverts the neuritogenesis induced by GFP-Rnd1 on PC-12, N2a and SHSY-5Y cells and induces PC-12 differentiation. GFP-STI1 expression or soluble recombinant 6His-STI1 decreases COS-7 cell contraction mediated by GFP-Rnd1 and cytoplasmic Plexin-A1. STI1 and Rnd1 are present both in lipid rafts and detergent soluble membrane fractions from mouse brain. PC-12 biotinylated rafts indicated that STI1 could be present in the cytoplasmic side of rafts. Results show that Rnd1 and STI1 interact to each other and this interaction is involved with cytoskeleton plasticity.

Death from acute diarrhea has been reduced since 80´s. However diarrhoeal diseases account for nearly 1.34 million deaths a year among children under-five years of age, making them the second most common cause of child deaths worldwide. As mortality acute diarrhea was reduced, persistent diarrhea (PD) has become a major enteric diseases infant collaborating to morbidity of affected populations. Small intestinal mucosa injury that becomes prolonged has been named as a central mechanism in the pathophysiology of PD. The protein malnutrition and infection by Escherichia coli enteroaggregative (EAEC) are strongly associated with development PD. The present study investigated the effect of supplementation of Alanyl-Glutamine on monolayer of intestinal cells in the absence of infection, evaluated some parameters of the injury caused by EAEC (strain 239-1) on the intestinal mucosa in vitro and modulation of such injury by Alanyl-Glutamine 10mM. The result show that effects of supplementation of Alanyl-Glutamine 10mM is no different from effects free glutamine 4mM. Compared to E. coli HS, EAEC infection reduced the number of migrating cells, increased the percentage of necrosis, decreased the proliferation and transcription-reverse from small GTPases (RhoA, Rac1 and Cdc42), within 6 hours of contact. The contact EAEC reduced transcription of IL-8 (6h and 0h), NF-κB (6h) and TLR5 (6h and 12h) and increased TNF-α expression. The treatment of infection with Ala-Gln 10mM altered the following parameters: reduced the percentage of necrosis, increase of cell migration, although it has not caused changes in the transcription of Rho GTPases genes, increased transcription IL-8, NF-κB (6h) e TLR5 (6h and 12h). Treatment with dipeptidio significantly reduced the secretion of TNF-α (12h) while increased protein expression of IL-6 (6 e 12h). In conclusion, found that glutamine deprivation decreases cellular response against the infectious stimulus. The EAEC appears to minimize the innate host immune defenses by reducing the transcription of NF-kB and TLR5 and limit the increased transcription of IL-8. The Ala-Gln seems to make the cell more reactive against injurious stimuli, increasing their responsiveness through increased transcriptional IL-8, NF-kB and TLR5. Moreover increased protein expression of IL-6 appears to be one of the mechanisms by which promotes Ala-Gln protective effect on the intestinal epithelial barrier. A morte por diarreia aguda tem apresentado grande declínio desde a década de 80 em todas as regiões do mundo. Entretanto as doenças diarreicas ainda são responsáveis por 1,34 milhões de mortes infantis a cada ano e representam a segunda maior causa de mortalidade no grupo etário com idade inferior a 5 anos. Com o declínio de mortalidade por casos de diarreia aguda a diarreia persistente (DP) se tornou uma das principais doenças entéricas infantis contribuindo para morbidade das populações afetadas. Uma lesão no intestino delgado que se torna prolongada tem sido colocada como elemento central da patofisiologia da DP. A desnutrição proteica e a infecção por Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) estão fortemente associados ao desenvolvimento da DP. O presente estudo investigou o efeito da suplementação de Alanil-Glutamina sobre monocamada de células da mucosa intestinal na ausência de infecções. Avaliou alguns parâmetros da lesão promovida por EAEC (cepa 239-1) sobre a mucosa intestinal in vitro e a modulação de tal dano pela Alanil-Glutamina 10Mm. Os resultados obtidos mostram que os efeitos da suplementação de Ala-Gln 10mM não diferem dos efeitos exibidos pela glutamina livre 4mM. Em relação a cepa comensal E. coli HS, a infecção com EAEC reduziu de forma significativa a quantidade de células em migração, aumentou o percentil de necrose, diminuiu a proliferação celular e reduziu significativamente a transcrição dos genes das pequenas GTPases (RhoA, Cdc42 e Rac1) após 6h de contato com enterócitos. O contato com EAEC reduziu a transcrição de IL-8 (0h e 6h), NF-κB (6h) e TLR5 (6h e 12h) e aumentou a expressão proteica de TNF- α (12h). O tratamento da infecção com Ala-Gln 10mM alterou significativamente os seguintes parâmetros: aumento da quantidade de células em migração embora não tenha causado alteração na transcrição dos genes da pequenas GTPases, redução do percentual de necrose, aumento da proliferação celular, aumento da transcrição IL-8, NF-κB (6h) e TLR5 (6h e 12h). O tratamento com o dipeptidio reduziu significativamente a secreção de TNF-α (12h) enquanto aumentou a expressão proteica de IL-6 (6 e 12h). Em conclusão, verificamos que a privação de glutamina diminui a resposta celular frente ao estímulo infeccioso. A EAEC, por sua vez, parece minimizar as defesas imunes inatas hospedeiro ao reduzir a transcrição de NF-kB e TLR5 e limitar o aumento da transcrição de IL-8. A Ala-Gln parece tornar a célula mais reativa frente aos estímulos lesivos, aumentando sua capacidade de resposta através do aumento transcricional de IL-8, NF-kB e TLR5. Por outro lado o aumento da expressão proteica de IL-6 parece ser um dos mecanismos pelas quais Ala-Gln promove efeito protetor sobre a barreira epitelial intestinal.