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Submitted by RAINER MARCO LOPEZ LAPA (reimco2@gmail.com) on 2019-04-23T23:29:50Z No. of bitstreams: 1 Rainer_Lopez_Tese_Doutorado.pdf: 7605148 bytes, checksum: bbed15f282f29d859ff24940f01c5ce9 (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2019-04-25T18:06:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lapa_rml_dr_bot_par.pdf: 721062 bytes, checksum: c1d9177c0e1f8a154991b7f533d5cb9b (MD5) Made available in DSpace on 2019-04-25T18:06:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lapa_rml_dr_bot_par.pdf: 721062 bytes, checksum: c1d9177c0e1f8a154991b7f533d5cb9b (MD5) Previous issue date: 2019-02-27 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Introdução: O adenocarcinoma é o subtipo histológico mais comum de câncer de pulmão e leva à óbito milhões de pacientes a cada ano, mundialmente. Biomarcadores com utilidade clínica potencial têm sido identificados; entre estes, os RNAs não codificadores e os pseudogenes apresentam um potente papel na regulação de genes-alvo e genes parentais regulados por mRNAs respectivamente, os quais estão associados a vias moleculares de tumorigênese. Objetivos: Identificar alterações na expressão de pseudogenes em adenocarcinoma pulmonar, utilizando dados de transcritoma (RNA-Seq). Material e Métodos: Este estudo incluiu 27 tumores de adenocarcinoma pulmonar e 10 tecidos pulmonares histologicamente normais, adjacentes ao tumor, dos mesmos pacientes. Dados de RNA-Seq foram gerados na plataforma Illumina HiScan SQ e utilizados para a aplicação de uma estratégia de análise a fim de identificar sequências de pseudogenes com expressão anormal em tumores. Os pseudogenes com expressão significativamente alterada (p1 million), every year. Clinically useful biomarkers have been identified; among these, non-coding RNAs and pseudogenes have a potent role in the regulation of miRNA target genes and parental genes, respectively, which are associated with tumorigenesis pathways. Objectives: To identify alterations in pseudogene expression in lung adenocarcinoma using transcriptome data (RNA-Seq). Material and Methods: This study included 27 lung adenocarcinoma and 10 histologically normal tissues, adjacent to the tumors, from the same patients. RNA-Seq data were generated on the Illumina HiScan SQ platform and utilized for application of a data analysis strategy (pipeline) in order to identify pseudogene sequences with abnormal expression in tumor compare to normal tissues. Pseudogenes with significantly altered expression (p

Submitted by DUÍLIO MAZZONI ZERBINATO DE ANDRADE SILVA null (duzerbinato@yahoo.com.br) on 2018-03-13T18:57:43Z No. of bitstreams: 1 Tese_Duilio_2018.pdf: 3388923 bytes, checksum: d3bd5397e2e92ef08a15e7b3a7fe9cc8 (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-03-16T19:40:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_dmza_dr_bot.pdf: 3388923 bytes, checksum: d3bd5397e2e92ef08a15e7b3a7fe9cc8 (MD5) Made available in DSpace on 2018-03-16T19:40:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_dmza_dr_bot.pdf: 3388923 bytes, checksum: d3bd5397e2e92ef08a15e7b3a7fe9cc8 (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Cerca de 15% dos organismos eucariotos possuem elementos genômicos adicionais dispensáveis chamados cromossomos B. Na maioria dos casos a composição e os efeitos da presença destes cromossomos é desconhecida. Estes elementos estão presentes em diversas espécies de peixes do gênero Astyanax. Assim, os objetivos do presente trabalho foram caracterizar a composição do cromossomo B de A. paranae, bem como os efeitos da presença deste cromossomo nesta espécie e sua relação com cromossomos B de espécies próximas. Foram identificados sete genes codificadores de proteínas no cromossomo B de A. paranae, dos quais quatro mostraram expressão diferencial nos ovários de fêmeas 0B e 1B. Além disto, quatro destes genes estão presentes nos cromossomos B de A. fasciatus e de A. bockmanni. Desta forma, nós concluímos que o cromossomo B de A. paranae interfere na expressão dos genes que carrega em seu próprio benefício e possui uma origem comum com cromossomos B encontrados em outras espécies de Astyanax. Além deste objetivo principal do trabalho, também foi realizada uma análise do DNA mitocondrial de A. paranae e, por extensão, dos vertebrados em geral. Esta análise revelou inicialmente que o conteúdo de bases do DNA mitocondrial dos vertebrados tende a um padrão comum. Adicionalmente, foi possível distinguir grupos entre as classes de vertebrados com conteúdos semelhantes na composição de bases do DNA mitocondrial, indicando que a evolução do DNA destas organelas poderia estar relacionada às características biológicas de cada grupo, como modo de respiração, ocupação do meio terrestre ou aquático, modo de vida em água doce ou salgada e taxa metabólica dos organismos. About 15% of eukaryotic organisms have additional and dispensable genomic elements called B chromosomes. In most cases the composition and effects of the presence of these chromosomes is unknown. These elements are present in several species of fish of the genus Astyanax. Thus, the objectives of the present work were to characterize the composition of the B chromosome of A. paranae, as well as the effects of the presence of this chromosome in this species and its relation with B chromosomes of nearby species. Seven protein-coding genes were identified on the B chromosome of A. paranae, of which four showed differential expression in the ovaries of females 0B and 1B. In addition, five of these genes are present on the B chromosomes of A. fasciatus and A. bockmanni. Thus, we conclude that the B chromosome of A. paranae interferes with the expression of the genes it carries for its own benefit and has a common origin with B chromosomes found in other species of Astyanax. In addition to this main objective of the work, an analysis of the mitochondrial DNA of A. paranae and, by extension, of the vertebrates in general was also performed. This analysis initially revealed that the base content of vertebrate mitochondrial DNA tends to a common pattern, and it was possible to distinguish groups among vertebrate classes with similar contents in mitochondrial DNA bases, indicating that the DNA evolution of these organelles could be related to the biological characteristics of each group, such as the type of respiration, occupation of the terrestrial or aquatic environment, freshwater or salt water livelihood and metabolic rates of organisms. 2013/24367-0

Submitted by DIEGO FELIPE ALVES BATISTA null (diegofelipe_vet@hotmail.com) on 2017-07-23T15:53:00Z No. of bitstreams: 1 Tese final.pdf: 4005234 bytes, checksum: 457b822652d4193c9c8e25953f4d3dc1 (MD5) Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: Incluir o número do processo de financiamento FAPESP nos agradecimentos da dissertação/tese. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-07-26T13:34:20Z (GMT) Submitted by DIEGO FELIPE ALVES BATISTA null (diegofelipe_vet@hotmail.com) on 2017-07-26T14:07:28Z No. of bitstreams: 1 Tese_Diego_Felipe_Alves_Batista.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-07-26T19:26:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 batista_dfa_dr_jabo.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) Made available in DSpace on 2017-07-26T19:26:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 batista_dfa_dr_jabo.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) Previous issue date: 2017-07-04 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O tifo aviário, causado por Salmonella Gallinarum biotipo Gallinarum, é uma infecção caracterizada pela alta mortalidade nos lotes de aves suscetíveis acometidos, enquanto S. Gallinarum biotipo Pullorum, o agente da pulorose, infecta as aves de produção industrial com as quais desenvolve relação mais branda. Ainda é escasso o conhecimento sobre os mecanismos moleculares que sustentam essas diferentes interações patógeno-hospedeiro. Nesse estudo, objetivou-se investigar o efeito de deleção parcial das sequências codificantes dos genes idnT (transportador de L-idonato ou D-gluconato), idnO (5-cetogluconato redutase) e ccmH (heme liase necessária na montagem de citocromos do tipo C) sobre a patogenicidade de S. Gallinarum 287/91 (SG287/91), uma vez que seus ortólogos são pseudogenes conservados em S. Pullorum. Os clones mutantes SG∆idnTO, SG∆ccmH e SG∆ccmHidnTO foram obtidos por meio da técnica de mutação sítio-dirigida, denominada de recombinação Lambda-Red e testados em dois experimentos independentes com aves comerciais semipesadas de postura suscetíveis ao tifo aviário. No 1º experimento não se observou alteração da patogenicidade dos clones mutantes após inoculação oral, pois todos os animais infectados desenvolveram sinais clínicos típicos do tifo aviário e vieram a óbito ao longo de 12 dias pós-infecção (dpi). Apesar dos 100% de mortalidade, as infecções desenvolvidas pelos clones SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO levaram os animais a óbito dentro de 48 horas desde o aparecimento dos sinais clínicos, enquanto SG287/91 o fez em 6 dias, sugerindo aumento da virulência dos clones mutantes. No 2º experimento observou-se que as mutantes invadiram o hospedeiro a partir do intestino, embora as quantidades recuperadas de SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO nos fígados e de SG∆idnTO nos baços, no 5º dpi, foram superiores a de SG287/91, reforçando a hipótese de aumento da virulência dos clones contendo a alteração idnTO. Apesar disso, os níveis de transcrição das citocinas CXCLi2 e IL6 produzidos à infecção por SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO não diferiram nas tonsilas cecais nos 1º e 3º dpi e nos baços no 3º dpi em relação à infecção por SG287/91. Somente SG∆ccmH inclinou-se a estimular a transcrição de CXCLi2 e IL6 nas tonsilas cecais no 1° dpi em relação ao grupo controle, enquanto SG287/91 tendeu a suprimi-la. Porém, não houve suporte estatístico para essa observação. Os níveis de mRNA do IFNγ estavam aumentados para todas as estirpes de S. Gallinarum, mutantes ou não, porém sem diferença estatística entre eles. Os resultados do presente estudo indicam que a ruptura nos genes idnTO, e em menor grau do gene ccmH, poderiam levar a perda de “fitness” em S. Gallinarum, lhes justificando a permanência no genoma desse micro-organismo, ao contrário do que ocorre com S. Pullorum. O estudo da patogenicidade de estirpe de S. Pullorum tendo reconstituídos os genes idnTO e ccmH no seu genoma poderia esclarecer os motivos pelos quais esses foram negativamente selecionados por esse micro-organismo. Fowl typhoid, caused by Salmonella Gallinarum biovar Gallinarum, is an infectious disease which elicits high mortality into a flock of susceptible birds whereas S. Gallinarum biovar Pullorum, the aetiological agent of pullorum disease, infects poultry of commercial importance with which such a bacterium sets off a more permissive host-pathogen interaction. Little is known about the molecular mechanisms driving these distinct interplays with the host. Herein, we aimed at investigating the effect of partial deletions in the idnT (L-idonate / D-gluconate transporter), idnO (5-ketogluconase reductase) and ccmH (heme liase involved in the c-type cytochrome maturation) coding sequences on S. Gallinarum 287/91 (SG287/91) pathogenicity since they are conserved pseudogenes in S. Pullorum genomes. SG∆idnTO, SG∆ccmH and SG∆ccmHidnTO mutant strains were constructed through a one-step inactivation technique, known as Lambda-Red-mediated recombination, and tested on two independent experiments by using a commercial brown egg-producing layer line susceptible to fowl typhoid. On the experiment 1, no changing was observed in the pathogenicity of the mutant strains upon oral inoculation as the infected animals developed typical fowl typhoid clinical signs and died along 12 days post-infection (dpi). In spite of causing 100% mortality, SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO killed all the animals within 48 hours since the clinical signs appearance while SG287/91 did so in 6 days, indicating an increased virulence by these mutant strains. On the experiment 2 every mutant strain were able to invade the host system from the intestine albeit SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO were recovered from livers and SG∆idnTO alone from spleens at higher numbers than was SG287/91, supporting the hypothesis of increased virulence for those clones harbouring the idnTO mutation. Despite the results above, CXCLi2 and IL6 transcription levels during infection by SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO were similar to that induced by SG287/91 in caecal tonsils at 1 and 3 dpi and in spleens at 3 dpi. In contrast, SG∆ccmH trended to stimulate CXCLi2 and IL6 transcription in caecal tonsils at 1 dpi when compared to the negative, control group whereas SG287/91 tended to suppress it, but no statistical significance was found for such an observation. IFNγ mRNA were augmented for all S. Gallinarum strains, mutant or not, but without statistical difference amongst them. These findings indicate that gene decay into idnTO, and at a lesser extent, into ccmH sequences might lead to the loss of fitness by S. Gallinarum, raising an explanation for their maintenance on this bacterium chromosome when the opposite happens to S. Pullorum. Studying the pathogenicity of a S. Pullorum strain possessing both the idnTO and ccmH genes in its genome could bring to light the reasons whereby such genes were negatively selected by this microorganism. FAPESP: 2013/22920-4 FAPESP: 2013/26127-7

Introdução: Mycobacterium bovis é um agente do complexo M. tuberculosis que causa TB animal, mas que pode afetar também o ser humano, sendo a sua contribuição relativa no contexto global da tuberculose humana (TB) provavelmente subestimada devido às suas características de crescimento disgônico e lento e, à ausência de piruvato na maioria dos meios utilizados que dificulta o seu isolamento primário. No Brasil, cultivos de microrganismos do complexo Mycobacterium tuberculosis (CMT), sua identificação e testes de sensibilidade são realizados apenas em centros de referência em tuberculose (TB), em geral, em casos específicos. Além disso, meios sólidos, à base de ovo, como Löwenstein-Jensen (LJ) ou Ogawa contendo glicerol (sem suplementação de piruvato) são usados rotineiramente, prejudicando o isolamento de M. bovis. Os principais objetivos desta tese foram: 1 - descrever a identificação do complexo Mycobacterium tuberculosis baseada na amplificação e sequenciamento do pseudogene oxyR de esfregaços de escarro corados por Ziehl-Neelsen obtidos de pacientes com TB pulmonar diagnosticada em dois laboratórios de referência da rede pública de Juiz de Fora, Minas Gerais, em 2007 (artigo original 1); 2 - determinar a importância relativa de M. bovis como causa de TB em suspeitos referenciados a dois centros de saúde de Juiz de Fora, Minas Gerais, de março de 2008 a fevereiro de 2010 (artigo original 2); 3 - Investigar fatores associados a infecções humanas por M. bovis e micobactérias não-tuberculosas, respectivamente (artigo original 3). Os métodos para atingir esses objetivos e os resultados foram apresentados em três artigos originais resumidos a seguir. Artigo original 1: Foi realizada uma análise transversal de esfregaços de escarro de lâminas de baciloscopia corados por Ziehl-Neelsen (ZN), provenientes de pacientes com TB atendidos em dois laboratórios públicos de referência de tuberculose localizados em Juiz de Fora, Minas Gerais, objetivando distinguir Mycobacterium bovis de outros membros do CMT. Uma abordagem em duas fases foi utilizada (a) amplificação do pseudogene oxyR para detectar CMT e, posteriormente, (b) sequenciamento alelo-específico baseado no polimorfismo na posição 285 do pseudogene em questão para distinguir Mycobacterium bovis de outros membros do CMT. O pseudogene oxyR foi amplificado com sucesso em 100 (56,5%) de 177 esfregaços disponíveis de 99 indivíduos. Nenhum perfil molecular de M. bovis foi encontrado. A análise multivariada indicou que os resultados de Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR) e o laboratoraório fonte foram associados (p0,05) com a amplificação do pseudogene oxyR. Esfregaços BAAR ++ mostraram maior chance de amplificação do pseudogene oxyR que aqueles com BAAR 0, possivelmente devido à quantidade de DNA. Um dos dois laboratórios de origem apresentaram maior chance de amplificação do pseudogene oxyR, sugerindo que as diferenças na conservação de escarro entre os laboratórios poderiam ter influenciado o estado de preservação do DNA. Este estudo fornece evidências de que lâminas de baciloscopia de escarro coradas por ZN armazenadas podem ser utilizadas para detecção molecular do CMT, mas não forneceu evidências de M. bovis estar associado com tuberculose pulmonar humana em uma área urbana de Minas Gerais. Artigo original 2: Um estudo de corte transversal foi conduzido para determinar a importância relativa de M. bovis na tuberculose humana em Juiz de Fora, Minas Gerais. Foram investigados 1000 espécimes (603 suspeitos de tuberculose), os quais foram inoculados em meios LJ e Stonebrink (SB). Um total de 356 espécimes tiveram cultura positiva para Mycobacterium spp. seja no meio LJ ou no SB e 178 casos de TB tiveram as micobactérias implicadas caracterizadas por métodos convencionais e / ou moleculares (genotipagem do gene pncA). Entre os 178, detectou-se um único caso de M. bovis por métodos convencionais, mas não pôde ser confirmado por métodos moleculares. Uma amostra da cultura da micobactéria não apresentou qualquer amplificação do gene pncA ou do pseudogene oxyR. Adicionalmente, tentou-se a extração do DNA presente em 38 biopsias de 38 suspeitos de TB extrapulmonar e a genotipagem do oxyR e 14 (36,8%) foram confirmados como TB. Dois deles foram reconhecidos como co-infecções de M. bovis. Os dados indicam que a importância relativa de M. bovis no conjunto da TB humana em Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil foi baixa. Três co-infecções de M. bovis-M. tuberculosis (1,5%) foram evidenciadas dentre 191 pacientes que tiveram confirmadas infecções por Mybocabterium spp. (IC95% = 0 - 3,3%). M. tuberculosis foi detectado isoladamente em 184 (96,4%) dos 191 pacientes (IC95% = 93,6% - 98,9%), e evidência de M. avium-intracellulare isoladamente ou em co-infecção com M. tuberculosis foi encontrada em quatro (2,0%) dos 191 pacientes (IC95% = 0 - 4,1%). Artigo original 3: Foram avaliados possíveis fatores associados respectivamente a co-infecções de M. bovis (estudo 1) e evidências de M. avium-intracellulare de forma isolada ou como co-infecções (estudo 2) por meio de dois estudos de caso-controle aninhados em um corte transversal, no qual foram caracterizadas as micobactérias envolvidas em 191 pacientes. Foram selecionados em ambos os estudos 15 controles (TB por M. tuberculosis) por cada co-infecção de M. bovis ou evidência de M. avium intracellulare, respectivamente. Em ambos os estudos os controles foram pareados por faixa de idade (ponto de corte 38 anos) e sexo (estudo 1) e por faixa de idade (ponto de corte 38 anos), sexo e tipo de entrada no serviço (estudo 2). No estudo 1, co-infecções por M. bovis tiveram associação (p 0,05) com uma exposição zoonótica (OR=16,85; IC 95% = 0,64-275,18) e com a forma clínica de TB (OR=16,00; IC 95%=1,21-209,94). No estudo 2, evidências de M. avium-intracellulare, agentes que afetam animais, ocasionalmente seres humanos imunocompetentes e frequentemente imunossuprimidos, apresentou uma associação (p 0,05) com a infecção por HIV/AIDS (OR=13,36; IC 95%=1,26-140,93). Introduction: Mycobacterium bovis is an organism of the M. tuberculosis complex that causes animal tuberculosis, but can also affect human beings. The relative contribution of Mycobacterium bovis to the global tuberculosis (TB) is likely to be underestimated due to its dysgonic and slow growth characteristics and because of the absence of pyruvate in most used media is unfavorable for its primary isolation. In Brazil Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) cultures, identification and susceptibility tests are performed only in tuberculosis (TB) referral centers, generally for particular cases. Furthermore, solid, egg-based, glycerol-containing (without pyruvate supplementation) Löwenstein-Jensen (LJ) or Ogawa media are routinely used, unfavouring M. bovis isolation. The main objectives of this thesis were: 1) To describe the identification of Mycobacterium tuberculosis complex based on amplification and sequencing of oxyR pseudogene from stored Ziehl-Neelsen-stained sputum smears obtained from patients with pulmonary tuberculosis diagnosed at two public referral laboratories from Juiz de Fora, Minas Gerais State, in 2007 (original article 1); 2) To determine the relative importance of M. bovis to the global tuberculosis in suspected TB referred to the two health centers from Juiz de Fora, Minas Gerais State, from March 2008 to February 2010 (original article 2); 3) To evaluate factors associated with human infections due to M. bovis and atypical mycobacteria (original article 3). The methods for achieving such goals and the results were presented as three original articles and will be summarized respectively. Original article 1: A cross-sectional analysis of stored Ziehl-Neelsen (ZN)-stained sputum smear slides (SSS) obtained from two public tuberculosis referral laboratories located in Juiz de Fora, Minas Gerais, was carried out in order to distinguish Mycobacterium bovis from other members of MTC. A two-step approach was used, (a) oxyR pseudogene amplification to detect MTC; and, subsequently, (b) an allele-specific sequencing based on the polymorphism at position 285 of this gene for distinguishing Mycobacterium bovis from other members of MTC. OxyR pseudogene was successfully amplified in 100 (56.5%) among 177 SSS available from 99 individuals. No molecular profile of M. bovis was found. The multivariate analysis indicated that AFB results and source laboratory were associated (p

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The investigation of intra-individual variation of the rDNA cistron ITS in Carapichea ipecacuanha was made from direct sequencing of 26 individuals and from sequencing of 240 clones, representing another 51 individuals. The secondary structures of 5.8S and ITS2 regions show the typical configurations present in angiosperms respectively for 20 and 48 haplotypes. The comparison with the conserved motifs in angiosperms and the secondary structures obtained for the 5.8S region, the most reliable markers of functional sequences in C. ipecacuanha, allowed the identification of 13 pseudogenes among 26 haplotypes of 5.8S. The analysis of the secondary structure of ITS2 added one haplotype to the set of pseudogenes. The loss of functionality in some haplotypes has occurred prior to the others copies due to the accumulation of a larger number of substitutions and the formation of groups of pseudogenes that belong to distinct populations. A investigação da variação intra-individual do cistron de rDNA ITS em Carapichea ipecacuanha foi realizada a partir de seqüenciamento direto de fragmentos de PCR de 26 indivíduos e do seqüenciamento de 240 clones, representando outros 51 indivíduos. As estruturas secundárias das regiões 5.8S e ITS2 apresentam as configurações típicas presentes em angiospermas respectivamente em 20 e 48 haplótipos encontrados. A comparação com os motivos conservados em angiospermas e as estruturas secundárias obtidas para a região 5.8S, indicadores mais confiáveis da funcionalidade das seqüências em C. ipecacuanha, permitiram a identificação de 13 pseudogenes entre os 26 haplótipos de 5.8S encontrados. A análise da estrutura secundária do ITS2 adicionou um haplótipo ao conjunto de pseudogenes. A perda de funcionalidade em alguns haplótipos deve ser mais antiga do que em outros em razão do acúmulo de maior número de substituições e da formação de grupos de pseudogenes pertencentes a populações distintas.